專利名稱：：純化小模塊免疫藥物蛋白的方法純化小模塊免疫藥物蛋白的方法相關(guān)申請(qǐng)參考本申請(qǐng)要求2009年3月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/159，347號(hào)的權(quán)益，其內(nèi)容整體援引并入本文。
背景技術(shù)：
：通常，當(dāng)生產(chǎn)藥用蛋白時(shí)，在其可以用于診斷應(yīng)用、治療應(yīng)用、應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和功能研究之前，必須從蛋白制備物去除污染物。例如，從培養(yǎng)細(xì)胞收獲的蛋白制備物常含有不需要的組分，如細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的高分子量(HMW)團(tuán)聚體。在給藥時(shí)高分子量團(tuán)聚體可以通過引起補(bǔ)體激活或過敏反應(yīng)而不利地影響產(chǎn)品安全性。此外，團(tuán)聚體可以通過引起產(chǎn)物產(chǎn)量減少、峰加寬和活性丟失來阻礙制造過程。與抗體和其他治療性蛋白相比，小模塊免疫藥物(SMIP)蛋白屬于相對(duì)較新種類的藥物蛋白。因此，由于對(duì)這類型蛋白缺乏認(rèn)識(shí)，SMIP蛋白的純化特別具有挑戰(zhàn)性。此外，SMIP蛋白具有高聚集傾向。例如，細(xì)胞培養(yǎng)物中HMW團(tuán)聚體的百分率可以高達(dá)50-60%。發(fā)明概述本發(fā)明提供了純化含有HMW團(tuán)聚體的蛋白的有效方法。本發(fā)明涵蓋了以下發(fā)現(xiàn)，利用不超過3個(gè)層析步驟可以從含有高百分率HMW團(tuán)聚體(例如，超過50-60%)的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白。因此，根據(jù)本發(fā)明的創(chuàng)造性的方法減少了柱步驟的數(shù)量，導(dǎo)致加工時(shí)間顯著減少并且產(chǎn)物產(chǎn)量顯著提高。本發(fā)明特別有益于純化小模塊免疫藥物蛋白。本發(fā)明的方法還可以用于純化其他蛋白，特別是那些具有聚集傾向的蛋白。在一方面，本發(fā)明提供了從含有高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白的方法，其包括在操作條件下使所述蛋白制備物進(jìn)行羥基磷灰石層析的步驟，使得所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4%的團(tuán)聚體(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%、1.5%、1%、0.8%、0.6%、0.5%、0.4%、0.2%或0.1%)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包含不超過3個(gè)層析步驟。在一些實(shí)施方案中，所述操作條件包括在磷酸鹽緩沖液中從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無內(nèi)毒素的。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無熱原的。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液包含磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。在一些實(shí)施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液含有在lmM-50mM濃度范圍的磷酸鈉。在一些實(shí)施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液還含有在100mM-2.5M濃度范圍的氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液含有在2mM-32mM濃度范圍的磷酸鈉和在IOOmM-L6M濃度范圍的氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，合適的磷酸鹽緩沖液具有6.5-8.5范圍的PH。在一些實(shí)施方案中，所述操作條件包括通過NaCl梯度從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述操作條件包括通過NaCl分步洗脫方法從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述操作條件包括通過磷酸鹽梯度(例如，線性磷酸鹽梯度)從羥基磷灰石層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述羥基磷灰石層析使用含有I型或II型陶瓷羥基磷灰石樹脂的柱。在一些實(shí)施方案中，所述柱含有I型陶瓷羥基磷灰石樹脂。在一些實(shí)施方案中，適合羥基磷灰石層析的樹脂直徑為ιμrn-l,000μm。在一些實(shí)施方案中，適合羥基磷灰石層析的樹脂直徑為10μm-100μm。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在羥基磷灰石層析步驟之前通過親和層析純化蛋白制備物的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析步驟使用結(jié)合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的蛋白吸收劑。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析使用結(jié)合至免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的蛋白吸收劑。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的蛋白吸收劑結(jié)合至VH3結(jié)構(gòu)域或與VH3同源的結(jié)構(gòu)域(例如，來自VH3家族的結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的蛋白吸收劑包含A蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析使用MabklectTMrfr0teinA樹脂柱。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包括加入添加劑(例如，PEG和/或其他非離子型有機(jī)聚合物)以促進(jìn)結(jié)合至蛋白吸著劑的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析步驟包含利用洗滌緩沖液洗滌親和層析柱，所述洗滌緩沖液包含Hepes、氯化鈉、氯化鈣、精氨酸、Tris、氯化鎂、組氨酸、尿素、咪唑、一種或多種有機(jī)溶劑(例如，乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、異丙醇和丁醇)和/或去污劑(例如，離子型或非離子型)。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析步驟包含利用洗脫緩沖液從親和層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白，所述洗脫緩沖液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化鎂、尿素、丙二醇、乙二醇、一種或多種有機(jī)酸(例如，乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、苯二甲酸和水楊酸)和/或精氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液還包含選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其組合的鹽。在一些實(shí)施方案中，所述鹽濃度范圍為ImM-lM。在某些實(shí)施方案中，所述鹽濃度范圍為lmM-500mM。在某些實(shí)施方案中，所述鹽濃度范圍為ImM-IOOmM在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包含利用陰離子交換層析樹脂通過陰離子交換層析純化蛋白制備物的步驟。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包含在親和層析之后但是在羥基磷灰石層析步驟之前通過陰離子交換層析純化蛋白制備物的步驟。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包含加入添加劑以增強(qiáng)小模塊免疫藥物蛋白和/或雜質(zhì)結(jié)合至陰離子交換層析樹脂的步驟。在一些實(shí)施方案中，加入的添加劑誘導(dǎo)一種或多種污染物或雜質(zhì)從蛋白制備物沉淀。在一些實(shí)施方案中，通過過濾從蛋白制備物去除沉淀的污染物。在一些實(shí)施方案中，合適的添加劑為或含有非離子型有機(jī)聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纖維素、葡聚糖、淀粉和/或聚乙烯吡咯烷酮)。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包含在親和或陰離子交換層析之前將蛋白制備物應(yīng)用于深層濾器(cbpthfilter)的步驟。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包含一個(gè)或多個(gè)過濾步驟。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)過濾步驟包含病毒保留過濾步驟。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)過濾步驟包含超濾和/或滲濾步驟。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白制備物是從培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、無細(xì)胞培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物制備的。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白制備物為細(xì)胞培養(yǎng)基制備物。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基制備物含有從培養(yǎng)細(xì)胞分泌的小模塊免疫藥物蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)細(xì)胞為CHO細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基制備物是從大型生物反應(yīng)器制備的。在一些實(shí)施方案中，待純化的蛋白制備物含有細(xì)胞提取物。在一些實(shí)施方案中，待純化的蛋白制備物是從包涵體制備的。在另一方面，本發(fā)明提供了從含有高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白的方法，所述方法通過使所述蛋白制備物在操作條件下進(jìn)行(a)親和層析和/或離子交換層析(例如，一個(gè)或兩個(gè)離子交換層析步驟)，和(b)羥基磷灰石層析，使得純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%,0.2%,0.1%)的團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，使所述蛋白制備物進(jìn)行(al)親和層析、(^)離子交換層析和(b)羥基磷灰石層析。在一些實(shí)施方案中，使所述蛋白制備物進(jìn)行(al)陽離子交換層析、(^)陰離子交換層析和(b)羥基磷灰石層析。在一些實(shí)施方案中，所述親和層析為A蛋白層析。在一些實(shí)施方案中，所述離子交換層析為陰離子或陽離子交換層析。在一些實(shí)施方案中，所述離子交換層析樹脂選自QSepharoseFF、QS印haroseXL,DEAES印haroseFF,POROSHQ50,ToyopearlιDEAEJoyopearlGigaCapQ-650M,ToyopearlDEAE-650M,CaptoQ、CaptoDEAE和觸角型陰離子交換層析(tentacleanionexchangechromatography)(例如，F(xiàn)ractogelTMAEHiCap(M)>FractogelTMAE(TM或Fractopr印TMAETM)。在一些實(shí)施方案中，所述陰離子交換層析樹脂為帶電膜吸收體(例如，MustangQ、MustangE、&irtobind和/或Chromasorb)。在一些實(shí)施方案中，所述離子交換層析樹脂為帶電單片支持體(例如，CIM-DISK)。在特別的實(shí)施方案中，所述親和層析為MabklectrProteinA親和層析，所述離子交換層析為觸角型陰離子交換層析，并且所述羥基磷灰石層析為I型陶瓷羥基磷灰石層析。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包含不超過3個(gè)層析步驟。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還包括剝除(strip)和/或再生一個(gè)或多個(gè)層析柱用于重新使用的步驟。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化含有超過5%(例如，超過lO^JO^i、30%、40(%、50(%、60(%、70(%或更多)的高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化含有少于70%(例如，少于60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%)的高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化含有4-70%(例如，4-60%、4-50%、4-40%、4-30%、4-20%、4-15%、4-10%)的高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于純化特異性結(jié)合至CD20的小模塊免疫藥物蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于純化包含與SEQIDNO:1-59和67-76中任一個(gè)具有至少80%相同性的氨基酸序列的小模塊免疫藥物蛋白。在另一方面，本發(fā)明用于從含有超過20%(例如，超過25%、30%、35%、40%、45^^50^^55%,60^^70%或更多)的高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化蛋白，其包括使蛋白制備物在操作條件下進(jìn)行羥基磷灰石層析的步驟，使得純化的蛋白含有少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%,0.2%或0.)的團(tuán)聚體。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白制備物含有超過60%的高分子量團(tuán)聚體。在某些實(shí)施方案中，所述操作條件包含在磷酸鹽緩沖液中從羥基磷灰石層析柱洗脫蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無內(nèi)毒素的。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液是無熱原的。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液包含磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液包含在lmM-50mM濃度范圍的磷酸鈉。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液還包含在100mM-2.5M濃度范圍的氯化鈉。在特別的實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液包含在2mM-32mM濃度范圍的磷酸鈉和在IOOmM-L6M濃度范圍的氯化鈉。在一些實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液具有6.5-8.5范圍的pH。在一些實(shí)施方案中，待純化的蛋白含有小模塊免疫藥物多肽。本發(fā)明還提供了利用本文所述方法純化的小模塊免疫藥物蛋白。此外，本發(fā)明提供了包含小模塊免疫藥物蛋白和藥學(xué)可接受媒介物的藥物組合物，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含少于4%(例如，少于3.5%,3%,2.5%,2%U.5%U%>0.8%,0.6%,0.5%,0.4%、0.2%或0·1%)的團(tuán)聚體。在本申請(qǐng)中，除非另有說明，“或”的使用表示“和/或”。如本申請(qǐng)所用，術(shù)語“包含(comprise)，，和該術(shù)語的變體，例如“包含(comprising)，，和“包含(comprises)，，并不排除其他添加劑、組分、整體或步驟。如本申請(qǐng)所用，術(shù)語“約”和“大約”等義使用。本申請(qǐng)所用的任何數(shù)字，有或沒有約/大約，意味著覆蓋相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的任何正常波動(dòng)。本發(fā)明的其他特點(diǎn)、目的和優(yōu)點(diǎn)在下文的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求中是顯而易見的。然而，應(yīng)該理解詳細(xì)描述、圖片和權(quán)利要求在說明本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)，僅以說明的方式給出，而不是限制。在本發(fā)明范圍之內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。附圖僅用于說明目的，而不是為了限制。圖1示出了抗CD20小模塊免疫藥物蛋白的示例性結(jié)構(gòu)。圖2說明了溶液中可能的SMIP分子的示例性構(gòu)型。圖3A-3C說明各種結(jié)構(gòu)域-交換機(jī)理可以導(dǎo)致形成SMIP分子的高分子量團(tuán)聚體，如三聚體、四聚體或多聚體。圖4示出了說明示例性細(xì)胞培養(yǎng)和收獲過程的示意圖。圖5示出了在12-14天培養(yǎng)期期間2個(gè)不同CHO細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的TRU-015的生產(chǎn)生物反應(yīng)器的示例性每天滴度測(cè)量(μg/mL)。在生產(chǎn)生物反應(yīng)器生長(zhǎng)的第12天和第14天之間獲得了滴度峰值。滴度峰值范圍為1500-3000μg/mL。圖6示出了利用批量結(jié)合機(jī)理的高通量篩選的示例性設(shè)計(jì)。圖7示出了A蛋白柱操作和高通量篩選模型的示例性設(shè)計(jì)。圖8示出了示例性A蛋白高通量篩選結(jié)果。圖9.(A)在陶瓷羥基磷灰石層析的高通量篩選中測(cè)試的示例性變量的總結(jié)。(B)示例性等高線圖顯示在cHA純化期間當(dāng)使用不同濃度磷酸鹽和NaCl時(shí)的百分比HMW化合物。(C)示例性HMWvs.LogKp圖證實(shí)在約10的Kp(或logKp為1)下，大部分HMW化合物已從樣品去除。圖10示出了為了cHA層析步驟的發(fā)展的利用cHA柱和NaCl梯度洗脫的示例性可選蹄選。圖11示出了示例性典型cHA層析譜。圖12示出了示例性TRU-015純化過程。圖13示出了通過MabklectProteinA親和層析與通過CEX的HMW團(tuán)聚體減少量的示例性比較。圖14示出了顯示CEX樹脂的蛋白產(chǎn)物結(jié)合容量的示例性結(jié)果。圖15示出了顯示利用25vs.75mg/mLr裝載挑戰(zhàn)(loadingchallenge)的CEX峰的示例性結(jié)果。圖16示出了證明利用AEX柱有效去除HMW的示例性結(jié)果。收集池為88%純，具有>95%產(chǎn)率的“單體”SMIP蛋白。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了基于羥基磷灰石層析的從含有HMW團(tuán)聚體和其他雜質(zhì)的蛋白制備物純化或回收蛋白，特別是小模塊免疫藥物蛋白的方法。在一些實(shí)施方案中，所述羥基磷灰石層析與親和層析和/或離子交換層析組合使用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的創(chuàng)造性的方法還包括一個(gè)或多個(gè)過濾步驟以進(jìn)一步去除病毒污染物、濃縮蛋白和/或緩沖液交換。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法具有不超過3個(gè)層析步驟(例如，2個(gè)層析步驟或3個(gè)層析步驟)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法具有不超過3個(gè)過濾步驟(例如，2個(gè)過濾步驟、3個(gè)過濾步驟)。如實(shí)施例部分所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了合適的羥基磷灰石層析、親和層析和/或離子交換層析操作條件，其允許從蛋白制備物有效去除HMW團(tuán)聚體和其他雜質(zhì)(例如，DNA、宿主細(xì)胞蛋白、病毒和其他污染物)。在一些實(shí)施方案中，HMW團(tuán)聚體的百分率可以從起始制備物中超過20%(例如，25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%或更多)減少至純化的蛋白產(chǎn)物中少于4%(例如，少于3.5%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.8%,0.6%,0.4%,0.2%,0.1%)0在一些實(shí)施方案中，起始制備物中的HMW團(tuán)聚體可以減少至少約5倍，或至少約10倍，或至少約20倍，或至少約30倍，或至少約40倍，或至少約50倍，或至少約60倍，或至少約70倍，或至少約80倍，或至少約90倍，或至少約100倍。此外或可選地，純化的蛋白中其他污染(例如，HCP)的百分率不超過約10，000ppm，或不超過約5000ppm，或不超過約2500ppm，或不超過約400ppm，或不超過約360ppm，或不超過約320ppm,或不超過約^Oppm，或不超過約MOppm，或不超過約200ppm，或不超過約160ppm，或不超過約140ppm，或不超過約120ppm，或不超過約lOOppm，或不超過約80ppm，或不超過約60ppm，或不超過約40ppm，或不超過約30ppm，或不超過約20ppm，或不超過約lOppm。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的創(chuàng)造性的方法提供了所關(guān)注蛋白的至少50%的回收率(例如，至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供了至少20%的產(chǎn)物產(chǎn)率(例如，至少22%、24%、沈％、觀％、30%、32%、34%、36%、38%、40%、42%、44%、46%、48%或50%)。在以下部分中詳細(xì)描述了本發(fā)明的各方面。部分的用途不是為了限制本發(fā)明。每個(gè)部分可以應(yīng)用于本發(fā)明的任何方面。在本申請(qǐng)中，除非另有說明，“或”的使用表示“和/或”。定義為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義某些術(shù)語。以下術(shù)語和其他術(shù)語的額外的定義在整個(gè)說明書中指出。吸收劑吸收劑是附著至固相支持體的至少一種分子，或者本身是固體的至少一種分子，其用于進(jìn)行層析。11親和層析親和層析是利用生物分子之間特異性、可逆的相互作用，例如，A蛋白結(jié)合至IgG抗體的Fc部分的能力，而不是諸如等電點(diǎn)、疏水性或大小的分子一般特性來實(shí)現(xiàn)層析分離的層析。在實(shí)踐中，親和層析包含利用諸如附著至固相支持體的A蛋白的吸收劑來層析分離或多或少緊密結(jié)合至吸收劑的分子。參見Ostrove(1990)GuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymology182:357-379,^^{φ^Λ^ο大約如本文所用，當(dāng)應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)所關(guān)注的值時(shí)，術(shù)語“大約”或“約”指與所述參考值相似的值。在某些實(shí)施方案中，除非從上下文另有說明或顯而易見，術(shù)語“大約”或“約，，指落在所述參考值的任一方向(大于或小于)25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%之內(nèi)的值的范圍(除了這樣的數(shù)會(huì)超過可能值的100%的地方)。結(jié)合-洗脫模式術(shù)語“結(jié)合-洗脫模式”(也被稱為“結(jié)合模式”)指產(chǎn)物制備物分離技術(shù)，其中制備物中含有的至少一種產(chǎn)物結(jié)合至層析樹脂或介質(zhì)。在這種模式中的結(jié)合產(chǎn)物在洗脫階段期間被洗脫。層析層析是通過混合物通過吸收劑的滲濾來互相分離混合物中化學(xué)性質(zhì)不同的分子，所述吸收劑或多或少強(qiáng)烈吸附或保留不同分子。在更強(qiáng)烈吸附或保留的分子不被釋放的條件下，被吸收劑最少強(qiáng)度吸附或保留的分子從吸收劑釋放。免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域抗體免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域是與人或動(dòng)物來源的Q、CH1、Ch2Xh3或Ch4結(jié)構(gòu)域相同或基本上相似的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。參見例如CharlesAHasemannandJ.DonaldCapra,ImmunoglobulinsStructureandFunction,inWilliamE.Paul,ed.,FundamentalImmunology,SecondEdition,209，210-218(1989)，其整體援引并入本文。CH2或Ch3結(jié)構(gòu)域，或者與Ch2或Ch3結(jié)構(gòu)域基本上相似的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域也被稱為抗體的F。部分。污染物或雜質(zhì)污染物或雜質(zhì)指任何外源或不期望的分子，包括也存在于被純化的所關(guān)注蛋白的樣品中的生物大分子，如DNA、RNA或除被純化的所關(guān)注蛋白之外的蛋白。雜質(zhì)包括，例如，蛋白變體，如聚集的蛋白、高分子量種類、低分子量種類和片段以及脫酰胺種類；來自分泌被純化的蛋白的宿主細(xì)胞的其他蛋白(宿主細(xì)胞蛋白)；可能在之前的純化步驟期間滲入樣品的用于親和層析的吸收劑的部分蛋白，如A蛋白；內(nèi)毒素；和病毒。流穿模式術(shù)語“流穿模式”一般指產(chǎn)物制備物分離技術(shù)，其中制備物中含有的至少一種產(chǎn)物將流穿層析樹脂或介質(zhì)，而至少一種潛在的污染物或雜質(zhì)結(jié)合至層析樹脂或介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，流穿模式為弱分配層析(WPC)，其中產(chǎn)物可以弱結(jié)合至樹脂，而至少一種潛在的污染物或雜質(zhì)更優(yōu)先地結(jié)合至層析樹脂或介質(zhì)。通常，WPC在比傳統(tǒng)流穿模式更高的分配系數(shù)下，但是在比結(jié)合-和-洗脫模式更低的分配系數(shù)下操作。在弱分配中，可以用裝載階段之后實(shí)施的較大裝載挑戰(zhàn)和短洗滌來實(shí)現(xiàn)高回收率。宿主細(xì)胞蛋白宿主細(xì)胞蛋白是編碼待純化蛋白的DNA被引入的宿主細(xì)胞天然存在的基因組所編碼的蛋白。宿主細(xì)胞蛋白可以是待純化蛋白的污染物，其水平可以通過純化來降低。宿主細(xì)胞蛋白可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉頊y(cè)定，包括凝膠電泳和染色和/或ELISA測(cè)定等。羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析是用陶瓷羥基磷灰石作為吸收劑的層析。參見例如MarinaJ.Gorbunoff(1990),ProteinChromatographyonHydroxyapatiteColumns,GuidetoProteinPurification,MurrayP.Deutscher,ed.,MethodsinEnzymology182:329-339,其整體并入本文。裝載術(shù)語“裝載”指含有來源于澄清的細(xì)胞培養(yǎng)物或發(fā)酵條件培養(yǎng)基的產(chǎn)物，或者來源于層析步驟的部分純化的中間物的任何裝載物質(zhì)。術(shù)語“裝載流體”指含有裝載物質(zhì)的液體，用于在本發(fā)明的操作條件下通過介質(zhì)。裝載挑戰(zhàn)(LC)術(shù)語“裝載挑戰(zhàn)”指在層析步驟的裝載循環(huán)中裝上柱或在批量結(jié)合中應(yīng)用于樹脂的產(chǎn)物的總質(zhì)量，測(cè)量單位為產(chǎn)物質(zhì)量每單位體積樹脂。A蛋白A蛋白是最初在葡萄球菌(Mapphylococcus)的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其結(jié)合至抗體的F。部分或可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，A蛋白結(jié)合至來自VH3家族的結(jié)構(gòu)域(例如，IgG抗體的VH3結(jié)構(gòu)域)。為了本發(fā)明的目的，“A蛋白”為任何與葡萄球菌(MapphylococcaDA蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商購和/或重組形式的A蛋白。為了本發(fā)明的目的，為了確定基本相似性的目的的A蛋白生物活性為結(jié)合至IgG抗體的Fc部分或可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH3)的能力。G蛋白G蛋白是最初在鏈球菌(Sti^pt0c0ccus)的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其結(jié)合至抗體(例如，IgG)的F。部分或可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，G蛋白結(jié)合至來自乂氏家族的結(jié)構(gòu)域(例如IgG抗體的VH3結(jié)構(gòu)域)。為了本發(fā)明的目的，“G蛋白”為任何與鏈球菌(Str印tococcal)G蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商購和/或重組形式的G蛋白。為了本發(fā)明的目的，為了確定基本相似性的目的的G蛋白生物活性為結(jié)合至IgG抗體的F。部分或可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH3)的能力。LG蛋白LG蛋白是結(jié)合至IgG抗體的重組融合蛋白，其包含G蛋白(參見上文的定義)和L蛋白部分。L蛋白最初是從消化鏈球菌(P^tosti^ptococcus)的細(xì)胞壁分離的。LG蛋白包含來自L蛋白和G蛋白的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Volaetal.(1994)Cell.Biophys.24-2527-36，其整體并入本文。為了本文的目的，“LG蛋白”為任何與LG蛋白相同或基本上相似的蛋白，包括商購和/或重組形式的LG蛋白。為了本文的目的，為了確定基本相似性的目的的LG蛋白生物活性為結(jié)合至IgG抗體的能力。純化純化蛋白表示減少外源或不期望的元素的量，特別是可能存在于蛋白樣品中的生物大分子，如蛋白或DNA。外源蛋白的存在可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定，包括凝膠電泳和染色和/或ELISA測(cè)定。DNA的存在可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定，包括凝膠電泳和染色和/或利用聚合酶鏈反應(yīng)的測(cè)定?？贵w免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域抗體免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域是與人或動(dòng)物來源的\或Vh結(jié)構(gòu)域相同或基本上相似的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。為了本發(fā)明的目的，為了確定基本相似性的目的的抗體免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域生物活性為抗原結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗體免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域?yàn)閂H3結(jié)構(gòu)域。如本文所用的VH3結(jié)構(gòu)域指VH3本身或任何與VH3結(jié)構(gòu)域具有同源性的結(jié)構(gòu)域。小模塊免疫藥物蛋白如本文所用，小模塊免疫藥物(SMIP)蛋白指含有一個(gè)或多個(gè)以下融合結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或由其衍生的結(jié)構(gòu)域；和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，其可以為免疫球蛋白重鏈Ch2恒定區(qū)或由其衍生的結(jié)構(gòu)域；和免疫球蛋白重鏈Ch3恒定區(qū)或由其衍生的結(jié)構(gòu)域。SMIP蛋白治療劑優(yōu)選為單特異性的(即其識(shí)別并附著至單個(gè)抗原靶標(biāo)以啟動(dòng)生物頁活性)。本發(fā)明還涉及多特異性和/或多價(jià)分子，如SCORPION治療劑，其并入了SMIP蛋白并且還具有額外的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于該分子的SMIP蛋白部分的C端。優(yōu)選地，SCORPION治療劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域每個(gè)結(jié)合至不同靶標(biāo)。適合本發(fā)明的小模塊免疫藥物的結(jié)構(gòu)域?yàn)榛騺碓从谌嘶蛐蛄挟a(chǎn)物的多肽，任何其他天然或人工來源，包括基因工程和/或突變的多肽。小模塊免疫藥物也被稱為結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，適合小模塊免疫藥物的鉸鏈區(qū)來源于免疫球蛋白，如IgGl、IgA、IgE等。例如，鉸鏈區(qū)可以為具有零個(gè)、一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基的突變IgGl鉸鏈區(qū)多肽。適合小模塊免疫藥物蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以為任何具有特異性識(shí)別并結(jié)合至同源(cognate)生物分子的能力的蛋白，所述同源生物分子如抗原、受體(例如，CD20)或者超過一個(gè)分子或組件或團(tuán)聚體的復(fù)合體。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)多肽，如重鏈或輕鏈V-區(qū)的全部或部分或片段，只要其能夠特異性結(jié)合抗原或其他所關(guān)注的期望靶結(jié)構(gòu)。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括單鏈免疫球蛋白來源的Fv產(chǎn)物，其可以包括至少一個(gè)免疫球蛋白輕鏈V-區(qū)的全部或部分和至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈V-區(qū)的全部或部分，并且其還包含融合至V-區(qū)的接頭。本發(fā)明可以應(yīng)用于各種小模塊免疫藥物。示例性小模塊免疫藥物可以靶向受體或其他蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受體家族成員，如EGF受體，HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘附分子，如LFA-1，Mol，pl50、95，VLA-4，ICAM-1，VCAM；生長(zhǎng)因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；C蛋白；EGFR、RAGE、P40、DkkUNOTCHUIL-13、IL-21、IL-4和IL-22等。在一些實(shí)施方案中，利用本發(fā)明純化特異性識(shí)別CD20的小模塊免疫藥物。特異性結(jié)合⑶20的示例性小模塊免疫藥物蛋白如圖1所示。如圖1所示，抗⑶20SMIP蛋白通常為重組同型二聚體融合蛋白，由3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成(1)嵌合(鼠/人)CD20結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括通過氨基酸接頭(例如，15-氨基酸接頭)連接的可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)片段；(2)修飾的人免疫球蛋白(例如，IgGl)鉸鏈結(jié)構(gòu)域和，(3)IgG效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，如人IgGl的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。通常，SMIP蛋白可以兩種明顯相關(guān)的同型二聚體形式存在，預(yù)測(cè)的鏈間二硫鍵連接的共價(jià)同型二聚體(CD)的主要形式，和不具有鏈間二硫鍵的同型二聚體形式(可分離的二聚體，DD)?？煞蛛x的二聚體一般是完全活性的。通常，二聚體具有約106，000道爾頓的理論分子量。SMIP蛋白還可以形成多價(jià)復(fù)合體。通常，SMIP蛋白作為糖蛋白存在。例如，如圖1所示，可以用寡糖在每個(gè)蛋白鏈的CH2結(jié)構(gòu)域中的N聯(lián)糖基化共有序列(例如，327NST)處修飾抗CD20SMIP蛋白(參見圖1)。SMIP蛋白還可以含有核心-巖藻糖基化脫唾液酸-去半乳糖-二分支的N聯(lián)寡糖(GOF)；在每條鏈上的C00H-末端Gly476和NH2-末端焦谷氨酸鹽(G0F/G0F)。兩種較少的糖形GlF/GOF和G1F/G1F以及其他預(yù)期的痕量級(jí)N聯(lián)糖形也可以存在。此外，在SMIP蛋白的鉸鏈區(qū)中還觀察到低水平的核心10-聚糖修飾。在一些實(shí)施方案中，SMIP蛋白的等電點(diǎn)(pi或IEP)范圍為約7.0-9.0(例如，7.2、7·4、7·6、7·8、8·0、8·2、8·4、8·6、8·8)。如本文所討論的，本發(fā)明可以用于純化各種形式的SMIP蛋白(例如，單體多肽、同型二聚體、可分離的二聚體或多價(jià)復(fù)合體)。本發(fā)明可以用于純化各種修飾的SMIP蛋白，如人源化SMIP或嵌合SMIP蛋白。如本文所用，術(shù)語“人源化SMIP蛋白，，指包括至少一個(gè)人源化免疫球蛋白區(qū)(例如，人源化免疫球蛋白可變區(qū)或恒定區(qū))的SMIP蛋白。在一些實(shí)施方案中，人源化SMIP蛋白包含人源化可變區(qū)，其包括基本上來源于人免疫球蛋白的可變框架區(qū)(例如，全人FR1、FR2、FR3和/或FR4)，同時(shí)保持了一個(gè)或多個(gè)靶特異性互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)(例如，至少一個(gè)⑶R、兩個(gè)⑶R或三個(gè)⑶R)。在一些實(shí)施方案中，人源化SMIP蛋白包含一個(gè)或多個(gè)人或人源化恒定區(qū)(例如，人免疫球蛋白Ch2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域)。術(shù)語“基本上來自人免疫球蛋白或抗體”或“基本上人”表示，當(dāng)為了比較目的與人免疫球蛋白或抗體氨基序列比對(duì)時(shí)，該區(qū)域與人框架或恒定區(qū)序列享有至少80-90%，優(yōu)選90-95%,更優(yōu)選95-99%的相同性(即局部序列相同性)，其允許例如，保守置換、共有序列置換、種系置換、回復(fù)突變等。如本文所用，術(shù)語“嵌合SMIP蛋白”指可變區(qū)來源于第一物種并且恒定區(qū)來源于第二物種的SMIP蛋白。例如，嵌合SMIP蛋白可以通過基因工程從屬于不同物種的免疫球蛋白基因片段構(gòu)建。人源化和嵌合SMIP蛋白在國(guó)際申請(qǐng)公開WO2008/156713中進(jìn)一步描述，其援引并入本文。本發(fā)明還可以用于純化具有改變效應(yīng)器功能的修飾的糖基化模式和/或鉸鏈、Ch2和/或Ch3結(jié)構(gòu)域突變的SMIP蛋白。在一些實(shí)施方案中，SMIP蛋白可以在鉸鏈連接區(qū)中相鄰或接近的位點(diǎn)上含有影響受體結(jié)合親和力的突變。此外，本發(fā)明可以用于純化包括小模塊免疫藥物多肽或其部分的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化包括SEQIDNO:1-76(參見示例性SMIP序列部分)中任一個(gè)的氨基酸序列或其變體的SMIP蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化含有可變結(jié)構(gòu)域的SMIP蛋白，所述可變結(jié)構(gòu)域具有SEQIDNO:1-59中任一個(gè)的氨基酸序列或其變體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化SMIP蛋白，其含有具有SEQIDNO:1-59中任一個(gè)的氨基酸序列或其變體的可變結(jié)構(gòu)域，具有SEQIDNO:60-64中任一個(gè)的氨基酸序列或其變體的鉸鏈區(qū)，和/或具有SEQIDNO:65或66的氨基酸序列或其變體的免疫球蛋白恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化具有SEQIDNO67-76中任一個(gè)的氨基酸序列或其變體的SMIP蛋白。如本文所用，親本序列的變體包括但不限于與親本序列至少70^^75^^80%,85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。兩個(gè)氨基酸序列的相同性百分比可以通過目視檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定，或者更優(yōu)選地，通過利用計(jì)算機(jī)程序比較序列信息來進(jìn)行比較，如GeneticsComputerGroup(GCG；Madison,Wis.)Wisconsinpackageversion10.Oprogram,"GAP"(Devereuxetal.,1984,Nucl.AcidsRes.12:387)^!比較的計(jì)算機(jī)程序。“GAP”程序的優(yōu)選缺省參數(shù)包括(I)Gribskov和Burgess的加權(quán)氨基酸比較矩陣((1986)，Nucl.AcidsRes.14:6745)，如SchwartzandDayhoff，eds.，AtlasofPolypeptideSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)所述，或其它可比較的比較矩陣；(對(duì)于氨基酸序列，每個(gè)缺口30的罰分并且每個(gè)缺口中每個(gè)符號(hào)1的額外罰分；C3)末端缺口不罰分；和(4)長(zhǎng)缺口無最大罰分。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的其他序列比較程序。額外的小模塊免疫藥物在以下專利中進(jìn)一步描述，例如美國(guó)專利公開20030133939、20030118592、20040058445、20050136049、20050175614、20050180970、20050186216,20050202012,20050202023,20050202028,20050202534,20050238646和20080213273；國(guó)際專利公開WO02/056910,WO2005/037989和WO2005/017148，全部援引并入本文。蛋白聚集不希望受任何理論束縛，應(yīng)該考慮結(jié)構(gòu)域交換可以為蛋白聚集機(jī)理。當(dāng)?shù)鞍椎拿黠@結(jié)構(gòu)分段(結(jié)構(gòu)域)與另一個(gè)單體的明顯結(jié)構(gòu)分段物理上交換以產(chǎn)生二聚體或更高的寡聚體時(shí)，發(fā)生結(jié)構(gòu)域交換。在結(jié)構(gòu)域交換的蛋白中，每個(gè)結(jié)構(gòu)域保持了與其在未交換的單體中的結(jié)構(gòu)可比的天然樣整體結(jié)構(gòu)。當(dāng)含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊蛋白被低PH、高溫或剪切力脅迫時(shí)，可以誘導(dǎo)部分折疊或“打開”的構(gòu)象(通過分離但折疊的結(jié)構(gòu)域來表征)。一些“打開”的分子通過簡(jiǎn)單的折疊結(jié)構(gòu)域的重新聯(lián)合來重折疊為其天然結(jié)構(gòu)。在某些情況下(通常被較高蛋白濃度所偏好)，結(jié)構(gòu)域重新聯(lián)合發(fā)生在兩個(gè)鄰近的分子之間，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域交換的二聚體。這樣的分子間交換可以傳播，導(dǎo)致更大的團(tuán)聚體。通常，結(jié)構(gòu)域交換的蛋白為非共價(jià)(但是穩(wěn)定)關(guān)聯(lián)的分子，具有天然樣結(jié)構(gòu)域折疊和結(jié)構(gòu)域間接觸。在這樣的情況下，通過通常分子內(nèi)存在的非常相同的結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域界面將多聚體蛋白保持在一起。在純化過程之前，SMIP蛋白含有大量(例如，20-60%)HMW蛋白(團(tuán)聚體)。過量的HMW含量可能是由于SMIP的分子結(jié)構(gòu)。如圖1所示，典型的SMIP二聚體分子含有2個(gè)相同的單鏈Fv區(qū)，包括通過柔性接頭(例如，GGGSGGGGSGGS(SEQIDNO:77))連接的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其與人IgGlFc結(jié)構(gòu)域融合(圖1)。不希望受任何理論束縛，因?yàn)槊總€(gè)亞基中的柔性接頭，SMIP分子可能更易于解折疊(打開Fv構(gòu)象)然后結(jié)構(gòu)域交換，導(dǎo)致蛋白聚集。根據(jù)利用冷凍電子顯微鏡的研究，SMIP分子在溶液中可以例如緊湊、混合、拉伸或雙抗體樣構(gòu)型存在(圖幻。不希望受任何理論束縛，應(yīng)該考慮一些具有拉伸或打開的鏈的SMIP分子可以嘗試通過簡(jiǎn)單的折疊結(jié)構(gòu)域的重新聯(lián)合來重折疊為其天然結(jié)構(gòu)。如圖3A所示，結(jié)構(gòu)域重新聯(lián)合可以發(fā)生在兩個(gè)鄰近的SMIP分子之間，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域交換的二聚體。這樣的分子間交換可以傳播，導(dǎo)致更大的團(tuán)聚體，如三聚體、四聚體或多聚體(參見，圖3B和圖3C)。蛋白制備物與本文所述方法使用的蛋白制備物可以從任何體內(nèi)或體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得。適合本發(fā)明的蛋白制備物的示例性來源包括但不限于，來源于培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)注蛋白的重組細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基，或者來自例如產(chǎn)生產(chǎn)物的細(xì)胞、細(xì)菌、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞提取物，或者動(dòng)物血清、腹水、雜交瘤或骨髓瘤上清液。合適的細(xì)菌細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌(Escherichiacoli)細(xì)胞。合適的大腸桿菌(E.coli)菌株的實(shí)例包括HB101、DH5a、GiC9^、JM109、KW251、NM538、NM539和任何不能切割外源DNA的大腸桿菌菌株?？梢允褂玫暮线m的真菌宿主細(xì)胞包括但不限于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiapastoris)禾口曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。合適的昆蟲細(xì)胞包括但不限于S2Schneider細(xì)胞、D.Mel-2細(xì)胞、SF9、SF21、High-5、Mimic-SF9、MGl和KCl細(xì)胞。合適的示例性重組細(xì)胞系包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤系、人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER.C6)、猴腎細(xì)胞、人胚腎系093)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、小鼠支持細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、犬腎細(xì)胞、布法羅大鼠肝細(xì)胞、人肺細(xì)胞、人肝細(xì)胞、小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞、TRI細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、FS4細(xì)胞和人肝癌系OfepG2)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的各種載體(例如，病毒載體)表達(dá)所關(guān)注的蛋白，并且可以在本領(lǐng)域已知的各種條件下培養(yǎng)細(xì)胞(例如，補(bǔ)料分批)?；蚋脑旒?xì)胞以產(chǎn)生蛋白的各種方法為本領(lǐng)域眾所周知。參見例如Ausabeletal.，eds.(1990)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley,NewYork)?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的各種細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)SMIP蛋白的細(xì)胞。示例性細(xì)胞培養(yǎng)基可以基于DMEM、DMEM/F12、Ham’sF-10、Ham’sF-12、F-12K、培養(yǎng)基199、MEM、RPMI1640、Ames，、BGJb,Click，s、CMRL-1066,Fischers、GMEM、IMDM、L-15、McCoy，s5AModified、NCTC、Swik，sS_77、Waymouth、William，s培養(yǎng)基E。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基可以是無血清的。在一些實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞培養(yǎng)基可以包括血清/培養(yǎng)基添加劑，其包括但不限于胎牛血清、新生牛血清、小牛血清和成牛血清，雞、山羊、馬、豬、兔、綿羊、人血清，血清替代品或牛胚胎液。合適的細(xì)胞培養(yǎng)基還可以包括補(bǔ)充物和/或抗生素，其包括但不限于L-谷氨酰胺溶液、L-Albany-L-谷氨酰胺溶液、非必需氨基酸溶液、青霉素、鏈霉素?？梢岳帽景l(fā)明純化粗蛋白制備物。例如，本發(fā)明可以用于直接從含有分泌自培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白的條件培養(yǎng)基純化蛋白。條件培養(yǎng)基可以從小規(guī)模培養(yǎng)物(例如，搖床、波浪袋(wavebag))，或者從種子生物反應(yīng)器或生產(chǎn)生物反應(yīng)器(例如，250L、600L、2500L或6000L生物反應(yīng)器)獲得。在一些實(shí)施方案中，可以利用本發(fā)明從制備自含有蛋白的細(xì)胞的粗細(xì)胞裂解物純化細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于從含有所關(guān)注蛋白的血清、乳或其它流體純化蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于從部分純化的制備物純化蛋白，如來自層析柱的洗脫液或流穿液，或者來自儲(chǔ)存或配制過程的中間蛋白制備物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于純化在包涵體(例如，細(xì)菌、病毒、植物細(xì)胞或任何其它類型的包涵體)中表達(dá)的蛋白。在包涵體中表達(dá)的蛋白通常形成團(tuán)聚體，其對(duì)純化構(gòu)成挑戰(zhàn)。因此本發(fā)明可以特別有利于純化在包涵體中表達(dá)的蛋白。從包涵體純化蛋白通常需要首先從細(xì)菌或其它類型的細(xì)胞提取包涵體，然后溶解純化的包涵體。包涵體提取和溶解的各種方法為本領(lǐng)域眾所周知并且可以在本發(fā)明中使用。例如，強(qiáng)變性劑(例如，尿素和鹽酸胍)、改變的PH和/或溫度、物理破壞(例如，超聲處理等)等可以用于提取和/或溶解包涵體。包涵體提取和/或溶解過程可以導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明包涵體提取物可以直接裝至層析柱。在一些實(shí)施方案中，在本文所述的層析步驟之前首先使提取自包涵體的蛋白經(jīng)過重折疊過程。在一些實(shí)施方案中，重折疊過程可以包括將蛋白透析或稀釋入折疊緩沖液。各種折疊緩沖液為本領(lǐng)域眾所周知并且可以在本發(fā)明中使用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于從含有各種雜質(zhì)的制備物純化蛋白，所述雜質(zhì)包括但不限于，不期望的蛋白變體，如聚集的蛋白，例如高分子量種類、低分子量種類和片段以及脫酰胺種類；來自分泌被純化的蛋白的宿主細(xì)胞的其他蛋白；宿主細(xì)胞DNA;來自細(xì)胞培養(yǎng)基的組分，在之前的純化步驟期間滲入樣品的用于親和層析的吸收劑的部分分子，例如，A蛋白和G蛋白；內(nèi)毒素；核酸；病毒，或任何上述物質(zhì)的片段。本發(fā)明特別有利于去除HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，起始蛋白制備物可以含有至少4%,5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%、75%、80%、85%、90%、95%的HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，起始蛋白制備物可以含有少于95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%的HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，起始制備物可以含有以上百分率組合范圍(例如，約4-95%、5-70%、10-60%、4-30%、4-25%、4-20%、4-15%、4-10%和以上確定的百分率的任何組合)之內(nèi)的HMW團(tuán)聚體。如本文所用，術(shù)語“高分子量(HMW)團(tuán)聚體”指至少兩個(gè)蛋白單體的聯(lián)合。為了本發(fā)明的目的，單體指所關(guān)注蛋白的任何生物活性形式的單個(gè)單元。例如，小模塊免疫藥物蛋白的單體可以為單體多肽，或同型二聚體，或可分離的二聚體，或SMIP蛋白多價(jià)復(fù)合體的單元。所述聯(lián)合可以是共價(jià)、非共價(jià)、二硫鍵、非還原交聯(lián)的，或通過其他機(jī)理。在一些實(shí)施方案中，合適的蛋白制備物可以通過收獲處理獲得。如實(shí)施例中所討論的，可以通過離心從生產(chǎn)生物反應(yīng)器收獲條件培養(yǎng)基(例如，通過碟式沉積離心(discstackcentrifugation)(DSC))0離心步驟可以從含有分泌蛋白(例如，SMIPs)的條件培養(yǎng)基分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施方案中，在DSC之后，可以將內(nèi)容物應(yīng)用于墊式過濾裝置(padfiltrationapparatus)，然后過濾入濾液容器或袋。在一些實(shí)施方案中，在DSC和親和層析步驟之間的過程中保存期間，可以將H印es/EDTA緩沖溶液加入過濾濃縮池以減少酸性種類的產(chǎn)生。此外，可以加入諸如EDTA或咪唑的蛋白酶抑制劑以抑制金屬蛋白酶活性、某些絲氨酸蛋白酶或其他蛋白酶活性。在一些實(shí)施方案中，可以按照約0.001μM至約IOOmM的量將合適的蛋白酶抑制劑加入蛋白制備物。可以在A蛋白親和層析之前和/或期間將蛋白酶抑制劑加入蛋白制備物。加入蛋白酶抑制劑(例如，EDTA)還可以減少A蛋白浸出。還可以調(diào)整諸如溫度和PH的其他條件以減少A蛋白浸出。用于減少A蛋白浸出的方法和條件在美國(guó)公開第20050038231號(hào)中詳細(xì)描述，其援引并入本文。純化方法根據(jù)本發(fā)明的純化過程包含一個(gè)或多個(gè)層析步驟(例如，親和層析、羥基磷灰石層析或離子交換層析)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的純化方法包含羥基磷灰石層析步驟。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的純化方法包含與親和層析和/或離子交換層析組合的羥基磷灰石層析步驟。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括膜過濾步驟(例如，超濾、滲濾和/或最終過濾)。示例性純化過程在實(shí)施例部分中詳細(xì)描述。親和層析親和層析步驟的主要目標(biāo)包括從起始制備物(例如，無細(xì)胞條件培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解物、包涵體提取物等)捕獲產(chǎn)物，以及從過程來源的雜質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞DNA和宿主細(xì)胞蛋白、培養(yǎng)基組分和不定物質(zhì))分離所關(guān)注的蛋白。因此，適合本發(fā)明的親和層析涉及利用可以結(jié)合至SMIP蛋白的吸收劑。例如，合適的吸收劑可以為結(jié)合至抗體免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的蛋白。合適的吸收劑可以為G蛋白、LG蛋白或A蛋白。在一些實(shí)施方案中，合適的吸收劑為結(jié)合至抗體免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH3結(jié)構(gòu)域或與VH3結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域)的蛋白。吸收劑可以附著至任何合適的固相支持體，包括瓊脂糖(agarose)、瓊脂糖(s印harose)、二氧化硅、火棉膠活性炭、沙和任何其他合適的材料。這樣的材料為本領(lǐng)域眾所周知。任何合適的方法均可以用于將吸18收劑附著至固相支持體。用于將蛋白附著至合適的固相支持體的方法為本領(lǐng)域眾所周知。參見例如Ostrove(1990),inGuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymology,182:357-371。在一些實(shí)施方案中，合適的親和層析步驟可以使用A蛋白層析柱或G蛋白層析柱。A蛋白層析柱可以為，例如PROSEP-A(Millipore,U.K.)、A蛋白瓊脂糖FASTFLOW(GEHealthcare,Piscataway,N.J.)>T0Y0PEARL650MA胃白(TosoHassCo.，Philadelphia,Pa.)或MabSelectA蛋白柱(GEHealthcare,Piscataway,N.J.)。在將蛋白制備物應(yīng)用于親和層析柱之前，可以期望調(diào)整諸如pH、離子強(qiáng)度和溫度的參數(shù)，并且在有些情況下加入不同種類的物質(zhì)。因此，通過用為蛋白產(chǎn)物的結(jié)合和純化帶來合適特征的溶液(例如，用于調(diào)整PH、離子強(qiáng)度等或用于引入去污劑的緩沖液)洗滌來進(jìn)行親和層析柱的平衡是任選步驟。在一些實(shí)施方案中，可以利用含有鹽的溶液平衡A蛋白柱，例如，約IOOmM至約150mM磷酸鈉、約IOOmM至約150mM乙酸鈉和約IOOmM至約150mMNaCl。平衡緩沖液的pH范圍可以從約6.O至約8.O。在一實(shí)施方案中，平衡緩沖液的pH為約7.5。平衡緩沖液還可以含有約IOmM至約50mMTris0在另一實(shí)施方案中，所述緩沖液可以含有約20mMTris0在裝載蛋白制備物之后，可以利用洗滌溶液來洗滌結(jié)合柱。合適的洗滌溶液可以含有鹽(例如，H印es、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂)、精氨酸、組氨酸、Tris和/或其他組分。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的洗滌溶液可以含有精氨酸或精氨酸衍生物。合適的精氨酸衍生物可以為但不限于乙酰精氨酸、胍基丁胺、arginicacid、N-α-丁酰-L-精氨酸或Ν-α-新戊酰精氨酸。洗滌溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的合適濃度在約0.IM和約2.OM之間(例如，0.1Μ、0·4Μ、0·5皿、1.011、1.511或2.010，或者約0.5Μ和約1.0Μ之間(例如，0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、0.8Μ、0.9Μ或1.0Μ)。精氨酸或精氨酸衍生物在親和層析中的用途在美國(guó)申請(qǐng)公開第2008/0064860號(hào)中詳細(xì)描述，其公開內(nèi)容援引并入本文。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的洗滌溶液可以含有咪唑或咪唑衍生物。在一些實(shí)施方案中，合適的洗滌溶液可以含有離液劑(例如，尿素、硫氰酸鈉和/或鹽酸胍)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗滌溶液可以含有疏水改性劑(例如，有機(jī)溶劑，包括乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、六甘醇、丙醇、丁醇和異丙醇)。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的洗滌溶液可以含有去污劑(例如，非離子型去污劑和/或離子型去污劑)。洗滌溶液的pH—般在約4.5和約8.0之間，例如，4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0。在相同情況下，洗滌溶液的pH大于5.0和小于約8.0，例如，5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0。洗滌溶液可以含有20mM-50mMTris(例如20mM、30mM、40mM或50mM)。可以通過洗脫緩沖液從已洗滌的諸如A蛋白柱的柱洗脫產(chǎn)物。通常，合適的洗脫緩沖液可以含有H印es、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、一種或多種有機(jī)酸(例如，乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、苯二甲酸、水楊酸)和/或精氨酸。合適的洗脫緩沖液還可以含有鹽(例如，氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、鈣鹽、和/或鎂鹽)。合適的鹽濃度范圍可以為OmM-IM(例如，0mM-500mM、0mM-100mM、0mM-50mM)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液含有約15mM至約IOOmMNaCl。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液中的NaCl濃度可以在4個(gè)水平(例如，0mM、15mM、30mM和50mM)。在其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以含有約20mM至約200mM精氨酸或精氨酸衍生物。在其他實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以含有20mM-200mM甘氨酸。洗脫緩沖液還可以含有約20mM至約IOOmMHEPES。洗脫緩沖液還可以含有約25mM至約IOOmM乙酸。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以含有檸檬酸(例如，約IOmM至約500mM檸檬酸)。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以含有甘氨酰甘氨酸(例如約10-50mM、約50-100mM或約100_200mM)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液可以含有離液劑(例如，尿素、硫氰酸鈉和/或鹽酸胍)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液可以含有烷基二醇(例如，乙二醇、丙二醇、六甘醇)。洗脫緩沖液的PH范圍可以從約2.5至約4.0。在一實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH為約3.0?？梢酝ㄟ^中和緩沖液中和來自親和層析柱的洗脫液。合適的中和緩沖液可以含有Tris,Hepes和/或咪唑。洗脫之后，可以任選地清洗親和層析柱，即在蛋白洗脫之后剝除和/或再生親和層析柱。通常定期進(jìn)行這個(gè)步驟以使雜質(zhì)在固相表面上的積累最小化和/或消毒基質(zhì)以避免微生物污染產(chǎn)物。剝除和/或再生的柱可以重復(fù)使用。可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)調(diào)整緩沖液組分。下文的實(shí)施例中提供了樣品緩沖液的組成范圍。不是所有緩沖液或步驟都是必需的，但是僅為了說明而提供。如實(shí)施例所述，高通量篩選可以用于高效優(yōu)化A蛋白柱層析的緩沖條件。離子交換層析離子交換層析步驟的主要目標(biāo)包括去除過程來源的雜質(zhì)(例如，浸出的A蛋白、宿主細(xì)胞DNA和/或蛋白、不定物質(zhì))以及產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，如HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明離子交換層析與親和層析組合使用。在一些實(shí)施方案中，可以用離子交換層析(例如，陽離子交換和/或陰離子交換層析)代替親和層析。可以使各種陰離子或陽離子取代基附著至基質(zhì)以形成層析的陰離子或陽離子支持體。陰離子交換取代基包括二乙氨乙基(DEAE)、三甲基氨乙基丙烯酰胺(TMAE)、四級(jí)氨乙基(QAE)和季銨類(Q)基團(tuán)。陽離子交換取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸鹽(P)和磺酸鹽(S)。具有聚乙烯亞胺功能基團(tuán)的離子交換樹脂，如P0R0SHQ50可從AppliedBiosystems,FosterCity,CA獲得。具有固定化重組A蛋白功能基團(tuán)的交換樹脂，如P0R0SA50可從AppliedBiosystems,FosterCity，CA獲得。諸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52的纖維素離子交換樹脂可從WhatmanLtd.Maidstone,Kent,U.K.獲得。基于葡聚糖凝膠和交聯(lián)的離子交換劑也是已知的。例如，CAPTOQ、DEAE_、QAE-、CM-和SP-葡聚糖凝膠，以及DEAE-、Q-、CM-和S-瓊脂糖(例如，DEAE瓊脂糖FF、Q瓊脂糖FF和Q瓊脂糖XL)，以及瓊脂糖全部可從GEHealthcare,Piscataway,N.J.獲得。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物，如T0Y0PEARLDEAE-650S或M，T0Y0PEARLCM-650S或M，T0Y0PEARLGIGACAPQ-650，以及T0Y0PEARLGIGACAPCM-650可從TosoHaasCo.，Philadelphia,Pa獲得。根據(jù)本發(fā)明還可以使用諸如CIM_DISK的離子交換整體層析支持體，并且可從BiaS印arations，Austria獲得。根據(jù)本發(fā)明還可以使用離子交換膜吸附器，如MustangQ和MustangE(PallCorporation,NewYork)、SartobindQ(SartoriusStedimBiotechS.A.,France)以及Chromasorb(Millipore,Massachusetts)。在一些實(shí)施方案中，使用陰離子交換柱。在與蛋白接觸之前，可以首先用高鹽緩沖液然后低鹽緩沖液平衡陰離子交換柱。通常，SMIPs僅弱結(jié)合至柱，這允許大部分產(chǎn)物流穿，而具有負(fù)電荷的雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞DNA和HCP強(qiáng)結(jié)合并被保留。然后可以用平衡緩沖液洗滌柱以收集弱結(jié)合至樹脂的額外的產(chǎn)物。一旦產(chǎn)物已從柱移除，可以利用高鹽緩沖液剝除雜質(zhì)。樹脂可以再生、衛(wèi)生處理，然后儲(chǔ)存在乙醇溶液中。在一些實(shí)施方案中，在離子交換層析之前期望使用吸附性深層濾器以增加離子交換層析中所用的樹脂的雜質(zhì)容量和壽命。例如，F(xiàn)ractogelEMDTMAEHi-Cap(M)樹脂是具有合成甲基丙烯酸酯聚合物基質(zhì)(polymericbase)的強(qiáng)陰離子交換劑。由纏結(jié)的聚合物團(tuán)塊形成的孔具有約800埃的大小。由于聚合物中的醚鍵，表面是強(qiáng)親水的。長(zhǎng)、線性聚合物鏈攜帶功能配體。這些聚合物鏈被稱為觸角。所有觸角共價(jià)連接至甲基丙烯酸酯骨架的羥基。根據(jù)本發(fā)明還可以使用額外的觸角樹脂，如FractogelEMDTMAE(M)、FractogelEMDTMAE(S)和Fractopi^pTMAE。在蛋白裝載(例如，ProA峰池)中使用吸附性深層預(yù)濾器可以保護(hù)TMAE柱以防雜質(zhì)。可能這些雜質(zhì)可以耗盡或封閉TMAE柱的結(jié)合位點(diǎn)，減少樹脂對(duì)雜質(zhì)的容量。例如，通過吸附深層濾器的預(yù)過濾或蛋白沉淀可以減少這些雜質(zhì)。洗脫之后，可以任選地清洗離子交換層析柱，即在蛋白洗脫之后，剝除和/或再生離子交換層析柱。通常定期進(jìn)行這個(gè)步驟以使雜質(zhì)在固相表面上的積累最小化和/或減少微生物污染產(chǎn)物的可能性。在一些實(shí)施方案中，通過用濃度范圍為10mM-2MNaOH的NaOH溶液處理來再生離子交換柱。剝除和/或再生的柱可以重復(fù)使用。如上文所述，在一些實(shí)施方案中，深層過濾可以用于減少蛋白制備物中的雜質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，深層過濾介質(zhì)是由纖維素纖維、硅藻土和陽離子樹脂粘合劑組成的高度多孔濾器。通過纖維素纖維篩分、疏水吸附至硅藻土和離子吸附至陽離子粘合劑，深層濾器可以去除雜質(zhì)。深層濾器可以為，例如0.5cm、lcm、1.5cm、2.Ocm厚。在一些實(shí)施方案中，可以將一種或多種添加劑加入蛋白制備物以誘導(dǎo)沉淀和/或增強(qiáng)蛋白吸附至離子交換柱。在一些實(shí)施方案中，可以通過添加劑誘導(dǎo)蛋白沉淀以減少雜質(zhì)的量。各種蛋白沉淀方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本發(fā)明中使用。例如，可以通過鹽析沉淀蛋白(例如，利用中性鹽)。在一些實(shí)施方案中，可以通過加入有機(jī)溶劑(例如，甲醇、乙醇)沉淀蛋白。在一些實(shí)施方案中，非離子型有機(jī)聚合物可以用于促進(jìn)蛋白結(jié)合至表面和/或沉淀。各種非離子型有機(jī)聚合物可商購并且可以在本發(fā)明中使用。實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、纖維素、葡聚糖、淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。在一些實(shí)施方案中，PEG用作添加劑。在本發(fā)明中可以使用具有各種分子量的PEG。合適的PEG可以具有范圍從例如約100至約20，000道爾頓的平均聚合物分子量。在一些實(shí)施方案中，合適的PEG可以具有200-12，000、400-20，000、400-1000、200-1000、400-2000、1000-5000、800-8，000、1000-10，000,2,000-12，000道爾頓之間的平均分子量。在一些實(shí)施方案中，示例性PEG包括具有例如200、400、800、1000、2，000、4，000、6，000、8000、10，000、12，000,14,000,16，000、18，000、20，000道爾頓等的平均分子量的PEG。可以加入各種濃度的PEG。較低分子量PEG—般會(huì)需要較高濃度以達(dá)到與較高分子量PEG相似的效果。示例性合適的PEG濃度范圍為0-25%(例如，0-6%、0-9%、0-12%、0-15%、0-18%、0-20%、3-9%、3-15%、6-12^^6-20%或6-25%)。PEG或其他有機(jī)聚合物可以為線性或支化聚合物。應(yīng)該考慮到PEG的結(jié)合或沉淀效果一般取決于蛋白的分子量。通常，對(duì)于較大的蛋白，PEG效果更大。例如，與導(dǎo)致相同量的增強(qiáng)的單體蛋白或LMW雜質(zhì)結(jié)合所需的PEG濃度相比，較低濃度的給定分子量的PEG—般用于增強(qiáng)較大蛋白(例如，HMW團(tuán)聚體)以及病毒的結(jié)合。因此，團(tuán)聚體、復(fù)合體和其他大分子污染物的保留一般會(huì)被增強(qiáng)至比其來源的蛋白的非聚集形式更大的程度。因此，PEG或其他非離子型聚合物修飾特別有利于通過弱分配層析增強(qiáng)去除雜質(zhì)，特別是那些弱結(jié)合的HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，可以在陰離子交換層析之前但是在親和層析步驟之后加入PEG。在一些實(shí)施方案中，為了蛋白沉淀使用非離子型有機(jī)聚合物可以幫助減少或消除蛋白變性以及去除去污劑和其他雜質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，添加劑(例如，聚乙二醇)可以用于濃縮產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，可以通過離心、過濾或其他本領(lǐng)域已知的分離方法分離沉淀物。在一些實(shí)施方案中，沉淀物含有污染物，如HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，期望去除含有污染物的沉淀物(例如，通過過濾)。在一些實(shí)施方案中，SMIPs存在于沉淀物中。在一些實(shí)施方案中，期望將含有SMIPs的沉淀物溶解在重懸緩沖液中。在一些實(shí)施方案中，重懸緩沖液具有適合直接裝上離子交換柱的PH和/或電導(dǎo)率。如實(shí)施例所述，高通量篩選可以用于高效優(yōu)化離子交換層析的緩沖條件。羥基磷灰石層析陶瓷羥基磷灰石(cHA)步驟的主要目標(biāo)是去除高分子量(HMW)團(tuán)聚體、滲出的A蛋白、用于促進(jìn)沉淀或結(jié)合至吸收劑的添加劑(例如，聚乙二醇)和宿主細(xì)胞來源的雜質(zhì)，如DNA和HCP。用中性pH左右和低離子強(qiáng)度的磷酸鹽充電的cHA樹脂可以用于結(jié)合單體蛋白產(chǎn)物(例如，SMIP)和HMW團(tuán)聚體。因?yàn)镠MW團(tuán)聚體比單體更緊密地結(jié)合至cHA樹脂，可以利用弱酸性至弱堿性PH的具有合適離子強(qiáng)度的洗脫緩沖液選擇性洗脫單體。隨后可以任選地利用在中性PH下的甚至更高離子強(qiáng)度和更高磷酸鹽濃度的緩沖液從樹脂洗掉HMW團(tuán)聚體。如實(shí)施例所述，本發(fā)明已開發(fā)了可以從蛋白制備物高效去除麗團(tuán)聚體的cHA操作條件。在一些實(shí)施方案中，HMW團(tuán)聚體的百分率可以從在裝載物質(zhì)中超過5%(例如，5%、10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%)減少至在純化的蛋白產(chǎn)物中少于4%(例如，少于3.5%,3.0%,2.5%,2.0%U.5%U.0%,0.8%,0.6%,0.4%,0.2%,0.1%)0在一些實(shí)施方案中，在cHA層析之后HMW團(tuán)聚體可以減少至少約2倍，至少約5倍，至少約10倍，至少約20倍，至少約30倍，至少約40倍，至少約50倍，至少約60倍，至少約70倍，至少約80倍，至少約90倍或至少約100倍。1.羥基磷灰石樹脂各種羥基磷灰石層析樹脂可商購并且可以用于本發(fā)明。例如，羥基磷灰石可以為結(jié)晶形式。在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的羥基磷灰石可以是團(tuán)聚以形成顆粒并且在高溫下燒結(jié)為穩(wěn)定的多孔陶瓷塊(mass)的羥基磷灰石。羥基磷灰石的顆粒大小可以廣泛變化，但是典型的顆粒大小范圍為直徑1μm-1,000μm,并且可以為10μm-100ym(例如，20μm、40μm、60μm80μm)。許多層析樹脂可以用于cHA柱的制備，最廣泛使用的是I型和II型羥基磷灰石。I型具有高蛋白結(jié)合能力和對(duì)酸性蛋白更好的能力。I型特別適合小模塊免疫藥物蛋白的純化。然而，II型具有較低的蛋白結(jié)合能力，但是對(duì)核酸和某些蛋白具有較好的分辨率。II型材料還具有非常低的白蛋白親和力，并且特別適合于許多物種和種類免疫球蛋白的純化。具體的羥基磷灰石類型的選擇可以由熟練的技術(shù)人員確定。22本發(fā)明可以使用松散、填充在柱中或連續(xù)環(huán)形層析中的羥基磷灰石樹脂。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，陶瓷羥基磷灰石樹脂填充在柱中。柱尺寸的選擇可以由熟練的技術(shù)人員確定。在一些實(shí)施方案中，至少0.5cm的柱直徑與約20cm的床高度可以用于小規(guī)模純化。在一些實(shí)施方案中，可以使用從約35cm至約60cm的柱直徑。在一些實(shí)施方案中，可以使用60cm-85cm的柱直徑。在一些實(shí)施方案中，在pH9.0的200mMNa2HPO4溶液中的陶瓷羥基磷灰石樹脂漿可以用于以約4cm/min的恒定流速或用重力填充柱。在一些實(shí)施方案中，在蛋白洗脫之后，可以任選地清洗，即剝除和/或再生羥基磷灰石樹脂。剝除和/或再生的柱可以重復(fù)使用。2.操作緩沖液和條件在用裝載物質(zhì)接觸羥基磷灰石樹脂之前，重要的是調(diào)整諸如pH、離子強(qiáng)度和溫度的參數(shù)，以及在某些情況下加入不同種類的物質(zhì)。因此，通過用為所關(guān)注蛋白(例如，SMIPs蛋白)的純化帶來必需特征的溶液(例如，用于調(diào)整pH、離子強(qiáng)度等或用于引入去污劑的緩沖液)洗滌來進(jìn)行羥基磷灰石基質(zhì)的平衡是任選步驟。在一些實(shí)施方案中，可以利用弱酸性至弱堿性pH的含有0.01-2.OMNaCl的溶液平衡羥基磷灰石基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，平衡緩沖液可以含有磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。例如，平衡緩沖液可以含有l(wèi)_20mM磷酸鈉(例如，I-IOmM磷酸鈉、2-5mM磷酸鈉、2mM磷酸鈉或5mM磷酸鈉)。平衡緩沖液可以含有0.01-0.2MNaCl(例如，0.025-0.IMNaCl,0.05-0.2MNaCl、0.05-0.IMNaCl,0.05MNaCl或0.IMNaCl)。裝載緩沖液的pH范圍可以為6.2-8.0(例如，6.6-7.7,6.5-7.5,6.8,7.0,7.1,7.2或7.3)。平衡緩沖液還可以含有0-200mM精氨酸(例如，50mM、100mM、120mM精氨酸，140mM、160或180mM精氨酸)。平衡緩沖液還可以含有0-200mMHEPES(例如，20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mMHEPEQ?？梢赃M(jìn)行超過一個(gè)平衡步驟。各種蛋白制備物可以用作裝載物質(zhì)(例如，來自親和層析的峰池、來自離子交換層析的流穿液或原始制備物)。在一些實(shí)施方案中，裝載可以緩沖液交換入適當(dāng)?shù)难b載緩沖液。例如，蛋白制備物可以緩沖液交換入弱酸性至弱堿性PH的含有0.2-2.5MNaCl的裝載緩沖液。例如，裝載緩沖液可以含有l(wèi)_20mM磷酸鈉(例如，2-8mM磷酸鈉、3-7mM磷酸鈉或5mM磷酸鈉)。裝載緩沖液可以含有0.01-0.2MNaCl(例如，0.025-0.IMNaCl、0.05-0.2MNaCl.O.05-0.IMNaCl.O.05MNaCl或0.IMNaCl)。裝載緩沖液的pH范圍可以為6.4-7.6(例如，6.5-7.0或6.6-7.2)?？梢酝ㄟ^將蛋白制備物應(yīng)用于含有固相介質(zhì)的填充床柱、流化/擴(kuò)增床柱來進(jìn)行裝載，和/或通過簡(jiǎn)單批量操作將蛋白制備物與羥基磷灰石樹脂混合，其中固相介質(zhì)與溶液混合一定時(shí)間。裝載之后，可以任選地利用洗滌緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)洗滌羥基磷灰石樹脂以去除松散結(jié)合的雜質(zhì)?？梢允褂玫南礈炀彌_液將取決于羥基磷灰石樹脂的性質(zhì)，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。在任選的洗滌步驟之后，可以從柱洗脫結(jié)合產(chǎn)物。為了從柱高效洗脫SMIP蛋白單體，本發(fā)明使用了弱酸性至弱堿性pH的高離子強(qiáng)度磷酸鹽緩沖液。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液可以含有磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。例如，合適的洗脫緩沖液可以含有1-IOOmM磷酸鈉(例如，2-50mM、2_40mM、2_35mM、2_32mM、2-30mM,4-35mM,4-20mM,10_40mM、10-35mM、4-10mM或2-6mM磷酸鈉)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液可以含有2mM、3mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM磷酸鈉。合適的洗脫緩沖液還可以含有0.01-2.5MNaCl(例如，0.1-2.5Μ、0·1-2.OM、0.1-1.6Μ、0·1-1.2Μ、0·1-1.0Μ,0.1-0.8Μ、0·1-0.5ΜΜ、0·2-1.5Μ、0·2-1.2ΜNaCU0.2-1.0Μ、0.2-0.8Μ、0.3-1.IM或0.2-0.5ΜNaCl)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液含有10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、500mM、l.0M、1.5M、2.OM或2.5MNaCl)。合適的洗脫緩沖液的pH范圍為6.4-8.5(例如，6.4-8.0,6.4-7.8、6.5-7.7或6.5-7.3)。在一些實(shí)施方案中，合適的洗脫緩沖液的pH可以為6.4,65,6.6,6.8,7.0,7.2、7.4,7.6,7.8,8.0,8.2,8.4或8.5)。在一些實(shí)施方案中，含有不同鹽濃度的洗脫緩沖液可以用于連續(xù)或分步梯度地從柱洗脫結(jié)合產(chǎn)物。示例性緩沖液和操作條件如實(shí)施例部分所述。如實(shí)施例所述，高通量篩選或可選篩選(例如，梯度洗脫篩選)可以用于高效優(yōu)化羥基磷灰石層析的緩沖液和操作條件。通常，結(jié)合模式cHA層析用于本發(fā)明?？蛇x地或額外地，可以使用流穿模式。在流穿模式中，如本文所述，通常將蛋白制備物緩沖液交換入合適的裝載緩沖液。然后允許蛋白制備物流穿羥基磷灰石柱，而諸如HMW團(tuán)聚體的雜質(zhì)結(jié)合至柱。隨后任選地洗滌柱以允許額外純化的蛋白流穿柱。在組合結(jié)合/流穿模式中，允許蛋白制備物流穿羥基磷灰石柱，最初蛋白單體和HMW團(tuán)聚體均結(jié)合。然而，隨著裝載繼續(xù)，進(jìn)入的HMW團(tuán)聚體能夠比蛋白單體更緊密地結(jié)合，并且因此置換結(jié)合的單體。因此，置換的單體流穿柱。隨后任選地洗滌柱以允許額外置換的單體流穿柱。除了上文特別討論的鹽和緩沖液，層析和裝載可以在各種緩沖液和/或鹽中進(jìn)行，包括鈉、鉀、銨、鎂、鈣、氯化物、氟化物、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和/或Tris緩沖液。這樣的緩沖液和鹽的具體實(shí)例為Tris、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、氯化鎂、氯化鈣、氟化鈉、氟化鉀、氟化銨、氟化鈣、氟化鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸銨、乙酸鎂、乙酸鈣、乙酸鈉、乙酸鉀或乙酸銨。如實(shí)施例所述，高通量篩選可以用于高效優(yōu)化cHA層析的緩沖條件。此外，可以處理本文所述的各種緩沖液和溶液以確保無內(nèi)毒素和/或外毒素。特別地，如果純化的蛋白制備物是為了用于制藥和/或臨床用途，可以期望使用無內(nèi)毒素和/或外毒素的緩沖液。從緩沖液或溶液去除內(nèi)毒素和/或外毒素的各種方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本發(fā)明中使用。例如，緩沖液和溶液可以是無熱原的?？梢酝ㄟ^例如酸水解、氧化、加熱、氫氧化鈉等完成去熱原。額外的過濾步驟額外的膜過濾步驟可以用于減少不定病毒和其他污染物，濃縮和/或緩沖液交換。在本發(fā)明中可以使用各種病毒保留濾器，包括但不限于PlanOVa20N病毒保留過濾(VRF)和Plan0va35N病毒保留過濾(VRF)等。各種超濾和/或滲濾裝置(skid)(例如，分子量截留IOkDa)可以用于在制劑緩沖液中濃縮和/或緩沖液交換過程流(processstream)。可以使最終的藥物通過例如一次性使用0.2pm濾器以去除任何潛在的不定微生物污染物和顆粒物質(zhì)。含有純化的SMIP蛋白的藥物組合物本文所述的純化的蛋白制備物可以為藥用配制。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以含有純化的SMIP蛋白，其具有少于4%(例如，少于3.5%、3.0%、2.5%,2.0%U.5%U.0%,0.8%,0.6%,0.4%,0.2,0.1%)的HMW團(tuán)聚體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以含有純化的SMIP蛋白，其具有超過70%(例如，超過75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%)的以生物活性單體形式存在的蛋白。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種藥學(xué)可接受的媒介物。這樣的藥學(xué)可接受的媒介物將包括與藥物給予相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。用于藥物活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域已知的。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或物質(zhì)，其在組合物中的使用是預(yù)期的。還可以通過藥劑學(xué)/微生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法將輔助活性化合物(根據(jù)本發(fā)明鑒定和/或本領(lǐng)域已知)并入組合物。本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期的給藥途徑相容。用于給藥的溶液或懸浮液可以包括本領(lǐng)域眾所周知的組分，如無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于漲度調(diào)整的物質(zhì)，如氯化鈉或葡萄糖，和/或酸或堿，如鹽酸或氫氧化鈉等。適合給藥的本發(fā)明的劑型可以為本領(lǐng)域已知的任何形式。例如，用于口服的合適的劑型可以為膠囊劑、明膠膠囊劑、小藥囊劑、片劑(tablet)、片劑(troche)、錠劑、粉劑、顆粒劑、在水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液、或者水包油乳劑或油包水乳劑。還可以大丸劑、干藥糖劑(electuary)或糊劑的形式給予治療劑。如另一實(shí)例，可注射使用的合適的劑型包括無菌水性溶液(可溶于水)或分散劑(dispersion)，以及用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末。為了靜脈內(nèi)給藥，合適的媒介物包括生理鹽水、抑菌水、乳浮ELTM(BASF，Parsippany,N.J.)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。適合關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的劑型可以為無菌水性制劑形式的治療劑，所述治療劑可以為微晶形式，例如，水性微晶懸浮液形式。為了關(guān)節(jié)內(nèi)和眼部給藥，脂質(zhì)體劑型或可生物降解的聚合物系統(tǒng)也可以用于呈現(xiàn)治療劑。用于包括眼部治療在內(nèi)的體表給藥的劑型包括液體或半液體制劑，如搽劑、洗劑、凝膠劑、applicants，水包油或油包水乳劑，如霜?jiǎng)?、軟膏劑或糊劑；或者溶液或懸浮液，如滴劑。為了吸入治療，如為了哮喘，可以使用由噴霧器、霧化吸入器或霧化器分配的吸入粉末(自動(dòng)推進(jìn)或噴霧劑型)。為了從粉末吸入裝置或自動(dòng)推進(jìn)粉末制劑肺部給藥，這樣的劑型可以是精細(xì)粉碎的粉末。W109]還可以通過透粘膜或透皮方式全身給藥。根據(jù)本發(fā)明，可以通過任何途徑向哺乳動(dòng)物宿主給予包含純化的制備物的藥物組合物。因此，在適當(dāng)情況下，可以口服或胃腸道外給藥，例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、吸入、透皮(體表)、透粘膜和直腸給藥。因此，通過參照以下實(shí)例，一般描述的本發(fā)明會(huì)更容易理解，以下實(shí)例以說明方式提供而不是為了限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)和收獲利用在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)的重組中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系產(chǎn)生抗⑶20SMIP蛋白TRU-015。產(chǎn)生TRU-015的示例性細(xì)胞培養(yǎng)和收獲過程如圖4所示。對(duì)于本文所述的所有細(xì)胞培養(yǎng)步驟，加入所述步驟的液體在添加之前通過0.2μm濾器過濾至少一次。不能通過這樣的濾器的消泡劑懸浮液在添加之前高壓滅菌。含有細(xì)胞的培養(yǎng)液在步驟之間不過濾。將含有表達(dá)TRU-015的CHO細(xì)胞系的小瓶細(xì)胞解凍并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，所述培養(yǎng)瓶含有預(yù)熱的、具有用于選擇壓力的0.45μM氨甲喋呤的搖瓶培養(yǎng)基。瓶和波浪袋中細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)大和維持最初利用分批-重補(bǔ)料過程將細(xì)胞培養(yǎng)物擴(kuò)大至一次性搖瓶(最大工作體積1L)。在分批-重補(bǔ)料循環(huán)中，始終將每個(gè)搖瓶在控制的溫度和(X)2空氣下振蕩培養(yǎng)。在循環(huán)結(jié)束時(shí)，將所有或部分培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)其他搖瓶(或者，如果有足夠數(shù)量的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至波浪袋-參見下文)，并且用搖瓶培養(yǎng)基稀釋至預(yù)定義的目標(biāo)起始細(xì)胞密度。重補(bǔ)料之后，將每個(gè)稀釋的培養(yǎng)物放回培養(yǎng)箱，在另一個(gè)分批-重補(bǔ)料循環(huán)中始終振蕩。直到最終的補(bǔ)料分批培養(yǎng)步驟，所用的所有細(xì)胞培養(yǎng)基任選含有氨甲喋呤以保持選擇壓力。一旦通過在搖瓶中生長(zhǎng)獲得了足夠數(shù)量的細(xì)胞，在波浪袋中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。生長(zhǎng)循環(huán)和培養(yǎng)箱條件與瓶相同，除了擺動(dòng)波浪袋代替搖動(dòng)。波浪袋培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基相同。只要需要，以這種方式繼續(xù)搖瓶和波浪袋培養(yǎng)，直到從解凍開始規(guī)定的最大代數(shù)。典型地，一旦波浪袋中可獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞就接種種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器，并且保留至少一個(gè)波浪袋作為種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器的后備。種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)大和維持在種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器中繼續(xù)擴(kuò)大接種物。將種子生物反應(yīng)器培養(yǎng)基加入生物反應(yīng)器，并且補(bǔ)充高壓滅菌的在鹽水中的消泡劑懸浮液。加入來自波浪袋的接種培養(yǎng)物至預(yù)定義的目標(biāo)細(xì)胞密度以開始每個(gè)分批-重補(bǔ)料傳代。在傳代中始終在控制的條件下攪拌維持培養(yǎng)物，之后取回部分并用于接種下一個(gè)生物反應(yīng)器，或者如果需要丟棄部分。將溫度控制在或接近37°C，利用噴射的0.2μπι過濾的空氣、氧或兩種氣體的混合物來控制溶解氧(DO2)，利用碳酸鹽溶液(堿滴定劑)控制ρΗ。每個(gè)后續(xù)種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器分批-重補(bǔ)料傳代從保留來自前一循環(huán)的部分培養(yǎng)物、用種子生物反應(yīng)器培養(yǎng)基稀釋和加入消泡劑懸浮液開始。將種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器和波浪袋維持在分批-重補(bǔ)料操作中，根據(jù)需要互相作為后備，并且為多個(gè)生產(chǎn)生物反應(yīng)器批次提供接種物。一旦可獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器。生產(chǎn)生物反應(yīng)器利用持續(xù)10-15天的最終補(bǔ)料分批過程在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中產(chǎn)生含有TRU-015的條件培養(yǎng)基。將來自種子培養(yǎng)生物反應(yīng)器的接種培養(yǎng)物加入生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始生產(chǎn)培養(yǎng)基。加入消泡劑懸浮液。在批中始終在控制的條件下攪拌維持所得培養(yǎng)物。在接種后約4天時(shí)，將溫度調(diào)定點(diǎn)從37°C轉(zhuǎn)換至31°C。在生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中始終利用噴射的0.2μm過濾的空氣、氧或混合物來控制DO2,并且利用碳酸鹽溶液(堿滴定劑)控制ρΗ。在補(bǔ)料分批期間還加入濃縮的補(bǔ)料培養(yǎng)基溶液。接種之后10天和15天之間，收獲整個(gè)體積的生產(chǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)物。基于進(jìn)度考慮和/或培養(yǎng)物存活力考慮選擇收獲日期。26圖5示出了在14天培養(yǎng)期期間2個(gè)不同CHO細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的TRU-015的生產(chǎn)生物反應(yīng)器的示例性每天滴度測(cè)量(μg/mL)。在生產(chǎn)生物反應(yīng)器生長(zhǎng)的第12天和第14天之間獲得了滴度峰值。滴度峰值范圍為1500-3000μg/mL。通過碟式沉積離心(DSC)收獲通過碟式沉積離心收獲來自生產(chǎn)生物反應(yīng)器的條件培養(yǎng)基以獲得澄清的條件培養(yǎng)基(CCM)。DSC步驟的一個(gè)目標(biāo)是從含有SMIP蛋白的條件培養(yǎng)基分離CHO細(xì)胞和細(xì)胞碎片。通過壓力使生物反應(yīng)器容器的內(nèi)容通過DSC，然后墊式過濾裝置，然后0.2μm濾器進(jìn)入濾液容器或袋。當(dāng)收獲處理完成時(shí)，將HEPES/EDTA緩沖溶液加入過濾的離心分離池(centratepool)。該添加的一個(gè)目的是減少在DSC和后續(xù)步驟之間的過程中保存期間酸性種類的產(chǎn)生。EDTA還可以抑制蛋白酶活性和減少A蛋白滲出。DSC步驟在室溫下操作。實(shí)施例2.層析條件的高通量篩選用高通量篩選開發(fā)優(yōu)化的純化過程條件。潛力層析選項(xiàng)的早期高通量篩選允許操作窗口的快速鑒定。高通量篩選結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的比較進(jìn)一步縮小了操作條件。高通量篩選使運(yùn)行的柱數(shù)量和所需的過程中物質(zhì)最小化，并且使得能夠平行發(fā)展努力。A蛋白層析A蛋白層析步驟的主要目標(biāo)包括從無細(xì)胞的澄清條件培養(yǎng)基捕獲產(chǎn)物，并且從過程來源的雜質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞DNA和宿主細(xì)胞蛋白[HCP]、培養(yǎng)基組分和不定物質(zhì))分離TRU-O15。進(jìn)行高通量篩選以優(yōu)化A蛋白柱條件以增加產(chǎn)物捕獲、雜質(zhì)的去除并且最小化洗脫液沉淀。利用批量結(jié)合機(jī)理的高通量篩選的示例性設(shè)計(jì)如圖6所示，并且A蛋白柱操作和高通量篩選模型的實(shí)例如圖7所示。如圖所示，篩選了賦形劑洗滌、洗脫和中和條件的不同組合。特別地，所述篩選至少變化了作為洗滌賦形劑的氯化鈉、氯化鈣、精氨酸和Tris的水平；作為洗脫緩沖液的HEPES、乙酸和甘氨酸；作為中和緩沖液的Tris、HEPES和咪唑；和洗脫中的氯化鈉濃度水平(例如，0mM、15mM、30mM和50mM)。所述篩選使用含有96孔的濾板，每個(gè)孔具有不同條件。每個(gè)孔含有約50μ1樹脂禾口300μ1液體。禾Ij用TecanRobot(TecanUS,Inc.4022StirrupCreekDriveSuite310Durham,NC27703,USA)將樹脂和液體混合約20分鐘，并且將板離心以收集上清液。分析來自每個(gè)孔的上清液以確定產(chǎn)物的回收率、單體和團(tuán)聚體的量以及宿主細(xì)胞蛋白的存在。例如，用在A280處的UV吸光度確定總蛋白濃度。通過在A320處的吸光度測(cè)量濁度。通過大小排阻HPLC測(cè)量單體和團(tuán)聚體的量。通過ELISA表征宿主細(xì)胞蛋白。示例性A蛋白高通量篩選結(jié)果如圖8所示。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中鑒定的一示例性有利條件包括鈣洗滌、具有氯化鈉的乙酸洗脫和HEPES中和(參見圖8)。離子交換層析離子交換層析的主要目標(biāo)包括去除過程來源的雜質(zhì)(例如，滲出的A蛋白、宿主細(xì)胞DNA和蛋白以及不定物質(zhì))以及產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)，如高分子量(HMW)種類。相似地，用高通量篩選鑒定陰離子交換層析(AEX)條件和陽離子交換層析(CEX)的潛力操作條件以去除雜質(zhì)。測(cè)試的示例性變量如表1所示。表1.AEX和CEX的高通量篩選方法權(quán)利要求1.一種從含有高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白的方法，其包含使所述蛋白制備物在操作條件下進(jìn)行羥基磷灰石層析的步驟，使得所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4%的團(tuán)聚體。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包含不超過3個(gè)層析步驟。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述操作條件包含在磷酸鹽緩沖液中從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液是無內(nèi)毒素的。5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液是無熱原的。6.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。7.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含在lmM-50mM濃度范圍的磷酸鈉。8.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液還包含在100mM-2.5M濃度范圍的氯化鈉。9.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含在2mM-32mM濃度范圍的磷酸鈉和在IOOmM-L6M濃度范圍的氯化鈉。10.權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液具有6.5-8.5范圍的pH。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述操作條件包含通過NaCl梯度從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述操作條件包含通過NaCl分步洗脫方法從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述操作條件包含通過磷酸鹽梯度從羥基磷灰石層析柱洗脫所述小模塊免疫藥物蛋白。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述磷酸鹽梯度為線性梯度。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述磷酸鹽梯度為分步梯度。16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述羥基磷灰石層析使用含有I型或II型陶瓷羥基磷灰石樹脂的柱。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述柱含有I型陶瓷羥基磷灰石樹脂。18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述樹脂直徑為1μm-1,000μm。19.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述樹脂直徑為10μm-100μm20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含在羥基磷灰石層析之前通過親和層析純化所述蛋白制備物的步驟。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述親和層析使用結(jié)合至免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的蛋白吸收劑。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述親和層析使用結(jié)合至免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的蛋白吸收劑。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白吸收劑結(jié)合至VH3結(jié)構(gòu)域。24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白吸收劑包含A蛋白。25.權(quán)利要求M的方法，其中所述親和層析使用MabklectrProteinA樹脂柱。26.權(quán)利要求20的方法，其中所述親和層析步驟包含利用洗滌緩沖液洗滌親和層析柱，所述洗滌緩沖液包含Hepes、氯化鈉、氯化鈣、精氨酸、Tris、氯化鎂、組氨酸、尿素、咪唑、一種或多種有機(jī)溶劑、離子型和/或非離子型去污劑。27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述一種或多種有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、丙二醇、乙二醇、丙醇、異丙醇、丁醇及其組合。28.權(quán)利要求20的方法，其中所述親和層析步驟包含利用洗脫緩沖液從親和層析柱洗脫小模塊免疫藥物蛋白，所述洗脫緩沖液包含Hepes、磷酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、氯化鎂、尿素、丙二醇、乙二醇、一種或多種有機(jī)酸和/或精氨酸。29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述一種或多種有機(jī)酸選自乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丙二酸、苯二甲酸和水楊酸。30.權(quán)利要求觀的方法，其中所述洗脫緩沖液還包含選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其組合的鹽。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述鹽濃度范圍為ImM-lM。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述鹽濃度范圍為lmM-500mM。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述鹽濃度范圍為ImM-lOOmM。34.權(quán)利要求20-33的方法，其中所述方法還包含加入添加劑以促進(jìn)結(jié)合至吸著劑。35.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包含使用陰離子交換層析樹脂通過陰離子交換層析純化所述蛋白制備物的步驟。36.權(quán)利要求20-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含在所述親和層析之后但是在所述羥基磷灰石層析之前通過陰離子交換層析純化所述蛋白制備物的步驟。37.權(quán)利要求35或36的方法，其中所述方法還包含加入添加劑以增強(qiáng)所述小模塊免疫藥物蛋白和/或雜質(zhì)結(jié)合至所述陰離子交換層析樹脂的步驟。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述添加劑包含非離子型有機(jī)聚合物。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述非離子型有機(jī)聚合物為聚乙二醇(PEG)。40.權(quán)利要求35-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括在所述陰離子交換層析之前的深層過濾步驟。41.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包含一個(gè)或多個(gè)過濾步驟。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)過濾步驟包含病毒保留過濾步驟。43.權(quán)利要求41的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)過濾步驟包含超濾和/或滲濾步驟。44.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含加入添加劑的步驟以誘導(dǎo)來自所述蛋白制備物的一種或多種污染物蛋白沉淀，使得可以從污染物進(jìn)一步分離所述小模塊免疫藥物蛋白。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述添加劑包含非離子型有機(jī)聚合物。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述非離子型有機(jī)聚合物為聚乙二醇(PEG)。47.權(quán)利要求44-46中任一項(xiàng)的方法，其中所述沉淀在陰離子交換層析之前誘導(dǎo)，并且其中所述方法還包含通過過濾從所述蛋白制備物去除沉淀的污染物的步驟。48.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于2%的團(tuán)聚體。49.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于的團(tuán)聚體。50.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有超過10%的高分子量團(tuán)聚體。51.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有超過20%的高分子量團(tuán)聚體。52.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有超過30%的高分子量團(tuán)聚體。53.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有超過60%的高分子量團(tuán)聚體。54.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于30%的高分子量團(tuán)聚體。55.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于20%的高分子量團(tuán)聚體。56.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于15%的高分子量團(tuán)聚體。57.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于10%的高分子量團(tuán)聚體。58.權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于5%的高分子量團(tuán)聚體。59.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述小模塊免疫藥物蛋白特異性結(jié)合至CD20。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含與SEQIDN0:l_59和67-76中任一個(gè)具有至少80%相同性的氨基酸序列。61.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物是從培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、無細(xì)胞培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物制備的。62.權(quán)利要求1-60中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物為細(xì)胞培養(yǎng)基制備物。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述培養(yǎng)基制備物包含從培養(yǎng)細(xì)胞分泌的所述小模塊免疫藥物蛋白。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述培養(yǎng)細(xì)胞為CHO細(xì)胞。65.權(quán)利要求62的方法，其中所述培養(yǎng)基制備物是從大型生物反應(yīng)器制備的。66.權(quán)利要求1-61中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物包含細(xì)胞提取物。67.權(quán)利要求1-61中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物是從包涵體制備的。68.一種從含有高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化小模塊免疫藥物蛋白的方法，所述方法包含使所述蛋白制備物在操作條件下進(jìn)行(a)親和層析和/或離子交換層析，和(b)羥基磷灰石層析，使得所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于4%的團(tuán)聚體。69.權(quán)利要求68的方法，其中使所述蛋白制備物進(jìn)行(al)親和層析、(^)離子交換層析和(b)羥基磷灰石層析。70.權(quán)利要求68的方法，其中使所述蛋白制備物進(jìn)行(al)陽離子交換層析、(a2)陰離子交換層析和(b)羥基磷灰石層析。71.權(quán)利要求68-70中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包含不超過3個(gè)層析步驟。72.權(quán)利要求68或69的方法，其中所述親和層析為A蛋白層析。73.權(quán)利要求68或69的方法，其中所述離子交換層析為使用陰離子交換層析樹脂的陰離子交換層析。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述陰離子交換層析樹脂選自QSepharoseFF、QSepharoseXL、DEAESepharoseFF、POROSHQ50、POROSA50、ToyopearlDEAE>iToyopearlGigaCapQ-650M,ToyopearlDEAE-650M,CaptoQ.CaptoDEAE和觸角型陰離子交換層析。75.權(quán)利要求73的方法，其中所述陰離子交換層析樹脂為帶電膜吸收體。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述陰離子交換層析選自MuStangQ、MuStang_E、SartobindQ和Chromasorb。77.權(quán)利要求73的方法，其中所述陰離子交換層析樹脂為帶電單片支持體。78.權(quán)利要求77的方法，其中所述陰離子交換層析為CIM-DISK。79.權(quán)利要求69的方法，其中所述親和層析為MabklectTMrfr0teinA親和層析，所述離子交換層析為觸角型陰離子交換層析，并且所述羥基磷灰石層析為I型陶瓷羥基磷灰石層析。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述觸角型陰離子交換層析選自Fract0gelTMAEHiCap(M)、FractogelTMAE(S)和Fractopi^pTMAE。81.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包含剝除和/或再生一個(gè)或多個(gè)層析柱用于重新使用。82.權(quán)利要求68-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于2%的團(tuán)聚體。83.權(quán)利要求68-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述純化的小模塊免疫藥物蛋白含有少于的團(tuán)聚體。84.權(quán)利要求68-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有超過20%的高分子量團(tuán)聚體。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述蛋白制備物含有超過60%的高分子量團(tuán)聚體。86.權(quán)利要求68-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白制備物含有少于30%的高分子量團(tuán)聚體。87.權(quán)利要求68-86中任一項(xiàng)的方法，其中所述小模塊免疫藥物蛋白特異性結(jié)合至CD20。88.權(quán)利要求87的方法，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含與SEQIDN0:l_59和67-76具有至少80%相同性的氨基酸序列。89.使用權(quán)利要求1-88中任一項(xiàng)的方法純化的小模塊免疫藥物蛋白。90.一種從含有超過20%的高分子量團(tuán)聚體的蛋白制備物純化蛋白的方法，所述方法包含使所述蛋白制備物在操作條件下進(jìn)行羥基磷灰石層析的步驟，使得所述純化的蛋白含有少于4%的團(tuán)聚體。91.權(quán)利要求90的方法，其中所述蛋白制備物含有超過60%的高分子量團(tuán)聚體。92.權(quán)利要求90的方法，其中所述操作條件包含在磷酸鹽緩沖液中從羥基磷灰石層析柱洗脫所述蛋白。93.權(quán)利要求92的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含磷酸鈉、磷酸鉀和/或磷酸鋰。94.權(quán)利要求92的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含在lmM-50mM濃度范圍的磷酸鈉。95.權(quán)利要求92的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液還包含在100mM-2.5M濃度范圍的氯化鈉。96.權(quán)利要求92的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液包含在2mM-32mM濃度范圍的磷酸鈉和在IOOmM-L6M濃度范圍的氯化鈉。97.權(quán)利要求92-96中任一項(xiàng)的方法，其中所述磷酸鹽緩沖液具有6.5-8.5范圍的pH。98.權(quán)利要求90的方法，其中所述蛋白包含小模塊免疫藥物多肽。99.一種包含小模塊免疫藥物蛋白和藥學(xué)可接受的媒介物的藥物組合物，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含少于4%的高分子量團(tuán)聚體。100.權(quán)利要求99的藥物組合物，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含少于3%的高分子量團(tuán)聚體。101.權(quán)利要求99的藥物組合物，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含少于2%的高分子量團(tuán)聚體。102.權(quán)利要求99的藥物組合物，其中所述小模塊免疫藥物蛋白包含少于的高分子量團(tuán)聚體。全文摘要本發(fā)明提供了基于羥基磷灰石層析的從含有高分子量(HMW)團(tuán)聚體和其他雜質(zhì)的蛋白制備物純化或回收蛋白，特別是小模塊免疫藥物(SMIPsTM)蛋白的方法。在一些實(shí)施方案中，所述羥基磷灰石層析與親和層析和/或離子交換層析組合使用。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的創(chuàng)造性的方法包含不超過3個(gè)層析步驟。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明純化的諸如SMIPsTM的蛋白和含有相同蛋白的藥物組合物。文檔編號(hào)C07K16/46GK102395597SQ201080011523公開日2012年3月28日申請(qǐng)日期2010年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者A·諾伊斯,C·加洛,D·拉卡斯,J·E·布思,J·科米爾,S·孫申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司