專利名稱：一種卵泡刺激素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種促性腺激素類藥物的制備方法，具體涉及一種卵泡刺激素的制備方法。
背景技術：
卵泡刺激素(FSH)是一種促性腺激素類可注射蛋白質藥物，主要用于女性和男性病人不孕和生殖紊亂的治療。FSH還可用于女性病人輔助生殖技術(ART)中的誘導排卵 (OI)和控制性超排卵(COH)。FSH還被用于誘導精子減少的男性病人的精子產生。由于FSH 在治療生殖紊亂中的重要性，所以最好提供高純度和高比活性的FSH(參見尿卵泡刺激素標準TOH312420(^)。尿卵泡刺激素(u-FSH)是以人絕經期促性腺激素(HMG)為原料，采用現代化生物技術純化而得的。根據尿卵泡刺激素國家標準的記載“本品為絕經婦女尿中提取的促性腺激素，主要包含卵泡刺激素O^ollicle-stimulating Hormone,簡稱FSH)，幾乎不含黃體生成素(Luteinising Hormone，簡稱LH) ”，表明該產品的主要成分為單組分高純度的FSH，不似其它多組分生化藥物的組成復雜，組成成分不完全明確且含有雜蛋白。用于生產尿卵泡刺激素的原料HMG主要包含卵泡刺激素與黃體生成素。黃體生成素的效價與卵泡刺激素效價的比值約為1 (中國藥典2010年版二部尿促性腺激素，第378 頁)。從HMG的電泳分析結果還可以看出，其中還含有大量的雜蛋白。制備高純度尿卵泡刺激素需要除去HMG中的LH和其他尿蛋白質，保留高純度單一活性組分的FSH，獲得成分單一、明確的生化藥品。目前，國外高純度的U-FSH主要由krono公司生產，Serono公司的生產方法包括將HMG粗品經乙醇抽提后，再經硅酸鋁吸附，然后采用DEAE柱層析純化，再經抗FSH單克隆抗體層析柱選擇性吸附，最后通過反相層析獲得高純度u-FSH。但是，Serono公司的生產方法存在一個很大的缺陷，即抗FSH單克隆抗體層析需采用氨水進行洗脫，條件劇烈，容易破壞FSH的結構，影響成品的質量和提取效率。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種卵泡刺激素的制備方法，與已有工藝相比，該制備方法獲得的卵泡刺激素純度更高，雜質含量大大降低，更有利于該藥物的臨床應用以及運輸和保存。本發(fā)明提供的卵泡刺激素的制備方法包括以下步驟(1)采用二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換層析純化促性腺激素，獲得包含卵泡刺激素的中間體I ；(2)采用黃體生成素單抗親和層析除去中間體I中的黃體生成素，獲得包含卵泡刺激素的中間體II ；(3)采用羧甲基(CM)陽離子交換層析以及Cikicron Blue染料親和層析進一步純化中間體II，得到卵泡刺激素。
優(yōu)選地，上述制備方法還包括將步驟(3)得到的卵泡刺激素與輔料，優(yōu)選為乳糖混合后凍干。其中，優(yōu)選地，二乙基氨基乙基陰離子交換層析為以二乙基氨基乙基為配基的瓊脂糖陰離子交換柱層析；黃體生成素單抗親和層析為以黃體生成素單抗為配基的瓊脂糖親和柱層析；羧甲基陽離子交換層析為以羧甲基為配基的瓊脂糖陽離子交換柱層析； Cibacron Blue染料親和層析為以Cikicron Blue染料為配基的瓊脂糖親和柱層析，每毫升配體含量為大于6. 7至7. 9微摩爾Cikicron Blue ；顆粒大小為45-165微米。具體來說，步驟(1)可以包括以下步驟a.調節(jié)促性腺激素溶液的PH值，使得卵泡刺激素帶負電荷；b.將促性腺激素溶液加到二乙基氨基乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱；c.以 pH 值為 7. O 7. 5 的 0. 03mol/L Tris-HCl 水溶液洗脫；d.以pH值為7. O 7. 5的0. 15mol/L Tris-HCl水溶液洗脫，收集目視可見的條
市οFSH的等電點在pH 5左右，通過調節(jié)pH值可使FSH帶上負電荷，從而被吸附在陰離子交換樹脂上，而一部分尿蛋白雜質因所帶電荷差異而被直接洗出；再將吸附在陰離子交換樹脂上的FSH通過合適的洗脫液洗脫下來，而另一部分雜質由于與層析柱結合得非常牢固被保留在層析柱上。通過DEAE陰離子交換層析進行初步分離可去除> 50%的尿蛋白雜質，得到中間體I。具體來說，步驟⑵包括以下步驟e.將中間體I的溶液加到黃體生成素單抗瓊脂糖親和層析柱；f.以pH值為7. 0 7. 5的0. lmol/L Tris_HCl水溶液洗脫，并檢測洗脫液在^Onm 處的OD值；g.當280nm處的OD值開始上升時，收集洗脫液直至^Onm處的OD值不再下降。利用LH與單抗配基的特異性親和吸附可以將樣品中的LH吸附在層析柱上，FSH及其它雜質尿蛋白直接被洗出，從而選擇性地除去LH，得到的中間體II。具體來說，步驟(3)包括以下步驟h.將中間體II的溶液加到羧甲基瓊脂糖陽離子交換層析柱；i.以pH值為5. 0 6. 0的0. 02mol/L醋酸鈉水溶液洗脫；j.以 pH 值為 8. 5 9. 5 的包含 0. 05mol/L Tris-HCl 和 0. 20mol/L NaCl 的水溶液洗脫，收集目視可見的條帶；k.將收集的溶液通過超濾膜，例如截留分子量為1萬的超濾膜脫鹽濃縮后，加到 Cibacron Blue染料瓊脂糖親和層析柱；1.分別以pH值為9. 5 10. 0的包含0. 05mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉的水溶液和 pH值為8. 5 9. 5的包含0. 05mol/L Tris-HCl和0. 20mol/L NaCl的水溶液洗脫；m.以 pH 值為 8. 5 9. 5 的包含 0. 05mol/L Tris-HCl 和 0. 20mol/L NaCl 的水溶液洗脫，收集目視可見的條帶。優(yōu)選地，收集的產物用超濾膜，例如截留分子量為1萬的超濾膜進行脫鹽濃縮。通過調節(jié)pH值可使FSH帶上正電荷，其它雜質由于電荷差異或者因不能吸附在層析柱上而直接流出；或者在洗脫目的產物時，其它雜質仍結合在CM陽離子交換層析柱上。 利用FSH與Cibacron Blue染料配基的特異性親和吸附，而其它雜蛋白與染料不結合或者結合力非常差來進行分離。通過Cikicron Blue染料親和層析可以完全去除所有雜蛋白， 得到高純尿卵泡刺激素(u-FSH)。優(yōu)選地，上述步驟(1)、⑵和/或(3)包括向層析獲得的產物中加入乙醇，例如無水乙醇進行沉淀；然后進行干燥，例如真空干燥。更優(yōu)選地，層析獲得的產物與乙醇的體積比為1 5，即可達到理想的沉淀效果。本發(fā)明還提供了根據上述制備方法制備的卵泡刺激素。本發(fā)明以HMG原料藥為起始原料，分別采用DEAE陰離子交換層析、LH單抗親和層析、CM陽離子交換層析和Cikicron Blue染料親和層析技術獲得了純度更高的卵泡刺激素。其中，DEAE陰離子交換層析利用FSH與其他雜質所帶電荷的差異進行初步分離，能夠去除> 50%的尿蛋白雜質。LH單抗親和層析利用LH與其單抗配基的特異性親和吸附，將LH 吸附在層析柱上，FSH及其它雜質尿蛋白直接被洗出從而選擇性地除去LH。CM陽離子交換層析和Cibacron Blue染料親和層析可以完全去除雜蛋白，得到的產物為高純度尿卵泡刺激素(u-FSH)。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為HMG、中間體I、FSH和LH的電泳圖。其中，1-Mark, 2-HMG，3-中間體I，4-FSH， 5-LH。圖2為中間體II、高純度尿卵泡刺激素、FSH和LH的電泳圖。其中，l_Mark，2-中間體II，3-高純度尿卵泡刺激素，4-FSH，5-LH)。圖3為被酸破壞的FSH的電泳圖。圖4為HMG、高純度FSH、FSH和LH的電泳圖。其中，l_Mark，2_中間體II，3-高純度 FSH，4-FSH,5-LH)。圖5為穩(wěn)定性考察前FSH(乳糖)的HPLC圖譜。圖6為穩(wěn)定性考察前FSH(甘露糖)的HPLC圖譜。圖7為RH92. 5%下考察10天后FSH (乳糖)的HPLC圖譜。圖8為RH92. 5%下考察10天后FSH (甘露糖)的HPLC圖譜。圖9為30°C加速考察1月后FSH(乳糖)的HPLC圖譜。圖10為30°C加速考察1月后FSH(甘露糖)的HPLC圖譜。圖11實施例1制備的FSH產品與市售產品的電泳圖。其中，l_Mark，2-081201批產品，3-5 %的自身對照品，4-080901批市售產品，5_5 %的自身對照品。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例11. 二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換層析1. 1 材料HMG 第060602-R2批，國藥標準字H20023376，并經乙肝、丙肝和HIV病毒檢驗和殘留溶劑檢驗合格。凝膠DEAEipharose FF(GE Healthcare)。平衡液0.03mol/L Tris-HCl, pH 7. 0 7. 5。洗脫液0.15mol/L Tris-HCl, pH 7. 0 7. 5。1. 2工藝參數1.2. 1平衡液、洗脫液的pH選擇DEAE陰離子交換層析的原理是利用FSH所帶的負電荷與其他雜質所帶電荷的差異進行初步分離，以去除大部分的尿蛋白雜質。當平衡液、洗脫液的PH < 7時，上樣時流出液的產品損失較大；當平衡液、洗脫液的PH > 7時，即可以使FSH帶負電荷。但如果超過 7. 5時，產品的洗脫也大大加大，收率也明顯降低，所以綜合考慮選擇平衡液與洗脫液的pH 為 7. 0 7. 5。采用IOml-DEAE陰離子交換層析柱研究了不同pH時流出液中FSH的比例與收率， 詳見表1。表1不同pH下流出液中FSH比例與收率
權利要求
1.一種卵泡刺激素的制備方法，該制備方法包括以下步驟(1)采用二乙基氨基乙基陰離子交換層析純化促性腺激素，獲得包含卵泡刺激素的中間體I ；(2)采用黃體生成素單抗親和層析除去中間體I中的黃體生成素，獲得包含卵泡刺激素的中間體II ；(3)采用羧甲基陰離子交換層析以及CibacronBlue染料親和層析進一步純化中間體 II，得到卵泡刺激素。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括將步驟C3)得到的卵泡刺激素與輔料，優(yōu)選為乳糖混合后凍干。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述二乙基氨基乙基陰離子交換層析為以二乙基氨基乙基為配基的瓊脂糖陰離子交換柱層析；所述黃體生成素單抗親和層析為以黃體生成素單抗為配基的瓊脂糖親和柱層析；所述羧甲基陽離子交換層析為以羧甲基為配基的瓊脂糖陽離子交換柱層析；所述Cikicron Blue染料親和層析為以Cikicron Blue染料為配基的瓊脂糖親和柱層析。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)包括以下步驟a.調節(jié)促性腺激素溶液的pH值，使得卵泡刺激素帶負電荷；b.將促性腺激素溶液加到二乙基氨基乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱；c.以pH值為7.0 7. 5的0. 03mol/L Tris-HCl水溶液洗脫；d.以pH值為7.0 7. 5的0. 15mol/L Tris-HCl水溶液洗脫，收集目視可見的條帶。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟( 包括以下步驟e.將中間體I的溶液加到黃體生成素單抗瓊脂糖親和層析柱；f.以pH值為7.0 7. 5的0. lmol/L Tris-HCl水溶液洗脫，并檢測洗脫液在^Onm處的OD值；g.當^Onm處的OD值開始上升時，收集洗脫液直至^Onm處的OD值不再下降。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟C3)包括以下步驟h.將中間體II的溶液加到羧甲基瓊脂糖陽離子交換層析柱；i.以pH值為5.0 6. 0的0. 02mol/L醋酸鈉水溶液洗脫；j.以 pH 值為 8. 5 9. 5 的包含 0. 05mol/L Tris-HCl 和 0. 20mol/L NaCl 的水溶液洗脫，收集目視可見的條帶；k.將收集的溶液通過超濾膜，例如截留分子量為1萬的超濾膜脫鹽濃縮后，加到 Cibacron Blue染料瓊脂糖親和層析柱；1.分別以PH值為9. 5 10. 0的包含0. 05mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉的水溶液和pH 值為8. 5 9. 5的包含0. 05mol/L Tris-HCl和0. 20mol/L NaCl的水溶液洗脫；m.以 pH 值為 8. 5 9. 5 的包含 0. 05mol/L Tris-HCl 和 0. 20mol/L NaCl 的水溶液洗脫，收集目視可見的條帶。
7.根據權利要求1至7中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述收集的產物用超濾膜，例如截留分子量為1萬的超濾膜進行脫鹽濃縮。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)、(2)和/ 或( 包括向層析獲得的產物中加入乙醇，例如無水乙醇進行沉淀；然后進行干燥，例如真空干燥。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述層析獲得的產物與乙醇的體積比為1 5。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的制備方法制備的卵泡刺激素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種卵泡刺激素的制備方法，該制備方法包括以下步驟(1)采用二乙基氨基乙基陰離子交換層析純化促性腺激素，獲得包含卵泡刺激素的中間體I；(2)采用黃體生成素單抗親和層析除去中間體I中的黃體生成素，獲得包含卵泡刺激素的中間體II；(3)采用羧甲基陰離子交換層析以及Cibacron Blue染料親和層析進一步純化中間體II，得到卵泡刺激素。與已有工藝相比，該制備方法獲得的卵泡刺激素純度更高，雜質含量大大降低，更有利于該藥物的臨床應用以及運輸和保存。
文檔編號C07K1/18GK102464713SQ20101060828
公開日2012年5月23日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權日2010年12月21日
發(fā)明者萬龍巖, 宣建剛, 有洪華, 阮振興, 陳攀 申請人:上海麗珠制藥有限公司