專利名稱：α-葡聚糖抗原及特異性單克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種α -葡聚糖抗原及特異性單克隆抗體的制備方法。
背景技術：
α -葡聚糖(Dextran)是一種完全由葡萄糖單體組成的多糖，分子式(C6HltlO5)η，分 子量一般在幾萬至幾百萬之間，通常為白色的無定形粉末固體，呈膠粘狀，粘度隨分子量和 濃度的增加而增加，無臭無味，易溶于水，溶解性隨分子量的增加而下降。在常溫、中性溶液 中可穩(wěn)定存在，遇強酸分解，在堿性溶液中其端基易被氧化，受熱時可逐漸變色或分解。α-葡聚糖對制糖工業(yè)的危害有以下幾個方面(1)造成糖分損失，減少收回率; (2)使糖液的粘度增加；(3)使轉光度測定結果偏高；(4)使糖液的粘度增大；(5)使蔗糖結 晶時晶體生長變形；(6)大大降低制糖生產(chǎn)的效率。1959年，Nicholson和Horsley首次報道了 Haze法測定制糖過程中的α -葡聚 糖，這種方法是在樣本中加入酒精使α -葡聚糖沉淀，然后利用分光光度計測量所產(chǎn)生的 濁度。ICUMSA第16屆會議上討論了采用50%酒精以保證α -葡聚糖完全沉淀，又避免過高 酒精度下其它多糖沉淀的可能(CSRHaze法)，在第17屆會議上被列為試行方法，當時命名 為“原糖中類α-葡聚糖的Haze法”。此方法須在加入酒精前除去淀粉、蛋白質、脂肪、無 機鹽等在50%酒精中不溶解的非α-葡聚糖物質，前處理比較麻煩。該方法作為ICUMSA的 試行方法一直到1986年才被取消。1984年周重吉和Wnukowski對Haze法進行了改進，主要是化驗結果用MAU (千分 之一吸光度單位)取代CRSHaze的ppm (百萬分之一吸光度單位)，這樣可以避免作標準曲線 時所涉及的α-葡聚糖相對分子質量的問題。此方法被原糖貿(mào)易契約所采用，由于Haze法 的測定結果隨著用來標定的α -葡聚糖相對分子質量的改變而變化，Amstar契約法不用標 準曲線，而以濁度或Haze (模糊度)作為結果，其單位是MAU，在酒精沉淀前使用大量的離子 交換樹脂、微孔過濾器，使用無水酒精。羅伯特法是用80%的酒精分離糖液中所有的多糖，然后再用堿式硫酸銅處理這些 收集到的多糖，通過形成銅-α-葡聚糖絡合物而分離出α-葡聚糖。用硫酸水解分離的 α-葡聚糖，所得的α-葡聚糖與苯酚顯色，再通過分光光度法測定。據(jù)ICUMSA報道，對 于α -葡聚糖含量在300mg/L以上的原糖，CSRHaze法和羅伯特法的重復性和再現(xiàn)性在含 α-葡聚糖相當?shù)乃缴鲜且恢碌摹＝陙?，在尋找更準確、更快捷的α-葡聚糖檢測方法方面已經(jīng)開展了大量的研 究。出現(xiàn)了酶水解法、SPRI快速掃描檢驗法和免疫分析法等新方法。美國糖業(yè)研究院的Brown和hkerman研究出用酶法測定還原糖中α -葡聚糖含 量的定量分析法。首先用80%的酒精沉淀α-葡聚糖，然后用α-葡聚糖酶進行水解，所 得的主要產(chǎn)物異麥芽糖(Isomaltose)用HPLC檢測，根據(jù)異麥芽糖的含量可計算出α-葡 聚糖的含量。該方法所需時間較長，并且α-葡聚糖酶較貴，不適于常規(guī)檢驗。Richard和 Storkee的酶解法采用專一的α -葡聚糖酶，但該酶只能切斷直鏈(1，6)鍵，對支鏈(1，2)，(1,3),(1,4)鍵不起作用，同時酶解后的短鏈分子很難通過滲透膜。英國旋光儀器公司(OPTICALACTIVITY)與倫敦的^festminster大學和牙買加的糖 業(yè)研究所合作開發(fā)了一種新的近紅外旋光測定儀，使用了專用的酶，能分解α-葡聚糖，用 近紅外旋光儀測定其旋光度的變化，可精確測量甘蔗樣品中的α-葡聚糖。但目前專用的 α -葡聚糖酶和近紅外旋光儀都較貴，還不適用于常規(guī)檢驗。澳大利亞的Curtin曾嘗試過用免疫分析法對α -葡聚糖進行分析。免疫分析法 的操作步驟是根據(jù)抗體和抗原發(fā)生反應生成絡合物制定的。免疫法具有操作簡單，靈敏度 高，不需要特殊儀器和設備等優(yōu)點，特別適合測定甘蔗的α-葡聚糖，目前正在研究將這種 方法用在常規(guī)檢驗中。但目前只有美國米蘭公司(Midland)等能制備α-葡聚糖特異性單 克隆抗體，且價格昂貴，需進一步研究低成本、高效價抗體的制備技術。美國Clarke等研究出SPRI快速掃描檢驗法，也稱為Tilbury修訂法。這種掃描 法可在5min內完成檢驗，因此這種測定方法耗時少，從而避免了由于時間、溫度等因素對 樣品中α-葡聚糖含量的變化的影響，還具有操作簡單，不需要特殊儀器和設備等優(yōu)點，適 合于用在對甘蔗和蔗汁的常規(guī)檢驗中。此法相對快速，但前處理過程不可避免，且所測結果 包括所有多糖，使結果偏高。此外，近年來對α -葡聚糖含量的測定方法的研究報告主要還有苯酚-硫酸法、剛 果紅法、雙酶法和熒光鈉法等。苯酚-硫酸法測量準確度不夠，主要原因是加入樣品中濃 硫酸會水解多糖和寡糖，特別是在糖品中存在大量蔗糖和多糖。剛果紅法經(jīng)常使測量結果 偏低，主要原因是α -葡聚糖分子可能被其它大分子所包裹，未能充分溶解，使顯色不足。 雙酶法利用苔酶將被包裹的α-葡聚糖分子打開成為分子量較小的α-葡聚糖，然后利用 α -葡聚糖酶將其分解為葡萄糖，并通過測定α -葡聚糖前后樣品中葡萄糖含量的差異來 計算α-葡聚糖含量。該方法主要缺點是測量時間較長，試劑盒單價高，試劑保存時間短。 熒光鈉法是利用熒光鈉與α-葡聚糖結合后熒光最大激發(fā)和發(fā)射波長發(fā)生明顯變化，而與 葡萄糖、乳糖、麥芽糖等結合后熒光性質不發(fā)生變化的原理測定α-葡聚糖含量。主要缺點 是如果樣品中同時存在其它類似α-葡聚糖的多糖時，結果可能偏高。到目前為止，還沒有一種α -葡聚糖測定方法被ICUMSA列為正式方法，主要是現(xiàn) 有的實驗方法都有不完善的地方，有準確度不高、繁瑣復雜、耗時太多等缺點。免疫學檢測法具有特異性高，操作方便，結果可行等優(yōu)點，是當前α-葡聚糖的定 量分析的主要發(fā)展方向。免疫學檢測法結果的好壞，直接取決于抗體的效價和特異性，而抗 體的效價和特異性又直接取決于抗原的好壞。在CN 101139395Α中，公開了一種α-葡聚糖單克隆抗體的制備方法，通過將 葡聚糖分別與鑰孔戚血紅蛋白和牛血清蛋白偶聯(lián)得到抗原，之后按常規(guī)方法制得單克
隆抗體，但是得到的抗體效價極低，其效價比不超過10_4，根本無法和α-葡聚糖有效反應 得到沉淀，其主要原因是抗原的免疫原性弱。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種α -葡聚糖抗原及特異性單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明所采取的技術方案是
一種α-葡聚糖抗原的制備方法，包括以下步驟1)將α-葡聚糖與蛋白混合，用水溶解，調節(jié)溶液的pH為5 8，冷凍干燥，研磨成
粉；
2)將粉末置于50 60°C的恒溫，相對溫度為60% 90%，至少反應3天，得到α -葡 聚糖-蛋白交聯(lián)物，所述α-葡聚糖-蛋白交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一種。α -葡聚糖的分子量在10 200kDa之間。一種α -葡聚糖特異性單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟
1)使用制備得到的α-葡聚糖抗原與佐劑混合，乳化，注射到動物體內；
2)選取血清效價高的動物體，取其脾細胞制成懸液，并與對數(shù)生長期的瘤細胞混合， 介導融合、篩選得到可以分泌α-葡聚糖特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；
3)使用雜交瘤細胞生產(chǎn)得到α -葡聚糖特異性單克隆抗體或使用腹水法生產(chǎn)得到 葡聚糖特異性單克隆抗體。本發(fā)明方法制備的抗原，免疫原性高，可有效地誘導產(chǎn)生免疫反應，獲得性能優(yōu)異 的抗體。由本發(fā)明抗原誘導的抗體，可特異性的與α-葡聚糖反應，可產(chǎn)生肉眼可見的沉 淀，效價高，可用于α-葡聚糖的定量分析。


圖1抗原交聯(lián)物的電泳圖。圖2是不同免疫部位獲得的抗體效價測定對比圖。圖3是血清效價的測試結果圖。圖4是腹水的效價測試結果圖。圖5是抗體與競爭物的交叉反應性。圖6是抗體與Dextran_T2000反應的效果圖。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明。α-葡聚糖抗原的制備 抗原制備實施例1
1)將Dextran 40 (分子量40kDa)與BSA按1 :1的質量比混合，之后使用蒸餾水溶 解，調節(jié)溶液的PH=6，固形物含量為6% (w/v)，冷凍干燥，研磨成粉；
2)將粉末置于60°C的恒溫下，保持相對濕度為79%，反應7天，得到Dextran-BSA交 聯(lián)物，該交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。按同樣的條件制備Dextran-OVA交聯(lián)物。對不同反應時間取樣，并對產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳并使用糖染色和考馬斯亮藍 R250染色，其結果如圖1所示，圖Ia為糖染色，圖Ib為考馬斯亮藍R250染色。圖1中，條 帶 1 為 BSA ;2 為 Dextran 40-BSA 偶聯(lián)反應 Od ；3 為 Dextran 40-BSA 偶聯(lián)反應 Id ；4 為 Dextran 40-BSA 偶聯(lián)反應 3d ；5 為 Dextran 40-BSA 偶聯(lián)反應 7d。結果表明反應Od時，未見交聯(lián)物條帶；反應Id后，BSA大量減少，交聯(lián)物大量出現(xiàn)(圖1 b，條帶3)，交聯(lián)物條帶非常明顯。隨著反應時間的增加，交聯(lián)物條帶越來越深，說明 共價結合反應不斷發(fā)生，聚合程度不斷增加，分子量越來越大，得到大量的交聯(lián)物(圖1 b， 條帶4、5)?？梢?，只要反應3d以上，即可獲得可觀的α-葡聚糖-蛋白交聯(lián)物(α-葡聚 糖抗原)
抗原制備實施例2
1)將Dextran 400 (分子量400kDa)與BSA按2 :1的質量比混合，之后使用蒸餾水溶 解，調節(jié)溶液的PH=5，固形物含量為8% (w/v)，冷凍干燥，研磨成粉；
2)將粉末置于50°C的恒溫下，保持相對濕度為90%，反應3天，得到Dextran-BSA交 聯(lián)物，該交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。按同樣的條件制備Dextran-OVA交聯(lián)物?？乖苽鋵嵤├?
1)將Dextran 1000 (分子量IOOOkDa)與BSA按1 :2的質量比混合，之后使用蒸餾水 溶解，調節(jié)溶液的ΡΗ=8，固形物含量為6% (w/v)，冷凍干燥，研磨成粉；
2)將粉末置于55°C的恒溫下，保持相對濕度為60%，反應5天，得到Dextran-BSA交 聯(lián)物，該交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。按同樣的條件制備Dextran-OVA交聯(lián)物?？乖苽鋵嵤├?
1)將Dextran 2000 (分子量2000kDa)與BSA按1 :1. 5的質量比混合，之后使用蒸餾 水溶解，調節(jié)溶液的PH=7，固形物含量為5% (w/v)，冷凍干燥，研磨成粉；
2)將粉末置于60°C的恒溫下，保持相對濕度為75%，反應6天，得到Dextran-BSA交 聯(lián)物，該交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。按同樣的條件制備Dextran-OVA交聯(lián)物?？乖苽鋵嵤├?
1)將Dextran 10 (分子量IOkDa)與BSA按1. 5 :1的質量比混合，之后使用蒸餾水溶 解，調節(jié)溶液的ΡΗ=6. 5，固形物含量為5% (w/v)，冷凍干燥，研磨成粉；
2)將粉末置于58°C的恒溫下，保持相對濕度為83%，反應5天，得到Dextran-BSA交 聯(lián)物，該交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。按同樣的條件制備Dextran-OVA交聯(lián)物?？乖瓕Ρ壤?br> 高碘酸氧化法取200mg的葡聚糖Dextran 40與等當量的高碘酸鉀(KIO4)溶于pH=8 的PBS中，攪拌lh，加入一定量的BSA，在36°C水浴恒溫攪拌池，再加入硼氰化鈉(妝8!14)還 原。用7kD的透析袋在PBS中透析，冷凍干燥，得到Dextran-BSA交聯(lián)物。α -葡聚糖抗體的制備 血清抗體的制備
將抗原制備實施例1制得的Dextran-BSA交聯(lián)物與等量完全弗氏佐劑混合并充分乳 化，分別經(jīng)背部皮內、腹腔、脾內注射C57黑鼠或Balb/C白鼠，每次抗原劑量為50 μ g/只，2 周后以等量不完全弗氏佐劑進行第2次免疫，之后每隔2周加強免疫1次，3次免疫后采血 測定血清中抗體的效價；按同樣的處理，將通過高碘酸氧化法制備得到的Dextran-BSA交 聯(lián)物免疫C57黑鼠或Balb/C白鼠。
6
小鼠經(jīng)過4次免疫后，尾靜脈采血，用ELISA法測定血清效價，以P/N彡2. 1的血 清稀釋度判為血清效價。結果顯示抗原制備實施例1制得的Dextran-BSA交聯(lián)物的不同免疫方式，其免 疫效果有所不同，其ELISA效價如圖2所示，以皮下注射的免疫效果最好。皮下注射獲得 的血清抗體，其效價在1 :8000以上(P=O. 166，N=O. 070)，可見，抗原制備實施例1制得的 Dextran-BSA交聯(lián)物具有很好的免疫原性，可誘導產(chǎn)生高效價的α -葡聚糖血清抗體。按同樣的操作，使用其他α-葡聚糖-蛋白交聯(lián)作為α-葡聚糖抗原免疫動物，得 到血清抗體。經(jīng)測定，其誘導效果較抗原制備實施例1制得的Dextran-BSA交聯(lián)物差。按同樣的操作，使用高碘酸氧化法制備得到的Dextran-BSA交聯(lián)物免疫C57黑鼠 和BALB/C白鼠，無法誘導產(chǎn)生血清抗體。按同樣的操作，使用Dextran 40直接免疫C57黑鼠和BALB/C。多次免疫后，其血 清效價依然極低，表明Dextran 40單獨作為抗原不能引起小鼠的免疫應答。雜交瘤細胞的制備
1)選擇血清效價最高的鼠，處死，取出脾臟，置于滅菌的含少量培養(yǎng)液的平皿中，用 眼科剪刀將脾臟剪成小塊，然后置入研磨器內，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，充分研磨，擠出脾 細胞，再加入約IOml RPMI-1640培養(yǎng)液，充分混合后吸入大離心管，IOOOrpm離心6min，棄 去上清，重復上述過程2 3次；用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸脾細胞；
2)將對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞與上述制備的脾細胞分別用臺盼藍染色計數(shù)，吸取含 IO8個細胞和1 3 X IO7個骨髓瘤細胞的懸液量，充分混勻。IOOOrpm離心7min，上清盡量 棄凈。將試管放于37°C恒溫水浴中，沿管壁加入50% PEG 0. 8ml，靜置Imin ；
3)在5分鐘內加入25ml不完全培養(yǎng)液，第1分鐘加1ml，第二分鐘加細1，隨后的3 分鐘內將剩余液加完；
4)IOOOrpm離心7min，棄上清，加入IOml HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮 并混勻；
5)將細胞懸浮液加入已鋪有飼養(yǎng)細胞層的96孔培養(yǎng)板中，每孔0. lml,37°C,5%C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，篩選得到可分泌α -葡聚糖單克隆抗體的雜交瘤細胞。經(jīng)篩選，得到兩株產(chǎn)出性能好的雜交瘤細胞，分別記為D9和D24。直接培養(yǎng)雜交瘤細胞，可獲得α -葡聚糖單克隆抗體。 出于成本考慮，一般將雜交瘤細胞注射到動物體內，通過腹水法生產(chǎn)抗體。本發(fā)明中，將采用腹水法生產(chǎn)抗體，其具體步驟如下
1)采用健壯成年Balb/c小鼠，在注射雜交瘤細胞前1周，預先腹腔注射0. 5mL滅菌 液體石蠟；
2)每只鼠腹腔注射含1 5X IO6雜交瘤細胞的0. 5mL的鹽水；當小鼠產(chǎn)生腹水時， 腹部穿刺放出腹水，離心腹水除去細胞，3000rpm離心15min ；
3)無菌儲存或加0.01%疊氮鈉置于_20°C冰箱凍存?zhèn)溆?。腹水的間接ELISA檢測結果如圖4所示，篩選得到雜交瘤細胞腹水的效價均大于 IO60圖4中，A為使用D9雜交瘤細胞生產(chǎn)得到的腹水效價，B為使用DM雜交瘤細胞生產(chǎn) 得到的腹水效價。使用rProtein A親和層析純化腹水，可得到高純度的抗體。
抗體的特異性鑒定
采用競爭ELISA方法鑒定抗體的特異性，使用的抗體為純化后的抗體。1) 將抗原制備實施例1制得的Dextran-OVA包被于96孔板，4°C過夜；
2)1%的明膠封閉2h，PBST洗板3次，分別加入倍比稀釋的Dextran 2000與其競爭 物BSA、OVA、蔗糖、葡萄糖各50 μ L/孔，再加入抗體50 μ L/孔，板內競爭反應45min ；
3)用PBST洗滌液洗3次，加羊抗鼠酶標二抗，37°C放置Ih；
4)用PBST洗3次，加入OPD底物溶液，37°C避光放置15 min，加終止液(2M H2SO4溶 液)終止反應，酶標儀490nm讀取結果。結果顯示，OD值隨標準品Dextran 2000增加而快速下降，當競爭抑制物Dextran 2000濃度為128 μ g/mL時，OD值為0. 167，抑制率達到85. 57%。而添加同濃度倍比稀釋的 BSA、0VA，蔗糖，葡萄糖，其OD值與Dextran 2000為0時(OD=L 108)相當，抑制率均在3%以 下，說明抗體與這些競爭物無任何交叉反應。反應結果如圖5所示。圖5中，A為Dextran 2000，B為BSA，C為OVA，D為蔗糖，E為葡萄糖?？贵w的免疫沉淀反應
在IOOyL rProtein A親和層析純化的抗體中，加入不同量的Dextran 2000和PBS，實 驗表明，加入IOOng的DeXtran-T2000即可獲得肉眼可見的明顯沉淀，而加PBS沒有沉淀產(chǎn) 生。反應結果如圖6所示，表明本發(fā)明的抗體可有效地與α-葡聚糖反應，產(chǎn)生沉淀。比色 皿上標示的數(shù)據(jù)為Dextran 2000的加入量，con為對照。
權利要求
1.一種α-葡聚糖抗原的制備方法，包括以下步驟1)將α-葡聚糖與蛋白混合，用水溶解，調節(jié)溶液的ρΗ為5 8，冷凍干燥，研磨成粉；2)將粉末置于50 60°C的恒溫，相對溫度為60% 90%，至少反應3天，得到α-葡聚 糖-蛋白交聯(lián)物，所述α-葡聚糖-蛋白交聯(lián)物即為α-葡聚糖抗原。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種α-葡聚糖抗原的制備方法，其特征在于蛋白為牛血 清白蛋白或卵清蛋白中的一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種α-葡聚糖抗原的制備方法，其特征在于α-葡聚糖的 分子量在10 200kDa之間。
4.一種α-葡聚糖特異性單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟1)使用權利要求1 3任意一項方法制備得到的α-葡聚糖抗原與佐劑混合，乳化，注 射到動物體內；2)選取血清效價高的動物體，取其脾細胞制成懸液，并與對數(shù)生長期的瘤細胞混合，介 導融合、篩選得到可以分泌α-葡聚糖特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；3)使用雜交瘤細胞生產(chǎn)得到α-葡聚糖特異性單克隆抗體或使用腹水法生產(chǎn)得到 葡聚糖特異性單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種α-葡聚糖抗原及特異性單克隆抗體的制備方法。抗原的制備方法，包括將α-葡聚糖與蛋白混合，用水溶解，調節(jié)溶液的pH為5～8，冷凍干燥，研磨成粉；將粉末置于50～60℃的恒溫，相對溫度為60～90%，至少反應3天，得到α-葡聚糖抗原?？贵w的制備方法包括使用制備得到的抗原與佐劑混合，乳化，注射到動物體內；選取血清效價高動物體的脾細胞與瘤細胞融合，得到可分泌抗體的雜交瘤細胞；使用雜交瘤細胞生產(chǎn)或腹水法生產(chǎn)抗體。本發(fā)明方法制備的抗原，免疫原性高，可有效地誘導產(chǎn)生免疫反應，獲得性能優(yōu)異的抗體。本發(fā)明的抗體，可與α-葡聚糖特異性反應，產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，效價高，可用于α-葡聚糖的定量分析。
文檔編號C07K1/113GK102127143SQ20101060698
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權日2010年12月27日
發(fā)明者張遠平, 曾練強, 李雨虹, 梁達奉, 王生育, 蟻細苗, 鐘映萍, 顏江華, 黃玉南 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所