專利名稱：生產(chǎn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(Lf)達(dá)到其所有最佳活性并且避免任何繼發(fā)效應(yīng)的品質(zhì)。
背景技術(shù)：
自從超過65年前其第一次鑒定為牛奶中的“紅色蛋白”，并且在1960年純化，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白引起了研究者的興趣并使他們感到困惑。隨后其氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)和詳細(xì)的鐵結(jié)合特性的測定堅(jiān)定地證實(shí)了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白是糖蛋白，作為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的成員，并且增強(qiáng)了其生物功能與鐵結(jié)合相關(guān)的自然推測。不同的研究中心起著重要作用，著重于蛋白質(zhì)的一些生物關(guān)鍵功能。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白作為多形核白細(xì)胞的特定顆粒中的主要成分得到分離，在炎癥反應(yīng)的擴(kuò)增中起著重要作用。Masson及其比利時小組的大量工作已經(jīng)證實(shí)了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在細(xì)胞免疫性中的明確作用，并且已經(jīng)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞上的特異性乳轉(zhuǎn)鐵蛋白-受體的鑒定，內(nèi)毒素性休克和 hyposideremia的媒介作用。Montreuil及其法國小組的開拓性努力闡明了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物化學(xué)。Liinnerdal已經(jīng)公開了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在吸收腸道中的金屬離子的營養(yǎng)作用。 Broxmeyer及其同事報道了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在骨髓組織生成中的調(diào)控作用。從他的觀點(diǎn)看， Reiter報道了奶乳轉(zhuǎn)鐵蛋白抑制一些微生物生長的能力，并且發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的鐵營養(yǎng)缺失導(dǎo)致了抗微生物活性。Arnold及其合作者報道了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白對各種微生物的殺菌活性。 Tomita及其在日本Morinaga乳品業(yè)的研究小組發(fā)現(xiàn)了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的酸/胃蛋白酶水解可以產(chǎn)生陽離子抗微生物肽“乳鐵多肽(lactoferricin) ”。幾項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了補(bǔ)充乳轉(zhuǎn)鐵蛋白可以提供特別的健康益處和對抗幾種疾病的有效的保護(hù)。功能表征技術(shù)已經(jīng)說明了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的多功能活性的分子機(jī)理。此外，全世界的實(shí)驗(yàn)室研究人員已經(jīng)在隨機(jī)的人體試驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭序?yàn)證了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白補(bǔ)充的功能成果。但如果使用實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的高品質(zhì)的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白證明了作為對抗環(huán)境攻擊的一級哺乳動物免疫防御的關(guān)鍵成分的這種胞外糖蛋白的多功能活性，我們發(fā)現(xiàn)了商業(yè)上生產(chǎn)的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白不是這種情況。在工業(yè)方法過程中，在其他乳堿性蛋白(MBP)(如，乳過氧化物酶)、一些免疫球蛋白和濃度依賴于陽離子交換樹脂特異性的其他雜質(zhì)的存在下，從奶或乳清中提取出Lf。這構(gòu)成提取和純化Lf的簡單方法。實(shí)際上，我們具有有利條件:MBP中所含的大部分蛋白和酶是著色的。結(jié)合于樹脂上的不同成分的洗脫將使用含有不同NaCl濃度的溶液進(jìn)行。使用這樣的程序，工業(yè)生產(chǎn)者認(rèn)為90至92 %的純度對應(yīng)于足夠純以被用于不同的應(yīng)用中的Lf。然而，這些方法中沒有一種，也沒有用于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的商業(yè)規(guī)模純化的任何其他現(xiàn)有的方法，能夠除去影響乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的穩(wěn)定性和活性的雜質(zhì)。看來雜質(zhì)酶存在于目前現(xiàn)有的商業(yè)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白制劑中。在從奶或乳清純化乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的過程中，這些酶被共同純化。關(guān)于雜質(zhì)，如以下將證明的，我們還發(fā)現(xiàn)了在Lf的純化過程中可以純化血管生成素。該分子具有15kDa的分子量和非常接近于Lf的9. 5的等電點(diǎn)pH。該分子引起供養(yǎng)癌細(xì)胞的血管形成、對于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的發(fā)展必不可少的新血管形成。在Lf的純化過程中，該分子被濃縮至少4倍，這無疑對于消費(fèi)者的健康是沒有益處的。血管生成素促進(jìn)炎癥過程，使得內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過基底膜移動以進(jìn)入損傷部位。血管生成素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的新血管并且促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的增殖。血管生成素是一種15kDa的蛋白質(zhì)，具有非常接近于Lf的9. 5的等電點(diǎn)pH。如 St rydom等在1997年(Eur. J. Bi ochem，247，535-544)所述的，將血管生成素施加于 CM-52(陽離子交換色譜樹脂)并用50mM磷酸鈉，pH6. 6的溶液中的IM NaCl來洗脫。因此，該分子與Lf被共同純化并且在所有商業(yè)Lf存在下已經(jīng)在SDS-PAGE凝膠中檢測到并不令人驚訝。另一個問題是我們也已經(jīng)證明的通過Lf聚合物的熱處理的生產(chǎn)，參見下文。因此，對乳轉(zhuǎn)鐵蛋白制劑的新的純化和穩(wěn)定方法以便除去雜質(zhì)、蛋白質(zhì)降解和LPS 以增強(qiáng)對細(xì)菌生長的活性和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并持續(xù)較長的一段時間存在很大需求。盡管最初被鑒定為奶分泌中的豐富蛋白，但乳轉(zhuǎn)鐵蛋白主要通過表面上皮細(xì)胞來表達(dá)并分泌至粘膜環(huán)境中。如所述的，不僅在奶中高水平地產(chǎn)生乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，而且在鼻和氣管通道中以及在胃、生殖器和眼分泌物中也高水平地產(chǎn)生。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白還在嗜中性粒細(xì)胞中高水平地產(chǎn)生，其貯存在次級顆粒中，并在炎癥過程中釋放，有助于它們的抗微生物活性。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白含有2個螯合可用鐵的同源鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并使需鐵結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌失去這種必需的生長要素。以這種方式，該蛋白發(fā)揮出對抗大范圍的微生物和某些酵母的抑菌作用。此外，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，通過其位于該蛋白的氨基端附近的陽離子肽的存在，已經(jīng)顯示出具有與該蛋白的鐵結(jié)合功能無關(guān)的滅菌和抗內(nèi)毒素活性。該區(qū)域通過破壞細(xì)菌膜和通過結(jié)合并滅活含有脂質(zhì)-A的細(xì)菌脂多糖(也稱為內(nèi)毒素)來起作用(參見

圖1)。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞信號途徑，其影響如炎癥的減輕、骨生長的促進(jìn)和癌形成的抑制這樣的活性。因此，其抗炎活性與抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力相關(guān)，但通過幾種截然不同的機(jī)制，和通過有絲分裂素-激活的蛋白激酶途徑產(chǎn)生的骨生長的調(diào)節(jié)。數(shù)量日增的研究表明乳轉(zhuǎn)鐵蛋白具有抗癌特性，抑制癌癥的生長，這源于其調(diào)節(jié)影響細(xì)胞周期的途徑或?qū)е录?xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-18)表達(dá)的上調(diào)的能力。此外，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗微生物功能取決于其蛋白構(gòu)象、金屬結(jié)合和環(huán)境條件(Naidu AS 禾口 Arnold RR. , 1995, Lactoferrin interactions and biological Functions (乳轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用和生物功能)，pp259_275，Totowa, NJ, Humana Press)。 當(dāng)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合微生物表面時，抗微生物活性增強(qiáng)。已經(jīng)對不同的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌病原體鑒定出特定的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合微生物靶(Naidu SS等，1991，APMIS,99, 1142-1150)。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白與包括大腸桿菌的革蘭氏陰性腸細(xì)菌的孔形成外膜蛋白的高親和性相互作用對于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗微生物結(jié)果是關(guān)鍵的(Erdei等，1994，Infect Immun, 62,1236-1240)。因此，革蘭氏陰性細(xì)菌中乳轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的外膜損傷和通過引起改變的外膜滲透的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)的抗生素強(qiáng)化作用是這種抗微生物結(jié)果的典型實(shí)例(Naidu等，Diagn Microbiol Infect, 1988, Infect Immun，56，2774-2781)。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白與微生物表面 (特別是外膜)的相互作用，形成其他抗微生物機(jī)制，如對腸上皮的微生物粘附-阻斷和病原體從消化道粘膜上的特異性脫離。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性結(jié)合快速地瓦解了細(xì)菌外膜屏障功能并導(dǎo)致病原體定殖因子和腸毒素產(chǎn)生的停工。從另一方面看，Appelmelk及其合作者(Appelmelk BJ 等，1994，Infection and Immunity, 62, 2628-2632)發(fā)現(xiàn)了 Lf結(jié)合脂質(zhì)A，這是LPS的一部分，并且 Elass (Elass-RochartE 等，1995，Biochem J. 312,839-845)證明了該結(jié)合位點(diǎn)位于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的N-端(肽1至52)，其中還位于Lf活性的主要部分。從這些結(jié)果看，容易理解存在于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白活性與乳轉(zhuǎn)鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)上結(jié)合的LPS存在之間的關(guān)聯(lián)。存在著LPS和內(nèi)毒素從腸腔連續(xù)轉(zhuǎn)移至血流中。在健康的個體中，血漿阻止LPS 和內(nèi)毒素的腸流入，并且保護(hù)內(nèi)部器官免受損傷。然而，消化道滲透性的任何失調(diào)可能提高 LPS和內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移至血流中。這樣的大規(guī)模流入會耗盡血漿滅活LPS和內(nèi)毒素的能力并最終導(dǎo)致臨床內(nèi)毒素血癥(Opal SM, 2002, J. Endotoxin Res，8，473-476)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明活性氧物質(zhì)是內(nèi)毒素血癥過程中細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)，作為大分子損傷的結(jié)果或通過干擾胞外或胞內(nèi)調(diào)節(jié)過程。防止生理內(nèi)毒素血癥的重要機(jī)理是減少來自腸腔的脂多糖(LPS)。在N-端(乳轉(zhuǎn)鐵多肽)Lf結(jié)合脂質(zhì)-A (具有高親和性的LPS的毒性部分)，并作為治療劑起作用來抵消LPS和內(nèi)毒素的影響(Appelmelk BJ等，1994，Infect Immun, 62, 2628-2632)。Lf可以有效地減少LPS和內(nèi)毒素流入至血流中，同時毒素仍然在腸腔內(nèi)部，但沒有達(dá)到這樣的結(jié)果，重要的是無LPS和內(nèi)毒素地制造了 Lf。此外，如果健康人供給的Lf 被LPS覆蓋，這些LPS可以從該分子中移出并轉(zhuǎn)移至血流中。然而，在此過程中，如果LPS和內(nèi)毒素以大量連續(xù)釋放，Lf也被快速耗盡，并且不可能從足量存在來執(zhí)行此功能(Caccavo等，2002，J. Endotoxin Res，8，403-417)。已經(jīng)報道了 Lf對抗通過靜脈內(nèi)給予內(nèi)毒素誘導(dǎo)的致命休克的保護(hù)作用。Lf-介導(dǎo)的對抗內(nèi)毒素 (如果分子自身在生產(chǎn)過程中無內(nèi)毒素)激發(fā)的保護(hù)與抵抗誘導(dǎo)體溫過低和健康的整體提高相關(guān)聯(lián)。使用流式細(xì)胞計數(shù)測量的體外研究表明Lf以劑量依賴性方式抑制內(nèi)毒素結(jié)合單核細(xì)胞，這表明體內(nèi)的Lf作用機(jī)理可能是由于防止誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞驅(qū)動的炎癥毒性細(xì)胞因子引起的(Lee WJ 等，1998，hfect Immun, 66,1421-1421) 人的臨床試驗(yàn)也已經(jīng)顯示了食用Lf在宿主防御的初級激活中的積極影響 (Yamauchi等，1998，Adv Exp Med Biol，443，261-265)。健康的人顯示出其血清嗜中性粒細(xì)胞功能的改善，包括增強(qiáng)的吞噬活性和過氧化物產(chǎn)生。此外，Lf與肺泡巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板和T-淋巴細(xì)胞的特異性相互作用使Lf 在粘膜和細(xì)胞免疫中的作用顯得突出(Hanson LA, 1988, Biology of human milk。Nestl eNutrition Workshop series, 15, New York, Raven Press)。然而，Lf 結(jié)構(gòu)上該 LPS 的存在、由于在制造過程中使用太高的溫度(15秒后> 550°C)和由于該分子干燥的太高溫度引起的Lf聚糖鏈的損壞以及在該分子熱處理過程中出現(xiàn)的Lf聚合物的存在降低了由Lf與這些細(xì)胞的相互作用引起的所有這種活性。關(guān)于消化道成熟和粘膜修復(fù)，已經(jīng)證明了口服Lf給藥可以起到腸粘膜中的免疫刺激因子的作用。在母乳喂養(yǎng)期間的新生兒中，胃腸道更快地成熟。這種激活依賴于結(jié)合到腸上皮上的Lf。Lf可以在體內(nèi)加強(qiáng)胸腺嘧啶摻入隱窩細(xì)胞DNA中。這種營養(yǎng)作用有助于如腸胃炎這樣的病癥中的腸粘膜的細(xì)胞再生和組織修復(fù)(Nichols等，1990，Pediatr Res.，27， 525-528)。由于Lf結(jié)合腸上皮位于與LPS相同位置的肽(1_52)這一事實(shí)，Lf結(jié)構(gòu)上該LPS 的存在可降低Lf的這種活性。Lf在鐵和其他微量必需元素(如，鋅、銅)的腸吸收中也起著重要作用 (Lonnerdal B.，1989，J. Nutr. Suppl，119，1839-1844)。Lf 還保護(hù)消化道粘膜，以免過量吸收重金屬離子。人十二指腸刷狀緣中的特定Lf結(jié)合受體參與鐵吸收(Cox等，1979， Biochem Biophy Acta, 588，120-128)。鑒定了腸Lf受體。已經(jīng)報道了通過這種腸刷狀緣膜中的 Lf 受體提高的鐵吸收(Kawakami H 等，1991，Am. J. Physiol，261，G841-G846 和 Rosa G等，J. Med Biol. Res, 27，1527-1531)，并且在此還報道了負(fù)責(zé)該分子結(jié)合到其特異性受體上的Lf肽被局限于也負(fù)責(zé)LPS結(jié)合的肽1-52。關(guān)于其抗腫瘤活性，Lf顯示出能以劑量依賴性方式增強(qiáng)單核細(xì)胞的自然殺傷 (NK)活性。Lf強(qiáng)烈地提高NK和淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。如果 LPS沒有結(jié)合在Lf結(jié)構(gòu)上和如果Lf沒有受到血管生成素污染，低劑量的Lf是有效的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑和血清細(xì)胞毒性因子。然而，在較高濃度下，Lf-介導(dǎo)的誘導(dǎo)可能導(dǎo)致正反饋或負(fù)反饋，這不必定是根據(jù)免疫細(xì)胞群的密度和亞組以及Lf結(jié)構(gòu)上該LPS的存在。巨噬細(xì)胞、T和B-淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞上的特異性Lf受體的發(fā)現(xiàn)確定了 Lf的潛在抗腫瘤潛能(Siau等，1992，L. Leukoc Biol，51，343-349)，其結(jié)構(gòu)上LPS的存在可以消除這。Lf的抗炎活性主要與其清除鐵的能力相關(guān)。已知發(fā)炎組織中鐵的累積可能導(dǎo)致催化產(chǎn)生高毒性自由基。在炎癥應(yīng)答過程中，嗜中性粒細(xì)胞移動至激發(fā)位點(diǎn)，以釋放其含有 Lf的酸性顆粒。這導(dǎo)致了發(fā)炎組織部位的強(qiáng)酸性環(huán)境的形成，以擴(kuò)大Lf的鐵螯合和解毒能力。除了調(diào)節(jié)炎癥過程中鐵的動態(tài)平衡，存在日增的Lf可以直接調(diào)節(jié)各種炎癥應(yīng)答的證據(jù)。這種鐵依賴性的作用模式是基于Lf結(jié)合細(xì)菌LPS，這是細(xì)菌感染和膿毒性休克過程中的主要促炎調(diào)節(jié)劑(Miyazawa等，1991，J. Immunol, 146，723-729)。Lf在胃炎的調(diào)節(jié)中起著重要作用，因?yàn)檫@種蛋白也在胃的胃粘膜中表達(dá)，并且與位于胃腸上皮細(xì)胞上的受體相互作用。當(dāng)LPS覆蓋Lf結(jié)構(gòu)時，Lf的這種活性完全降低乃至消除。幾項(xiàng)體內(nèi)研究已經(jīng)顯示出口服Lf可以降低幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃炎并且保護(hù)內(nèi)毒素血癥過程中的胃腸道粘膜完整性。當(dāng)LPS結(jié)合在Lf結(jié)構(gòu)上時，Lf這樣的活性也非常差?？梢匀缦旅枋鯨f的鐵依賴性活性內(nèi)皮細(xì)胞的重要促炎功能之一是在炎癥組織部分募集循環(huán)的淋巴細(xì)胞。脂多糖(LPQ或內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的主要糖脂。 LPS是炎癥的有效刺激劑，其直接誘導(dǎo)或通過細(xì)胞因子的介導(dǎo)來誘導(dǎo)粘附分子的表達(dá)，粘附分子如內(nèi)皮-白細(xì)胞粘附分子(E-分泌素)和胞內(nèi)粘附分子(ICAM-I)。通過⑶14發(fā)現(xiàn)的可溶性蛋白(sCD14)(特異性受體)來介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)毒素刺激。CD14是一種55kDa的糖蛋白，其存在于血清中并且作為單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞表面上的錨定蛋白(mCD14)。在這種機(jī)理中，根據(jù)LPS(內(nèi)毒素)的濃度，存在稱為LPS-結(jié)合蛋白(LBP)的中間產(chǎn)物，其催化 LPS單體從聚集體轉(zhuǎn)移至⑶14，以形成s⑶14-LPS復(fù)合物。因此，通過s⑶14-LPS復(fù)合物或通過單獨(dú)的LPS的內(nèi)皮細(xì)胞的激活引起包括發(fā)燒和低血壓的各種病理反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤和微脈管血栓形成，并且在膿毒性休克中，引起彌散性血管內(nèi)炎癥的發(fā)病。然而，哺乳動物的外分泌腺分泌物中發(fā)現(xiàn)的和在炎癥過程中從嗜中性粒細(xì)胞的顆粒中釋放出來的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活并且避免由LPS存在引起的嚴(yán)重?fù)p傷。感染后，可以在血液中檢測到高于20μ gr/ml的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白是對抗炎癥的初級防御系統(tǒng)的一部分。生物體中任何的細(xì)菌存在將誘導(dǎo)炎癥、癌癥和其他病狀。這種誘導(dǎo)將刺激免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞因子產(chǎn)生、細(xì)胞粘附分子表達(dá)的提高以及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的促炎介質(zhì)分泌，其通過全身性LPS暴露進(jìn)入特定的宿主組織中。通過免疫調(diào)節(jié)分子，如腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)家族的成員、活性氧物質(zhì)和脂質(zhì)，來介導(dǎo)宿主對LPS的應(yīng)答。那些調(diào)節(jié)劑的過度產(chǎn)生誘導(dǎo)組織損傷，隨后產(chǎn)生多器官衰竭。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白防止LBP介導(dǎo)的LPS與mCD14的結(jié)合，并降低細(xì)胞因子從LPS-刺激的單核細(xì)胞中的釋放。乳轉(zhuǎn)鐵蛋白還可以調(diào)節(jié)炎癥過程。實(shí)際上，研究報道了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白在小鼠中對抗次致死劑量的LPS的保護(hù)性功能，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合游離LPS的能力可以部分地說明該分子的抗炎活性。這就是為什么當(dāng)人和動物口服或通過注射攝入乳轉(zhuǎn)鐵蛋白來修補(bǔ)或避免初級防御系統(tǒng)的缺陷時，根本的是該乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的品質(zhì)與產(chǎn)生于必須保護(hù)自身對抗微生物侵入的健康人中的內(nèi)生途徑的相同的原因。已知在衰老過程中，內(nèi)生性乳轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)生變得非常差，迫使患者口服或通過注射攝取外源性乳轉(zhuǎn)鐵蛋白。源材料中的雜質(zhì)會損害Lf的人體健康應(yīng)用。包括源材料的來源、蛋白質(zhì)純化、干燥過程和收集方法、制造環(huán)境和貯存條件的幾個因素，全部累積地造成Lf蛋白的生物負(fù)載。因此，當(dāng)用作源材料時，奶、乳清或奶清可能攜帶可發(fā)酵的鏈球菌(嗜熱鏈球菌...)，并且具有酸性環(huán)境的培養(yǎng)基選擇性地富集幾種酵母和霉菌。附帶地，通常已知這些微生物群增殖并競爭性地限制幾種益生菌的生長。源自具有來自乳腺炎來源的奶集合的污染的奶的Lf能引入來自革蘭氏陽性球菌的LPS的存在，所述革蘭氏陽性球菌包括乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和凝固陰性的葡萄球菌。另一方面，環(huán)境污染物，如形成孢子的桿菌屬、乙酸鈣不動桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、假單胞菌屬種和大腸菌，包括大腸桿菌，以及這些微生物的LPS可以通過洗脫緩沖液、生物污染的設(shè)備、風(fēng)道等...進(jìn)入Lf材料中。對于GMO衍生的Lf和來自各種表達(dá)(如水稻、煙草、 酵母、細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因動物)的重組Lf蛋白，存在相似的微生物學(xué)品質(zhì)問題。因此， 一般而言，消除或顯著減少這類LPS微生物污染物對于商業(yè)Lf的人類健康應(yīng)用是非常需要的。如上文所解釋的，源材料中的LPS和內(nèi)毒素內(nèi)含物會不利地影響Lf應(yīng)用。革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的脂多糖(LPS)通常由稱為脂質(zhì)-A(或內(nèi)毒素)的疏水性結(jié)構(gòu)域、非重復(fù)核心寡糖和末端多糖(或0-抗原)組成(Erridge等，2002，Microbes Infect，4，837-851)。 LPS和內(nèi)毒素可以刺激細(xì)胞因子和炎癥的其他介體的誘導(dǎo)，其隨后會引發(fā)大范圍的不利生理響應(yīng)(Raetz等，2002，Annu Rev Biochem，71，635-700)。蛋白質(zhì)分離中所用的奶或其衍生物的革蘭氏陰性細(xì)菌生物負(fù)載、加工廠環(huán)境和條件累積地影響Lf源材料中的LPS和內(nèi)毒素水平。已經(jīng)綜述了蛋白質(zhì)材料分離過程中內(nèi)毒素污染的潛在貯藏所(Majde等，1993， Peptides 14，629-632)。Rylanders (Rylander 2002，J. Endotoxin Res，8，241-252)也綜述了不同環(huán)境條件中內(nèi)毒素水平的出現(xiàn)，并且進(jìn)一步指出了與非細(xì)菌內(nèi)毒素相關(guān)的風(fēng)險， 特別是來自霉菌細(xì)胞壁的l-3-i3_D-葡聚糖。因此，色譜樹脂的微生物保持標(biāo)準(zhǔn)，加工設(shè)備的衛(wèi)生操作，更重要地Lf純化中所用水的品質(zhì)，會累積地影響純化的Lf材料的LPS和內(nèi)毒素水平，并因此會限制商業(yè)Lf的體內(nèi)應(yīng)用。Lf-LPS和內(nèi)毒素復(fù)合物的預(yù)先存在可降低Lf 與消化道上皮相互作用的潛能，并削弱其控制LPS和內(nèi)毒素腸流入的能力。因此，所有商業(yè)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白都應(yīng)當(dāng)除去結(jié)合在其分子結(jié)構(gòu)上的LPS。例如，Ward、 Loren和同事在W02009/009706中描述了除去結(jié)合Lf的內(nèi)毒素并生產(chǎn)無內(nèi)毒素乳轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品(EFL)的方法。如果使用鱟測試分析LPS濃度，則不是這種情況。還證明了乳轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)上結(jié)合的這種LPS濃度太重要時，復(fù)合LPS-Lf能夠在一定程度上誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中炎癥介體的產(chǎn)生，而不是全部抑制LPS活性。這主要是由于以下事實(shí)LPS濃度太重要時，LPS 結(jié)合一LPS游離之間存在平衡，并且LPS-游離的存在誘導(dǎo)炎癥介體的產(chǎn)生。為了安全是迫使Lf生產(chǎn)者純化該分子除去結(jié)合在Lf分子結(jié)構(gòu)的表面上的LPS的原因。從奶和/或乳清制造，通常的情況是乳轉(zhuǎn)鐵蛋白通過奶中存在的細(xì)菌LPS覆蓋在其分子結(jié)構(gòu)上，并且如果這樣的奶集合已經(jīng)受到引起乳腺炎奶牛的微生物污染的奶的污染，將是危險的。我們知道一部分乳轉(zhuǎn)鐵蛋白活性是由其結(jié)合奶中存在的細(xì)菌LPS的抗細(xì)菌作用引起的。這意味著從奶中提取的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白完全由LPS覆蓋并不令人驚訝，其已經(jīng)失去了生物活性的重要部分所述生物活性分別為抗氧化活性、抗細(xì)菌活性及其抑制細(xì)菌生物膜形成和益生元活性。此外，通過熱處理可以使Lf變性。存在不同的可以用于研究乳轉(zhuǎn)鐵蛋白熱穩(wěn)定性的參數(shù)。熱處理變性遵循一級動力學(xué)。變性隨著溫度增加。無鐵乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(脫輔基乳轉(zhuǎn)鐵蛋白)顯示出比鐵飽和的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(全乳轉(zhuǎn)鐵蛋白)更快的變性。這反映出當(dāng)結(jié)合鐵時，構(gòu)象更穩(wěn)定。在熱變性過程中，幾個結(jié)合的破壞引起了 Lf結(jié)構(gòu)的重要變化。由于乳轉(zhuǎn)鐵蛋白與酪蛋白酸鹽和其他奶蛋白質(zhì)之間的相互作用，在其他奶成分的存在下，熱穩(wěn)定性提尚。從奶中提取出來的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白具有9至20%的鐵飽和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵飽和水平。 然而，與奶或干酪乳清任何熱處理前提取的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白相比，奶或干酪乳清巴氏滅菌后提取的蛋白不具有相同的活性水平并且不具有相同的值。實(shí)際上，熱處理能夠破壞對于保護(hù)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白對抗胃中存在的蛋白水解酶重要的分子的多糖鏈并且能夠產(chǎn)生Lf聚合物。還通過如下事實(shí)證明了這種作用使乳轉(zhuǎn)鐵蛋白接受熱處理時，該分子在^Onm下具有較高的吸光度(表1)。對熱處理敏感的多糖鏈的破壞還將提高細(xì)胞上乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的非特異性結(jié)合。替代促進(jìn)細(xì)胞生長，乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的非特異性結(jié)合反而將誘導(dǎo)細(xì)胞的窒息。實(shí)際上，商業(yè)Lf的生產(chǎn)者已經(jīng)確定了使用乙腈梯度通過反相HPLC來測定Lf的純度。分析一些商業(yè)Lf的純度，我們觀察到蛋白質(zhì)雜質(zhì)相對Lf峰為約8至9%。然而，稀釋相同量的商業(yè)Lf，通過灰分和含水量調(diào)節(jié)，我們在^Onm處沒有發(fā)現(xiàn)相同的光密度。這意味著如同Lf 一樣稀釋一些蛋白質(zhì)可以增加光密度。在圖2等中，我們能夠觀察到通過離子交換色譜FPLC(MorK)-S樹脂-Sulfopropyl)分析的Lf顯示出與熱處理Lf表面相比較小的表面。表面高度的降低是由于新表面的存在引起的，該新表面對應(yīng)于用FPLC分析觀察到的肩部，并且我們稱為峰C， 來簡化色譜圖的描述。我們還可觀察到Lf表面分裂成兩個部分峰A和峰B，彼此非常接
9近，峰A對應(yīng)于一個唾液酸含量的存在，這使該分子與不含有唾液酸的天然分子相比具有較小的堿性。就Lf-NFQ而言，Lf表面也是由兩個表面組成(表面A和表面B)。肩部(表面C)只在商業(yè)Lf中觀察到。與天然Lf相比，肩部或表面(在^Onm處具有較高的吸光度， 參見以下的表1。無論如何，我們可以認(rèn)為峰A和峰B是純Lf的一部分。使用反相色譜不能檢測到峰C的存在。為了了解這個峰C的存在，我們已經(jīng)進(jìn)行了 280nm至SOOnm的完整吸收光譜， 并且我們在410nm處觀察到Soret條帶(圖2)，這與Lf的鐵含量無關(guān)，因?yàn)樵揝oret條帶應(yīng)當(dāng)必須存在于接近465nm的波長處。此外，該峰C在^Onm處的吸光度幾乎是Lf的兩倍。只收集峰A和B，并且再次施加于Mono S樹脂上，我們可以注意到只有峰A和B存在于色譜圖上，沒有受到峰C的污染。另一方面，如果我們使含有峰A和B的溶液在5分鐘期間接受72°C的溫度，并且我們在Mono S樹脂上分析該溶液，我們觀察到與原始色譜圖相比，峰A的表面和峰B的表面的明顯下降，并且還出現(xiàn)了峰C(圖2)。我們使Lf接受更長時間的熱處理，更多的峰A和B將具有較低的面積，而峰C更明顯。如果我們在反相上比較，沒有熱處理的Lf色譜圖和經(jīng)過了 5分鐘熱處理(72°C ) 的相同Lf的色譜圖，我們可以注意到?jīng)]有熱處理的Lf的表面低于經(jīng)過了熱處理的Lf的表面(圖3)。已經(jīng)將峰C表征為具有更高吸光度的Lf聚合物。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，至少包括下列步驟a)使用沒有在高于50°C的溫度下處理過的原料，b)使該原料接受處理，以獲得乳抑菌素(LN)或乳堿性蛋白(MBP)的溶液，c)使該LN或MBP溶液接受在陽離子交換樹脂上純化的步驟，該樹脂用4與9之間pH 的醋酸鹽緩沖液平衡，并用含有不同溶質(zhì)濃度的不同緩沖液洗脫，和d)收集含有純度超過95%，不具有聚合物并且基本上沒有LPS、內(nèi)毒素和血管生成素的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的級分。
2.如權(quán)利要求1中所限定的方法，其中在潔凈室中進(jìn)行收集乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的步驟。
3.如權(quán)利要求1或2中所限定的方法，其中步驟b)是使該原料接受在陽離子交換樹脂上的提取步驟的步驟，使用排除的溶質(zhì)濃度溶液，以獲得LN或乳堿性蛋白(MBP)的溶液。
4.如權(quán)利要求1至3中所限定的方法，其中以流過或結(jié)合和洗脫模式來進(jìn)行在陽離子交換樹脂上的提取或純化步驟。
5.如權(quán)利要求1至4中所限定的方法，其中排除的溶質(zhì)是氯化鈉。
6.如權(quán)利要求1至5中所限定的方法，其中在步驟b)后進(jìn)行濃縮和滲濾的步驟。
7.如權(quán)利要求1至6中所限定的方法，其中步驟c)包括至少四個洗脫步驟，一個收集雜質(zhì)的步驟，一個收集乳過氧化物酶的步驟，一個收集LPS、內(nèi)毒素、蛋白酶和血管生成素的步驟和一個收集乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的步驟。
8.如權(quán)利要求1至7中所限定的方法，其中在4與7之間的pH下進(jìn)行收集乳過氧化物酶、LPS、內(nèi)毒素、蛋白酶和血管生成素的步驟。
9.如權(quán)利要求1至8中所限定的方法，其中在介于7和9之間的pH下進(jìn)行收集乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的步驟。
10.如權(quán)利要求1至9中所限定的方法，其中在純化步驟中，溶質(zhì)是濃度介于0.02至 1. 5M之間的氯化鈉。
11.一種乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，其具有超過95%的純度，基本上無LPS、內(nèi)毒素和血管生成素，具有介于9%至15%之間的鐵飽和水平。
12.如權(quán)利要求11中所限定的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，包含低于50pg/mg的LPS、內(nèi)毒素和血管生成素。
13.如權(quán)利要求11至12中所限定的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，其中其鐵飽和水平為15%至20%。
14.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于促進(jìn)新生兒胃腸道的成熟，或胃腸炎恢復(fù)條件下腸粘膜的組織修復(fù)的用途。
15.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于提高新生兒的肝合成的用途。
16.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于增強(qiáng)單核細(xì)胞的自然殺傷(NK)活性以及提高NK和淋巴因子-激活殺傷(LAK)細(xì)胞細(xì)胞毒性功能的用途。
17.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白通過其在巨噬細(xì)胞、T和 B-淋巴細(xì)胞以及白細(xì)胞細(xì)胞上的特異性受體作為潛在抗腫瘤劑的用途。
18.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于降低一些促炎細(xì)胞因子的表達(dá)的用途。
19.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于抑制或殺滅細(xì)菌或治療與生物膜細(xì)菌相關(guān)的疾病的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，與生物膜細(xì)菌相關(guān)的疾病是囊性纖維化或口腔炎癥。
21.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于制備傷口護(hù)理溶液、 創(chuàng)傷護(hù)理溶液、耳部護(hù)理溶液、傷口愈合軟膏或眼部護(hù)理溶液的用途。
22.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于就缺鐵癥和缺鐵性貧血患者而言以及對于孕婦的情況下通過上皮細(xì)胞攝取鐵的用途。
23.通過權(quán)利要求1至10中所限定的方法獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白用于治療呼吸道傳染病 (URTI和LRTI)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，至少包括步驟a)使用沒有在高于50℃的溫度下處理過的原料，b)使該原料接受處理，以獲得乳抑菌素(LN)或乳堿性蛋白(MBP)的溶液，c)使該LN或MBP溶液接受在陽離子交換樹脂上純化的步驟，該樹脂用4至9pH的醋酸鹽緩沖液平衡，并用含有不同溶質(zhì)濃度的不同緩沖液洗脫，和d)收集含有純度超過95％，不含有聚合物并且基本上沒有LPS、內(nèi)毒素和血管生成素的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白的級分。還涉及所獲得的乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，其具有超過95％的純度，基本上無LPS、內(nèi)毒素和血管生成素，具有9％至15％的鐵飽和水平。
文檔編號C07K1/18GK102348387SQ201080010953
公開日2012年2月8日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月28日
發(fā)明者讓-保羅·佩羅丹 申請人:讓-保羅·佩羅丹