專利名稱：一種連續(xù)提取番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離領(lǐng)域，涉及一種連續(xù)提取番茄紅素的方法。利用該方法可以 有效地從毛霉菌屬真菌三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)發(fā)酵菌絲體中提取番茄紅素。
背景技術(shù)：
番茄紅素是一種脂溶性天然色素，屬于類胡蘿卜素。番茄紅素具有比其他類胡蘿 卜素更為優(yōu)越的性能，如其抗氧化性在類胡蘿卜素中最強(qiáng)，猝滅單線態(tài)氧能力是VE的100
倍，是β-胡蘿卜素的2倍多，清除自由基的能力也優(yōu)于其他類胡蘿卜素。其具有極強(qiáng)的抗 氧化作用，可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減緩低密度脂蛋白(LDL)的氧化，防治動(dòng)脈硬化，保護(hù)心血 管，清除香煙和汽車廢氣中的有毒物質(zhì)等。番茄紅素的生產(chǎn)方法主要有天然提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵等，而微生物發(fā)酵 法生產(chǎn)番茄紅素具有成本低、污染小、安全及工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)之一。 目前，不少研究人員開(kāi)始研究利用微生物生產(chǎn)番茄紅素，其中研究最多的是利用三孢布拉 霉(Blakeslea trispora)真菌發(fā)酵獲得番茄紅素的方法(CN 1353765A ；CN 1370241A ；US 2005/0106657A1 ；US 3369974 ；GB 1008469)。目前報(bào)道的提取方法絕大多數(shù)為有機(jī)溶劑提 取，溶劑消耗大，提取過(guò)程中番茄紅素受到光照、空氣等影響極易氧化，番茄紅素?fù)p失較大。 專利CN1760282A報(bào)道超臨界CO2萃取番茄紅素，提取率高，無(wú)溶劑殘留，提取時(shí)間短，但因 設(shè)備昂貴，成本高而無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅 素，并且生產(chǎn)成本低、操作方便安全、提取率高的利用三孢布拉霉菌工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素的 方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)下列技術(shù)措施來(lái)達(dá)到一種利用混合溶劑連續(xù)提取番茄紅素的方法，其特征在于包含以下步驟a.三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進(jìn)行脫水處理，過(guò)濾分離菌絲體與乙醇處理 液；對(duì)濕菌絲體通過(guò)真空干燥和粉碎，得到干燥菌絲體；b.經(jīng)步驟a處理的菌絲體，加入混合溶劑進(jìn)行固相_液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng) 的各提取單元中加入經(jīng)步驟a處理的菌絲體，采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時(shí)間使 各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈，收集萃取液；c.步驟(b)中萃取液經(jīng)真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。所述的方法，其中步驟a中乙醇濃度在50% -100%之間，乙醇與三孢布拉霉菌發(fā) 酵菌絲體的體積質(zhì)量比(L/Kg)在1 1-10 1，常溫下處理5-180分鐘。 所述的方法，其中乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用。 所述的方法，其中步驟a中真空干燥溫度在30°C -80°C，真空干燥時(shí)間在1_24小
時(shí)，優(yōu)選4-12小時(shí)。
所述的方法，其中步驟b中固相-液相萃取階段所用的混合提取溶劑以正己烷 為主要溶劑，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑，主要溶劑與輔助溶劑的體積比為 1 1-10 1，優(yōu)選正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷與丙酮的體積比為1 1-5 1，優(yōu)選 2:1-5:1。所述的方法，其中步驟b中連續(xù)提取系統(tǒng)由6-16根層析柱、儲(chǔ)液罐、循環(huán)泵、閥門 和管道組成；每一提取單元由2-5根層析柱串聯(lián)而成，包括配套儲(chǔ)液罐、循環(huán)泵、閥門和管 道；連續(xù)提取系統(tǒng)能避光操作。所述的方法，其中步驟b中每個(gè)單元按濃度梯度排列按以下操作實(shí)現(xiàn)單元1-5分 別加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體，單元5加入新鮮混合提取溶劑提取t ( 一次階段提取時(shí) 間)后排出提取液，單元2-4分別進(jìn)行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、3/4階段提取時(shí)間)的 提取，將單元2和4的溶劑互換，最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個(gè)單元按照?qǐng)D 2過(guò)程一開(kāi)始提取時(shí)所示的濃度梯度排列，即制造好濃度梯度。所述的方法，其中連續(xù)提取系統(tǒng)每一過(guò)程均提取t1/4后對(duì)番茄紅素被提凈的單元 5進(jìn)行排渣裝料，對(duì)不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；經(jīng)過(guò)六個(gè) 操作過(guò)程，所有單元又回到起始濃度狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，如圖2所示。所述的方法，其中連續(xù)提取的方式為逆流提??；提取溫度在于20-60°C，優(yōu) 選30-50°C ；提取溶劑用量在于5-40mL/g菌絲體，優(yōu)選5_20mL/g菌絲體；回流速度為 0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積)，優(yōu)選0. 6-1. 8BV/h ；回流次數(shù)在于3_6次，優(yōu)選2_3次；提取時(shí) 間為2-8h，優(yōu)選于2-4h ；提取單元組數(shù)為3-6組，優(yōu)選5-6組。所述的方法，其中各提取單元中加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體。進(jìn)一步，具體操作過(guò)程如下(1)三孢布拉霉菌發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾處理后，得到濕菌絲體。(2)將步驟(1)中的濕菌絲體進(jìn)行預(yù)處理，其預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)選為a).濕菌絲體與乙醇在常溫下攪拌，過(guò)濾得到脫水菌絲體和乙醇處理液，濕菌絲體 與乙醇質(zhì)量體積比為1 1-1 10之間，優(yōu)選于1 1-1 5之間；b).乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用；脫水濕菌絲體通過(guò)真空干燥和粉 碎，得到干燥菌絲體。(3)經(jīng)步驟(2)的干燥菌絲體，加入混合溶劑進(jìn)行固相_液相萃取，在連續(xù)提取系 統(tǒng)的各提取單元中加入等量經(jīng)步驟(2)處理的菌絲體，采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一 定時(shí)間使各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈，收集萃取液。其提 取條件優(yōu)選于a).各單元濃度梯度排列按以下操作實(shí)現(xiàn)單元5加入新鮮混合提取溶劑提取 t ( 一次階段提取時(shí)間)后排出提取液，單元2-4分別進(jìn)行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時(shí)間的提 取，將單元2和4的溶劑互換，最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個(gè)單元按照?qǐng)D2 過(guò)程一開(kāi)始提取時(shí)所示的濃度梯度排列，即制造好濃度梯度；b).連續(xù)提取過(guò)程按以下操作實(shí)現(xiàn)每一過(guò)程均提取t1/4后對(duì)番茄紅素被提凈的 單元5進(jìn)行排渣裝料，對(duì)不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；經(jīng)過(guò) 六個(gè)操作過(guò)程，所有單元又回到起始濃度狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，如圖2所示；c).混合提取溶劑以正己烷為主要溶劑，丙酮為輔助溶劑，其體積比為1 1-10 1之間，優(yōu)選于2 1-5 1之間；d).連續(xù)提取的方式為逆流提取；e).提取溫度在于20_60°C之間，優(yōu)選于30_50°C之間；f).提取溶劑用量在于5_40mL/g菌絲體之間，優(yōu)選于5_20mL/g菌絲體之間；g) ·回流速度為0. 6-3. 6BV/h的流速之間，優(yōu)選于0. 6-1. 8BV/h之間；h).回流次數(shù)在于2-6次之間，優(yōu)選于2-3次之間；i).提取單元組數(shù)為3-6組，優(yōu)選于5-6組之間；j).提取時(shí)間為2_8h，優(yōu)選于2_4h之間。(4)將步驟(3)中萃取液經(jīng)真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。連續(xù)提取系統(tǒng)主要包括層析柱、儲(chǔ)液罐、循環(huán)泵、控制閥、管道。連續(xù)提取系統(tǒng)中的層析柱是指可裝填菌絲體進(jìn)行萃取的柱狀容器。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明采用混合溶劑提取番茄紅素，充分發(fā)揮各溶劑對(duì)番茄紅素的溶解作用。2、本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于操作的連續(xù)性，且可避光操作，減少了間歇操作對(duì)番茄 紅素不穩(wěn)定的影響。3、本發(fā)明與傳統(tǒng)溶劑提取法比，溶劑消耗少，處理量大，提取時(shí)間短，能耗低，成本 相對(duì)較低，易工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例中的連續(xù)提取系統(tǒng)裝置簡(jiǎn)圖，該系統(tǒng)由5個(gè)提取單元組成，每個(gè)提取 單元包括層析柱、儲(chǔ)液罐、循環(huán)泵、控制閥、管道。圖中1管道，2層析柱，3儲(chǔ)液罐，4控制 閥，5循環(huán)泵，6總管道(連接各單元)。圖2為連續(xù)提取工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。本發(fā)明所述的三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體是采用下列方法制備得到的本發(fā)明采用三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora) (+)(-)為發(fā)酵菌種，經(jīng)搖瓶一級(jí) 種子培養(yǎng)、二級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵罐三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)得到三孢布拉霉菌發(fā)酵液；發(fā)酵完成 后采用板框壓濾法去除發(fā)酵液中過(guò)多的水分，濕菌絲體經(jīng)95%乙醇攪拌處理2h，再經(jīng)板框 壓濾干燥得預(yù)處理菌絲體，酒精處理液經(jīng)精餾塔回收利用。本發(fā)明采用的提取過(guò)程結(jié)合圖1和圖2，提取“過(guò)程一”至“過(guò)程五”各提取單元溶劑遷移路線、進(jìn)料和排 渣、加入新鮮溶劑和提取液導(dǎo)出等操作規(guī)律(系經(jīng)過(guò)多個(gè)過(guò)程后建立的)，“過(guò)程六”及以后 的四個(gè)提取過(guò)程為“過(guò)程一”至“過(guò)程五”的重復(fù)。具體操作包括a.造梯度先分別將單元1和5裝入預(yù)處理后菌絲體，單元5加入新鮮混合提取 溶劑提取一次階段提取時(shí)間t后排出提取液，單元2-4分別進(jìn)行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時(shí) 間的提取，將單元2和4的溶劑互換，最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑，使各個(gè)單元按照?qǐng)D2過(guò)程一開(kāi)始提取時(shí)所示的濃度梯度排列，即制造好圖2所示濃度梯度；b.排渣裝料每一過(guò)程均再提取t1/4后對(duì)番茄紅素被提凈的單元5進(jìn)行排渣，裝 料；c.飽和溶劑遷移將單元1的飽和溶劑轉(zhuǎn)移入儲(chǔ)液罐中，本過(guò)程只涉及溶劑已飽 和的單元(即被提凈單元5的下一單元)；d.不飽和溶劑遷移①3— 1;②5 — 3;③2 — 5;④4 — 2，本過(guò)程涉及4個(gè)單 元，其遷移遵循規(guī)律即按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；e.填充溶劑對(duì)單元4填入新鮮混合提取溶劑；f.經(jīng)過(guò)六個(gè)操作過(guò)程，所有單元又回到起始濃度狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。實(shí)施例1將三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)原菌株單菌落自斜面接種到500mL搖瓶 中進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)，裝液量10%，培養(yǎng)溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)30h。將一級(jí)搖瓶 種子液接種至2. 5L搖瓶中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度維持在30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng) 30h。種子培養(yǎng)完畢將其接種到50L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝料系數(shù)60 %，裝料量30L，培 養(yǎng)溫度維持在30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量0. 2-0. 5L/min,培養(yǎng)120h。發(fā)酵完成后得28L發(fā)酵液，采用離心法去除發(fā)酵液中過(guò)多的水分，得到3kg濕菌 絲體，然后加入3L 95%乙醇混合攪拌2h，再經(jīng)板框壓濾得到0. 8kg菌絲體，濕菌絲體通過(guò) 真空干燥(真空干燥溫度在30°C -80°C之間，真空干燥時(shí)間優(yōu)選4-12小時(shí))和粉碎，得到 預(yù)處理后的干燥菌絲體，乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用；預(yù)處理菌絲體用正己烷 /丙酮混合溶劑(體積比為1 1-10 1，優(yōu)選3 1)采用連續(xù)提取系統(tǒng)進(jìn)行逆流提取 (提取過(guò)程如前所述)，提取條件為提取溫度30°C，提取溶劑用量10mL/g菌絲體，回流速 度1. 2BV/h,回流2-3次，提取時(shí)間2-4h，提取單元組數(shù)5組；提取液經(jīng)真空濃縮得到番茄紅 素濃縮液。實(shí)施例2取實(shí)施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體10g，置500mL圓底燒瓶中，加入400mL正己 烷/丙酮混合提取溶劑，40°C攪拌提取lh，提取三次，該操作條件下番茄紅素的提取率達(dá) 81. 42%o取實(shí)施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體50g裝入層析柱中，加500mL正己烷/丙酮混 合溶劑，30°C下以1. 2BV/h的流速逆流循環(huán)提取1. 5h，回流三次，該操作條件下番茄紅素的 提取率達(dá)88%。實(shí)施例3取實(shí)施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體250g，等量加入如圖1所示的具有5個(gè)提取單 元的連續(xù)提取系統(tǒng)的各層析柱中，單元5加入新鮮溶劑一次階段提取1. 5h后排出提取液， 單元2-4分別進(jìn)行22. 5min、45min、67. 5min的一次階段提取，將單元2和4的溶劑互換，最 后在單元5加入新鮮溶劑，使各個(gè)單元按照?qǐng)D2所示的濃度梯度排列；繼續(xù)提取22. 5min后 對(duì)已被提凈的單元5進(jìn)行排渣裝料，將單元1的飽和溶劑轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液罐中；對(duì)不飽和溶劑按 番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元；遷移完后對(duì)單元4填入新鮮溶劑。各單元提 取條件為溫度30°C，提取單元組5組，每組10mL/g菌絲體的溶劑，以1. 2BV/h的流速逆流 循環(huán)提取1. 5h。其他同實(shí)施例1，該操作條件下番茄紅素的提取率可達(dá)94. 76%。
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各種工藝的提取結(jié)果見(jiàn)表1 表1提取工藝比較
攪拌提取 81.423 120 40
單柱提取 884.5 60 30
連續(xù)逆流提取 94.761.875 20 30 連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流提取的番茄紅素提取率最高，分別比攪拌法和單柱法高了 13. 34% 和6. 76%，提取時(shí)間比單柱法縮短了三分之一，溶劑用量?jī)H為攪拌法的1/6，提取溫度近乎 常溫，顯示出了連續(xù)逆流提取的優(yōu)越性。
權(quán)利要求
1.一種利用混合溶劑連續(xù)提取番茄紅素的方法，其特征在于包含以下步驟a.三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進(jìn)行脫水處理，過(guò)濾分離菌絲體與乙醇處理液； 對(duì)濕菌絲體通過(guò)真空干燥和粉碎，得到干燥菌絲體；b.經(jīng)步驟a處理的菌絲體，加入混合溶劑進(jìn)行固相-液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng)的各 提取單元中加入經(jīng)步驟a處理的菌絲體，采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時(shí)間使各單 元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈，收集萃取液；c.步驟(b)中萃取液經(jīng)真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中乙醇濃度在50%-100%之間，乙 醇與三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體的體積質(zhì)量比在1 1-10 1，常溫下處理5-180分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中真空干燥溫度在30°C-80°C，真空 干燥時(shí)間在1-24小時(shí)，優(yōu)選4-12小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中固相-液相萃取階段所用的混 合提取溶劑以正己烷為主要溶劑，以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑，主要溶劑與輔 助溶劑的體積比為1 1-10 1，優(yōu)選正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷與丙酮的體積比為 1:1-5: 1，優(yōu)選 2 1-5 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中連續(xù)提取系統(tǒng)由6-16根層析柱、 儲(chǔ)液罐、循環(huán)泵、閥門和管道組成；每一提取單元由2-5根層析柱串聯(lián)而成，包括配套儲(chǔ)液 罐、循環(huán)泵、閥門和管道；連續(xù)提取系統(tǒng)能避光操作。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中每個(gè)單元按濃度梯度排列按以下 操作實(shí)現(xiàn)單元1-5分別加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體，單元5加入新鮮混合提取溶劑提 取t(一次階段提取時(shí)間)后排出提取液，單元2-4分別進(jìn)行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、 3/4階段提取時(shí)間)的提取，將單元2和4的溶劑互換，最后在單元5加入新鮮混合提取溶 劑，使各個(gè)單元按照?qǐng)D2過(guò)程一開(kāi)始提取時(shí)所示的濃度梯度排列，即制造好濃度梯度。
8.根據(jù)權(quán)利7所述的方法，其特征在于連續(xù)提取系統(tǒng)每一過(guò)程均提取t1/4后對(duì)番茄紅 素被提凈的單元5進(jìn)行排渣裝料，對(duì)不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一 單元；經(jīng)過(guò)六個(gè)操作過(guò)程，所有單元又回到起始濃度狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，如圖2所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于連續(xù)提取的方式為逆流提??；提取溫度在 于20-60°C，優(yōu)選30-50°C ；提取溶劑用量在于5_40mL/g菌絲體，優(yōu)選5_20mL/g菌絲體；回 流速度為0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積)，優(yōu)選0. 6-1. 8BV/h ；回流次數(shù)在于3-6次，優(yōu)選2-3 次；提取時(shí)間為2-他，優(yōu)選于2-4h ；提取單元組數(shù)為3-6組，優(yōu)選5-6組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于各提取單元中加入等量經(jīng)步驟a處理的菌 絲體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分離領(lǐng)域，公開(kāi)了一種連續(xù)提取番茄紅素的方法。該方法將三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進(jìn)行脫水處理，過(guò)濾分離菌絲體與乙醇處理液；對(duì)濕菌絲體通過(guò)真空干燥和粉碎，得到干燥菌絲體；將所得干燥菌絲體加入混合溶劑進(jìn)行固相-液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng)的各提取單元中加入菌絲體，采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時(shí)間使各單元按濃度梯度排列，再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈，收集萃取液；萃取液經(jīng)真空濃縮，得到番茄紅素濃縮液。該方法采用混合溶劑提取番茄紅素，充分發(fā)揮各溶劑對(duì)番茄紅素的溶解作用，操作具有連續(xù)性且可避光操作，溶劑消耗少，處理量大，提取時(shí)間短，能耗低，成本相對(duì)較低，易工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07C7/10GK102140052SQ20101061557
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者萬(wàn)紅貴, 盧定強(qiáng), 吳啟賜 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)