專利名稱：用于創(chuàng)傷調(diào)理和皮膚護(hù)理的新型蛋白酶的制作方法
用于創(chuàng)傷調(diào)理和皮膚護(hù)理的新型蛋白酶本發(fā)明涉及一種含有蛋白酶的用于創(chuàng)傷調(diào)理和皮膚護(hù)理的藥物組合物和化妝品組合物以及醫(yī)藥產(chǎn)品，所述蛋白酶來自絲光綠蠅(Lucilia sericata)，并被稱為清創(chuàng)酶 (debrilase)。清創(chuàng)酶是通過使用幼蟲轉(zhuǎn)錄物組(即，mRNA制備物)并將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA 而鑒定出的，并且通過使用重組技術(shù)和隨后在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)而制得。本發(fā)明的蛋白酶具有纖維蛋白水解活性、酪蛋白水解活性和PAR_2(蛋白酶激活受體幻激活活性。在一個實(shí)施方式中，提供了含有清創(chuàng)酶的組合物，用來清潔由壞死細(xì)胞、組織和纖維蛋白圍袖 (fibrin cuff)引起的緩慢愈合或不愈合的創(chuàng)傷，這一過程被稱為清創(chuàng)。在另一個實(shí)施方式中，提出了清創(chuàng)酶在皮膚護(hù)理和皮膚光滑化領(lǐng)域中的化妝品用途。本發(fā)明還涉及編碼具有切割纖維蛋白和酪蛋白能力的絲氨酸蛋白酶的核酸分子， 所述核酸分子是編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :4或由氨基酸序列SEQ ID NO :4組成的絲氨酸蛋白酶的核酸分子，本發(fā)明還涉及編碼上述絲氨酸蛋白酶的前體或片段的核酸分子。 此外，本發(fā)明涉及包含核苷酸序列SEQ ID NO :3或由核苷酸序列SEQ ID NO :3組成的核酸分子，和與核苷酸序列SEQ ID NO :3的同一性為至少77%、更優(yōu)選為至少80%、進(jìn)一步優(yōu)選為至少85%且最優(yōu)選為至少90%的編碼絲氨酸蛋白酶的核酸分子。在其中T被U置換了的任何上述核酸也在本發(fā)明的范圍中。在本說明書中，引用了包括專利申請和制造商的手冊在內(nèi)的多個文獻(xiàn)。不認(rèn)為這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容與本發(fā)明的專利性有關(guān)，并通過引用將其完整地并入本文中。更具體而言，將所參考的所有文獻(xiàn)通過引用并入本文中，其程度相當(dāng)于特定地且單獨(dú)地指明將每個單獨(dú)的文獻(xiàn)都通過弓I用并入本文中。創(chuàng)傷愈合有三個不同階段⑴炎癥；(2)細(xì)胞遷移和增殖；和(3)重塑。在炎癥階段，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞會釋放蛋白酶。嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會分泌出對創(chuàng)傷愈合的下一階段進(jìn)行調(diào)節(jié)的各種淋巴因子。第二階段稱為增殖階段，該階段包括成纖維細(xì)胞遷移、增殖和新的細(xì)胞外基質(zhì)分子的合成。這些事件看似是以確定的順序出現(xiàn)，在此情況下包括纖維連接蛋白、膠原和蛋白聚糖在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)分子被分泌至肉芽床(granulation bed)中。 炎癥階段在3天時達(dá)到峰值。創(chuàng)傷愈合的第二階段通常在受傷后約1到2周達(dá)到峰值，隨后是更加長久的第三階段，即組織重塑，該階段在幾周內(nèi)開始并可能持續(xù)數(shù)月。在重塑階段， 當(dāng)已破壞的膠原纖維被更厚更有序排列的膠原分子置換時，結(jié)締組織基質(zhì)變成熟。這種組織重塑最終增加了創(chuàng)傷的抗張強(qiáng)度，且有時伴有瘢痕形成。皮膚損傷基本上總會涉及對血管的傷害。因此，創(chuàng)傷愈合還包括凝血過程，凝血過程是血液形成凝塊的復(fù)雜過程。該過程為止血的重要環(huán)節(jié)，通過該過程，含有血小板和纖維蛋白的凝塊會覆蓋受損的血管壁，從而使流血停止并開始修復(fù)受損血管。凝血紊亂會使出血和/或形成血栓的風(fēng)險升高。在血管所受的傷害已經(jīng)對內(nèi)皮造成損傷后，幾乎會立即引發(fā)凝血。血小板會在受傷部位立刻形成止血栓(初期止血)。在血漿中的凝血因子以復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)做出響應(yīng)從而形成強(qiáng)化血小板栓的纖維蛋白股的同時，發(fā)生二期止血。二期止血的凝血級聯(lián)反應(yīng)有兩種途徑，即接觸活化途徑(舊稱內(nèi)源性途徑)和組織因子途徑(舊稱外源性途徑)，這兩種途徑均導(dǎo)致纖維蛋白的形成?，F(xiàn)已知，血液凝固啟動的主要途徑是組織因子途徑。這些途徑為一系列反應(yīng)，其中絲氨酸蛋白酶的酶原(無活性的酶前體)及其糖蛋白輔助因子經(jīng)活化而變成具有活性的組分，該組分隨后催化級聯(lián)中的下一個反應(yīng)， 并最終形成交聯(lián)的纖維蛋白。除了 FVIII和FV是糖蛋白并且因子XIII是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶之外，凝血因子通常為絲氨酸蛋白酶。通常凝血級聯(lián)劃分為三個途徑。組織因子途徑和接觸活化途徑均會激活因子X、凝血酶和纖維蛋白的“最終共同途徑”。纖維蛋白是參與血液凝塊形成的蛋白。其為纖維狀蛋白，其經(jīng)聚合而與血小板一起在創(chuàng)傷部位上形成止血栓或凝塊。纖維蛋白是從其酶原纖維蛋白原轉(zhuǎn)變而來，纖維蛋白原是由肝臟合成的可溶的血漿糖蛋白。在凝血級聯(lián)反應(yīng)中，酶原凝血酶原(prothrombin) 經(jīng)活化而成為絲氨酸蛋白酶凝血酶，凝血酶負(fù)責(zé)將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。隨后纖維蛋白通過因子XIII而發(fā)生交聯(lián)，從而形成凝塊。纖溶酶以蛋白水解方式將纖維蛋白切割成纖維蛋白降解產(chǎn)物，纖維蛋白降解產(chǎn)物抑制過多的纖維蛋白形成。纖溶酶是通過對纖溶酶原進(jìn)行蛋白水解式切割而產(chǎn)生的，纖溶酶原是在肝臟中合成的血漿蛋白。內(nèi)皮合成并分泌的組織纖溶酶原激活劑(t-PA)催化上述切割。纖溶酶原在凝塊形成過程中被捕集，并在創(chuàng)傷已停止流血且凝塊分解時被緩慢激活。創(chuàng)傷愈合過程中的凝塊瓦解是使上述基質(zhì)形成和重塑得以實(shí)現(xiàn)的重要步驟。緩慢愈合或慢性創(chuàng)傷的一個潛在原因據(jù)認(rèn)為是缺乏纖維蛋白溶解作用。所謂的“纖維蛋白圍袖”，由纖維蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、腱生蛋白、膠原和白細(xì)胞組成，會妨礙營養(yǎng)、 生長因子和氣體的交換，并導(dǎo)致缺氧、潰瘍形成，且阻礙血管生成。這些“纖維蛋白圍袖”的蛋白水解式溶解支持新血管形成、白細(xì)胞侵襲、成纖維細(xì)胞遷移、新上皮的形成，并且誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移。此外，膿液、組織碎屑、細(xì)菌和滲出液的存在會延遲創(chuàng)傷的愈合，其可以通過清創(chuàng)試劑來除去。清創(chuàng)的定義為將非生命組織從創(chuàng)傷處除去。在慢性創(chuàng)傷中，清創(chuàng)是指消除壞死物以及將創(chuàng)傷敷料、異物和其他非生命物質(zhì)清除掉。充分的清創(chuàng)是無延遲創(chuàng)傷愈合過程的一個基本前提。除了對延遲性創(chuàng)傷愈合的起因進(jìn)行處理外，清創(chuàng)還應(yīng)當(dāng)是為慢性創(chuàng)傷進(jìn)行的充分的階段適應(yīng)性創(chuàng)面床準(zhǔn)備中的第一步。對慢性創(chuàng)傷的不同清創(chuàng)方法已有描述，例如外科手術(shù)、蛆療法、激光、超聲、水療法、濕-干(wet-to-dry)法、自體溶解、蛋白水解酶、滲透壓清創(chuàng)或化學(xué)清創(chuàng)。清創(chuàng)試劑在不傷害活細(xì)胞的情況下快速消化壞死組織，從而加速了愈合過程。在尋找此類清創(chuàng)試劑的過程中已采用了大量不同的植物和動物材料，例如蛆或麗蠅 (blowfly)的幼蟲，但也采用了酶，如來源于植物的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶(bromelain) 及羅漢果蛋白酶(ananain)(例如 US 6548556、EP 0194647B1、US 5106621)、來源于微生物的蛋白酶(例如來自弧菌屬的蛋白酶，US 5145881 ；來自桿菌屬的嗜熱菌蛋白酶，WO 03/088993AUUS 2003/0198632A1)和來自動物的蛋白酶(例如，來自魚的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，US 684648 。一些清創(chuàng)性酶作為凝血級聯(lián)反應(yīng)中的蛋白酶抑制劑(凝血酶抑制性微管連接蛋白-1 (PN-I)，US 5112608)或急性期反應(yīng)中的蛋白酶抑制劑(α 1-抗胰蛋白酶，US 6262020)起作用。清創(chuàng)性酶的主要目的是清潔創(chuàng)傷的所有不同壞死組織要素，并減少粘性滲出性分泌。恰當(dāng)應(yīng)用的蛋白水解酶會凈化受感染表面的炎性滲出液，且不傷害活組織。這些酶促使分布有含膿、含血和含纖維蛋白的累積物的區(qū)域的排出，促進(jìn)藏匿細(xì)菌的
5釋放以使其可接觸免疫防御系統(tǒng)。清創(chuàng)性酶的酶促作用可用于非愈合性創(chuàng)傷(例如Lobmarm等，Proteases and the diabetic foot syndrome :Mechanisms and therapeutic Implications. Diabetes Care 觀0005)，461-471)，但是其也能夠有益于治療炎性皮膚疾病(例如銀屑病和濕疹等)和嚴(yán)重程度較低的皮膚病癥(例如皺紋、痤瘡和干性皮膚)，如在例如美國專利第4，524，136、 5，439，935,5, 441，740,5, 554，366,5, 853，705 和 6，780，444 號中所公開的。包含此類酶的
商品也是可以獲得的，例如Accuzyme (木瓜蛋白酶)和Granulex (胰蛋白酶)，其應(yīng)用限于對創(chuàng)傷的清創(chuàng)。為找到更佳的創(chuàng)傷清創(chuàng)用酶而進(jìn)行的努力一直在持續(xù)。高度優(yōu)選的創(chuàng)傷清創(chuàng)用酶的一些標(biāo)準(zhǔn)是下述標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個、且優(yōu)選多個(例如全部)其應(yīng)當(dāng)能夠快速消化纖維蛋白、變性膠原、彈性蛋白和滲出液；其應(yīng)當(dāng)不傷害正常出現(xiàn)的人皮膚組織；其應(yīng)當(dāng)對創(chuàng)傷無毒性且無刺激性；其應(yīng)當(dāng)容易制備、穩(wěn)定且易于使用。例如，W02007/074454A2中描述了適于在環(huán)境條件下儲存且同時保持酶活性的穩(wěn)定的濃縮酶組合物以及包含酶組合物的試劑盒。處理慢性創(chuàng)傷的若干方法包括使用使創(chuàng)傷保持濕潤的敷料，從而支持浸潤創(chuàng)傷的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的活力。對于創(chuàng)傷處理，提出了使用蛋白酶(S卩，肽鏈外切酶和肽鏈內(nèi)切酶)和使用蛋白酶抑制劑。Bott 等(A silicone-based controlled-release device for accelerated proteolytic debridement of wounds,Wound Repair Regen. (2007) 15 :227-35)描述了一種基于硅酮的器件，用來對創(chuàng)傷的蛋白水解式清創(chuàng)所用的酶進(jìn)行控制型釋放，該器件使用了枯草桿菌蛋白酶家族的蛋白酶。類似的是，US 73681 描述了一種用于持續(xù)釋放清創(chuàng)性酶的敷料，該敷料由吸收材料層和可降解的聚合物材料組成。幾個世紀(jì)以來，已知蛆對創(chuàng)傷具有有益效果。在20世紀(jì)30年代到20世紀(jì)40年代早期的美國，釆納并常規(guī)地使用了蛆清創(chuàng)療法(MDT)方法，但是青霉素和現(xiàn)代外科手術(shù)禾呈序的出現(xiàn) MDT (Child FS, Roberts EF. The treatment of chronic osteomyelitis with live maggots. New York State J Med 1931 ；31 :937-43 ；Teich S, Myers RAM. Maggot therapy for severe skin infections. South Med J 1986 ；79 :1153-5 ；Church JCT. Larvae therapy in modern wound care :A review. Primary Intention 1999 ；May :63-8 ； Sherman RA, Hall MJR, Thomas S. Medicinal maggots :An ancient remedy for some contemporary afflictions. Ann Rev Entomol 45(2000) :55-81，Courtenay，M.等，Larva therapy in wound management，J. R. Soc. Med. 93(2000) :72-74)。對創(chuàng)傷應(yīng)用蛆常常使患者感到不愉快甚至疼痛。但是，不同昆蟲物種的幼蟲卻被用于常規(guī)情況下無法治療的創(chuàng)傷的清潔和愈合。某些蠅物種的蛆以壞死組織為食，并且通過這種清創(chuàng)活性幫助愈合慢性軟組織創(chuàng)傷，例如壓力性潰瘍和靜脈淤滯潰瘍、糖尿病足感染和手術(shù)后創(chuàng)傷，這些創(chuàng)傷對外科手術(shù)或抗生素干預(yù)有抗性(Sherman RA. 1998，Maggot debridement in modern medicine. Infect Med 15 :651-6, Sherman RA,Hall MJR,Thomas S.,2000,Medicinal maggots :An ancient remedy for some contemporary afflictions. Ann Rev Entomol 45 :55-81)。
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醫(yī)學(xué)用蛆發(fā)揮三個主要作用1)其通過溶解死(壞死)的受感染組織而對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)(清潔)；2)其通過殺死細(xì)菌而對創(chuàng)傷進(jìn)行殺菌；和3)其刺激創(chuàng)傷愈合。Horobin等Q006)描述了使用了應(yīng)用至慢性創(chuàng)傷的絲光綠蠅的幼蟲或綠蠅 (green bottle fly)的蛆的MDT，從而通過觸發(fā)成纖維細(xì)胞遷移和基質(zhì)重塑來幫助愈合 (Horobin 等，Promotion of human dermal fibroblast migration， matrix remodelling and modification of fibroblast morphology within a novel 3D model by Lucilia sericata larval secretions，J Invest Dermatol. 126 :1410-1418)。此前，他們對存在于蛆的排泄物/分泌物(ES)中的某種酶活性進(jìn)行了表征(Horobin等，2003，Maggots and wound healing :an investigation of the effects of secretions from Lucilia sericata larvae upon interactions between human dermal fibroblasts and extracellular matrix components, Br.J.Dermatol. 148 :923-933)。通過使用3齡幼蟲，示出了來自絲光綠蠅蛆的分泌物對諸如藤黃色微球菌 (Micrococcus luteus)和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)等常見的創(chuàng)傷菌落具有殺菌活性(Daeschlein, G.等，2007，In vitro antibacterial activity of Lucilia sericata maggot secretions，Skin Pharmacol· Physiol· 20 :112-115)0成纖維細(xì)胞和周圍的細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用在組織形成中起到關(guān)鍵作用，影響成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和組織重塑。蛆增強(qiáng)創(chuàng)傷內(nèi)組織形成的假定機(jī)制可能是通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的移動性、加速細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和協(xié)調(diào)細(xì)胞響應(yīng)，從而使具有活力的成纖維細(xì)胞更廣泛分布。據(jù)顯示，絲光綠蠅的ES產(chǎn)物在被覆纖維連接蛋白的表面上促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移，并且這與蛆排泄物/分泌物中的絲氨酸蛋白酶所導(dǎo)致的纖維連接蛋白的降解有關(guān)(Chambers 等，2000，Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds, Brit J Dermatol. 148 :14-23)。在羊麗蠅(即銅綠蠅(Lucilia cuprina))的1齡幼蟲cDNA中鑒定出了很多各種各樣的絲氨酸蛋白酶基因(Elvin 等，1994，An estimate of the number of serine protease genes expressed in sheep blowfly larvae (Lucilia cuprina)” Insect Molecular Biol 3:105-115)。從銅綠蠅的1齡幼蟲的ES產(chǎn)物中純化出了兩種胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(Casu等，1994，Excretory/secretory chymotrypsin from Lucilia cuprina purification， enzymatic specificity and amino acid sequence deduced from mRNA， Insect Molecular Biol 3 :201-211)。使用對胰蛋白酶樣和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶有活性的多種蛋白酶抑制劑通過體外喂食測定來表征了來自銅綠蠅的消化道蛋白酶(Cam 等，1994，Isolation of a trypsin-like serine protease gene family from the sheep blowfly Lucilia cuprina, Insect Molecular Biol3 :159-170)。在用胰蛋白酶抑制劑尤其是大豆胰蛋白酶抑制劑對1齡幼蟲進(jìn)行喂食時，觀察到了明顯的幼蟲生長阻滯。喂食胰凝乳蛋白酶抑素(chymostatin)(—種胰凝乳蛋白酶抑制劑)不會導(dǎo)致明顯的生長阻滯。這一信息表示胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶很可能是主要的消化道消化酶。Chambers 等(2003, Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds, British J. Dermatol 148 :14-23)描述了對綠蠅絲光綠蠅的1 3齡幼蟲的纖維蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)組分有活性的蛋白酶。他們在早幼蟲期(1齡和2齡)的排泄物中發(fā)現(xiàn)了最高的比活性。包含在幼蟲排泄/分泌(ES)產(chǎn)物中的具有胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶樣活性的蛋白酶據(jù)認(rèn)為可通過除去壞死組織而有助于對創(chuàng)傷的清創(chuàng)。使用帶異硫氰酸熒光素標(biāo)簽的酪蛋白作為模型底物，在分泌物中檢測到了三類蛋白水解酶兩個不同亞類(胰蛋白酶樣和胰凝乳蛋白酶樣)的絲氨酸蛋白酶(最適pH為8 9)、天冬氨酸蛋白酶(最適pH為5)和具有肽鏈外切酶特性的金屬蛋白酶(最適PH為9)。使用皮膚相關(guān)的ECM組分作為底物，絲光綠蠅的ES產(chǎn)物使纖維蛋白凝塊溶解并且降解了纖維連接蛋白、層粘連蛋白和酸化可溶的I型和III型膠原。盡管存在這些結(jié)果，但科學(xué)家和醫(yī)生們至今仍在尋找幼蟲中大量的具有蛋白水解活性的蛋白中的有效要素。已知幼蟲分泌物能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)/創(chuàng)傷組分、纖維連接蛋白、層粘連蛋白以及膠原I、III、IV和V。這些大分子見于慢性創(chuàng)傷的腐肉(slough)中， 而且還形成主要存在于慢性潰瘍中的“纖維蛋白圍袖”。幼蟲分泌物對層粘連蛋白和纖維連接蛋白的降解作用受到PMSF的抑制，但不會受到APMSF或金屬蛋白酶抑制劑1，10- 二氮雜菲的明顯抑制。幼蟲分泌物活性的最適pH為8. 0 8. 5 (Chambers等，2000，Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds, Brit J Dermatol. 148 :14-23)，該pH值與慢性創(chuàng)傷中從酸性到堿性的較寬pH范圍并不一致。因此，需要這樣清創(chuàng)性酶在寬得多的PH范圍內(nèi)其還具有如所述的幼蟲分泌物的活性那樣的活性。據(jù)US 7144721B1中推測，幼蟲分泌物中的主要蛋白水解活性是絲氨酸蛋白酶活性，并且存在兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性；一種源自胰凝乳蛋白酶，另一種源自胰蛋白酶。US 2008/0108551A1提供證據(jù)證明，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是絲光綠蠅進(jìn)行的蛋白酶介導(dǎo)的創(chuàng)傷愈合中的重要步驟。在上述申請中，提出了從絲光綠蠅的排泄/分泌產(chǎn)物中分離出的絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其分別降解細(xì)胞外基質(zhì)組分纖維連接蛋白或提高細(xì)胞遷移。顯而易見，所得到的具生物活性的纖維連接蛋白降解產(chǎn)物會促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。 WO 2007/138361A3公開了一種用于治療創(chuàng)傷的來自絲光綠蠅幼蟲的胰凝乳蛋白酶。在絲光綠蠅幼蟲的分泌產(chǎn)物中，鑒定出了明顯參與創(chuàng)傷愈合的其他蛋白，例如核酸酶(W0 2007/122424A2)和 toll 樣受體的配體(US 2005/0053597A1)。雖然近年來在清創(chuàng)組合物的開發(fā)中取得了進(jìn)展，但仍然需要提供明確確定的清創(chuàng)化合物或含有確定成分的組合物，其性質(zhì)與上文討論的現(xiàn)有技術(shù)的材料相比如果沒有改進(jìn)，則至少應(yīng)當(dāng)相似。例如通過鑒定使蛆提供的創(chuàng)傷愈合得到提高的有效要素，可以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。此類化合物還可用于化妝品應(yīng)用中。因此，在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，所述核酸分子是(i)編碼具有纖維蛋白和酪蛋白切割能力的絲氨酸蛋白酶的下述核酸分子(a) (f) :(a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :4或由氨基酸序列SEQ ID NO :4組成的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO 3或由核苷酸序列SEQ ID NO 3組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(d)包含與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一個的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子；(ii)編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的片段的核酸分子，所述片段與(i)中所述的絲氨酸蛋白酶活性相同；(iii)編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的前肽(prop印tide)的核酸分子，所述前肽被切割為其活性形式，且優(yōu)選在治療創(chuàng)傷前即刻切割或在治療創(chuàng)傷過程中切割，其中，所述前肽由選自下述核酸分子(a) (f)的核酸分子編碼(a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO 6或由氨基酸序列SEQ ID NO 6組成的絲氨酸蛋白酶前肽的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO 5或由核苷酸序列SEQ ID NO 5組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與
(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶前肽的核酸分子；(d)包含與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一個的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子；或者(iv)編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的前肽原(pre-prop印tide)的核酸分子， 其中，所述前肽原由選自下述核酸分子(a) (f)的核酸分子編碼(a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO :2或由氨基酸序列SEQ ID NO :2組成的絲氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子；(b) 包含核苷酸序列SEQ ID NO 1或由核苷酸序列SEQ ID NO=I組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子；(d)包含與
(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成的核酸分子；(e)與 (d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一個的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子。本發(fā)明中的術(shù)語“核酸分子”包括DNA (例如cDNA或基因組DNA)和RNA。還包括本領(lǐng)中已知的核酸模擬分子，例如DNA或RNA的合成或半合成的衍生物，以及混合聚合物。 本發(fā)明的這種核酸模擬分子或核酸衍生物包括硫代磷酸核酸(phosphorothioate nucleic acid)、氨基磷酸核酸(phosphoramidate nucleic acid),2' -0-甲氧基乙基核糖核酸、嗎啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、肽核酸(PNA)和鎖核酸(LNA)(參見Braasch和Corey，Chem Biol 2001,8 1)0 LNA是其中核糖環(huán)受到2'氧和4'碳間的亞甲基鍵限制的RNA衍生物。術(shù)語“絲氨酸蛋白酶”是指屬于一個亞類的具有蛋白水解活性的蛋白，其特征為該亞類的成員在其活性中心含有絲氨酸，該絲氨酸與組氨酸和天冬酰胺一起構(gòu)成多數(shù)絲氨酸蛋白酶所共有的催化三聯(lián)體(Rawlings，N. D.，Barrett, A. J. (1994). Families of serine peptidases. Meth. Enzymo 1. 244 :19-61)。絲氨酸蛋白酶的類別為水解酶，并且屬于EC編號分類體系中的亞類3. 4. 21。本發(fā)明的核酸分子所編碼的蛋白本身可以顯示出絲氨酸蛋白酶的蛋白水解活性(例如SEQ ID NO 4)或者可以在進(jìn)一步成熟或活化(例如，通過蛋白水解加工)后顯示出上述活性(例如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 6)；另外參見下文對本發(fā)明的前肽的討論。蛋白水解加工可以包括信號肽從前肽原(例如具有SEQ ID NO :2的前肽原) 的切除以及通過蛋白水解式切割對前肽(例如具有SEQ ID NO 6的前肽)進(jìn)行的進(jìn)一步蛋白水解加工。本文所用的術(shù)語“信號肽”的定義為引導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至特定細(xì)胞區(qū)室且優(yōu)選轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的短氨基酸序列(優(yōu)選3 60個氨基酸長)。本文所用的術(shù)語“前肽”描述了線狀的氨基酸分子鏈，其為蛋白的前體并且在該蛋白成熟或活化的過程中被切割(例如，氨基酸序列SEQ ID NO :6或由核苷酸序列SEQ ID NO 5編碼的氨基酸序列)。本文所用的術(shù)語“前肽原”是前肽的前體，其進(jìn)一步含有信號肽 (例如，氨基酸序列SEQ ID NO :2或由核苷酸序列SEQ ID NO 1編碼的氨基酸序列)。其為最初的翻譯產(chǎn)物。同樣地，如果將所述前肽原應(yīng)用至創(chuàng)傷中，其被切割為其活性形式，且優(yōu)選是在治療所述創(chuàng)傷前即刻切割或在治療所述創(chuàng)傷的過程中切割。術(shù)語“具有纖維蛋白和酪蛋白切割能力”優(yōu)選僅指成熟蛋白的活性，但也可以包括作為成熟蛋白前體的前肽原和前肽的即將具有的活性(該活性通過上述切割來實(shí)現(xiàn))。本文所用的術(shù)語“蛋白”可與術(shù)語“多肽”或“肽”互換，其描述了線狀的氨基酸分子鏈，包括單鏈蛋白或其片段，且優(yōu)選包含超過30個氨基酸。通常僅將具有30個氨基酸以下的氨基酸段稱為肽而不是多肽。根據(jù)場合，本文中的術(shù)語“蛋白”或“多肽”可以表示成熟蛋白(例如氨基酸序列SEQ ID NO :4或由核苷酸序列SEQ ID NO :3編碼的氨基酸序列)、前肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO :6或由核苷酸序列SEQ ID NO :5編碼的氨基酸序列)或前肽原(例如氨基酸序列SEQ ID NO :2或由核苷酸序列SEQ ID NO 1編碼的氨基酸序列)。 多肽可以進(jìn)一步形成由至少兩個相同或不同的分子組成的寡聚體。相應(yīng)地，將此類多聚體的相應(yīng)更高級結(jié)構(gòu)稱為同源或異源二聚體、同源或異源三聚體等。此外，本發(fā)明還涵蓋此類蛋白/多肽的肽模擬物，其中氨基酸和/或肽鍵已被功能性類似物置換。這種功能性類似物包括除20種基因編碼的氨基酸外所有已知的氨基酸，例如硒代半胱氨酸。術(shù)語“多肽”、 “蛋白”和“肽”還指經(jīng)天然修飾的多肽/蛋白和肽，其中所述修飾通過例如糖基化、乙?；?磷酸化及本領(lǐng)域公知的類似修飾來實(shí)現(xiàn)。關(guān)于本發(fā)明的片段，術(shù)語“相同的活性”是指本文所列舉的存在于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶清創(chuàng)酶的片段中的生物活性。本發(fā)明此實(shí)施方式的片段視其長度可以是多肽或具有 30個以下氨基酸的肽。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“百分比(％ )序列同一性”描述了相對于構(gòu)成模板核酸或氨基酸序列總長度的核苷酸或氨基酸殘基數(shù)量，比對中的兩個以上核酸或氨基酸序列中相一致的核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)數(shù)。換言之，通過使用比對，對于兩個以上的序列或子序列，在對這些(子)序列進(jìn)行比較和比對以在比較視窗或指定區(qū)域上獲得用本領(lǐng)域已知的序列比較算法測得的最大對應(yīng)時，或者在進(jìn)行人工比對和目視檢查時，可以確定其相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比(例如，80^^85^^90%或95%的同一性)。此定義同樣適用于測試序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的氨基酸序列分析和比對是通過使用NCBI BLAST算法進(jìn)行的(St印hen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro Α. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller 禾口 David J.Lipman(1997), “ Gapped BLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs" , Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402)。技術(shù)人員還知曉用來對核酸序列進(jìn)行比對的適合程序。與SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6相比，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列中的替換優(yōu)選為保守性替換。即，替換優(yōu)選發(fā)生在同一類別的氨基酸內(nèi)。例如，優(yōu)選將帶正電荷的氨基酸突變?yōu)榱硪粠д姾傻陌被?。這同樣適用于堿性氨基酸類、芳香氨基酸類或脂肪族氨基酸類。本發(fā)明中的術(shù)語“簡并”是指遺傳密碼的簡并。簡并的產(chǎn)生是因?yàn)槿?lián)體密碼指定了 20種氨基酸和終止密碼子。由于存在四種用來編碼遺傳信息的堿基，因此需要三聯(lián)體密碼子來產(chǎn)生至少21種不同的密碼。堿基三聯(lián)體可以有43種可能性，從而產(chǎn)生64種可能的密碼子，這意味著必須存在某種簡并。因此，一些氨基酸由多于一個三聯(lián)體編碼，即由最多6個三聯(lián)體編碼。簡并主要產(chǎn)生于三聯(lián)體中第三個位置的變更。這意味著序列與上述序列不同但仍編碼同一多肽的核酸分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)創(chuàng)傷未在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)愈合時，經(jīng)常面臨的問題是除去“纖維蛋白圍袖”和壞死組織以使成纖維細(xì)胞能夠浸潤并因此使創(chuàng)傷愈合過程能夠開始。令人驚奇的是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的核酸所編碼的絲氨酸蛋白酶具有溶解這些纖維蛋白圍袖從而使創(chuàng)傷可以進(jìn)行自然愈合的極佳性質(zhì)。據(jù)信具有絲光綠蠅創(chuàng)傷愈合活性的主要有效要素是一種具有生物活性的絲氨酸蛋白酶。在本文中該酶亦稱“清創(chuàng)酶”，意指其對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)的提出用途。絲光綠蠅的幼蟲通常以活體應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，用來治療對常規(guī)治療有抗性的創(chuàng)傷。由于許多患者對蛆療法感到很不愉快，并且該昆蟲分泌物也遠(yuǎn)非確定的藥物組合物，所以本發(fā)明人通過分子方法而著手鑒定了至少一種創(chuàng)傷清創(chuàng)的有效要素。從以血瓊脂為食的2齡幼蟲的mRNA (轉(zhuǎn)錄物組)生成cDNA文庫，從而鑒定出了編碼高豐度表達(dá)的胰蛋白酶樣蛋白酶及相應(yīng)氨基酸序列的核酸，該蛋白酶及相應(yīng)氨基酸序列可能是參與絲光綠蠅幼蟲對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)的主要蛋白酶。在從分離自5日齡幼蟲(3齡) 的mRNA得到的cDNA文庫中未發(fā)現(xiàn)此酶。這與幼蟲齡期越晚清創(chuàng)活性越低這一現(xiàn)象相符 (Chambers 等，2003)。在用血基底誘導(dǎo)的2齡幼蟲的轉(zhuǎn)錄物組中，通過對所述文庫進(jìn)行酪蛋白蛋白水解活性篩選而得到了編碼蛋白酶的若干cDNA序列。對誘導(dǎo)的2齡幼蟲的文庫中的cDNA序列進(jìn)行分析，從而鑒定出了僅存在于2齡幼蟲所產(chǎn)生的cDNA文庫中但不在更晚期(3齡) 幼蟲的轉(zhuǎn)錄物組中的蛋白酶。在所發(fā)現(xiàn)的這些蛋白酶中，有一些分別與含磷胰凝乳蛋白酶 (phosphochymotrypsin)、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶具有核酸序列相似性。未發(fā)現(xiàn)金屬型、 蘇氨酸型、半胱氨酸型、天冬氨酸型或谷氨酸型蛋白酶。在脫脂乳上進(jìn)行的第一瓊脂平板篩選中，發(fā)現(xiàn)了若干cDNA克隆分泌出具有酪蛋白水解活性的酶，但僅有一種酶還在含纖維蛋白的基底上顯示出活性。通過重組表達(dá)和在不同測定中對該酶的生化性質(zhì)進(jìn)行的評估，對該酶進(jìn)行了表征。核酸序列分析顯示出在誘導(dǎo)的幼蟲的mRNA中高豐度的三種絲氨酸型蛋白酶和兩種胰蛋白酶型蛋白酶。所述胰蛋白酶型蛋白酶顯示出纖維蛋白水解活性和酪蛋白水解活性。使用 NCBI BLAST 算法 Stephen F. Altschul，Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller 禾口 David J. Lipman(1997), " Gapped BLAST and PSI-BLAST -.a new generation of protein database search programs “ ，Nucleic Acids Res. 25 :3389-340 對纖維蛋白水解蛋白酶中的一種(其與由氨基酸序列SEQ IDNO :4表示的且由核酸序列SEQ ID NO :2編碼的清創(chuàng)酶對應(yīng))進(jìn)行的氨基酸序列分析顯示出，其與來自麻蠅屬(Sarcophaga sp.)的胰蛋白酶樣蛋白酶的蛋白序列同一性為76. 1%， 為與已知酶最接近的相似性。已發(fā)現(xiàn)清創(chuàng)酶以高豐度表達(dá)，因此其可能是參與絲光綠蠅幼蟲對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)的主要蛋白酶。在經(jīng)表達(dá)和翻譯后，清創(chuàng)酶是包含信號肽和前肽氨基酸的前肽原(圖5A)。通過切掉信號肽并通過對前肽進(jìn)行進(jìn)一步切割而實(shí)現(xiàn)對酶活性的激活， 從而產(chǎn)生清創(chuàng)酶的成熟蛋白(SEQ ID NO :4)，其中所述前肽明顯通過自體蛋白水解而得到切割。優(yōu)選的是，上述成熟蛋白由SEQ ID NO :3組成的核酸分子編碼。成熟清創(chuàng)酶具有纖維蛋白和酪蛋白切割能力。PMSF (苯甲基磺酰氟)和APMSF(4-脒苯基甲磺酰氟)可以完全抑制其活性。使用針對金屬型、蘇氨酸型、半胱氨酸型或天冬氨酸型蛋白酶的抑制劑時未檢測出抑制作用。這表明該蛋白是絲氨酸蛋白酶并且具有胰蛋白酶樣活性。已知惡化中的創(chuàng)傷病況涵蓋了較寬的pH范圍(Greener B等，2005. ftx)teases and pH in chronic wounds. J Wound Care;14Q))。在另一詳細(xì)研究中，在 12 個月中對患有不同來源的慢性創(chuàng)傷的39個患者的247個pH值進(jìn)行了分析，檢測到的值為5. 45 8. 65(Dissemond,J.等，2003，pH-Wert des Milieus chronischer Wunden,Untersuchungen im Rahmen einer modernen Wundtherapie，Der Hautarzt 54，No. 12，959-965)。清創(chuàng)酶高度穩(wěn)定，并且在5 10的pH范圍內(nèi)具有活性，從而使之適合應(yīng)用于慢性創(chuàng)傷并在上述具有較寬PH范圍發(fā)揮作用。此外，在細(xì)胞受體活化測定中，發(fā)現(xiàn)清創(chuàng)酶具有使蛋白酶激活受體2(PAM)活化的能力。PAR2是與鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體大家族的成員。PAR2還是蛋白酶激活受體家族的成員。其由胰蛋白酶而不是凝血酶來激活。胰蛋白酶實(shí)現(xiàn)了對受體的細(xì)胞外氨基末端的蛋白水解式切割，新氨基末端發(fā)揮系鎖配體(tethered ligand)的功能并且將該受體激活。PAR2在炎癥和疼痛中、在成纖維細(xì)胞增殖中(Asano-Kato等，Tryptase increases proliferative activity of human conjunctival fibroblasts through protease-activated receptor-2, Invest Ophthalmol Vis Sci.,2005 46(12) :4622-6) 和在有助于創(chuàng)傷愈合的結(jié)締組織形成中(Borensztajn K.等，2008，lector Xa stimulates proinflammatory and profibrotic responses in fibroblasts via protease-activated receptor-2activation, 1 =Am J Pathol. 172(2) :309-20)起重要作用。因此，本發(fā)明的胰蛋白酶樣酶通過切割系鎖配體而激活受體，隨后該受體觸發(fā)參與促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的生化過程。 例如，可以有利地使用清創(chuàng)酶來溶解在非愈合性創(chuàng)傷上經(jīng)常觀察到的“纖維蛋白圍袖”、除去壞死組織并觸發(fā)由受體介導(dǎo)的免疫和細(xì)胞響應(yīng)的反應(yīng)。本文在重組表達(dá)后首次在分子水平上描述和表征了來自絲光綠蠅的具有纖維蛋白水解活性、酪蛋白水解活性、PAR2激活活性和較寬的酶活性pH范圍的蛋白酶。清創(chuàng)酶及其具有清創(chuàng)酶活性的片段具有如下能力通過對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)，即除去死組織并溶解纖維蛋白圍袖，對緩慢愈合的創(chuàng)傷或慢性創(chuàng)傷進(jìn)行處理或預(yù)處理從而使之易于經(jīng)歷自然愈合過程和/或接受常規(guī)醫(yī)學(xué)治療。此外，所用的涉及皮膚處理的化妝品可改善皮膚的外表或肌理。向創(chuàng)傷應(yīng)用前肽會使該前肽通過酶促切割而轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍?。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子(即，編碼本說明書中所述的成熟蛋白、前肽或前肽原的核酸分子)的載體。此外，該載體可以包含編碼上述片段的核酸分子。本發(fā)明的載體能夠引導(dǎo)本發(fā)明的核酸分子的復(fù)制和/或表達(dá)，或者/并且引導(dǎo)由所述核酸分子編碼的多肽的表達(dá)。優(yōu)選的是，該載體為質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或在例如遺傳工程中常規(guī)使用的其他載體。例如在 Studier 等中(Studier, W. F. ；Rosenberg Α. H. ；Dunn J. J. ；Dubendroff J. W. ,1990, Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185,61-89)或在由 Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech 和Gibco BRL等公司提供的宣傳冊中，列有示例性的質(zhì)粒和載體。其他優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可見于:Glover,D. Μ. ,1985,DNA cloning :a practical approach，第 I-III 卷，IRL Press Ltd.，Oxford ；Rodriguez, R. L 禾口 Denhardt，D· T·(編)，1988，Vectors :a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham ；Goedeel, D. V.，1990，Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185，3—7 ； Sambrook, J. ；Russell，D. W.，2001，Molecular cloning :a laboratory manual，第三片反， Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York0適合的載體的非限制性實(shí)例包括原核生物質(zhì)粒載體，例如pUC系列、 pBluescript (Stratagene)、pET 系列表達(dá)載體(Novagen)或 pCRTOPO (Invitrogen) > λ gtll、ρ JOE、pBBRl-MCS 系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACTl,以及與在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)相容的載體，如pREP (Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、 pMClneo (Stratagene)、pXTl (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EB0_pSV2neo、pBPV-1、 pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2_dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA 表達(dá)載體 pcDVl (Pharmacia) 、 pRc/CMV、 pcDNAl、 pcDNA3 (Invitrogene) 、 pSPORTl (GIBCO BRL)、 pGEMHE (Promega)、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen)禾口 pCINeo (Promega)。適合于畢赤酵母(Pichia pastoris)的質(zhì)粒載體的實(shí)例包括例如質(zhì)粒pA0815、pPIC9K和pPIC3. 5K (全部來自 Invitrogen)。還可以將上文提及的本發(fā)明的核酸分子插入載體中從而產(chǎn)生與另一個核酸分子的翻譯融合物。將由此產(chǎn)生的產(chǎn)物稱作融合蛋白并且下文將對其進(jìn)一步描述。所述另一個核酸分子可以編碼例如可以使本發(fā)明的核酸分子所編碼的蛋白溶解度提高和/或易于純化的蛋白。非限制性實(shí)例包括pET32、pET41、pET43。載體還可以包含額外的可表達(dá)的核酸， 所述核酸編碼一種或多種用來促使蛋白正確折疊的分子伴侶。適合的細(xì)菌表達(dá)宿主包括例如源自 BL21 (如 BL21 (DE3)、BL21 (DE3) PlysS、BL21 (DE3) RIL、BL21 (DE3) PRARE)或Rosetta 的菌株?？梢杂脕韺⒕幋a本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的特別優(yōu)選的質(zhì)粒是pUC 18/19 (Roche Biochemicals)、pKK_177_3H(Roche Biochemicals)、pBTac2 (Roche Biochemicals)、pKK223_3 (Amersham Pharmacia Biotech)、pKK_233_3 (Stratagene)禾口 PET(Novagen)。在PCT/EP03/07148中列有其他適合的質(zhì)粒。極特別優(yōu)選的是以屬于pET 系列的質(zhì)粒為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)。關(guān)于載體修飾技術(shù)，參見Sambrook和Russel，2001。通常，載體可以包含用于克隆或表達(dá)的一個或多個復(fù)制起點(diǎn)(ori)和遺傳系統(tǒng)、用于在宿主中進(jìn)行選擇的一個或多個標(biāo)記基因(例如，抗生素抗性)和一個或多個表達(dá)盒。適合的復(fù)制起點(diǎn)包括例如Col El復(fù)制起點(diǎn)、SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)和M 13復(fù)制起點(diǎn)。插入載體中的編碼序列可以例如用標(biāo)準(zhǔn)方法合成或從天然來源分離。通過使用成熟的方法，可以將編碼序列連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和/或其他氨基酸編碼序列。確保在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(屬于表達(dá)盒的一部分)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。這些元件包括確保轉(zhuǎn)錄開始的調(diào)控序列(例如，翻譯起始密碼子、啟動子、增強(qiáng)子和 /或絕緣子)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ (Owens等，2001)和可選的確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定的poly-Α信號。額外的調(diào)控元件可以包括轉(zhuǎn)錄及翻譯增強(qiáng)子，和/或天然相關(guān)的或異源的啟動子區(qū)域。優(yōu)選的是，使本發(fā)明的核酸分子可操作地連接至使得可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的此類表達(dá)控制序列。載體還可以包含編碼分泌信號的核苷酸序列作為另外的調(diào)控元件。這些序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。此外，根據(jù)所用的表達(dá)系統(tǒng)，可以在本發(fā)明的核酸分子的編碼序列上添加能夠?qū)⒁驯磉_(dá)的多肽引導(dǎo)至細(xì)胞區(qū)室的前導(dǎo)序列。這些前導(dǎo)序列在本領(lǐng)域中是公知的。經(jīng)特別設(shè)計(jì)的載體使得DNA可以在不同宿主 (例如細(xì)菌-真菌細(xì)胞，或細(xì)菌-動物細(xì)胞)間穿梭。上文所述的本發(fā)明的核酸分子經(jīng)設(shè)計(jì)可以直接導(dǎo)入細(xì)胞或通過脂質(zhì)體、噬菌體載體或病毒載體(例如，腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)導(dǎo)入細(xì)胞。此外，桿狀病毒系統(tǒng)或基于牛痘病毒或塞姆利基森林病毒的系統(tǒng)可以作為載體用于本發(fā)明核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)中。源自諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒或牛乳頭狀瘤病毒等病毒的表達(dá)載體可以用來將核酸或載體遞送至靶向細(xì)胞群中。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來構(gòu)建重組病毒載體；參見例如Sambrook，2001和Ausubel，2001中描述的技術(shù)?？墒褂玫奶貏e是用于大腸桿菌中的對實(shí)施本發(fā)明而言特別有利的啟動子是技術(shù)人員己知的(Sambrook, J. ；Fritsch, E. F.禾口 Maniatis，Τ. (1989)，Molecular cloning -.a laboratory manual, M 二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。其他適合的啟動子是選自T7、lac、tac、trp、ara或可被鼠李糖誘導(dǎo)的啟動子的那些。另外的啟動子在下述文獻(xiàn)中有所提及Cantrell，SA(2003)Vectors for the expression of recombinant proteins in E. coli. Methods in Molecular biology 235 :257-275 ；Sawers, G ；Jarsch, M(1996)Alternative principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 46(1) :1_9。極特別優(yōu)選的是在本發(fā)明的載體中使用T7啟動子 (Studier, W. F. ；Rosenberg Α. H. ；Dunn J. J. ；Dubendroff J. W. ； (1990)，Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes,Methods Enzymol. 185,61-89 ； 或由Novagen或Promega等公司提供的宣傳冊)。允許在真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的實(shí)例有酵母中的AOXl或GALl啟動子，或者哺乳動物及其他動物細(xì)胞中的CMV (巨細(xì)胞病毒)啟動子、SV40啟動子、RSV (勞氏肉瘤病毒)啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、CAG啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子和巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子的組合)、gailO啟動子、人類延長因子Ia啟動子、CMV增強(qiáng)子、 CaM-激酶啟動子、苜蓿尺蠖蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcMNPV)多面啟動子(polyhedral promoter)或球蛋白內(nèi)含子。除了負(fù)責(zé)啟動轉(zhuǎn)錄的元件外，此類調(diào)控元件還可以在所述核酸下游包含轉(zhuǎn)錄終止信號，例如SV40-poly-A位點(diǎn)或tk-poly-A位點(diǎn)或SV40、IacZ和AcMNPV多面多腺苷酸化信號。
與用于在大腸桿菌和其他細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)的選擇性標(biāo)記基因(例如卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因)的共轉(zhuǎn)染使得能夠鑒定并分離出已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的選擇性標(biāo)記基因是dhfr、gpt、新霉素、潮霉素抗性基因。 還可以使轉(zhuǎn)染的核酸擴(kuò)增，從而表達(dá)大量的所編碼的(多)肽。DHFR(二氫葉酸還原酶)標(biāo)記物可用來建立攜帶興趣基因的幾百或甚至幾千個拷貝的細(xì)胞系。其他有用的選擇標(biāo)記物是谷氨酰胺合成酶(GQ (Murphy 等，1991 ；Bebbington 等，1992)。通過使用這些標(biāo)記物，使細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長，從而選擇出具有最高抗性的細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染了的宿主細(xì)胞。使用可以將包含本發(fā)明的核酸分子的載體克隆至其中的宿主細(xì)胞來復(fù)制和分離充足量的重組酶。用于此目的的方法為技術(shù)人員所公知(Sambrook，J. ；Fritsch, Ε. F.和 Maniatis, Τ. (1989), Molecular cloning -.a laboratory manual，^!二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。適合的原核生物宿主細(xì)胞包括例如埃希氏菌屬的細(xì)菌，例如源自大腸桿菌 BL21 (例如BL21 (DE3)、BL21 (DE3)PlysS、BL21 (DE3) RIL、BL21 (DE3)PRARE、BL2lcodon plus、 BL21(DE3)codon plus) >Rosetta > XLlBlue, NM522、JMlOl、JM109、JM105、RRl、DH5 α、TOP 10、HBlOl或MIC94的菌株。其他適合的細(xì)菌宿主細(xì)胞是鏈霉菌、沙門氏菌或芽胞桿菌，例如枯草芽胞桿菌。大腸桿菌菌株是本發(fā)明中優(yōu)選的原核生物宿主細(xì)胞。適合的真核生物宿主細(xì)胞是例如酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢森酵母(Hansenulapolymorpha)或畢赤酵母屬(Pichia sp.)，如巴斯德畢赤酵母(Ppastoris))、昆蟲細(xì)胞(例如果蠅S2或甜菜夜蛾(Spodoptera) Sf9細(xì)胞)或植物細(xì)胞。極特別優(yōu)選的是存在于原核生物宿主大腸桿菌BL21和真核生物宿主巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)系統(tǒng)。可以使用的哺乳動物宿主細(xì)胞包括人Hela、HEK293、H9和Jurkat細(xì)胞，小鼠 NIH3T3和C127細(xì)胞，COS 1、COS 7和CV1，鶉QC1-3細(xì)胞，小鼠L細(xì)胞，Bowes黑色素瘤細(xì)胞，以及中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制造上述絲氨酸蛋白酶、其片段、前肽或前肽原的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞并分離所產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原。培養(yǎng)原核生物或真核生物宿主的適合條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，培養(yǎng)細(xì)菌的適合條件是，在通氣條件下使細(xì)菌在Luria Bertani(U)培養(yǎng)基中生長。為了提高產(chǎn)量和表達(dá)產(chǎn)物的溶解度，可以對培養(yǎng)基進(jìn)行緩沖或向其補(bǔ)充已知會增強(qiáng)或促進(jìn)產(chǎn)量和溶解度的適合的添加劑。大腸桿菌可以在4°C 約37°C下培養(yǎng)，確切的溫度或溫度順序取決于待過表達(dá)的分子。通常，技術(shù)人員還知道這些條件可能必須經(jīng)改良以適應(yīng)宿主的需要和所表達(dá)的多肽的要求。在可誘導(dǎo)的啟動子控制存在于宿主細(xì)胞中的載體中的本發(fā)明的核酸的情況下，可以通過添加適合的誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)多肽的表達(dá)。適合的表達(dá)操作規(guī)程和策略對技術(shù)人員來說是已知的。根據(jù)細(xì)胞類型和其具體要求，可以在例如含有10% (v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI或DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)?？梢詫⒓?xì)胞保持在37°C的含5% CO2的水飽和的氣氛中。用于昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的適合培養(yǎng)基是例如TNM+10% FCS或SF900培養(yǎng)基。昆蟲細(xì)胞通常作為黏附培養(yǎng)物或懸液培養(yǎng)物在27°C生長。用于真核細(xì)胞的適合的表達(dá)操作規(guī)程為技術(shù)人員所公知，并且可以從例如 Sambrook, 2001 獲得。對所產(chǎn)生的多肽進(jìn)行分離的方法在本領(lǐng)域中是公知的，其包括但不限于諸如離子交換色譜、凝膠過濾色譜(尺寸排阻色譜)、親和色譜、高壓液相色譜(HPLC)、反相HPLC、圓盤凝膠電泳或免疫沉淀等方法步驟，參見例如Sambrook，2001。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的核酸分子編碼的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶、其片段、前肽或前肽原。如已提到的，該絲氨酸蛋白酶亦稱“清創(chuàng)酶”。如上所述，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的特征在于(i)其源自絲光綠蠅，(ii) 其顯示出針對纖維蛋白、酪蛋白和TosyI-Gly-Pro-Arg-AMC的蛋白水解活性，但對 Suc-Ala-Ala-Phe-AMC無此活性，(iii)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的針對酪蛋白和纖維蛋白的蛋白水解活性受到絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和APMSF的抑制，和(iv)清創(chuàng)酶優(yōu)選激活蛋白酶激活受體PAR-2?？梢粤钊梭@奇地展示出，其在pH5 10的較寬pH范圍內(nèi)具有活性 (見圖3B)。如已提到的，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的前肽，其經(jīng)切割而產(chǎn)生其活性形式，且優(yōu)選是在治療創(chuàng)傷前即刻切割或在治療創(chuàng)傷的過程中切割。該前肽優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ ID NO :6，并且還優(yōu)選由核酸序列SEQ ID NO 5編碼。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的片段、本發(fā)明的前肽或本發(fā)明的前肽原的融合蛋白。除了本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶(清創(chuàng)酶)、其片段、前肽或前肽原的氨基酸序列外， 本發(fā)明的融合蛋白包含至少一種額外的異種氨基酸序列。通常但不必定的是，這些額外序列將位于多肽的N端末尾或C端末尾。舉例而言，可以方便地先將多肽作為融合蛋白表達(dá)， 且可以例如利用能夠特異性地修整本發(fā)明的多肽的蛋白酶來將額外的氨基酸殘基從該融合蛋白中除去。清創(chuàng)酶的示例性融合蛋白、其片段或清創(chuàng)酶的前肽(原)進(jìn)一步包含能夠發(fā)揮如下功能的肽或蛋白介導(dǎo)融合蛋白黏附到創(chuàng)傷敷料中所含的基質(zhì)上，從而使清創(chuàng)酶可以穩(wěn)定地混入本發(fā)明的醫(yī)藥產(chǎn)品中。融合蛋白可以選自由表面活性蛋白或抗體及其片段組成的組。對抗體及其片段的性質(zhì)將在下文結(jié)合本發(fā)明的抗體進(jìn)行進(jìn)一步的描述。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的或其片段的片段、本發(fā)明的前肽、本發(fā)明的前肽原、本發(fā)明的融合蛋白、本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的載體、 本發(fā)明的宿主細(xì)胞或其組合的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物是藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥物組合物，，是指用于向患者施用、優(yōu)選向人類患者施用的組合物。該藥物組合物優(yōu)選用于輔助治療場合，即用于通過除去壞死組織和溶解纖維蛋白圍袖(清創(chuàng))而使緩慢愈合的創(chuàng)傷易于經(jīng)歷自然愈合過程或接受常規(guī)醫(yī)學(xué)治療。本發(fā)明的藥物組合物包含單獨(dú)的或以組合形式存在的上述化合物。該組合物可以是固體或液體形式，并且可以尤其是粉末形式、溶液或氣溶膠形式、乳膏形式、軟膏形式或凝膠形式。本發(fā)明的藥物組合物可以可選地額外包含制藥可接受的載劑?！爸扑幙山邮艿妮d劑”意為任何類型的非毒性的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或配制輔助劑。適合的藥物載劑的實(shí)例在本領(lǐng)域中是公知的?？梢酝ㄟ^公知的常規(guī)方法來配制包含此類載劑的組合物。該藥物組合物可以進(jìn)行局部施用。對應(yīng)于適合的施用劑量的劑量方案將由主治醫(yī)師和臨床因素來決定，其可以尤其取決于創(chuàng)傷尺寸、創(chuàng)傷病況的階段或嚴(yán)重程度。在用于局部應(yīng)用的組合物中，上述化合物的濃度可以是0.001% ( / )、優(yōu)選0.01% 0.1% (w/w) ο對創(chuàng)傷的局部應(yīng)用優(yōu)選以每日應(yīng)用一次或多于一次的方式重復(fù)進(jìn)行。上述化合物可以作為活性成分用在藥物組合物中，所述藥物組合物用于通過溶解纖維蛋白圍袖而對慢性或緩慢愈合的創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選用于輔助治療場合，即，用于通過除去壞死組織和溶解纖維蛋白圍袖(清創(chuàng))而使緩慢愈合的創(chuàng)傷易于經(jīng)歷自然愈合過程或接受常規(guī)醫(yī)學(xué)治療。本發(fā)明的藥物組合物可以與諸如敷料、創(chuàng)可貼或繃帶等(固體)載劑或基質(zhì)一起組合應(yīng)用?；衔锟梢砸怨矁r方式或非共價方式與所述載劑或基質(zhì)結(jié)合。可以將其應(yīng)用到創(chuàng)傷上來促進(jìn)傷口愈合。例如，可以將化合物混入將在創(chuàng)傷上應(yīng)用的敷料中。此類敷料的實(shí)例包括可選地覆蓋有常規(guī)敷料的分階段或分層的敷料，所述分段或分層的敷料含有包含創(chuàng)傷愈合材料的緩慢釋放的水膠體顆?；虬瑒?chuàng)傷愈合材料的海綿。將固定在創(chuàng)傷敷料基質(zhì)中的藥物組合物溶液的濃度通常為在0.001 % (w/v)、優(yōu)選為0.01% 0. (w/v) 0此外，可以將上述化合物混入能夠以緩慢釋放或控制型釋放的方式將酶遞送至創(chuàng)傷的適合材料中。應(yīng)當(dāng)以適合的間隔(例如M小時)重復(fù)進(jìn)行對創(chuàng)傷敷料的更新，直至完全除去纖維蛋白圍袖和壞死組織。該敷料適用于包含壞死組織的任何創(chuàng)傷，包括下肢潰瘍、褥瘡、糖尿病足潰瘍和燒傷。優(yōu)選的是，該敷料包含一層吸收材料，例如水膠體、泡沫(例如聚氨酯泡沫)、海藻酸鹽、殼聚糖，因此可以將其用在滲液創(chuàng)傷上并保護(hù)周圍皮膚不被浸泡。創(chuàng)傷接觸層可以涂覆有賦形劑(例如礦脂)從而防止敷料粘到創(chuàng)傷上。可以將本發(fā)明的化合物混入聚合材料(例如纖維素、聚乳酸酯、聚乙烯、丙烯酸共聚物)中并以不同方式整合至敷料中。在一個實(shí)施方式中，所述聚合材料以膜形式存在于敷料面向創(chuàng)傷的表面上。在與創(chuàng)傷床接觸的敷料表面上需要高濃度的化合物，從而通過酶的高起始釋放量而實(shí)現(xiàn)更有效的清創(chuàng)。該膜可以為層的形式，或者可以涂布在網(wǎng)上。特別是對于三級燒傷的情況，可以在創(chuàng)傷清創(chuàng)療法中使用含有清創(chuàng)酶(作為清創(chuàng)性酶)的創(chuàng)可貼。在含有上述化合物(該化合物可選地包含在無菌載劑中)的制劑中，可以將液體形式的本發(fā)明的藥物組合物噴灑到創(chuàng)傷區(qū)域上，或者將固體或液體形式的本發(fā)明的藥物組合物混入待應(yīng)用至創(chuàng)傷的載劑中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶以其非活性形式包含在固體載劑(例如創(chuàng)傷敷料或繃帶)中，并且在例如與創(chuàng)傷滲出液接觸時可以通過以不同方式對上述前肽 (原)進(jìn)行切割而激活該絲氨酸蛋白酶。優(yōu)選的是，根據(jù)滲出液的量，酶活性在敷料的推薦佩戴時間內(nèi)持續(xù)。本發(fā)明的藥物組合物的凝膠制劑還包含至少一種在藥物凝膠配制中常用的凝膠形成劑。凝膠形成劑的實(shí)例有纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羥乙基纖維素和羧甲基纖維素；乙烯聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；以及羧聚乙烯衍生物，例如卡波姆?？捎糜诒景l(fā)明的其他凝膠劑為果膠、樹膠、海藻酸鹽、瓊脂和明膠。此外，凝膠或乳膠(emugel) 制劑可以包含常用于此類制劑中的輔助劑，例如防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑和香料。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述組合物是化妝品組合物。本發(fā)明的化妝品組合物用于非治療性應(yīng)用。通過其設(shè)計(jì)用途，還可以將化妝品組合物限定為設(shè)計(jì)用來擦抹、傾倒、噴灑、噴霧或以其它方式應(yīng)用至人體的組合物，從而實(shí)現(xiàn)清潔、美化、增加吸引力或改變外表。對本發(fā)明的化妝品組合物的具體制劑并無限制。所設(shè)想的制劑包括清洗液、乳劑、 乳膏、乳液、凝膠(如水凝膠)、軟膏、懸浮劑、分散體、粉末、固體涂棒、泡沫、噴霧或洗劑。為此目的，本發(fā)明的化妝品組合物還可以包含化妝品可接受的稀釋劑和/或載劑。根據(jù)所需的制劑來選擇適合的載劑和稀釋劑屬于技術(shù)人員的技能。適合的化妝品可接受的稀釋劑和載劑為本領(lǐng)域所公知，并且包含Bushell等(W0 2006/053613)提到的試劑。所述化妝品組合物的優(yōu)選制劑是清洗液和乳膏。本發(fā)明的組合物在化妝品中的應(yīng)用旨在以酶促方式處理皮膚以使皮膚剝蛻并使皮膚光滑，并且/或者干預(yù)瘢痕的形成。本發(fā)明的化合物在化妝品用途中的適合濃度為 0.0001% 1% (w/v)、優(yōu)選為 0. 0001% 0. (w/v)、更優(yōu)選為 0. 001% 0. (w/v)。本發(fā)明的化妝品組合物在單次應(yīng)用中的優(yōu)選應(yīng)用量為0. Ig 10g、更優(yōu)選為 0. Ig lg、最優(yōu)選為0. 5g。應(yīng)用量還取決于待治療的區(qū)域的尺寸，并且必須適應(yīng)于該尺寸。在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備化妝品組合物的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的片段、本發(fā)明的前肽、本發(fā)明的前肽原、本發(fā)明的融合蛋白、本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的宿主細(xì)胞，所述化妝品組合物用于使皮膚剝蛻、使皮膚光滑或干預(yù)瘢痕的形成，且最優(yōu)選為輔助療法的形式。本發(fā)明還涉及用于治療創(chuàng)傷的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的片段、本發(fā)明的前肽、本發(fā)明的前肽原、本發(fā)明的融合蛋白、本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的宿主細(xì)胞。對于將在上述化妝品應(yīng)用和治療應(yīng)用中使用的包含本發(fā)明的化合物的組合物，其細(xì)節(jié)已在上文有所描述。在優(yōu)選實(shí)施方式中，創(chuàng)傷是慢性創(chuàng)傷或緩慢愈合的創(chuàng)傷。在另一方面，本發(fā)明涉及治療人類或非人類哺乳動物的創(chuàng)傷以促進(jìn)其愈合的方法，所述方法包括向創(chuàng)傷應(yīng)用治療有效量的含有本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、其片段、前肽、前肽原、融合蛋白、核酸、載體或宿主細(xì)胞作為活性成分的無菌組合物。本發(fā)明亦涉及上述的本發(fā)明的化合物在制備或制造用于對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)并溶解纖維蛋白圍袖的醫(yī)藥產(chǎn)品(例如創(chuàng)可貼、敷料或繃帶)中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于治療伴有皮膚損傷和/或創(chuàng)傷愈合受影響的皮膚疾病的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶、本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的片段、本發(fā)明的前肽、本發(fā)明的前肽原、本發(fā)明的融合蛋白、本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的載體或本發(fā)明的宿主細(xì)胞。此類皮膚損傷和/或受損的愈合的實(shí)例為銀屑病、異位性皮炎、接觸性皮炎以及濕疹和蕁麻疹。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物額外包含選自由另外的蛋白酶、核酸酶、賦形劑、抗微生物劑和止痛劑組成的組的至少一種成分。清創(chuàng)過程以及敷料更換可能使患者感到疼痛，因此可以優(yōu)選的是，將止痛劑(例如鎮(zhèn)痛化合物或麻醉化合物)混入本發(fā)明的敷料中。本發(fā)明的敷料還可以包含除酶之外的其它清創(chuàng)性組合物，其可以具有加和的或協(xié)同的清創(chuàng)效果。這種化合物的實(shí)例是尿素。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶或其片段或者與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的前肽或前肽原特異性地結(jié)合的抗體或其片段或衍生物。本發(fā)明的抗體與上文中詳細(xì)描述的絲氨酸蛋白酶(清創(chuàng)酶)或其具有上述清創(chuàng)酶活性的片段或者與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的前肽或前肽原特異性地結(jié)合。本發(fā)明抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。術(shù)語“抗體”還包括仍保留有結(jié)合特異性的其衍生物或片段。此類片段包括尤其是Fab片段、F(ab' )2、Fv片段或scFv衍生物。制造抗體及其片段的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，并且在例如Harlow和Lane 的"Antibodies,A Laboratory Manual“ , Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988 以及 Harlow 禾口 Lane 的“Using Antibodies :A Laboratory Manual，，Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，1998中有所描述?？梢詫⑦@些抗體用于例如對清創(chuàng)酶或其片段進(jìn)行的免疫沉淀或親和純化中。本發(fā)明的抗體還包括諸如嵌合抗體、單鏈抗體和人源化抗體等實(shí)施方式。各種程序在本領(lǐng)域中是已知的并且可以用于產(chǎn)生此類抗體和/或片段。此外，可以對用于產(chǎn)生單鏈抗體的已有技術(shù)進(jìn)行改造而使之適合于產(chǎn)生對上述清創(chuàng)酶或其片段等有特異性的單鏈抗體。還可以使用轉(zhuǎn)基因動物來表達(dá)對清創(chuàng)酶或其片段有特異性的人源化抗體。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。對于制備單克隆抗體而言，可以使用提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)。此類技術(shù)的實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(KGhler^PMilstein Nature 256 (197 ，495-497)、三源雜交瘤(trioma)技術(shù)、人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor， Immunology Today 4(1983),72)和EBV雜交瘤技術(shù)，用來產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole等， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96)?？梢允褂肂IAcore系統(tǒng)所采用的表面等離子共振來提高與上述化合物的表位結(jié)合的噬菌體抗體的效率(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105 ；Malmborg, J. Immunol. Methods 183(199 ，7-1 。本發(fā)明的范圍還涵蓋的是，術(shù)語“抗體”包括可以在細(xì)胞中表達(dá)的抗體構(gòu)建體，例如可以通過尤其是病毒或質(zhì)粒載體而轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體構(gòu)建體。一旦獲得了本發(fā)明的抗體，可以對該抗體本身或編碼其的DNA進(jìn)行測序，從而為以重組方式小規(guī)?；虼笠?guī)模地生產(chǎn)本發(fā)明的抗體提供信息。產(chǎn)生重組抗體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。本發(fā)明中，術(shù)語“特異性地結(jié)合”可與“特異性地相互作用，，互換使用，其意思是抗體不會或基本不會與具有相似結(jié)構(gòu)的表位發(fā)生交叉反應(yīng)?？梢詫ρ芯恐械目贵w組的交叉反應(yīng)性進(jìn)行測試，例如，通過評估該抗體組在常規(guī)條件下與興趣表位的結(jié)合以及與(在結(jié)構(gòu)上和/或功能上)或多或少緊密相關(guān)的多種表位的結(jié)合。僅將下述抗體認(rèn)為是對興趣表位有特異性并因此認(rèn)為其為本發(fā)明的抗體所述抗體與在其相關(guān)環(huán)境中的興趣表位(例如， 蛋白結(jié)構(gòu)中的特定基序)結(jié)合，但不與或基本不與任何其他表位結(jié)合。相應(yīng)的方法在例如上文所引用的Harlow和Lane，1988和1999中有所描述。
出于對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說明性描述的目的，本文僅通過實(shí)例并參照附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述。所述附圖顯示了

圖1 在含有酪蛋白的瓊脂上進(jìn)行的擴(kuò)散測定，顯示了在分泌清創(chuàng)酶的大腸桿菌克隆周圍的清亮區(qū)。圖2 在含有纖維蛋白的瓊脂中進(jìn)行的活性測定，顯示了在清創(chuàng)酶活性樣品A)生長于含纖維蛋白的基底上的清創(chuàng)酶陽性克隆周圍的清亮區(qū)，B)用來自清創(chuàng)酶陽性重組大腸桿菌克隆的粗提取物進(jìn)行的瓊脂擴(kuò)散測定；(a)未稀釋的粗提取物，b)以1 10稀釋在PBS 中，c)以1 50稀釋在PBS中。圖3 :A)通過使用已知的絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑(APMSF)而進(jìn)行的用于鑒定重組清創(chuàng)酶活性特征的酶測定；B)pH值不同的緩沖液中的清創(chuàng)酶的活性測定，用來鑒定重組清創(chuàng)酶的PH特征。圖4 在基于細(xì)胞的受體測定中的PAR2的激活，所述測定使用HEK232細(xì)胞，并以 Ca2+流作為讀出。圖5 使用NCBI BLAST算法完成的對清創(chuàng)酶的前肽原氨基酸序列(A)及cDNA 核苷酸序列(B)與最接近的鄰近序列的比對，所述最接近的鄰近序列為來自水泡麻蠅 (Sarcophaga bullata)的胰蛋白酶樣蛋白，該比對顯示出76%的核苷酸序列同一性和蛋白序列同一性。(A)清創(chuàng)酶的信號肽由氨基酸1 16組成(該信號肽以粗體示出)，前肽由氨基酸17 2M組成(前肽氨基酸17 沈以下劃線標(biāo)出)，并且蛋白水解加工后的清創(chuàng)酶成熟多肽由氨基酸27 2M組成。圖6 (A)培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE 1)離心后；2)預(yù)過濾(0. 45 μ m) ；3)無菌過濾(0. 22 μ m)，前肽的分子量為25. 7kDa ； (B)活化的成熟清創(chuàng)酶的可視圖像5)在透析及隨后的PH變化(從5. 5到8)之后；6)親和色譜柱流穿液(未結(jié)合的蛋白)；7)洗柱液流穿液，8) 12)分別為分級的洗脫液1 5，(成熟蛋白的分子量為24. 6kDa)。以下實(shí)施例闡明了本發(fā)明。
實(shí)施例一般方法和材料從絲光綠蠅中分離出不同幼蟲期的mRNA2 日齡的綠蠅(絲光綠蠅)蛆購自 BioMonde (BioMonde，2^85 Barsbuttel,德國)。在血瓊脂(含10%牛血的1. 5% (w/v)的瓊脂)上進(jìn)行M小時O齡期)的喂食以提高蛋白酶產(chǎn)量，而后分離總RNA，并且在3天后當(dāng)在3齡期中的酶產(chǎn)量顯著降低時分離總 RNA(Chambers 2000,Degradation of extracellular matrix components by defined proteinases from the greenbottle larva Lucilia sericata used for the clinical debridement of non-healing wounds,Brit J Dermatol. 148 :14-23) ?！穣^>i^,g、RNA，M 液氮對3只幼蟲(約30mg)進(jìn)行速凍并進(jìn)行機(jī)械粉碎。使用試劑盒“總RNA分離，NucleoSpin RNA II”(購自 Macherey-Nagel，52313 Diiren，德國)分離 RNA，產(chǎn)生了 47 μ g 總 RNA。從分離自絲光綠蠅幼蟲的總RNA生成大腸桿菌cDNA文庫依照“SMART cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒用戶手冊”(CL0NTECH Laboratories, Inc.)從所述絲光綠蠅RNA生成了 cDNA文庫。對最終連接反應(yīng)物的體外包裝及隨后對大腸桿菌 XL-IBlue的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了 1. 5X10E6個原代空斑形成單位。收集原代噬菌體并將其儲存在-80°C的包含7% DMSO的噬菌體穩(wěn)定緩沖液中，以用于在大腸桿菌中進(jìn)行后續(xù)的感染和質(zhì)量切除(mass excision)。依照“SMART cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒用戶手冊”(CLONTECH Laboratories, Inc.), 通過“Cre”重組酶介導(dǎo)的對嵌有噬菌體的質(zhì)粒的質(zhì)量切除，將λ噬菌體文庫轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的質(zhì)粒文庫。通過限制性切割分析測試了該文庫的異源性和品質(zhì)。在絲光綠蠅cDNA文庫中鑒定蛋白酶在選擇性條件下在含有2%脫脂乳的瓊脂培養(yǎng)基上對經(jīng)上述質(zhì)量切除而產(chǎn)生的菌落形成單位進(jìn)行了篩選。異種蛋白酶的表達(dá)由包含可誘導(dǎo)的Pla。啟動子的載體驅(qū)動。根據(jù)在渾濁脫脂乳培養(yǎng)基中菌落周圍的清亮區(qū)的形成，檢測出了表達(dá)異種蛋白酶的菌落。入人±隨黼輔汰士纖腫躺#麵青仞丨_0為了獲得具有表征酶的足夠酶活性的清創(chuàng)酶的酶樣品，使用了表達(dá)相應(yīng)蛋白酶的 cDNA克隆或在常見表達(dá)載體(例如pET26b-載體(Novagen))中建立的更適合的表達(dá)構(gòu)建體，并使用了適合的表達(dá)宿主(例如大腸桿菌Rosetta (DE3) (Novagen))。為了構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體，對相應(yīng)的清創(chuàng)酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而在開放閱讀框(ORF)的上游和下游引入獨(dú)特的限制酶識別序列，其使得編碼蛋白酶的基因以確定的方式連接到表達(dá)載體(例如 pET26b)上。對限制酶識別序列，根據(jù)其不存在于清創(chuàng)酶基因的編碼區(qū)中來進(jìn)行選擇，并且其可以是例如NdeI、HindIII、EcoRI、Biol。通過對克隆后的擴(kuò)增子進(jìn)行測序，確認(rèn)了不存在因聚合酶的錯誤擴(kuò)增而產(chǎn)生的不需要的第二位點(diǎn)突變。用cDNA克隆或表達(dá)構(gòu)建體來進(jìn)行接種，例如對IL的愛倫美氏瓶中的200ml補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行接種。使用了 LB培養(yǎng)基和如下濃度的抗生素100μ g/ml的氨芐青霉素、25μ g/ml的卡那霉素、12. 5 μ g/ml的氯霉素。將起始光密度(OD58tl)調(diào)整至0. 05， 隨后使細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)振蕩器上于生長。當(dāng)光密度值達(dá)到約1時，通過添加濃度為20 μ M 500 μ M的IPTG來誘導(dǎo)從pTriplEx2 (Clontech)的Iac啟動子進(jìn)行的表達(dá)或從來自pET載體系列的載體(例如PET26)的T7啟動子進(jìn)行的表達(dá)。誘導(dǎo)4 20小時后，離心收集細(xì)胞。 將細(xì)胞沉淀物重懸浮在pH為7. O的5ml IXPBS中，通過超聲來破碎細(xì)胞。對于包含信號序列的完整蛋白，清創(chuàng)酶的分子量為27. 4kDa，而假想前肽的分子量為25. 7kDa，成熟蛋白的分子量為24. 6kDa。針對纖維蛋白水解活件的固相活件測定為了鑒定降解酪蛋白的克隆的提取物中的纖維蛋白水解活性，使用了固體瓊脂測定。為此，將含200mg瓊脂糖、87mg NaCl和3mg CaCl2的溶液A添加到pH為7. 4的IOml 0. IM Tris中并于50°C進(jìn)行溫育。將20 μ 1纖溶酶原O單位/毫克，Sigma Ρ7397)添加到含IOml 0. 9% NaCl和IOOmg纖維蛋白(Sigma F3879)的第二溶液B中，并于50°C進(jìn)行預(yù)溫育。將這兩種溶液與12 μ 1凝血酶(175 350ΝΙΗ單位，Sigma Τ4265)合并，并使用微孔形成器件將其涂布在瓊脂平板上。如果存在纖維蛋白水解活性，在含有提取物的孔洞周圍的不透明培養(yǎng)基中會出現(xiàn)清亮區(qū)。為了鑒定降解酪蛋白的克隆中的纖維蛋白水解活性，使用了固體瓊脂測定。因此，于 50°C溫育由含有 200mg 瓊脂糖、87mg NaCl 禾口 3mg CaCl2WlOml 2 X Luria Bertani 組成的培養(yǎng)基A。將20 μ 1纖溶酶原O單位/毫克，Sigma Ρ7397)添加到含IOml 0. 9% NaCl 和IOOmg纖維蛋白(Sigma F3879)的溶液B中，并于50°C進(jìn)行預(yù)溫育。將這兩種溶液與 12 μ 1凝血酶(175 350ΝΙΗ單位，Sigma T4265)和用于進(jìn)行選擇的適當(dāng)?shù)目股睾喜ⅲ⒃跓o菌條件下將其傾倒在瓊脂平板上，從而形成不透明的瓊脂培養(yǎng)基。如果存在由異種克隆表達(dá)的纖維蛋白水解活性，過夜溫育后在菌落周圍會出現(xiàn)清亮區(qū)。液相活件測定和抑制件特征描述通過在96孔板中進(jìn)行的以B0DIPY-FL-酪蛋白(Molecular Probes)為底物的熒光測定，對蛋白水解活性進(jìn)行了定量。因此，在未消化的底物酪蛋白上，標(biāo)簽分子彼此緊密接觸，從而通過淬滅機(jī)制而抑制了熒光。如果發(fā)生水解，這些分子會彼此分離，而且可以在 485nm激發(fā)熒光并在520nm進(jìn)行測量。標(biāo)準(zhǔn)測定含有在IOOyl PBS緩沖液中的Syg/ml B0DIPY-FL-酪蛋白和蛋白酶提取物的一系列稀釋液。于37°C溫育樣品60分鐘，隨后使用分光光度計(jì)(Novc^tar，BMG LABTECH，Offenburg,德國)來測量熒光，并使用以下參數(shù)激發(fā)485nm，發(fā)射520nm，增益5， 一個循環(huán)，10次閃光。使用了絲氨酸蛋白酶抑制劑APMSF (4-脒苯基甲磺酰氟)和PMSF(苯甲基磺酰氟)來測試分離出的蛋白酶的特異性。使用了以下測定濃度PMSF =絲氨酸蛋白酶抑制劑 5mmol/lAPMSF =胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶抑制劑 lmmol/1以下實(shí)例是說明性的，但并不限制本發(fā)明的范圍。在此可以進(jìn)行合理的修改(例如本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的那些)而不背離本發(fā)明的范圍。巴斯德畢赤酵母表達(dá)培養(yǎng)物本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶(即清創(chuàng)酶)的異源表達(dá)是在甲基營養(yǎng)酵母巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行的，食品和藥物管理局將該酵母分類為GRAS生物體并因此確立用于藥物生產(chǎn)過程。使用了整體載體系統(tǒng)來進(jìn)行表達(dá)，該系統(tǒng)提供可被甲醇誘導(dǎo)的啟動子。為了促進(jìn)在畢赤酵母中的高效分泌，用載體編碼的因子來自釀酒酵母的信號序列替換了清創(chuàng)酶的原生信號肽(“MFRFVALFAFVSCALA")。在第一批階段，在以甘油為唯一碳源的礦質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。在消耗掉首批甘油后，啟用分批補(bǔ)料模式(fed batch mode)。通過在基因表達(dá)過程中補(bǔ)充作為誘導(dǎo)物/碳源的甲醇和作為額外的非抑制性飼料的山梨醇，開始對異源表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)。在導(dǎo)致達(dá)到約600的光密度的分批/分批補(bǔ)料(FB)階段后，培養(yǎng)物達(dá)到了穩(wěn)定生長期。通過添加MeOH來開始進(jìn)行誘導(dǎo)。為了防止異種酶在此時以自動催化方式發(fā)生活化， 使過程溫度從30°C降到20°C。在該過程末期通過補(bǔ)料來支持清創(chuàng)酶的表達(dá)。在純化程序中(見下文)，通過將培養(yǎng)基的PH從5. 5提升到6. 8而實(shí)現(xiàn)了前肽的自動催化活化。從巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)表達(dá)培養(yǎng)物中提純清創(chuàng)酶蛋白通過使用與瓊脂糖凝膠運(yùn)載材料偶聯(lián)的絲氨酸蛋白酶抑制劑苯酰胺(GE Healthcare)的親和色譜來進(jìn)行純化。在除去未結(jié)合的純化蛋白后，使用添加有游離苯酰胺的緩沖液進(jìn)行競爭性洗脫，從而收集了純化的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。后續(xù)程序的SDS PAGE可見于圖6中。在隨后以檸檬酸鹽儲存緩沖液為背景進(jìn)行透析后，將純化的蛋白凍干， 呈白色干粉。
對以重組方式表達(dá)的清創(chuàng)酶進(jìn)行的N端測序?yàn)檫M(jìn)行Edman測序，將印跡放置在樣品制備盒中。為確定氨基酸序列，使用了蛋白質(zhì)測序儀ftOcise 492 (Applied Biosystems)。根據(jù)制造商的建議使用了試劑和操作規(guī)程。 使用適當(dāng)?shù)能浖?Applied Biosystems)分析了得到的色譜圖。在測試每個樣品前，先測試標(biāo)準(zhǔn)樣品和空白樣品。實(shí)施例1&從也.■蠅Φ成纖汰雅Φ ■胃_對含有8Χ10Ε6個原代克隆的噬菌體文庫進(jìn)了了蛋白酶表達(dá)篩選。為此，依照 "SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒用戶手冊”(CLONTECH Laboratories, he.)，與f 1型輔助噬菌體一起對大腸桿菌進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，將噬菌體文庫轉(zhuǎn)移到了質(zhì)粒文庫中。所得的克隆含有從噬菌體載體切下的原有質(zhì)粒。通過從代表性克隆中分離出40個質(zhì)粒，對質(zhì)粒文庫的異源性進(jìn)行了測試。實(shí)際上，每個質(zhì)粒都含有插入序列，而且這些插入序列在尺寸上顯示出完全多樣性。在選擇性條件下，在含有2%脫脂乳的固體培養(yǎng)基上對總共3X 10E5個cfu進(jìn)行了篩選。通過對來自這些形成暈圈的菌落中16個菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分離和測序，鑒定出了與來自水泡麻蠅的胰蛋白酶樣酶在氨基酸水平上的同一性為76%的蛋白酶的前肽原序列(SEQ ID NO :2)。實(shí)施例2對纖維蛋白水解蛋白酶的表征在上述瓊脂平板測定中進(jìn)行了對纖維蛋白水解活性的鑒定。通過在含渾濁纖維蛋白底物的營養(yǎng)瓊脂上將重組細(xì)胞劃痕培養(yǎng)，鑒定出了表達(dá)纖維蛋白水解活性的菌落。在 37°C下進(jìn)行過夜溫育后，帶有鑒定出的蛋白酶的含有質(zhì)粒的細(xì)胞在菌落周圍顯示出清亮區(qū)。使用經(jīng)緩沖的含纖維蛋白的瓊脂培養(yǎng)基，確定了不含細(xì)胞的粗提取物中的纖維蛋白水解活性。平板具有容量最多為200 μ 1的孔，這些孔是在瓊脂培養(yǎng)基固體化過程中通過使用微孔板器件而形成的。對重組細(xì)胞進(jìn)行超聲并將所得的提取物離心，置于瓊脂孔中并于37°C過夜溫育。通過在含有蛋白酶基因SEQ ID NO :1的重組克隆所在的微孔的周圍形成的清亮區(qū)，檢測出了具有纖維蛋白水解活性的粗提取物。實(shí)施例3對纖維蛋白水解蛋白酶的特征描述在96孔板中進(jìn)行的液體測定中，使用不同類型蛋白酶的特異性抑制劑，鑒定了重組蛋白酶的類型。此處測量了胰蛋白酶的特異性抑制劑(4-脒苯基甲磺酰氟，APMSF)、絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑(苯甲基磺酰氟，PMSF)、天冬氨酸蛋白酶的特異性抑制劑(胃酶抑素A)和金屬型蛋白酶的特異性抑制劑(1，10_ 二氮雜菲)。如圖3A所示，對重組克隆的抑制劑特征描述提示了胰蛋白酶活性，這與SEQ ID NO :2與BLAST數(shù)據(jù)庫間的比較性氨基酸序列比對數(shù)據(jù)對應(yīng)，所述比對數(shù)據(jù)顯示出與來自水泡麻蠅的酶具有最接近的同源性，即 76% (圖 5)。實(shí)施例4不同PH倌時的穩(wěn)定性
在液體測定中，使用3 10的適當(dāng)緩沖系統(tǒng)(0. IM 0.2M檸檬酸緩沖液，pH 為3 7 ；0. 05M Tris緩沖液，pH為8 ；0. IM碳酸鹽緩沖液，pH為9 10)和熒光底物 Z-Gly-Gly-Arg-AMC，測量了清創(chuàng)酶的活性。用 BMC Novostar 熒光計(jì)(λ ■= 365nm ； λ 發(fā) M= 440nm)測量了 7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的釋放。其結(jié)果示于圖中。清創(chuàng)酶在 5 10的pH范圍內(nèi)顯示出酶活性，這與創(chuàng)傷環(huán)境的類似寬度的pH范圍對應(yīng)。實(shí)施例5PAR2的激活(鈣成像)在基于細(xì)胞的熒光測定中，通過使用內(nèi)源性地表達(dá)人PAR2的野生型HEK293細(xì)胞系，監(jiān)測了清創(chuàng)酶隨時間的作為PAR2激動劑的活性。簡言之，在執(zhí)行測定的前1天，將表達(dá)人PAR2的HEK293細(xì)胞以每孔45，000個細(xì)胞的密度平板接種至96孔黑壁測定板上。使用 96 孔微孔板讀取儀(FlexStation ,Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，通過使用對鈣敏感的熒光染料fluo-4 (激發(fā)494nm，發(fā)射516nm)，對細(xì)胞鈣濃度的變化進(jìn)行了監(jiān)測。使用PAR2 激動劑胰蛋白酶(SnM)作為陽性對照。在添加了補(bǔ)充有激動劑的50 μ 1測定緩沖液(IlSmM NaCl ；4. 7mM KCl ；1. 2mM MgSO4 ；1. 2mMKH2P04 ；4. 2mM NaHCO3 ；1. 3mM CaCl2 ； IOmM HEPES (pH 7.4))后，將平板中載有染料的細(xì)胞放置在熒光微孔板讀取儀上以監(jiān)測熒光(激發(fā)488nm， 發(fā)射520nm)變化。將鈣動員定量為相對于基準(zhǔn)水平(F)的峰值熒光變化(AF)。數(shù)據(jù)以重復(fù)的獨(dú)立樣品的八？汗值(=1^仏相對熒光單位)的平均值S. E.表示。用FlexStation 軟件進(jìn)行分析。實(shí)施例6成熟清創(chuàng)酶的前10個氨基酸的序列該實(shí)施例的目的是通過N-端Edman測序來確定前10個氨基酸的序列。從N端成功地進(jìn)行了對樣品(來自圖6B中泳道5的蛋白)的測序。檢測到了以下主序列IVNGVDTTIQ該序列與對一級序列(圖5A)的分析所提出的成熟蛋白對應(yīng)。實(shí)施例7清創(chuàng)酶的分子性質(zhì)和酶性質(zhì)表1 清創(chuàng)酶的分子性質(zhì)和酶性質(zhì)概覽
分子量27.4 kDa (前肽原)，25.7 kDa (前肽)，24.6 kDa (成熟蛋白)Km:0.07 mM*Kcat 37.5 · s"1比活性90 μιηο * · min"1 · mg"1 酶最適pH:8最適Τ:37°C *在使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC為底物的熒光計(jì)量測定中測得
權(quán)利要求
1. 一種核酸分子，所述核酸分子(i)編碼具有纖維蛋白和酪蛋白切割能力的絲氨酸蛋白酶，所述核酸分子為(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO :4或由氨基酸序列SEQ ID NO :4組成的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQID NO 3或由核苷酸序列SEQ ID NO 3組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85% 同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(d)由與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列組成或包含該核苷酸序列的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一項(xiàng)的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子；( )編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的片段，所述片段與(i)中所述的絲氨酸蛋白酶活性相同；(iii)編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的前肽，所述前肽在治療創(chuàng)傷前即刻或在治療創(chuàng)傷過程中被切割為其活性形式，其中，所述前肽由選自下述核酸分子(a) (f)的核酸分子編碼(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO :6或由氨基酸序列SEQ ID NO :6組成的絲氨酸蛋白酶前肽的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQID NO 5或由核苷酸序列SEQ ID NO 5組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85% 同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶前肽的核酸分子；(d)由與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列組成或包含所述核苷酸序列的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一項(xiàng)的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子；或者(iv)編碼(i)中所述的絲氨酸蛋白酶的前肽原，其中，所述前肽原由選自下述核酸分子(a) (f)的核酸分子編碼(a)編碼包含氨基酸序列SEQID NO 2或由氨基酸序列SEQ ID NO 2組成的絲氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQID NO 1或由核苷酸序列SEQ ID NO=I組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85% 同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的絲氨酸蛋白酶前肽原的核酸分子；(d)由與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80%同一性、優(yōu)選至少85%同一性、更優(yōu)選至少90%同一性且最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列組成或包含所述核苷酸序列的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a) (d)中任一項(xiàng)的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子。
2.一種載體，所述載體編碼權(quán)利要求1的核酸分子。
3.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求2的載體。
4.一種制備絲氨酸蛋白酶及其片段、前肽或前肽原的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞并分離出所產(chǎn)生的所述絲氨酸蛋白酶、所述片段、所述前肽或所述前肽原。
5.一種由權(quán)利要求1的核酸分子編碼或通過權(quán)利要求4的方法制備的絲氨酸蛋白酶、 片段、前肽或前肽原。
6.一種融合蛋白，所述融合蛋白包含權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原。
7.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1的核酸，權(quán)利要求2的載體，權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞，權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原，或權(quán)利要求6的融合蛋白，或它們的組合。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，所述組合物是化妝品組合物。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，所述組合物是藥物組合物。
10.用于制備化妝品組合物的權(quán)利要求1的核酸、權(quán)利要求2的載體、權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者權(quán)利要求6的融合蛋白，所述化妝品組合物用于使皮膚剝蛻、使皮膚光滑或干預(yù)瘢痕的形成。
11.用于治療創(chuàng)傷的權(quán)利要求1的核酸、權(quán)利要求2的載體、權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者權(quán)利要求6的融合蛋白。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸、載體、宿主細(xì)胞、絲氨酸蛋白酶、片段、前肽、前肽原或融合蛋白，其中，所述創(chuàng)傷是慢性創(chuàng)傷或緩慢愈合的創(chuàng)傷。
13.用于治療伴有創(chuàng)傷愈合受影響的皮膚疾病的權(quán)利要求1的核酸、權(quán)利要求2的載體、權(quán)利要求3的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原或者權(quán)利要求 6的融合蛋白。
14.如權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物還包含選自由另外的蛋白酶、核酸酶、賦形劑、抗微生物劑和止痛劑組成的組的至少一種成分。
15.一種與權(quán)利要求5的絲氨酸蛋白酶、片段、前肽或前肽原特異性地結(jié)合的抗體或者其片段或衍生物。
全文摘要
發(fā)明人已通過分子克隆鑒定出源自絲光綠蠅幼蟲的蛋白酶，并且由于該蛋白酶具有可用于對創(chuàng)傷進(jìn)行清創(chuàng)的活性而將其命名為清創(chuàng)酶。本發(fā)明描述了一種編碼具有纖維蛋白和酪蛋白切割能力的絲氨酸蛋白酶的核酸分子，所述核酸分子是(a)編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO4或由氨基酸序列SEQ ID NO4組成的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(b)包含核苷酸序列SEQ ID NO3或由核苷酸序列SEQ ID NO3組成的核酸分子；(c)編碼氨基酸序列與(a)中所述的氨基酸序列具有至少80％同一性、優(yōu)選至少85％同一性、更優(yōu)選至少90％同一性且最優(yōu)選至少95％同一性的絲氨酸蛋白酶的核酸分子；(d)由與(b)中所述的核苷酸序列具有至少80％同一性、優(yōu)選至少85％同一性、更優(yōu)選至少90％同一性且最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列組成或包含該核苷酸序列的核酸分子；(e)與(d)所述的核酸分子簡并的核酸分子；或(f)與(a)～(d)中任一項(xiàng)的核酸分子對應(yīng)的其中T被U置換的核酸分子。
文檔編號C07K16/40GK102388135SQ201080015247
公開日2012年3月21日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日
發(fā)明者F·尼豪斯, J·埃克, M·克羅恩, R·舒爾茨 申請人:B.R.A.I.N.生物技術(shù)研究和信息網(wǎng)絡(luò)公司