專利名稱：一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯(lián)體及其工程菌的構(gòu)建、串聯(lián)體的融合表達(dá)、單體肽的制備方法及促小腸絨毛生長活性檢測。
背景技術(shù)：
人胰高血糖素樣肽-2(Glucag0n-like P印tide-2，GLP-2)屬于腸道產(chǎn)生的胰高血糖素原衍生肽(Proglucagon-derived Peptide, P⑶P)家族成員之一，是一條由33個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，多肽的羧基末端為天冬氨酸。GLP-2是腸上皮特異性生長因子，具有腸道特異性及更強(qiáng)的促生長作用，促進(jìn)腸黏膜生長、抑制腸上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞凋亡等生物活性，研究發(fā)現(xiàn)其可以治療或改善胃腸外營養(yǎng)依賴性短腸炎、炎性腸病、骨質(zhì)疏松、腸粘膜損傷等炎癥。由于天然的GLP-2易被二酰肽肽酶IV (Depiptidyl Peptidase IV，DPP- IV )降解而失去活性，所以近年來GLP-2的類似物的研究層出不窮，如NPS公司研發(fā)的一種耐DPP IV降解的GLP-2類似物Teduglutide 能促進(jìn)短腸綜合癥患者營養(yǎng)的吸收，且安全性、耐受性良好。人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有明顯體內(nèi)促小腸絨毛生長的作用，并且其體內(nèi)促腸生長活性與藥物劑量呈正相關(guān)性。然而，大量制備較為困難，由于肽鏈較長使化學(xué)合成法步驟較多、成本高、率較低；基因工程法生產(chǎn)同樣存在很多困難， 如長度在20 80氨基酸之間的肽類mRNA和表達(dá)的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定，導(dǎo)致表達(dá)效率很低；用融合方式雖能獲得高效表達(dá)，但從融合蛋白上釋放出目標(biāo)多肽相當(dāng)困難，同時目的肽在融合蛋白中比率較小，最終造成產(chǎn)率低，制備不經(jīng)濟(jì)等問題，雖已有將部分線性肽目的基因串聯(lián)起來，使目的基因在宿主菌中以串聯(lián)體方式表達(dá)，雖可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)效率，但表達(dá)的串聯(lián)體產(chǎn)物通常經(jīng)酶或化學(xué)試劑裂解獲得目的肽單體，其中所用的酶一般成本較高；化學(xué)試劑如溴化氫存在毒性強(qiáng)等問題，使相關(guān)肽的生產(chǎn)和研究受到限制。融合蛋白的表達(dá)形式直接影響到下游工藝路線和最終產(chǎn)品的產(chǎn)率，已有的下游工藝路線為重組質(zhì)粒pED-Pro-Pro-h Wly2]GLP-2 (1-35)表達(dá)的融合蛋白溶解后，經(jīng)多次乙醇沉淀、等電點(diǎn)沉淀等獲得融合蛋白粗品；酸水解后，通過離子交換獲得目的肽粗品；HPLC 柱進(jìn)一步去除因粗品融合蛋白帶來的雜質(zhì)。目的肽占融合蛋白的比例僅為22%，且過程繁瑣直接影響終產(chǎn)品的產(chǎn)率。因此需要一種目的肽表達(dá)量高、純化過程方便、可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的制備方法來獲得該產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯(lián)體。本發(fā)明的另一個目的是公開一種人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物不同拷貝數(shù)的基因串聯(lián)體構(gòu)建方法。本發(fā)明的再一個目的是公開一種用于制備該類型的人胰高血糖素樣肽-2(1-35 肽)類似物的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明第一方面，提供了一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯(lián)體，其特征在于胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的C 端天冬氨酸(Asp)和N端脯氨酸(ftx))可以重復(fù)串聯(lián)形成串聯(lián)體，即一個類似物C端的Asp 和先一個類似物N端的Pro形成酸水解位點(diǎn)，在鹽酸作用下可水解為單體肽，該基因串聯(lián)體氨基酸序列為Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n其中HP為一段氨基酸殘基的肽鏈，分子量為3237Da，HP肽鏈序列為Asp-His-His-His-His-His-His—Gln—Thr—Cys-Pro—Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys—A rg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala ；η = 6。本發(fā)明第二方面，提供了一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物不同拷貝數(shù)的基因串聯(lián)體構(gòu)建方法，包括以下步驟(a)含融合伙伴 AnsB-C 的 Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)基因串聯(lián)體構(gòu)建一組同尾酶BamH I和Bcl I分別位于插入目的肽片段的兩端，以質(zhì)粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板構(gòu)建重組質(zhì)粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)，再以 pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板逐步構(gòu)建重組質(zhì)粒 pED-4Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)、pED-6Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)、 pED-8Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。(b)含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h Wly2] GLP-2 (1-35)基因串聯(lián)體構(gòu)建在重組質(zhì)粒pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-3 基礎(chǔ)上，通過 PCR 將其 396bp 的融合伙伴AnsB-C縮短為Slbp的新融合伙伴HP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)禾口 pET-HP-8Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)。將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化coli BL21，得6種多拷貝基因串聯(lián)體工程菌。
本發(fā)明第三方面，提供了一種用于制備該類型的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽) 類似物的方法，包括以下步驟(a)最佳目的肽串聯(lián)體篩選將各重組菌乳糖誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測并分析，發(fā)現(xiàn)BL21/ pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)的目的肽表達(dá)量為 9%且最高。(b)人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體的制備將重組基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-超聲破碎-1. 2% Trition X-100提取-Ni瓊脂糖凝膠層析純化得串聯(lián)體。(c)人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的獲得將串聯(lián)體經(jīng)酸水解-沉淀-S^hadex G_25葡聚糖凝膠層析純化得到人胰高糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物。
本發(fā)明的一種人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物制備方法能帶來如下有益效果所表達(dá)的融合蛋白中，融合伙伴HP分子量較低使人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的比率為 90 %，BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的目的肽表達(dá)量是原 BL21/ pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)的2. 7倍實(shí)現(xiàn)了目的肽的高表達(dá)；融合伙伴中含有六個組氨酸組成的標(biāo)簽便于使用M瓊脂糖凝膠層析純化使純化操作簡便；單體肽水解過程不需使用CNBr或水解酶，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1各PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果。圖中M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，自下而上依次為100bp、250bp、500bp、750bp、 1000bp、2000bp ;1. 526bp 的 AnsB-C 和 Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)片段；2. 631bp 的 AnsB-C 和 2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)片段；3. 92bp 的 HP 片段；4 :316bp 的 HP 和 2Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)片段。圖2含不同拷貝數(shù)的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯(lián)體構(gòu)建關(guān)系。圖3人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體基因序列測序結(jié)果圖4各重組菌乳糖誘導(dǎo)表達(dá)情況。圖中1. Escherichia coli BL21空白對照；2 8分別為含pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-4Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)、pED-8Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)、pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)、pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)重組菌乳糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；Μ.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白自上而下依次為97. 4KDa、66. 2KDa、43. 0KDa、31. OKDa, 20.lKDa、14. 4KDa。圖5含不同拷貝數(shù)的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯(lián)體目的肽表達(dá)量情況。圖6人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體經(jīng)酸水解得到人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的單體示意圖。圖7人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體的酸水解以及純化單體的電泳圖。圖中l(wèi).Ni瓊脂糖凝膠層析純化得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體；2.人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物酸水解后等電點(diǎn)沉淀所得產(chǎn)物；3.kphadex G-25聚糖凝膠層析柱純化得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物；4. 5800bp未經(jīng)ME處理的標(biāo)準(zhǔn)重組胰島素。圖8人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的電噴霧質(zhì)譜圖。圖9小腸組織切片圖中A. PBS對照組，B.給藥組。
具體實(shí)施方式
以下通過附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本說明書中所提到的材料中(1)宿主菌和質(zhì)粒宿主菌hcherichia coli BL21是基因工程常用工具菌種，在與基因工程研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室一般都有保存。質(zhì)粒pED-Pro-Pro-h Wly2]GLP-2 (1-35)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。(2)酶和試劑分子克隆工具酶為i^rmentas和Takara兩家公司；質(zhì)粒抽提試劑盒為南京天為生物科有限公司；PCR膠回收試劑盒為Takara公司的產(chǎn)品。(3)培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn) Sambrook J, FristshE F, Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。(4)Ni瓊脂糖凝膠親和層析介質(zhì)為南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品。(5) Sephadex G-25葡聚糖凝膠為美國GE公司產(chǎn)品本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見Sambrook J， FristshE F, Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.16—340。實(shí)施例1重組質(zhì)粒及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建1. 1 含融合伙伴 AnsB-C 的 Pro-Pro-h[Gly2]GLP_2 (1-35)基因串聯(lián)體構(gòu)建在基因水平上，每個單體肽的兩端都預(yù)留編碼酸水解位點(diǎn)(Asp-Pro)的核苷酸序列，設(shè)計引物Nco I -up (含有Nco I酶切位點(diǎn))和Bcl I Down (含有Bcl I酶切位點(diǎn))， 以質(zhì)粒pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)(該質(zhì)粒的構(gòu)建方法見授權(quán)公告號CN10041893C 發(fā)明專利審定授權(quán)說明書，質(zhì)粒PED是在質(zhì)粒pET-28a的兩個酶切位點(diǎn)Nco I和Hind III間引入已消除唯一酸水解位點(diǎn)L-天冬酰胺酶AnsB-C構(gòu)建而成，AnsB-C分子量為13. 73KDa) 為模板，PCR擴(kuò)增融合伙伴AnsB-C基因和Pr0-Pr0-t^Gly2]GLP-2 (1_35)的單基因序列， 反應(yīng)總體積為50μ 1，經(jīng)94°C預(yù)變性50min，進(jìn)入如下32個循環(huán)94°C變性45s，57°C退火 45s，72°C延伸70s，最后在72°C下延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和Bcl I雙酶切，質(zhì)粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)進(jìn)行 Nco I 和 BamH I 雙酶切去除 AnsB-C 基因片段， 同尾酶BamH I和Bcl I的酶切產(chǎn)物的粘性末端相同，將兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 pED-2Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。以質(zhì)粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2] GLP-2 (1-35)為模板，Nco I Up 和 Bcl I Down 為引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和Bcl I雙酶切，質(zhì)粒 pED-2Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進(jìn)行 Nco I 和 BamH I 雙酶切，兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pED-4Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。按同樣方法構(gòu)建重組質(zhì)粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP—2 (1-35)及 pED-8Pro-Pro_h [Gly2] GLP—2 (1-35)。1. 2含截短型融合伙伴HP的Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)基因串聯(lián)體構(gòu)建設(shè)計編碼Thr-HP-Asp 肽鏈(即 fusion partner)的序列，其中 HP 為Asp-His_His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Ly s-Ser-Arg-Ala.以質(zhì)粒 pED-Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)為模板，Nco I His Up 和 BamH I Down 為引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和BamH I雙酶切，質(zhì)粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進(jìn)行 Nco I 和 BamH I 雙酶切去除 AnsB-C 基因片段，將兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)。以質(zhì)粒 pED-2Pro-Pro_h [Gly2]GLP-2 (1-35)為模板，Nco I His Up 和 Bcl I Down 為引物，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Nco I和Bcl I雙酶切，質(zhì)粒 pED-6Pro-Pro-h [Gly2]GLP-2 (1-35)進(jìn)行Nco I和BamH I雙酶切，將兩者的酶切產(chǎn)物連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-HP-8Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)，上述各PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果見附圖1，各串聯(lián)體構(gòu)建關(guān)系見附圖2。其中，4條引物序列如下Nco I Up 5' -ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3‘Nco I His Up :5，-TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGC AC-3'Bcl I Down 5' -AAAATGATCAGTGATTTTGGTCTG-3‘BamH I down 5' -TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3‘1.3相應(yīng)基因工程菌構(gòu)建將上述各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌hcherichia coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含100 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑取部分單菌落培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測選取表達(dá)融合蛋白相對分子質(zhì)量與預(yù)期結(jié)果相符且表達(dá)量較高的陽性重組菌測序，進(jìn)一步驗(yàn)證人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的多聯(lián)體基因序列的正確性，其中 pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)測序結(jié)果見附圖 3。實(shí)施例2目的肽表達(dá)量最佳串聯(lián)體篩選將各重組菌乳糖誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測并分析，發(fā)現(xiàn)BL21/ pET-HP-6Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的目的肽表達(dá)量為 9 % 且最高，是 BL21/ pED-Pro-Pro-h [Gly2] GLP-2 (1-35)的 2. 7 倍，結(jié)果見附圖 5。實(shí)施例3人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯(lián)體的制備3. 1人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體的制備將重組基因工程菌BL21/pET-HP-6Pro-P-h [Gly2]GLP-2 (1-3 以的接種量于 LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)到對數(shù)中期，按4%的接種量轉(zhuǎn)接到玉米漿培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 4小時后加入終濃度為5mmol/L的乳糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)。離心收集菌體按10倍重量體積加入菌體洗滌液(lOmmol/L Tris-HCl pH 8.0)洗滌兩次，離心收集菌體按5倍重量體積加入 PBS 溶液(20mmol/L Na2PHO4, 500mmol/L NaCl，pH 7. 4)，混勻，凍融，超聲破碎。離心收集沉淀并按 20 倍重量體積加入提取液(1.2% Triton X-100, 5mmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)，得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯(lián)體的粗品溶液。將人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物串聯(lián)體的粗品溶液上清上樣于以 Binding Buffer (1. 2 % TritonX-100,5mmol/L imidazole,500mmol/L NaCl,20mmol/LTris-HCl,pH 8. 0)平衡的Ni瓊脂糖凝膠親和層析柱，以10倍柱體積的Wash Buffer (1. 2% TritonX-100,20mmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)洗脫雜蛋白，最后以 Elute Buffer (1. 2% TritonX-100, lOOmmol/L imidazole, 500mmol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)收集目的蛋白，得人胰高血糖素樣肽_2 (1_35肽)類似物串聯(lián)體。3. 2人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的制備將含有人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物串聯(lián)體的Elute Buffer透析，凍干， 每克串聯(lián)體加入IOml 40 50mmol/L HCl溶解，置于48°C水浴48h，進(jìn)行酸水解，理論效果圖見附圖6。酸水解后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至3. 9，有大量沉淀生成，12000rpm離心20min， 去除上清，沉淀凍干后溶解于少量lOmmol/L的pH為7. 0磷酸鹽緩沖液中，上樣于kphadex G-25葡聚糖凝膠層析柱，收集樣品峰，透析除鹽，凍干收集目的肽。SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果見附圖7。實(shí)施例4質(zhì)譜分析通過基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F-MS)法，測得重組制備的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的相對分子質(zhì)量為3卯4. 038Da，與理論推算值一致， 見附圖8。實(shí)施例5人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物生物活性的檢測選取正常雄性SD大鼠(160-200g)，隨機(jī)分為2組，6只/組，1組為PBS對照組； 另一組組為給藥組，劑量分別為0. 5mg/Kg/day, 1天2次，腹部皮下注射給藥14天后，晚上禁食，第二天處死，取小腸，用生理鹽水清洗，進(jìn)行小腸組織切片分析，結(jié)果顯示給藥組的體內(nèi)促小腸絨毛生長活性明顯高于PBS組，結(jié)果見附圖9。除上述事實(shí)外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換性的技術(shù)方案，均落于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
9
權(quán)利要求
1.一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物基因串聯(lián)體，其中人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物氨基酸序列為Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-L eu-Ala—Ala—Arg-Asn-Phe-IIe-Asn-Trp-Leu-IIe-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr—Aspο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯(lián)體，其特征在于所述的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物C端天冬氨酸(Asp)與N端脯氨酸(ftx))可以重復(fù)串聯(lián)成串聯(lián)體，即一個類似物C端 Asp和下一個類似物N端的Pro形成酸水解位點(diǎn)，在鹽酸作用下可以斷開，串聯(lián)體氨基酸序列為Met-HP-Asp-(Pro-Pro-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)n其中HP為含有a個氨基酸殘基的肽鏈(a為非負(fù)整數(shù))；n > 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯(lián)體，其特征在于，所述HP肽鏈序列為Asp-His-His-His-His-His-His-Gln-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Lys-Arg-L ys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Ala ；η = 60
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法，包括重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的工程菌的構(gòu)建步驟，人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的串聯(lián)體的制備步驟，人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的獲取步驟，其特征在于在重組質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因工程菌構(gòu)建過程中，質(zhì)粒pED-Pr0-Pr0-t^Gly2]GLP-2(l-30為模板，是通過PCR反應(yīng)獲得含人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的DNA片段的擴(kuò)增序列，引物的核酸序?yàn)镹co I Up 5' -ACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3‘Nco I His Up 5 ‘ -TATACCATGGATCATCATCATCATCATCATCAGACCTGCCCGCCGTGCCCTGCAC-3'Bcl I Down 5' -AAAATGATACGTGATTTTGGTCTG-3‘BamH I down 5' -TTTCGGATCCGCACGGCTTTTT-3‘
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法， 其特征在于在人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體的制備步驟中，將重組菌 BL21/pET-HP-6Pro-Pro-h[Gly2]GLP-2 (1-35)經(jīng)發(fā)酵-離心-洗滌沉淀-超聲破碎-1. 2% TritionX-IOO提取-Ni瓊脂糖凝膠層析純化得較純串聯(lián)體，其中，發(fā)酵溫度為36 38°C， ρΗ 6. 8 7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物的制備方法，其特征在于在人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的串聯(lián)體的獲得步驟中，將串聯(lián)體經(jīng)酸水解-沉淀-S^hadex G-25葡聚糖凝膠柱層析純化得到人胰高血糖素樣肽_2 (1-35肽) 類似物，其中酸水解用40 60mmol/L濃度的鹽酸，Sephadex G-25聚糖凝膠柱層析純化， 獲得人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能串聯(lián)表達(dá)和同步酸水解釋放的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物的活性，其特征在于所述的人胰高血糖素樣肽-2 (1-35肽)類似物具有促小腸絨毛生長活性，有望用于治療短腸綜合征、吸收障礙等胃腸道疾病。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開一種融合表達(dá)且可酸水解釋放單體肽的人胰高血糖素樣肽-2(1-35肽)類似物基因串聯(lián)體及其工程菌的構(gòu)建、串聯(lián)體的表達(dá)、目的肽的制備方法。通過同尾酶法構(gòu)建出一系列該類似物基因串聯(lián)體，并將其融合伙伴進(jìn)行改造同時引入His標(biāo)簽，融合蛋白中目的肽的比率由22％提高到90％，目的肽的表達(dá)量提高了2.7倍，通過Ni瓊脂糖凝膠親和層析和Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析獲得的目的肽具有明顯的促小腸絨毛生長活性。該制備方法具有目的肽表達(dá)量高、純化過程簡便、獲取單體肽過程不需使用CNBr或水解酶等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07K14/605GK102190720SQ201010609740
公開日2011年9月21日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者劉景晶, 劉濤, 李泰明 申請人:中國藥科大學(xué)