專利名稱：一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)藥物及其基因工程制備方法。
背景技術(shù)：
對于腫瘤治療最重要的是首先要能相對準(zhǔn)確區(qū)分開腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，高效特異性殺死腫瘤細(xì)胞，而這種準(zhǔn)確區(qū)分的能力也是癌癥治療研究的熱點之一，也就是所謂的靶向殺傷腫瘤的策略。靶向殺傷腫瘤的策略是基于腫瘤細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志物或過表達(dá)的特異受體作為靶向，使細(xì)胞毒性藥物在靶向物質(zhì)的引導(dǎo)下，相對集中于腫瘤細(xì)胞周圍并將其殺死，而對于正常細(xì)胞卻無損害。利用細(xì)胞因子與受體的特異性結(jié)合的能力，根據(jù)某些細(xì)胞因子受體在腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)，而正常細(xì)胞基本沒有的這一事實，利用細(xì)胞因子攜帶細(xì)胞毒素特異殺傷腫瘤細(xì)胞就是其中的一種靶向殺傷策略。利用細(xì)胞因子作為導(dǎo)向藥物的研究已經(jīng)有很多，表皮生長因子受體在磷狀上皮癌發(fā)生時表達(dá)異常增多，如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等；轉(zhuǎn)化生長因子受體的導(dǎo)向意義與表皮生長因子受體基本相同；神經(jīng)分化因子受體為酪氨酸激酶家族，許多癌細(xì)胞都有高含量表達(dá)；粒細(xì)胞集落刺激因子受體在白血病細(xì)胞、口腔癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞等都有較高表達(dá)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體在骨肉瘤細(xì)胞、腺癌細(xì)胞上有高含量分布；IL-2R在T細(xì)胞白血病和淋巴瘤細(xì)胞中有較高分布； IL-4R在淋巴瘤細(xì)胞中、IL-6R在急性髓樣白血病細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等有較高分布；IL-9R在Hodg kin氏瘤細(xì)胞、IL-13R在腎細(xì)胞瘤和細(xì)胞膠質(zhì)瘤等有較高表達(dá)。這些細(xì)胞因子已有與綠膿桿菌外毒素(PEJseudomonas exotoxin)制備過重組毒素研究報道。利用腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志分子，利用抗體與腫瘤細(xì)胞抗原結(jié)合特性，利用抗體作為導(dǎo)向部分?jǐn)y帶毒素分子，可明顯提高靶向選擇性有效殺傷靶細(xì)胞，如單抗放射性碘治療原發(fā)性肝癌藥物-美妥昔單抗注射液導(dǎo)向性能良好。激素分子如LRH、α-促黑素等與PE結(jié)合，都能很好地起到導(dǎo)向作用；重組毒素是靶向治療癌癥較好的策略之一。PE毒素是結(jié)構(gòu)與其分子作用機(jī)理已研究的非常清楚，也是目前使用最多的一種細(xì)胞毒素，其作用于真核核糖體上的蛋白合成因子EF2，使其糖基化，使蛋白合成終止而死亡； PE毒素分子被修飾和改造出現(xiàn)了幾種衍生物，主要是缺失細(xì)胞膜親和區(qū)，使其失去細(xì)胞結(jié)合能力，同時使用KDEL序列替換REDLK，增加其核糖體親和性，其細(xì)胞毒性增加3倍以上，目前最常用結(jié)構(gòu)有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于減少其分子量、增加細(xì)胞毒性、增加分子穿透力和降低體內(nèi)免疫學(xué)反應(yīng)的副作用。我們利用hIL6作為導(dǎo)向載體，主要根據(jù)某些腫瘤細(xì)胞過表達(dá)IL6R這一事實，而血液細(xì)胞和組織細(xì)胞表面帶有IL6R數(shù)量的非常少，即使有表達(dá)量也非常低這一事實，利用 hIL6攜帶毒素PE38KDEL與細(xì)胞表面的IL6R特異性結(jié)合，在受體的介導(dǎo)下使重組毒素相對集中在腫瘤細(xì)胞膜上，形成復(fù)合物，經(jīng)重組毒素分子內(nèi)化段誘導(dǎo)的內(nèi)化作用，使PE38KDEL 分子進(jìn)入結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)furin酶的作用下切下一個37kDa的PE分子， 這個分子特異地與核糖體上的蛋白合成因子EF2結(jié)合，使蛋白合成終止，細(xì)胞因缺乏酶的合成而死亡。幾個種類的腫瘤細(xì)胞表面IL6R呈現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象，在骨髓瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、急
3性髓樣白血病細(xì)胞和前列腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等均高于正常細(xì)胞10倍以上，即腫瘤細(xì)胞上相應(yīng)受體數(shù)均在3000 4000個以上，骨髓瘤細(xì)胞U266上最多含20000 (如U266)個/細(xì)胞左右。重組毒素殺死腫瘤細(xì)胞需要一定的分子數(shù)，主要取決于細(xì)胞膜受體數(shù)和內(nèi)化效率，由于IL6R受體在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)與正常細(xì)胞上至少相差10倍以上，有的甚至達(dá)千倍以上，這使腫瘤細(xì)胞上聚集的重組毒素比正常細(xì)胞多得多，而對正常細(xì)胞的毒副作用減到最低，甚至不呈現(xiàn)毒副作用。據(jù)實驗分析證明，保證殺死一個瘤細(xì)胞其周圍需要400 1000個左右的毒素分子。正常細(xì)胞上IL6R的受體數(shù)都少于200個，同時重組毒素分子內(nèi)化的效率一般在15%左右，毒素分子對正常細(xì)胞發(fā)揮不了明顯的毒性作用。雖然美國Ira Pastan領(lǐng)導(dǎo)的課題小組率先構(gòu)建了 IL6PE40，緊接著國內(nèi)朱平、柳增善小組構(gòu)建了 IL6Q3)PE40，溪永志小組構(gòu)建了 IL6(23)PE40KDEL ；但I(xiàn)ra Pastan和奚永志小組在大腸桿菌均以包涵體表達(dá)，該蛋白復(fù)性率低，復(fù)性后活性略低于可溶性表達(dá)產(chǎn)物； 朱平、柳增善小組構(gòu)雖然實現(xiàn)了可溶性活性表達(dá)，但表達(dá)量只有5%左右，成為了該毒素大量制備的瓶頸。國內(nèi)PE重組毒素對腫瘤治療研究進(jìn)行最為深入的為朱平領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，其 LHRH-PE40已進(jìn)入II期臨床試驗。美國是重組毒素原始創(chuàng)新地，其多種PE類重組毒素已進(jìn)行臨床試驗；其中IL2-PE40是第一個上市以細(xì)胞因子為導(dǎo)向的重組毒素(Ontak)。由于重組毒素研究的發(fā)展，國內(nèi)外已經(jīng)有十幾個相關(guān)專利出現(xiàn)，這些上市的、臨床研究的和專利也佐證該類重組毒素在腫瘤治療上具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)及其制備方法，以解決蛋白復(fù)性率低、復(fù)性后活性低、表達(dá)量低的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括截短的細(xì)胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，作為導(dǎo)向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6 氨基端1- 個氨基酸。本發(fā)明的一種實施方式是做為導(dǎo)向載體的hIL6是截去氨基端23個氨基酸的衍生體。本發(fā)明的一種實施方式是做為導(dǎo)向載體的hIL6與PE38KDEL連接的接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE。本發(fā)明靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)的制備方法是以該重組蛋白一級氨基酸序列為模板，利用DNA編碼技術(shù)，重新編碼合成該重組蛋白的DNA序列，再通過基因工程表達(dá)制備該重組蛋白。本發(fā)明的一種制備方法實施方式是利用大腸桿菌偏愛密碼子，反向編碼 hIL6 (T23) -PE38KDEL 蛋白，使用 pED8 (a)、pET22 (b)載體，在宿主菌 Rosstabule 中表達(dá)出
高活性重組毒素。本發(fā)明的一種制備方法實施方式是利用畢赤酵母偏愛密碼子，反向編碼 hIL6(T23)-PE38KDEL蛋白，利用pPICZa、pGAP Za、pPIC9載體，使用宿主菌畢赤酵母中 GS115、SMD1168，在BMMY培養(yǎng)基中，甲醇誘導(dǎo)，分泌表達(dá)出高活性重組毒素。本發(fā)明靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)在制備抗腫瘤蛋白藥物中的應(yīng)用。
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本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，將作為導(dǎo)向部分的hIL6的通過連接橋與修飾的 PE38KDEL毒性的相偶聯(lián)，形成一新的非天然功能蛋白質(zhì)，使導(dǎo)向分子(hIL6)和毒素分子 (PE)各自保持原有的功能，且截斷的IL6減少了空間位阻，提高了親和性；再根據(jù)表達(dá)宿主密碼子的偏愛性，優(yōu)化該蛋白基因所使用的密碼子，通過人工合成該基因，在大腸桿菌和酵母中實現(xiàn)其高效、可溶性活性表達(dá)，克服了原天然基因在大腸桿菌中低表達(dá)或包涵體表達(dá)； 在酵母中極低量分泌表達(dá)的的制備瓶頸，為該重組毒素的制備開辟了一條途徑。重組靶向毒素特征是從氨基端最多可截短1- 個氨基端的hIL6，在其羧基端通過AEE三個氨基酸連接到PE38KDEL細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的氨基端。為了減少重組部分的空間位阻，減小蛋白的分子量，增加其穿透能力，增加其細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明優(yōu)選方案是hIL6的氨基端截斷23個氨基酸，其中所說的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)是PE38KDEL，連接部分的氨基酸是AEE，兩種連接均有良好的生物活性。根據(jù)本發(fā)明的目的，重組靶向蛋白質(zhì)hIL6 (T23) -PE38KDEL的基因除利用原始基因片段的連接；還包括為了高效表達(dá)，根據(jù)表達(dá)宿主優(yōu)化后合成或突變的基因，及根據(jù)表達(dá)載體多克隆位點，在5’端和3’而增加酶切位點而形成的基因結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)點是通過基因改造和密碼子優(yōu)化構(gòu)建了靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì) hIL6 (T23) -PE38KDEL，使得兩個配體間空位阻就減小，活性提高；在大腸桿菌實現(xiàn)了高效可溶表達(dá)，使用LB培養(yǎng)基，IOOuM IPTG、J8°C誘導(dǎo)5小時，表達(dá)量達(dá)20%左右。在酵母中實現(xiàn)了活性分泌表達(dá)，使用pPICh表達(dá)載體的重組酵母，使用BMMY培養(yǎng)基、0. 5%甲醇，30°C 誘導(dǎo)72小時，表達(dá)量達(dá)30%左右；使用pGAPh表達(dá)載體的重組酵母，使用YPD培養(yǎng)基30°C 誘導(dǎo)72小時，表達(dá)量達(dá)14%左右。純化后的hIL6(T2;3)-PE38KDE具有高效的選擇性殺傷活性，對IL6R受體過表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有高效殺傷活性，例如多發(fā)性骨髓瘤U266、SP2/0 ；對 IL6R受體陰性細(xì)胞無殺傷活性，如HBL-100 J93T。hIL6 (T23)-PE38KDEL對U266的選擇殺傷活性約是hIL6PE40活性的2倍，hIL6 (D24) PE40KDEL的1. 3倍。通過基因改造和密碼子優(yōu)化，使得該重組毒素對IL6R過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性提高，并且突破了天然基因低表達(dá)量的瓶頸，使得大規(guī)模制備該重組毒素成為可能。


圖1是本發(fā)明重組靶向蛋白質(zhì)hIL6(T23)-PE38KDEL —級氨基酸組成結(jié)構(gòu)示意圖， 接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE ；圖2是本發(fā)明重組靶向蛋白質(zhì)hIL6(T23)-PE38KDEL體外對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性圖。圖3是三種重組靶向蛋白質(zhì)體外殺傷U266腫瘤細(xì)胞的ID50圖，1 :hIL6PE40，2 hIL6(D24)-PE40KDEL, 3 :hIL6(T23)-PE38KDEL ；圖4是pET28a_IL6 (T23) PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖5是pET22b-IL6 (T23) PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖6是pGAPh-IL6 (T23) PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖7是pPICZa-IL6 (T23) PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的重組靶向蛋白質(zhì)hIL6(T23)_PE38KDEL兩種主結(jié)構(gòu)的一級氨基酸序列。l.hIL6 (T23)-PE38KDEL的基本氨基酸長度及其分子量510，MW = 56094hIL6 (T23)通過AEE三個氨基酸連接PE38KDEL，其氨基酸序列是SEQ No. 1。2.hIL6 (T23)-PE38KDEL的基本氨基酸長度及其分子量511，MW = 56239hIL6 (T23)通過AEE三個氨基酸連接PE38KDEL，其氨基酸序列是SEQ No. 2。實施例1 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 3，利用pET28a上多克隆位點Nco I 和Biol I在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)下列結(jié)構(gòu)的重組靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL，重組表達(dá)載體構(gòu)建見圖4。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosstabule宿主菌中，使用LB培養(yǎng)基，IOOuM IPTG，
誘導(dǎo)5小時，表達(dá)量占上清蛋白的14%-20%左右。經(jīng)分子量30，OOOMW超濾截留、IOmM PBS (pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 1。使用U266細(xì)胞和細(xì)胞檢測細(xì)胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細(xì)胞未見殺傷活性。實施例2 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 3，利用pET22b在大腸桿菌中在周質(zhì)空間中分泌表達(dá)下列結(jié)構(gòu)的重組靶向毒素hIL6 (T23) -PE38KDEL，重組表達(dá)載體構(gòu)建見圖 5。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosstabule宿主菌中，使用LB培養(yǎng)基，IOOuM IPTGJ8°C誘導(dǎo)5小時，利用滲透休克法提取周質(zhì)蛋白，表達(dá)量占上清蛋白的20% -25%左右。經(jīng)分子量30，000MW超濾截留、IOmM PBS(pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 1。使用U266細(xì)胞和細(xì)胞檢測細(xì)胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細(xì)胞未見殺傷活性。實施例3 人工合成下列基因，將最優(yōu)化重組毒素基因，其核苷酸序列是SEQ No. 4，插入到達(dá)載體EcoRI與Kpn I之間，重組表達(dá)載體的構(gòu)建見圖6。在畢赤酵母中SMD1168中分泌表達(dá)下列結(jié)構(gòu)的重組靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL，使用YPD培養(yǎng)基 30°C誘導(dǎo)72小時，表達(dá)量占培養(yǎng)基上清蛋白的16%左右。經(jīng)分子量30，000MW超濾截留、 IOmM PBS (pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 2。使用U266細(xì)胞和細(xì)胞檢測細(xì)胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細(xì)胞未見殺傷活性。實施例4 人工合成下列基因，其核苷酸序列是SEQ No. 4，插入到pPICh表達(dá)載體EcoRI與 Xho I之間，重組表達(dá)載體的構(gòu)建見圖7。在畢赤酵母中GS115中分泌表達(dá)下列結(jié)構(gòu)的重組靶向毒素hIL6 (T23)-PE38KDEL，使用BMMY培養(yǎng)基，0. 5%甲醇30°C誘導(dǎo)72小時，表達(dá)量占培養(yǎng)基上清蛋白的左右。經(jīng)分子量30，000MW超濾截留、IOmMPBS(pH7. 4)透析，氨基酸序列是SEQ No. 2。使用U266細(xì)胞和細(xì)胞檢測細(xì)胞殺傷活性，對U266具有明顯殺傷活性，293Τ 細(xì)胞未見殺傷活性。實驗例1 重組靶向蛋白質(zhì)hIL6 (T23) -PE38KDEL體外對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性研究U266, SP2/0是IL6R過表達(dá)腫瘤細(xì)胞，HBL-100.293T是IL6R陰性細(xì)胞。利用似66、SP2/0、HBL-100和細(xì)胞，使用[3H]亮氨酸滲入法測定 hIL6 (T22) -PE38KDEL蛋白質(zhì)抑制活性。細(xì)胞培養(yǎng)后使用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌3次，鋪96 孔板，每孔IX IO6個細(xì)胞、200 μ L 10%血清的1640培養(yǎng)液，加不同濃度的過濾除菌的各種重組毒素溶液。重組毒素溶于含有0. 2%人血清的IOmM PBS ρΗ 7. 4中，按10ng/mL、20ng/
mL、30ng/mL........加入細(xì)胞孔中，與細(xì)胞一同37°C培養(yǎng)30h后，[3H]亮氨酸滲入法測
定蛋白質(zhì)抑制活性。HBL-100細(xì)胞和細(xì)胞ID5tl沒有變化，U266細(xì)胞ID5tl為30ng/mL， SP2/0 細(xì)胞的 ID5tl 為 40ng/mL。實驗例2 三種重組靶向蛋白質(zhì)體外殺傷U266腫瘤細(xì)胞的ID50。細(xì)胞培養(yǎng)后使用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌3次，鋪96孔板，每孔1 X 106個U266細(xì)胞、200 μ L 10%血清的1640培養(yǎng)液，加不同濃度的過濾除菌的各種重組毒素溶液。重組毒素(① hIL6PE40 ；② hIL6 (D24) -PE40KDEL ；③ hIL6 (T23) -PE38KDEL)分別溶于含有 0. 2 % 人血清的 IOmM PBS ρΗ 7. 4 中，按 aig/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/
mL........ 200ng/mL加入細(xì)胞孔中，與細(xì)胞一同37°C培養(yǎng)30h后，[3H]亮氨酸滲入法測定
蛋白質(zhì)抑制活性。hIL6PE40 的 ID50 為 80ng/mL, hIL6 (D24) -PE40KDEL 的 ID50 為 40ng/mL, hIL6 (T23)-PE38KDEL 的 ID5tl 為 30ng/mL。從圖3結(jié)果可看到hIL6 (T23) -PE38KDEL有效作用濃度(ID5tl)明顯高于hIL6PE40 和hIL6 (D24) -PE40KDEL兩個重組蛋白分子。
權(quán)利要求
1.一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)，包括截短的細(xì)胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，其特征在于作為導(dǎo)向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6氨基端1- 個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)，其特征在于做為導(dǎo)向載體的 hIL6是截去氨基端23個氨基酸的衍生體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)，其特征在于做為導(dǎo)向載體的 hIL6與PE38KDEL連接的接頭氨基酸序列從氨基端到羧基端為AEE。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征是以該重組蛋白一級氨基酸序列為模板，利用DNA編碼技術(shù)，重新編碼合成該重組蛋白的DNA序列， 再通過基因工程表達(dá)制備該重組蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征是利用大腸桿菌偏愛密碼子，反向編碼hIL6 (T23) -PE38KDEL蛋白，使用pED8 (a)、pET22 (b)載體，在宿主菌Rosstabule中表達(dá)出高活性重組毒素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)的制備方法，其特征是利用畢赤酵母偏愛密碼子，反向編碼hIL6(T2;3)-PE38KDEL蛋白，利用pPIC^upGAP Za,pPIC9載體，使用宿主菌畢赤酵母中GS115、SMD1168，在BMMY培養(yǎng)基中，甲醇誘導(dǎo)，分泌表達(dá)出高活性重組
7.如權(quán)利要求1或2或3所述的靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)在制備抗腫瘤蛋白藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)及其制備方法，屬于靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)藥物。包括截短的細(xì)胞因子hIL6通過接頭連接到綠膿桿菌外毒素A衍生體PE38KDEL上，作為導(dǎo)向載體的hIL6的氨基酸突變衍生體，包括截去hIL6氨基端1-28個氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及該重組靶向蛋白在抗腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點是通過基因改造和密碼子優(yōu)化構(gòu)建了靶向抗腫瘤重組蛋白質(zhì)hIL6(T23)-PE38KDEL，使得兩個配體間空位阻就減小，活性提高；在大腸桿菌實現(xiàn)了高效可溶表達(dá)，突破了天然基因低表達(dá)量的瓶頸，使得大規(guī)模制備該重組毒素成為可能。
文檔編號C07K19/00GK102153655SQ201010620599
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者任洪林, 盧士英, 周玉, 李巖松, 柳增善, 郭德軍 申請人:吉林大學(xué)