專利名稱：用帶負(fù)電的聚合物沉淀生物分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離生物分子的方法。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及通過聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物形成和沉淀分離具有商業(yè)利益的抗體和其它蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
來自諸如牛奶和血漿的各種澄清進(jìn)料的蛋白質(zhì)的加工通常以超大規(guī)模進(jìn)行。生物醫(yī)藥生產(chǎn)者現(xiàn)在通常討論以IOOKg規(guī)模生產(chǎn)諸如單克隆抗體(mAbs)的生物醫(yī)藥。這意味著即使在高mAb滴度(10g/L)下，可能也需要處理10000升的發(fā)酵量。具有改進(jìn)的容量和高流動能力的色譜介質(zhì)可適合使用現(xiàn)有的直徑為1.5-2米的大柱來處理所述裝載量。然而， 所述柱特別是在它們被污染物弄臟的情況下可能難以工作，且經(jīng)所述柱處理大量物質(zhì)所耗的時間還將帶來調(diào)度(scheduling)和其它挑戰(zhàn)。另外，所述方法將不能處理與未來生物醫(yī)藥生產(chǎn)或加工蛋白質(zhì)為食品添加劑、工業(yè)催化劑等相關(guān)的可能甚至更大的量。因此，完全理解在色譜或相關(guān)下游操作之前應(yīng)該引入迅速、成本有效的減少處理量(和污染物)的操作。 這在處理來自細(xì)菌或諸如血液、重組牛奶或重組植物的其它復(fù)雜進(jìn)料物流來源的進(jìn)料時尤其如此。正在調(diào)查研究各種新的成本有效的初級回收方法。所述方法可以單獨使用或在發(fā)酵之后引入以增強(qiáng)現(xiàn)有的靶純化工藝。理想的是，所用方法將容易地對接現(xiàn)有工藝(過濾、 抗病毒和色譜)而不引起工藝物流的過度稀釋或污染。所關(guān)注的方法包括結(jié)合沉淀或過濾使用的水性聚合物相分配和(靶或污染物)絮凝(參見下文提到的參考文獻(xiàn))。由用親和或帶電的配體改性的聚合物誘發(fā)的靶蛋白絮凝(在本文中可與沉淀互換使用)因為其在概念上類似于通常用以純化蛋白質(zhì)的色譜方法而具有吸引力。另外，用帶電配體改性的聚合物比用親和配體改性的聚合物價格低廉。其他人在使澄清進(jìn)料沉淀方面的近期工作包括使用鈣和磷酸鹽誘發(fā)的絮凝(例如US20070066806 Al)或通過包括聚(乙二醇)的不帶電的聚合物(例如W02008100578 A2)或諸如聚乙烯基磺酸的帶負(fù)電的聚合物(見下文)幫助的所述絮凝。一些工作還組合了污染物絮凝與過濾(例如US20080193981 Al、W02008079302 A2)。在一些情況下，絮凝能夠?qū)崿F(xiàn)選擇度(參見US20080193981 Al，還有2008年3月2日的Judy Glynn,BioPharm International)。Genentech的專利申請(US20080193981 Al)使用聚乙烯基磺酸和聚丙烯酸(PAA) 來絮凝。以較低導(dǎo)電率(小于6mS/cm)和相當(dāng)?shù)偷目贵w濃度的狀況工作的體系似乎面臨再溶解所得復(fù)合物(即稀釋進(jìn)料物流)的挑戰(zhàn)，且在良好(> 95% )DNA減少并保持靶蛋白單體到集料比的情況下僅實現(xiàn)了約60 %的HCP減少、< 90 %的靶mAb回收率。在本工作中，值得注意的是a.(參考W128]和

圖10)“在pH 7和1. 5mS/cm下，直到PAA具有大于35，000 的麗才實現(xiàn)了完全沉淀”和b.(參考W129]和圖33) “在pH7和laiiS/cm下(用聚苯乙烯磺酸，PSS)，直到使用具有大于220，000 (220kDa)的MW的PSS才實現(xiàn)了完全沉淀”。以上作者還調(diào)查研究了與帶凈負(fù)電的靶蛋白相互作用的一些帶正電的聚合物。其它小組設(shè)法使常帶凈負(fù)電(酸性)的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)與重組蛋白質(zhì)進(jìn)料中的其它污染物復(fù)合并使用過濾來從靶蛋白中分離所述復(fù)合的污染物(例如，Judy. Glynn, Biopharm International，2008 年 3 月 2 日；A· Venkiteshwaran, P. Heider，L Teysseyre, G. Belfort, Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membrane microfiltration(使用控制污染的錯流膜微量過濾從牛血清選擇性沉淀輔助回收免疫球蛋白)，Biotechnology and Bioengineering, 2008 年 5 月 6 日在 Wiley InterScience (www. interscience. wiley. com). DOI 10. 1002/bit.21964中在線發(fā)表)。然而，所述方法沒有提供在工藝早期可為極其重要的靶濃縮(處理量減少)。如果考慮其中富含靶蛋白的溶液通過聚合物滴定旨在形成不溶性蛋白質(zhì)聚合物復(fù)合物的情形，則與上述研究相關(guān)的一些限制會更加透徹，所述復(fù)合物依賴于具有與多于一種蛋白質(zhì)相互作用的多于一種聚合物以便形成互連的復(fù)合物。隨著聚合物濃度相對于靶蛋白濃度增加，預(yù)期有靶最初過量(且可溶解)的情形，其轉(zhuǎn)向靶和聚合物處于類似濃度或相反處于可形成復(fù)合物的比率的情形，和最后聚合物過量使復(fù)合物解離的情形。在大多數(shù)情況下，如上述Genentech申請中所示，可能需要低離子強(qiáng)度來促進(jìn)強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)-聚合物相互作用。天然聚合物MW(正如蛋白質(zhì)MW—樣)在復(fù)合物形成中將起復(fù)雜的作用，因為較大尺寸的聚合物在空間意義上可促進(jìn)復(fù)合物形成，但因降低聚合物摩爾濃度和擴(kuò)散速率而對抗復(fù)合物形成。關(guān)于以上論沭，需要提到六點。第一，復(fù)合物形成和相關(guān)現(xiàn)象(凝聚相形成、沉淀物形成)為復(fù)雜的動態(tài)過程，其包括聚合物、蛋白質(zhì)、鹽和水在富含復(fù)合物(蛋白質(zhì)-聚合物和相關(guān)水)的液態(tài)區(qū)和富含未復(fù)合組分的液態(tài)區(qū)之間分配。因而，包括蛋白質(zhì)相對溶解度 (疏水性)和鹽相關(guān)霍夫邁斯特(Hoffmeister)系列效應(yīng)(參見L. A. Moreira,M. Bostrom, B. W Ninham, E.C. Biscaia, F. W. Tavares, Hoffmeister effects :ffhy protein charge, pH titration and protein precipitation depend on the choices of background salt solution, Colloids and Surfaces A(霍夫邁斯特效應(yīng)蛋白質(zhì)電荷、pH滴定和蛋白質(zhì)沉淀為何依賴于本底鹽溶液、膠體和表面A的選擇)，觀2-觀3，(2006)457-563)以及分配效應(yīng)(參見 H.-0. Johansson, G. Karlstrom, F. Tjerneld, C. A. Haynes, Driving forces for phase separation and partitioning in aqueous two-phase systems ( MT-^Z-KftMffi 體系中的相分離和分配的驅(qū)動力).J. Chromatography B, 711 (1998) 3-17)的熵因素可起重要作用。第二，需要低導(dǎo)電率來產(chǎn)牛靶捕獲(即復(fù)合物形成)的操作意味著無用地稀釋工藝進(jìn)料物流，這在較大規(guī)模操作中在經(jīng)濟(jì)方面可能不可行。第三，需要PH和低蛋白質(zhì)濃度的特定條件來實現(xiàn)靶釋放(即，復(fù)合物離解)的操作還可以導(dǎo)致需要調(diào)節(jié)PH和稀釋工藝物流。MM^在再溶解時，特定靶釋放條件和靶濃度可能限制可與其成本有效地聯(lián)合的其它下游分離方法。第i用較高M(jìn)W的聚合物最佳工作的操作更難以整合到工藝中，這是由于與溶液粘度增加、可溶性污染聚合物去除和高M(jìn)W的聚合物更容易非特異性地弄臟色譜、過濾器、泵及其它工藝物流表面相關(guān)的挑戰(zhàn)。第六，如果以復(fù)合物形式儲存超過數(shù)小時的仵何顯著時間，必須謹(jǐn)慎了解在與靶蛋白的改變(或保護(hù)其以免改變)相關(guān)的特殊因素下形成的復(fù)合物的性質(zhì)，和在加工期間蛋白質(zhì)以復(fù)合物形式儲存任何時間之后靶蛋白釋放的容易性。因此，仍然需要分離抗體及其它生物分子使其達(dá)到高純度水平的方法，所述方法節(jié)省時間和成本，同時規(guī)模可以調(diào)整且有效。關(guān)于復(fù)合物形成、絮凝、沉淀或相關(guān)方法，可以列出與這些基本未滿足的要求相關(guān)的一些所要特征。所述方法將用具有比較高的鹽濃度 (例如150mM NaCl)、中性pH和與許多上游蛋白質(zhì)進(jìn)料相關(guān)的高蛋白質(zhì)濃度的溶液來工作。 其還將用諸如澄清發(fā)酵進(jìn)料的多種不同溶液來工作。其將提供良好的靶選擇性和處理量減少，使得其可在上游使用。這包括消除諸如(常帶負(fù)電的)病毒、細(xì)菌、細(xì)胞碎片、毒素和核酸污染物的污染物。所述方法將以允許良好捕獲并簡便釋放的方式以顯著回收率結(jié)合諸如抗體或抗體片段的靶。釋放將不需要過度稀釋或改變PH且將使靶處于允許與多種其它分離方法、特別是本發(fā)明方法所共有的分離方法簡便整合的濃度和各種溶液中。即使在高蛋白質(zhì)濃度下，所述方法也將起作用，當(dāng)然，不包括加入如下物質(zhì)其去除需要增加新單元操作或顯著改進(jìn)現(xiàn)有單元操作來除去所加污染物。多年來，常將生物醫(yī)藥發(fā)酵、純化和研磨(polishing)/配制看作是單獨的工藝領(lǐng)域。其主要原因在于它們通常涉及到與各領(lǐng)域中的靶濃度大量測量有關(guān)的不同操作和規(guī)模，其中，發(fā)酵可能處于lmg/mL，通過親和或離子交換純化使?jié)舛壬叩娇赡?0mg/mL， 研磨配制步驟使液態(tài)或固態(tài)形式的靶達(dá)到100-200mg/mL的任何濃度。這些區(qū)別變得模糊，因為抗體及其它生物醫(yī)藥在發(fā)酵進(jìn)料中可達(dá)到30mg/mL且在離子交換色譜法中可達(dá)到 100mg/L或更高。配制常包括組合蛋白質(zhì)或其它生物醫(yī)藥與諸如聚合物(如Dextrans 、聚 (乙二醇)或Polysorbates (聚乙氧基烯脫水山梨醇和月桂酸酯)和氧乙烯或氧丙烯的各種市售共聚物或嵌段共聚物(如Tergitols 或Pluronics )的賦形劑。許多賦形劑也可為帶電的，包括使用諸如白蛋白的其它蛋白質(zhì)(即，帶電的兩親性生物聚合物)。除了在儲存期間使生物醫(yī)藥穩(wěn)定之外，還需在不誘發(fā)聚集的情況下保持高濃度并允許在體內(nèi)迅速溶解并吸收?？紤]到以上所述，很自然的是，用生物相容的聚合物定位抗體或其它靶蛋白在溶液或不溶性復(fù)合物中的任何分配或沉淀方法不僅對于生物醫(yī)藥的純化、而且對于其配制和儲存都將是有益的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離生物分子的方法。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及在如下條件下分離抗體(mAbs)和包含抗體片段(Fabs)的相關(guān)蛋白質(zhì)的方法，其中所述抗體和相關(guān)蛋白質(zhì)具有正電性和相對疏水性并且將與帶負(fù)電的聚合物反應(yīng)以形成沉淀的聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供分離生物分子的方法，其包括以下步驟(a) 提供含有所述生物分子的水性樣品；(b)在鹽存在下在一定條件下混合所述水性樣品與帶負(fù)電的聚合物以使得所述聚合物選擇性復(fù)合所述生物分子并使其絮凝以形成包含所述生物分子的沉淀物的混合物；(c)從所述水性液體中分離所述生物分子沉淀物；和(d)使所述生物分子再懸浮在再懸浮緩沖液中。所述分離可使用諸如具有各種分子量的聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖聚合物的低廉且生物相容的帶負(fù)電的聚合物作為沉淀劑來實現(xiàn)。其在比較高的聚合物濃度(例如10% ) 及高鹽濃度(> 50mM)和導(dǎo)電率(例如> lOmS/cm)下在寬pH范圍(在5_9之間，取決于多種因素)內(nèi)發(fā)生。因為所述方法以過量聚合物的狀況起作用，所以其對溶液蛋白質(zhì)濃度不是非常敏感。大多數(shù)聚合物和鹽沒有保留在沉淀劑中，而是“分配”到上清液中，在此可使它們再循環(huán)。諸如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸(和據(jù)推測其它帶負(fù)電的污染物，諸如病毒、細(xì)菌、毒素)的污染物趨于從聚合物-靶蛋白復(fù)合物中排除。在各種研究中，90+% mAb在沉淀物中回收，95+% HCP和DNA在上清液中回收所述方法顯示出用多種復(fù)合物溶液順利執(zhí)行，所述復(fù)合物溶液含有處于高濃度 (例如10g/L)和導(dǎo)電率的靶和其它蛋白質(zhì)。這些溶液包括諸如澄清發(fā)酵進(jìn)料的溶液和來自水性聚合物相分配的含靶相。所述沉淀物富含靶蛋白質(zhì)且在低稀釋度下容易地溶解于各種水溶液中。而這些溶液可以但不需要具有低PH。這允許直接將所述方法與各種其它分離和下游加工方法和操作整合。附圖簡述圖1 在室溫和不同鹽條件下在pH 7下Gammanorm人類多克隆抗體(GN)在含有 10% (w/w)NaPAA 8000的溶液中的聚合物蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和沉淀。圖2 隨著圖1中的鹽條件而變的抗體回收率。圖3 隨著關(guān)于圖1中的條件的緩沖液導(dǎo)電率(mS/cm)而變的抗體回收率。應(yīng)注意，緩沖液導(dǎo)電率不包括聚合物的貢獻(xiàn)。圖4 在室溫和不同鹽條件下在pH 7下Gammanorm人類多克隆抗體(GN)在含有 10% (w/w)NaPAA 15000的溶液中的聚合物蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和沉淀。圖5 隨著圖4中的鹽條件而變的抗體回收率。圖6 隨著關(guān)于圖4中的條件的緩沖液導(dǎo)電率(mS/cm)而變的抗體回收率。應(yīng)注意，緩沖液導(dǎo)電率不包括聚合物的貢獻(xiàn)。圖7 對于圖1-3中的NaPAA 8000相關(guān)實驗的K (沉淀的Ab/未沉淀的Ab的比率) 和對數(shù)(Ln)K對導(dǎo)電率(mS/cm)的曲線圖。對于與圖4_6相關(guān)的結(jié)果也得到了類似直接關(guān)系(數(shù)據(jù)未示出)。圖8:通過水性聚合物兩相體系(APTP)分配澄清的來自實際中國倉鼠卵巢 (Chinese Hampster Ovary, CH0)細(xì)胞發(fā)酵進(jìn)料的再懸浮的mAb沉淀物在Capto 匪C多峰陽離子交換色譜介質(zhì)(GE Healthcare)上的色譜。圖9 根據(jù)圖8的所施用部分和收集部分的SDS PAGE。條帶1 分子量標(biāo)記；條帶 2 =WAVE 51進(jìn)料；條帶3 =Wave 51進(jìn)料ATPS ；條帶4 上清液；條帶5 在pH 5. 5下的再懸浮的沉淀物；條帶6 =Al部分；條帶7 :A2部分；條帶8 :A3部分；條帶9 :A4部分；條帶10 A1-4部分；條帶11 -M部分，洗脫液；條帶12 分子量標(biāo)記。圖10 基于分配、沉淀和色譜的蛋白質(zhì)的三步初級純化方案的概述。在第一步驟中，至少95%的所關(guān)注的蛋白質(zhì)(mAb)分配到所要相中。發(fā)酵液也變得非常澄清。在第二步驟中，回收至少90%的蛋白質(zhì)，且HCP和DNA減少至少95%而且病毒和毒素含量明顯減少。發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明涉及從含有生物分子和雜質(zhì)的水性樣品中分離生物分子的方法。 具體地說，據(jù)發(fā)現(xiàn)帶負(fù)電的含羧基聚合物可從不同水溶液中選擇性地復(fù)合并絮凝(在本文中稱為沉淀)諸如抗體的帶正電的生物分子。所述方法可適于多種水性樣品。所述樣品包括但不限于來自原核或真核表達(dá)系統(tǒng)、血液、重組牛奶、重組植物溶液的發(fā)酵產(chǎn)物和含有所關(guān)注的生物分子的任何其它水性樣品。所述樣品優(yōu)選不含細(xì)胞且更優(yōu)選澄清化以除去任何固體污染物。這通過采用任何方便可行的方法，例如通過過濾或離心分離來實現(xiàn)。澄清化也可以通過水相分配法實現(xiàn)。
所述方法適于濃縮和分離抗體。本文使用的術(shù)語“抗體”是指任何重組或天然存在的完整抗體，例如抗體包括抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定域(CL)和重鏈恒定域。該術(shù)語還涵蓋抗體片段或包括抗體片段的分子，所述抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、 Fv和Fc片段。術(shù)語“抗體”具體涵蓋融合蛋白，諸如Fc融合蛋白、肽抗體及其它嵌合抗體。 術(shù)語“抗體”具體涵蓋單克隆抗體和多克隆抗體兩者。在各種實施方案中，抗體可為IgG抗體，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗體。雖然在下文舉例說明了抗體的分離，但是預(yù)計所述方法對于可顯示出凈正電荷的許多其它蛋白質(zhì)或生物分子的分離同樣有效。將包含所關(guān)注的生物分子的液體樣品的PH調(diào)節(jié)到處于或低于靶生物分子的pl， 或者如果存在多于一種靶生物分子，諸如在多克隆抗體靶樣品的情況下，則調(diào)節(jié)到處于或低于最低Pi靶分子的pi。生物分子的pi可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的測定pi的各種方法之一來容易地測定。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述Pl通過對包含生物分子的樣品進(jìn)行毛細(xì)管等電聚焦(ClEF)并測量Pl來測定。pH的調(diào)節(jié)可以任何方便的方式進(jìn)行，例如通過向水性樣品中加入酸性溶液等分試樣，直到樣品的PH落在可接受的pH范圍。優(yōu)選實現(xiàn)并保持5-9、諸如約中性(pH 7)的樣品pH。與調(diào)節(jié)樣品的pH同時或在其之后，可將帶負(fù)電的含羧基聚合物與樣品混合以使生物分子選擇性復(fù)合并絮凝。在合適的PH和鹽條件下，形成含有所關(guān)注的生物分子的絮凝物。所述聚合物合適地為多羧酸(PCA)聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地理解對于有效復(fù)合物形成選擇合適的PCA聚合物類型和取代度(羧基化)的原理。其它聚合物也會起到良好作用。這些聚合物包括CM纖維素或CM淀粉以及含有類似于丙烯酸的單體的聚合物。當(dāng)然， 所述聚合物可經(jīng)設(shè)計以顯示出進(jìn)一步增強(qiáng)其在所述方法中的用途的其它性質(zhì)(例如大小、 在一定條件下的溶解性、磁性)。優(yōu)選具有大于5，000的分子量的高度羧化的聚丙烯酸(PAA)用以實現(xiàn)選擇性抗體復(fù)合。用具有較低相對羧化程度(取代度1.4)的較高麗的羧甲基葡聚糖(CMD)也得到了類似結(jié)果。加到水性樣品中的聚合物的濃度優(yōu)選為3% (w/v)-30% (w/v)，例如5% (w/v), 10% (w/v)或 15% (w/v)。在優(yōu)選的實施方案中，含有所述生物分子的絮凝物(沉淀物)在聚合物存在下在約中性PH和比較高的導(dǎo)電率(例如>50mM磷酸鈉)下形成。在最優(yōu)選的實施方案中，所述聚合物為 PAA (MW > 5000)或 CMD (MW 10000 和 40000，取代 2. 26 和 3. 24mmol/g)。任選存在一種或多種鹽且其幫助沉淀工藝。所述鹽之一為磷酸鈉。通常一種鹽必須使導(dǎo)電率升高到高于發(fā)生沉淀的閥值(例如常為5mS/cm)。預(yù)期存在一些鹽的特定(例如霍夫邁斯特型)效應(yīng)，但操作者具有選擇鹽的一些自由?；蛘撸鳆}可為氯化鈉、檸檬酸鈉或硫酸鈉或鉀或其它鹽或所述鹽的混合物。鹽和聚合物可以固態(tài)加入，這可能需要用于溶解并混合試劑的額外平衡時間。鹽和聚合物也可以一種或多種液體濃縮物的形式加入或在一些情況下以固態(tài)加入。水性樣品、聚合物和鹽的混合物視加入形式(見上文)、混合(如果進(jìn)行的話)和體積而培養(yǎng)15分鐘小時的時間。然而，通常，如果在適當(dāng)混合下加入液體濃縮物，則對于大多數(shù)應(yīng)用來說30分鐘的時間將足夠。顯然，分離復(fù)合物和懸浮液(上清液)的時間將取決于用以分離它們的方法。用于小體積(最高達(dá)試管大小)的自發(fā)復(fù)合物形成和沉降的數(shù)小時與用于經(jīng)受過濾或離心分離的大體積的類似時間相對。培養(yǎng)時長可隨著待分離的生物分子而改變且可通過針對給定條件組(例如聚合物濃度、重量等)改變培養(yǎng)時間、測量各培養(yǎng)期沉淀的生物分子的量和選擇提供最佳或所要分離程度的培養(yǎng)期來優(yōu)化。經(jīng)過培養(yǎng)期，可將混合物連續(xù)混合、每隔一定間隔混合、僅以所要次數(shù)混合或根本不混合。在不需要混合時，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本發(fā)明的實踐中，在形成沉淀物的過程中可能需要混合。培養(yǎng)可在被認(rèn)為有助于沉淀物形成的任何溫度下進(jìn)行。例如，培養(yǎng)可在2V ~8V 的溫度下或在室溫下進(jìn)行。常將發(fā)酵樣品冷卻到室溫或較低溫度以降低在進(jìn)一步處理期間的蛋白酶活性。實際上，本發(fā)明的一個優(yōu)勢在于能夠在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)步驟，而不需要保持混合物冷凍或甚至調(diào)整到特定溫度。絮凝物一旦形成，則可通過采用任何方便的方法將混合物分離成沉淀物和液相。 在一個實施方案中，將混合物離心分離。在該實施方案中，沉淀物在容器的底部收集，而液相含有大部分雜質(zhì)。在離心分離之后，例如通過潷去或抽吸而除去液相。在另一實施方案中，混合物可通過過濾來分離。在從液體樣品中分離沉淀物之后，可任選用緩沖液洗滌沉淀物。任選洗滌步驟的目標(biāo)可為從沉淀物中除去殘留液體組分。所述任選洗滌可包括使洗滌緩沖液與沉淀物簡單接觸，隨后通過抽吸或潷去緩沖液而除去洗滌緩沖液。沉淀物可容易地再懸浮(即再溶解)在包括水或緩沖溶液的水溶液中。對再懸浮溶液的該相對自由的選擇在提供較低程度稀釋靶和只關(guān)心保持靶天然活性并優(yōu)化進(jìn)一步分離步驟時最佳選擇緩沖液方面有利。優(yōu)選再懸浮緩沖液為低離子強(qiáng)度溶液且具有 4. 0-9. 0的pH。再懸浮緩沖液的一個實例為pH 5. 0的乙酸鈉緩沖液。在以下實例中，用含有< 5g/L的抗體的樣品溶液形成復(fù)合物通常產(chǎn)生< 2%體積(且常常< 1%)的起始流體的絮凝劑。因此，沉淀獲得50-100X濃度的所要生物分子。 生物分子的回收率很高(約90%)，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA 二者的分離率也很高(都為約 95%)0與大多數(shù)污染物相比，高選擇性可存在于相對高度帶電、聚陽離子的、大表面積和抗體分子的相對鏈柔性中-與由聚羧酸酯對多硫酸化聚合物提供的更大鏈柔性聯(lián)合。因而， 所述復(fù)合物也可顯示出降低的病毒、毒素及其它帶負(fù)電污染物水平。對參與分離方法的特定抗原或配體沒有諸如結(jié)合部位親和性的抗體的特定性質(zhì)。因此，預(yù)計其對于包括抗體片段的多種其它分子起作用。體積顯著減少和復(fù)合物易于溶解(再懸浮)在各種溶液中支持當(dāng)前絮凝方法與標(biāo)準(zhǔn)下游純化工藝直接整合。因此，在沉淀物再懸浮之后，溶液中的再懸浮生物分子可通過諸如色譜法的一個或多個額外純化步驟以生物分子或殘留聚合物流過或捕獲的模式而進(jìn)一步處理，從而進(jìn)一步純化所要生物分子。因此，在一個實施方案中，再懸浮的生物分子被捕獲在親和介質(zhì)(例如蛋白質(zhì)A介質(zhì))上。隨后將靶生物分子洗脫并通過可能的陽離子交換(靶捕獲)步驟或混合模式(靶流過、污染物捕獲)步驟而進(jìn)行研磨。在一個供選的實施方案中，將靶生物分子裝載到陽離子交換介質(zhì)上，所述聚合物流過所述介質(zhì)。在一個不同的實施方案中，使生物分子再懸浮在較高離子強(qiáng)度的溶液中，并直接裝載到疏水性相互作用色譜柱、混合模式或親和柱上。如上所述，沉淀物中的殘留聚合物可通過使用捕獲色譜介質(zhì)清洗來除去。或者，所述聚合物可通過其它方法、諸如通過水性多相體系的相分配來除去。另外，沉淀物中的殘留聚合物可通過使其流過色譜或過濾或其它(整體)捕獲介質(zhì)而除去，所述介質(zhì)顯著吸附(捕獲)靶而不是聚合物?；蛘?，沉淀物中的殘留聚合物可通過使其流過色譜或過濾或其它(整體)尺寸排阻介質(zhì)而除去，所述介質(zhì)對于聚合物具有與對靶不同的流動速率或阻礙程度。因此，進(jìn)一步提供使用經(jīng)設(shè)計與高導(dǎo)電性溶液一起使用的Capto MMC和相關(guān)捕獲介質(zhì)來純化通過上述方法生產(chǎn)的含靶溶液的方法。應(yīng)注意到本發(fā)明的所有實施方案都可以任何規(guī)模使用。例如，本發(fā)明可適于大規(guī)模生物分子生產(chǎn)操作，其中生物分子從數(shù)十、數(shù)百或數(shù)千升細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。在另一實施例中，本發(fā)明可以較小規(guī)模使用，例如在試驗臺上規(guī)模操作中使用，其中生物分子從體積為約數(shù)升的介質(zhì)或甚至體積比1升少得多的介質(zhì)中分離。用于新方法的容器可以固定或為一次性的，且可以各種明顯的方式改進(jìn)以增強(qiáng)靶回收率和液體上清液的去除。因為所述方法僅包括向含靶進(jìn)料中加入聚合物和鹽溶液，所以其可容易地以在線或連續(xù)加工模式(例如使用過濾而不是沉降或離心分離來分離復(fù)合物)進(jìn)行。作為不依賴于固體載體的液體方法，其可以容易地采用高流通量篩分(例如，在微量滴定盤上以毫升級的體積)來在允許使用最少的昂貴靶蛋白和進(jìn)料的條件下優(yōu)化諸如靶回收率和污染物去除的各種參數(shù)。所述方法的簡單和實用性質(zhì)提供了許多其它令人興奮的可能性。例如，pH依賴性提出可以使用(X)2分壓來改變碳酸鹽緩沖溶液中的pH，從而在其中復(fù)合物將形成或溶解的 PH條件之間往復(fù)。沉淀后的再溶解步驟可與降低pH組合以實現(xiàn)殘留病毒的殺死。另一可能性是組合沉淀與在聚合物-鹽、聚合物-聚合物或熱響應(yīng)(逆熱溶解性)聚合物兩相體系中兩相分配的水性聚合物。在后一體系中，聚合物將在濁點溫度(Tc)下自結(jié)合且形成浮在富聚合物的相上的富水和(靶)蛋白質(zhì)的相。在所述體系中分配能夠在單位重力(即不使用離心分離)下實現(xiàn)進(jìn)料的快速初始澄清化(除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片)(2009年1月8日提交的題為"Separation method using single polymer phase systems (使用單一聚合物相體系的分離方法)”的James Van Alstine, Jamil Shanagar和Rolf Hjorth的瑞典專利申請0900014-2，其公開內(nèi)容以引用的方式全部結(jié)合在本文中)和去除一些污染物。且在與重組或其它大規(guī)模富含蛋白質(zhì)的進(jìn)料相關(guān)的導(dǎo)電率(包括與血漿、血液或含重組植物靶的進(jìn)料物流相關(guān)的那些)下正是如此。然而，其沒有提供很多靶濃縮或HCP去除。因此， 理想地是與本發(fā)明方法組合以產(chǎn)生易于插入至現(xiàn)有工藝或新工藝中的兩步澄清化和純化方案(表1)。這包括經(jīng)設(shè)計以完全用一次性部件工作的工藝。存在各種其它明顯的可能性，諸如在如下容器中進(jìn)行操作，其中靶和污染物在兩個隔室之間自由移動，但復(fù)合的聚合物因通過末端共價鍵結(jié)合定位被保留，或通過允許靶穿過而具有比靶高得多的MW的聚合物不能穿過的過濾器來基于MW而操作。表1.水性聚合物相體系和單獨使用或在分配操作之后使用的新聚合物沉淀方法的主要操作屬性
權(quán)利要求
1.一種分離生物分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供含有所述生物分子的水性樣品；(b)在鹽存在下混合所述水性樣品與帶負(fù)電的聚合物，在一定條件下混合以使得所述聚合物選擇性復(fù)合所述生物分子并使其絮凝以形成包含所述生物分子的沉淀物的混合物；(c)從所述水性液體中分離所述生物分子沉淀物；和(d)使所述生物分子再懸浮于再懸浮緩沖液中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子為蛋白質(zhì)，其包括激素或多克隆抗體或單克隆抗體或抗體衍生蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體為IgG抗體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子為抗體片段(Fab)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述帶負(fù)電的聚合物為聚丙烯酸(PAA)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述PAA具有大于5kD的分子量和大于3%(w/v)的濃度。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物為羧甲基-葡聚糖(CMD)或其它羧基改性的聚合物或其它多元酸或其它生物降解的多元酸聚合物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述鹽選自磷酸鈉、NaCl、檸檬酸鈉和硫酸鈉。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述鹽的濃度大于50mM。
10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中所述混合物的pH在5-9范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)中所述混合物的pH為約pH7。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述水性樣品選自來自原核或真核表達(dá)系統(tǒng)、病毒培養(yǎng)系統(tǒng)、全血、澄清血液、重組牛奶、重組植物溶液的澄清發(fā)酵產(chǎn)物和含有所關(guān)注的生物分子的任何其它水性樣品。
13.權(quán)利要求12的方法，其中澄清或其它初期樣品純化分離步驟通過在多種緩沖劑或鹽存在下在包括由一種或兩種水溶性聚合物形成的水性多相分離體系的一種或多種水性多相分離體系中離心分離或分配來進(jìn)行。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離包括(a)離心分離所述混合物以形成所述沉淀物和所述水性液體；和(b)從所述沉淀物除去所述水性液體。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離包括過濾所述混合物以從所述水性流體中分離所述復(fù)合物。
16.權(quán)利要求1的方法，其中使所述沉淀的生物分子再懸浮于具有3-9的pH的水性緩沖液或水中。
17.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述沉淀物中的殘留PAA或其它多元酸在步驟 (d)之后通過清洗除去。
18.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述沉淀物中的殘留PAA或其它多元酸在步驟 (d)之后通過水性多相體系除去。
19.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述沉淀物中的殘留PAA或其它多元酸在步驟(d)之后通過使其流過色譜或過濾或其它(整體)捕獲介質(zhì)而除去，所述介質(zhì)顯著吸附所述生物分子，但不吸附所述PAA或其它多元酸。
20.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述沉淀物中的殘留PAA或其它多元酸在步驟 (d)之后通過使其流過色譜或過濾或其它(整體)尺寸排阻介質(zhì)而除去，在所述介質(zhì)中PAA 或其它多元酸具有與所述生物分子不同的流動速率或阻礙程度。
21.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括一個或多個額外純化步驟，其可包括其它水相分配或沉淀步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述額外純化步驟包括使用多峰陽離子交換劑；蛋白質(zhì)A 親和柱、疏水性相互作用柱和陽離子交換的色譜法。
23.Capto MMC和相關(guān)捕獲介質(zhì)的用途，它們經(jīng)設(shè)計與高導(dǎo)電性溶液一起使用以在低稀釋度下純化由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的含生物分子的溶液。
24.權(quán)利要求1的方法用以分離穩(wěn)定形式的生物醫(yī)藥的用途，所述穩(wěn)定形式的生物醫(yī)藥用于儲存一段時間，諸如數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。
25.權(quán)利要求1的方法在配制步驟中與聚合物的或其它賦形劑一起用以使生物醫(yī)藥達(dá)到某一濃度或不溶解狀態(tài)的用途。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述聚合物包括可生物降解的多元酸，諸如CM-葡聚糖。
27.權(quán)利要求25和沈中任一項的用途，其中所述聚合物的或其它賦形劑對所述配制提供助劑性能。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離生物分子的方法。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及在如下條件下分離抗體(mAbs)和包含抗體片段(Fabs)的相關(guān)蛋白質(zhì)的方法，其中所述抗體和相關(guān)蛋白質(zhì)具有正電性和相對疏水性并且將與帶負(fù)電的聚合物反應(yīng)以形成會沉淀的聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物。所述分離可使用諸如具有各種分子量的聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖聚合物的低廉且生物相容的帶負(fù)電的聚合物作為沉淀劑來實現(xiàn)。其在比較高的聚合物濃度(例如10％)及高鹽濃度(＞50mM)和導(dǎo)電率(例如＞10mS/cm)下在寬pH范圍內(nèi)發(fā)生。
文檔編號C07K1/32GK102272146SQ201080004831
公開日2011年12月7日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者J·沙納加爾, J·范阿爾斯廷, K·萊基, R·霍爾思 申請人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司