專利名稱：篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，且更具體地涉及熒光標(biāo)記的Epac2基因、該基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和利用此類細(xì)胞篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法。
背景技術(shù)：
硫酰脲類(下文稱作“SU劑”)廣泛用作糖尿病治療劑，己知其通過結(jié)合SU受體 (SURl)顯示其效果，所述SU受體是ATP敏感性K+通道(Katp通道)的組分和調(diào)節(jié)亞基(非專利文件1-3)。Katp通道存在于胰腺β細(xì)胞的細(xì)胞膜上并通過其打開和關(guān)閉調(diào)節(jié)待分泌的胰島素量。SU劑對所述SU受體的結(jié)合誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞表面的Katp通道關(guān)閉，這引發(fā)了細(xì)胞膜的去極化。這隨之引起電壓依賴性Ca2+通道打開以允許Ca2+流入細(xì)胞，從而增強(qiáng)胰島素分泌。SU劑的例子包括甲苯磺丁脲，格列本脲，氯磺丙脲，格列齊特等。多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)參與調(diào)節(jié)胰島素分泌機(jī)制。具體地，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的cAMP作為非常重要的信號(hào)分子行使調(diào)節(jié)胰島素分泌細(xì)胞的功能。已知在通過cAMP引起的胰島素分泌的調(diào)控機(jī)制內(nèi)有兩類通路，為蛋白激酶A依賴性通路和獨(dú)立性通路。在蛋白激酶A獨(dú)立性通路中，由Epac 2介導(dǎo)的通路是已知的(通過cAMP直接激活交換蛋白由cAMP激活的小G蛋白R(shí)apl的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF))(非專利文獻(xiàn)4-6)。cAMP直接結(jié)合激活的Epac2 有Rapl鳥嘌呤核苷酸交換活性，該活性激活Rapl，從而促進(jìn)胰島素分泌。如上所述，雖然有多種調(diào)節(jié)胰島素分泌的機(jī)制，但對糖尿病治療劑(包括SU劑) 的作用機(jī)制尚未完全闡明。Epac2有一個(gè)與其結(jié)構(gòu)相似的同種型(Epacl)(非專利文獻(xiàn)7)。Epacl有cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，蓬亂蛋白(Dishevelled)，Egl_10，普列克底物蛋白(DEP)結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域起著Epacl膜定位的作用)，Ras交換基序(REM)，和位于羧基末端的GEF結(jié)構(gòu)域。除具有上述結(jié)構(gòu)域外，與Epacl結(jié)構(gòu)相似的Epac2還具有位于其氨基端的第二 cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與 Ras相互作用的Ras相關(guān)(RA)結(jié)構(gòu)域。Epacl和Epac2都通過cAMP參與胞內(nèi)信號(hào)傳輸。為了監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的通過cAMP的信號(hào)傳輸，已開發(fā)了作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)傳感器的融合蛋白，該蛋白監(jiān)測Epacl在活細(xì)胞內(nèi)的活化，在所述蛋白內(nèi)部分或全長Epacl夾在發(fā)出不同顏色熒光的兩種其他蛋白之間，即青色和黃色熒光蛋白(非專利文獻(xiàn) 8-10)?！癋RET”是這么一種現(xiàn)象，當(dāng)彼此接近的兩種(供體)染料分子之一，如熒光蛋白， 被有一定波長的光(激發(fā)光)輻照以激發(fā)該染料分子時(shí)，激發(fā)能量通過電子之間的共振被轉(zhuǎn)移到接近的另一個(gè)染料分子(受體)上。根據(jù)這一現(xiàn)象，通過由供體吸收的光能，所述受體發(fā)出一定波長的光(熒光)。因此，所述FRET技術(shù)是一種檢測由FRET引發(fā)的熒光變化的方法。當(dāng)用青色熒光蛋白(發(fā)出波長較短的熒光)的激發(fā)光(波長約440nm)照射由青色和黃色熒光蛋白和夾在它們之間的部分或全長Epacl (熒光標(biāo)記Epacl)組成的融合蛋白時(shí)，該蛋白被激發(fā)，并利用部分所述激發(fā)能量發(fā)生FRET，黃色熒光蛋白也被激發(fā)并發(fā)出波長為535nm的熒光。另一方面，所述青色熒光蛋白的部分激發(fā)能量不引發(fā)FRET，但該青色熒光蛋白發(fā)出波長為480nm的熒光。因此，由所述熒光標(biāo)記的Epacl發(fā)出的兩種不同波長的熒光的強(qiáng)度比率(535nm波長的熒光強(qiáng)度/480nm波長的熒光強(qiáng)度)取決于該分子內(nèi)青色和黃色熒光蛋白的構(gòu)象和之間的距離。因此，當(dāng)由于一些修飾或與別的分子結(jié)合導(dǎo)致上述分子構(gòu)象變化時(shí)，所述比例也發(fā)生相應(yīng)的變化。由于熒光標(biāo)記的Epacl的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(如當(dāng)cAMP結(jié)合該分子時(shí))，通過FRET技術(shù)對該變化的檢測能夠檢測cAMP分子是否與Epacl 結(jié)合。因此，當(dāng)用波長440nm的光照射熒光標(biāo)記的Epacl時(shí)，通過檢測利用FRET技術(shù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度的變化，可以檢測通過Epacl的信號(hào)傳輸是否存在。雖然如上所述已知在FRET技術(shù)中用Epacl作為傳感器(FRET傳感器)來測量信號(hào)傳輸?shù)姆椒?，但尚不知利用全長Epac2作為FRET傳感器的方法。已知Epac2通過cAMP依賴性、蛋白激酶A(PKA)獨(dú)立性通路介導(dǎo)胰島素分泌(非專利文件11和12)。Epac2最初鑒定為與SURl (Katp通道的調(diào)節(jié)亞基)相互作用的分子 (cAMP-GEF II)(非專利文獻(xiàn) 13)。已知SURl是SU劑的靶分子。SU劑和SURl的結(jié)合一方面引起Katp通道關(guān)閉，另一方面使電壓依賴性Ca2+通道打開，并且這就通過使Ca2+內(nèi)流入β細(xì)胞來增加胰島素分泌 (非專利文件2)。對缺乏Kir6. 2基因(Katp通道亞基)的小鼠和缺乏SURl基因的小鼠的研究證明所述Katp通道的關(guān)閉是SU劑提高胰島素分泌的先決條件(非專利文件14-16)。因此認(rèn)為SU劑是通過Katp通道表現(xiàn)出作為糖尿病治療藥物的藥理學(xué)作用。最近，Kir6. 2或SURl中的突變已證實(shí)會(huì)導(dǎo)致新生兒糖尿病和由Katp通道功能受損引起的各種癥狀(非專利文獻(xiàn)17)。當(dāng)胰島素注射改為口服高劑量SU劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多此類患者的血糖控制得到改善(非專利文獻(xiàn)18)。此外，有臨床報(bào)告稱在SU劑中，格列齊特對患有新生兒糖尿病的患者沒有效果， 而格列本脲改善此類患者的血糖控制(非專利文件19)。這一發(fā)現(xiàn)表明SU劑的作用機(jī)制并不統(tǒng)一。因此，了解SU劑的作用機(jī)制為新生兒糖尿病患者提供適當(dāng)?shù)闹委熓呛荜P(guān)鍵的。此外，澄清未知的作用機(jī)制是重要的，因?yàn)樗鼤?huì)為開發(fā)具有不同背景因素的糖尿病患者的醫(yī)學(xué)治療新途徑以及開發(fā)此類治療的新療劑提供線索和方法。引用文獻(xiàn)列表非專利文獻(xiàn)NPL 1 =Seino S.，(1999) Annu. Rev. Physiol. 61,337-62NPL 2 =Henquin J. C.，(2000)Diabetes 49，1751-60NPL 3 =Proks P.等，(2002)Diabetes 51，S368-76NPL 4 :de Rooji J.等，(1998)Nature 396,474-7NPL 5 =Kawasaki H.等，(1998) Science 282，2275-9NPL 6 :de Rooji J.等，(2000) J. Biol. Chem. 275, 20829-36NPL 7 :Bos J. L.等，(2003)Mol. Cell. Biol. 4，733-8NPL 8 =Nikolaev V. 0.等，(2004) J. Biol. Chem. 279,37215-8NPL 9 =Dipilato L. M.等，(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101，16513-8NPL 10 =Ponsioen B.等，(2004)EMBO R印.5，1176-80NPL 11 =Holz G. G.等，(2004)Diabetes 53,5-13
NPL 12 =Seino S.等，(2005)Physiol. Rev. 85,1303-42NPL 13 =Ozaki N.等，(2000)Nat. Cell. Biol. 2,805-811NPL 14 =Miki T.等，(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,10402-6NPL 15 =Seghers V.等，(2000) J. Biol. Chem. 275,9270-7NPL 16 =Shiota C.等，(2002) J. Biol. Chem. 277，37176—83NPL 17 =Hattersley A. T.等，(2005) Diabetes 54，2503-13NPL 18 =Pearson E. R.等，Q006) N. Engl. J. Med. 355，467-77NPL 19 =Koster J. C.，(2008)J. Clin. Endocrinol. Metab. 93，1054-6
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題在上述背景下，本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供篩選靶向Epac2的新胰島素分泌加強(qiáng)劑 的方法，該方法利用與兩種熒光蛋白融合的Epac2作為傳感器。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提 供篩選包括SU劑在內(nèi)的已知抗糖尿病藥物的方法以獲知他們?nèi)绾握_使用，該方法基于 它們與Epac2的結(jié)合。解決問題的方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)已知靶向SURl分子的SU劑的新作用機(jī)制，在所述機(jī)制內(nèi)SU劑通過 結(jié)合Epac2行使作用。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)并通過進(jìn)一歩研究完成。因此本發(fā)明提供了如下項(xiàng)。1. ー種編碼熒光標(biāo)記的Epac2的DNA，包含編碼發(fā)出波長彼此不同的熒光的兩種 不同熒光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合。2.如1所述的DNA，其中所述兩種不同熒光蛋白是青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。3.如上述2所述的DNA，其中編碼所述青色熒光蛋白的DNA和編碼所述黃色熒光 蛋白的DNA分別與編碼Epac2的DNA的5‘-和3‘-末端融合。4.如上述2或3所述的DNA，其中所述青色熒光蛋白是ECFP且所述黃色熒光蛋白 是EYFP。5. ー種表達(dá)載體，其包含如上述1-4中一項(xiàng)所述的摻入DNA。6.如上述5所述的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)載體用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。7. ー種細(xì)胞，其是攜帶有如上述5或6所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。8.如上述7所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳細(xì)胞。9.如上述8所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞不表達(dá)SURl基因。10.如上述9所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是COS細(xì)胞。11. 一種熒光標(biāo)記的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和與之融合的兩種不同的 熒光蛋白，其中所述兩種不同的熒光蛋白發(fā)出彼此波長不同的熒光。12. 一種熒光標(biāo)記的Epac2，其是融合蛋白，包含兩種不同的熒光蛋白和Epac2，其 中所述融合蛋白在如上述7-10中任一所述的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。13. 一種篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，該方法包括步驟提供胰島素分泌增強(qiáng) 劑的候選化合物，使各候選化合物與如上述7-10之一所述的細(xì)胞接觸，在所述候選化合物 與所述細(xì)胞接觸前后用所述兩種不同熒光蛋白中的短波長熒光蛋白的激發(fā)光照射所述細(xì)胞以測量所述細(xì)胞中包含在熒光標(biāo)記的Epac2內(nèi)的所述兩種不同熒光蛋白各自發(fā)出的熒光強(qiáng)度，檢測所述候選化合物與所述細(xì)胞接觸前后的所述兩種不同熒光之間強(qiáng)度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強(qiáng)劑。14. 一種篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，該方法包括步驟提供胰島素分泌增強(qiáng)劑的候選化合物，使各候選化合物與如上述11或12所述的熒光標(biāo)記Epac2接觸，在所述候選化合物與所述Epac2接觸前后用所述兩種不同熒光蛋白中的短波長熒光蛋白的激發(fā)光照射所述Epac2以測量包含在所述熒光標(biāo)記的Epac2內(nèi)的所述兩種不同熒光蛋白各自發(fā)出的熒光強(qiáng)度，檢測與所述候選化合物接觸前后的所述兩種不同熒光之間的強(qiáng)度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強(qiáng)劑。發(fā)明的有益效果本發(fā)明能夠篩選靶向Epac2的胰島素分泌增強(qiáng)劑。由于目前沒有已知的靶向 Epac2的胰島素分泌增強(qiáng)劑，本發(fā)明可用于篩選通過新作用機(jī)制工作的抗糖尿病藥物。考慮到糖尿病的產(chǎn)生機(jī)制沒有完全了解，且有患者耐受當(dāng)前的醫(yī)療治療，本發(fā)明的方法是有意義的。附圖簡要說明[

圖1]圖1是野生型小鼠Epac2表達(dá)載體的載體圖，pFLAG-EpaC2。[圖2]圖2是突變型小鼠Epac2表達(dá)載體的載體圖，pFLAG_Epac2G114EG244D。[圖3]圖3a是pFLAT_CMV_2的載體圖，圖北是其多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。[圖4]圖4顯示載體pECFP-Cl的基因圖和其多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。[圖5]圖5顯示載體pEYFP-Nl的基因圖和其多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。[圖6]圖6是熒光標(biāo)記的小鼠Epac2和熒光標(biāo)記的突變型小鼠的Epac2的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖=ECFP 青色熒光蛋白，EYFP 黃色熒光蛋白，A和B :cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DEP [蓬亂蛋白，Egl-10，普列克底物蛋白結(jié)構(gòu)域，REM =Ras交換基序，RA =Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域，GEF =GEF 結(jié)構(gòu)域。[圖7]圖7顯示用FRET技術(shù)對8_溴-cAMP存在下的C0S-1細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的動(dòng)態(tài)分析?？v軸表示R/禮值，橫軸表示加入8-溴-cAMP后的時(shí)間流逝。數(shù)據(jù)分別表示(a)熒光標(biāo)記的小鼠Epac2，和(b)熒光標(biāo)記的突變型小鼠Epac2。[圖8]圖8顯示SU劑對采用FRET技術(shù)動(dòng)態(tài)分析MIN6細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記小鼠Epac2 的影響。縱軸表示R/Ro值，橫軸表示加入SU劑后的時(shí)間流逝。分別加入(a)甲苯磺丁脲和(b)格列本脲作為SU劑。[圖9]圖9顯示SU劑對采用FRET技術(shù)動(dòng)態(tài)分析C0S-1細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的小鼠 Epac2的影響?？v軸表示R/R。值，橫軸表示加入SU劑后的時(shí)間流逝。分別加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙酰苯磺酰環(huán)己脲，(e)格列甲嗪，(f)格列齊特， 和(g)那格列奈作為SU劑。[圖10]圖10顯示氚標(biāo)記的格列本脲結(jié)合小鼠Epac2的競爭特性。(a)黑色圓圈 總結(jié)合，空心圓圈100 μ M未標(biāo)記格列本脲存在下的結(jié)合。縱軸表示結(jié)合的氚標(biāo)記的格列本脲的放射活性(DPM)，橫軸表示氚標(biāo)記的格列本脲的加入量。(b)空心圓圈未標(biāo)記的格列本脲，黑色圓圈甲苯磺丁脲，空心三角形8-溴-cAMP?？v軸表示結(jié)合的氚標(biāo)記的格列本脲的比例，橫軸表示競爭化合物的加入量(-log Μ)。
[圖11]圖11顯示MIN6細(xì)胞中SU劑誘導(dǎo)的Rapl活化情況。在各圖中，上部分表示GTP結(jié)合的Rapl的量，下部分表示Rapl總量。分別加入(a)甲苯磺丁脲，(b)格列本脲，(c)氯磺丙脲，(d)乙酰苯磺酰環(huán)己脲，(e)格列甲嗪，和(f)格列齊特。[圖12]圖12顯示在Epac2缺失胰腺β細(xì)胞內(nèi)的SU劑所致的Rap1活化情況。 圖中的標(biāo)記分別代表TLB 甲苯磺丁脲，CLP 氯磺丙脲，ACT 乙酰苯磺酰環(huán)己脲，GLP 格列甲嗪，和GLB:格列本脲。數(shù)據(jù)來自(a)EpaC2缺失胰腺β細(xì)胞，和(b)表達(dá)導(dǎo)入的小鼠 Epac2的Epac2缺失胰腺β細(xì)胞。[圖13]圖13分別顯示野生型小鼠(空心柱)和Epac2缺失小鼠(黑色柱)的胰腺β細(xì)胞分泌的胰島素量。分別加入(a)葡萄糖或KC1，(b)甲苯磺丁脲，(c)格列本脲， 和(d)格列齊特。[圖14]圖14顯示野生型小鼠(WT)和Epac2缺失小鼠(EpacIO)的血清胰島素濃度和血糖濃度?？招闹涂招膱A圈表示野生型小鼠的數(shù)據(jù)，黑色柱和黑色圓圈表示Epac2 缺失小鼠的數(shù)據(jù)。(a)葡萄糖單獨(dú)給予，或(b)葡萄糖和甲苯磺丁脲一起給予。實(shí)施方式說明在本發(fā)明中，當(dāng)簡單地描述“Epac2”時(shí)，表示哺乳動(dòng)物Epac2，具體的指小鼠和人 Epac2，且尤其指野生型Epac2。小鼠野生型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID N0:1，其氨基酸序列示為SEQ ID NO :2。人野生型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID NO :3，氨基酸序列示為SEQ ID NO :4。人Epac2cDNA可通過公知的方法獲得(非專利文獻(xiàn)5)。小鼠和人的野生型Epac2的氨基酸序列都由1011個(gè)氨基酸殘基組成，它們彼此僅有25個(gè)氨基酸不同。且在所述不同的氨基酸中的每五個(gè)中，所述不同限于相似氨基酸對之間(一個(gè)酸性氨基酸，一個(gè)堿性氨基酸，兩個(gè)支鏈氨基酸和一個(gè)羧基氨基酸)。因此，它們之間的同源性很高，即不低于98%。這一高同源性有力證明了它們在結(jié)構(gòu)和功能上基本等同。 同時(shí)，在本發(fā)明中，當(dāng)簡單地描述“Epac2”時(shí)，不僅包括自然產(chǎn)生的全長Epac2，還包括那些包含部分Epac2氨基酸序列的肽，該部分序列包括其cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，蓬亂蛋白，Egl_10， 普列克底物蛋白(DEP)結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域起著膜定位的作用)，Ras交換基序(REM)結(jié)構(gòu)域， 位于羧基末端的GEF結(jié)構(gòu)域，位于氨基末端的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和與Ras相互作用的Ras 相關(guān)(RA)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明中，“熒光標(biāo)記的Epac2”指包含Epac2和與前者融合的兩種不同熒光蛋白的蛋白質(zhì)。雖然只要融合到Epac2的熒光蛋白組合可引起FRET，這兩種不同的熒光蛋白的任意組合都可融合到Epac2上，但優(yōu)選青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的組合，更優(yōu)選 ECFP (增強(qiáng)型青色熒光蛋白)和EYFP (增強(qiáng)型黃色熒光蛋白)的組合。當(dāng)采用的熒光蛋白組合由青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白組成時(shí)，雖然只要形成的融合蛋白能引起FRET，這些蛋白各自可融合到Epac2的N末端或其C末端上，但優(yōu)選青色熒光蛋白融合到N-末端上，且黃色熒光蛋白融合到C-末端上。本發(fā)明中，術(shù)語“FRET技術(shù)”指將熒光標(biāo)記的Epac2產(chǎn)生的變化檢測為通過FRET 發(fā)出的熒光變化的方法。在本發(fā)明中，術(shù)語“熒光”還指熒光標(biāo)記的Epac2通過FRET發(fā)出的熒光。盡管只要摻入載體的熒光標(biāo)記的Epac2能表達(dá)，各種表達(dá)載體就可用在本發(fā)明中而沒有任何具體的限制，但優(yōu)選用于哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體。術(shù)語“用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞”表示所述載體能夠作為表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)起作用。只要在細(xì)胞被本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化時(shí)，熒光標(biāo)記的Epac2能在所述細(xì)胞中表達(dá)， 對于本發(fā)明所用細(xì)胞沒有具體的限制，并且所述細(xì)胞可能是包括大腸桿菌(E.coli)的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞如酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。當(dāng)本發(fā)明使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，對于細(xì)胞源自的物種沒有具體限制，優(yōu)選使用源自人、猿、小鼠或大鼠的細(xì)胞。此外，對可用的細(xì)胞種類沒有具體的限制，且可使用那些細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、腎源細(xì)胞、上皮細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞，還可使用任何正常細(xì)胞、癌化細(xì)胞、細(xì)胞系和原代細(xì)胞培養(yǎng)物。而且，本發(fā)明使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是那些表達(dá)Katp通道的細(xì)胞例如源自胰腺 β細(xì)胞的ΜΙΝ6細(xì)胞或是那些不表達(dá)Katp通道的細(xì)胞例如COS細(xì)胞如C0S-1細(xì)胞。然而，在要避免SURl和熒光標(biāo)記的Epac2之間任何相互作用的影響的情況下，優(yōu)選不表達(dá)Katp通道的細(xì)胞。術(shù)語“不表達(dá)Katp通道的細(xì)胞”不僅包括那些根本不表達(dá)Katp通道的細(xì)胞，還包括那些表達(dá)Katp通道但僅表達(dá)量很小以至于不能對用FRET技術(shù)獲取的測量值產(chǎn)生影響的細(xì)胞。本發(fā)明的篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法可通過以下方式進(jìn)行觀察表達(dá)熒光標(biāo)記 Epac2的細(xì)胞與試劑接觸之后、或之前和之后FRET技術(shù)產(chǎn)生的熒光變化。如果所述熒光標(biāo)記的Epac2由Epac2和與之融合的青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白組成，則可用作FRET技術(shù)的激發(fā)光波長為435-445nm，優(yōu)選440nm。且在這種情況下發(fā)出的熒光的波長為475-485nm 和 530-540nm，特別是 480nm 和 535nm。進(jìn)一步，在本發(fā)明的篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法中，可使用表達(dá)熒光標(biāo)記的 Epac2的細(xì)胞勻漿以及完全或部分純化自該勻漿的熒光標(biāo)記的Epac2。對于可被本發(fā)明篩選的胰島素分泌增強(qiáng)劑沒有具體的限制，只要它們能直接或間接通過Epac2增加胰島素分泌，且它們包括治療1型和2型糖尿病的試劑。所述術(shù)語“直接通過Epac2”作用指試劑通過直接結(jié)合Epac2起作用，且術(shù)語“間接通過Epac2”作用指胰島素分泌增強(qiáng)劑通過它對Epac2相關(guān)分子的作用引起信號(hào)傳輸(如通過所述信號(hào)傳輸通路的 Epac2上游蛋白如Rab3起作用，或通過結(jié)合Epac2的分子起作用)，盡管所述試劑本身并不直接結(jié)合Epac2。因此本發(fā)明可用于篩選通過Epac2起作用的胰島素分泌增強(qiáng)劑。反過來，這意味著本發(fā)明可用于從包括已知的抗糖尿病藥物的胰島素篩選增強(qiáng)劑中篩選不通過Epac2起作用的試劑。進(jìn)一步，本發(fā)明可用于篩選用于缺乏Katp通路的糖尿病患者的治療劑或評估它們的藥理學(xué)效果。本文所述術(shù)語“缺乏Katp通路的糖尿病患者”指那些遺傳性缺乏Katp通路的糖尿病患者且包括具有該遺傳特性的新生兒糖尿病患者。本文待篩選或評估藥理學(xué)效果的治療劑包括例如SU劑。本發(fā)明揭示了一些SU劑通過Epac2表現(xiàn)其藥理學(xué)活性，而其他的則不通過Epac2。那些預(yù)期在治療缺乏Katp通路的糖尿病患者中起作用的SU劑，是那些通過Epac2表現(xiàn)其藥理學(xué)活性的SU劑，此類試劑可用本發(fā)明篩選和評估它們的效果。
實(shí)施例參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的描述。然而，這并不意味著本發(fā)明受所述實(shí)施例限制。具體地，雖然下述實(shí)施例是在小鼠Epac2上，但如上所述小鼠Epac2和人Epac2 都由1011氨基酸組成且它們之間的同源性不低于98%的事實(shí)強(qiáng)有力地證明它們在結(jié)構(gòu)和功能上基本等同。因此，下述實(shí)施例在小鼠Epac2上獲得的所有結(jié)果在基本等同的人Epac2 上也必然有效。同時(shí)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依照神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)(Ethics Committee, School of Medicine, Kobe University)的指南進(jìn)行。試劑格列本脲購自ALEXIS公司(美國圣地亞哥市)。甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰環(huán)己脲、格列甲嗪、那格列奈和12-0-十四烷?；?佛波醇-13-乙酸鹽(TPA)購自西格瑪(SIGMA)公司(美國圣路易斯市)。格列齊特購自LKT實(shí)驗(yàn)室(美國圣保羅市)。氚標(biāo)記的格列本脲購自帕金埃爾默(PerknElmer)公司(美國沃森姆市)。動(dòng)物缺乏Epac2 的小鼠用文獻(xiàn) Shibasaki T.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104， 19333-9(2007)中所述技術(shù)制備。在所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用野生型小鼠(C57BL/6)作為對照組。缺乏Epac2的胰腺β細(xì)胞。缺乏Epac2 的胰腺 β 細(xì)胞按照文獻(xiàn) Shibasaki Τ.等 Proc. Natl. Acad. ki. USA 104,19333-9(2007)中公開的技術(shù)獲得，所述細(xì)胞分離自Epac2缺乏的小鼠和IT6小鼠交配后繁殖的小鼠，其中SV40大T抗體在人胰島素基因啟動(dòng)子控制下表達(dá)。制備IT6小鼠的方法如文獻(xiàn) Miyazaki J，等 Endocrinology，127，126-132 (1990)所述。進(jìn)一步，MIN6 細(xì)胞通過日本專利申請公開號(hào)2002-125661中所述技術(shù)制備。小鼠Epac2表達(dá)載體所用的野生型小鼠Epac2表達(dá)載體(pFLAG-EpaC2 圖1)和突變型小鼠表達(dá)載體 (pFLAG-Epac2 G114E G422D:圖 2)如文獻(xiàn)Ozaki N.等 U000)Nat. Cell. Biol. 2,805-811所述(非專利文獻(xiàn)13)。在野生型小鼠Epac2cDNA(SEQ ID NO 1)中，除了終止密碼子(tag) 外的前14個(gè)堿基和后12個(gè)堿基是PCR中使用的引物序列。用于構(gòu)建pFLAG-Epac2 和 pFLAG_Epac2 G114E G422D 的 pFLAT-CMV-2 的載體圖示于圖3a，且其全長DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO :5，其多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列分別示于圖 3b 和 SEQ ID NO :6。在表達(dá)載體pFLAG-Epac2 和 pFLAG-Epac2 G114E G422D 中，Epac2 基因插入到pFLAT-CMV-2載體的EcoRI位點(diǎn)。進(jìn)一步，上述所用的小鼠突變型Epac2的cDNA序列示為SEQ ID NO :7，且其氨基酸序列示為SEQ ID NO :8ο構(gòu)建青色和黃色熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體-步驟1 使用上述小鼠Epac2表達(dá)載體pFLAG_Epac2作為模板，用引物BglII_Epac2 (5 ‘ -agatctatggtcgctgcgca-3‘ ,SEQ ID NO :9)禾口弓丨物 Epac2_EcoRI(5' -gaattctggccttcga gg-3‘ =SEQ ID NO 10)進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增小鼠Epac2的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C 30秒，55°C :30秒，68°C 2分鐘)，30個(gè)循環(huán)(94°C :30秒， 500C 30秒，68°C 3分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C 5分鐘)組成。如此擴(kuò)增的小鼠野生型Epac2cDNA (上述SEQ ID NO 1)用BglII和EcoRI酶切，之后插入到已用Bgl11和EcoRI 酶切的青色熒光蛋白(ECFP)表達(dá)載體pECFP-Cl (圖4，克隆泰克公司(Clontech))中，其多克隆位點(diǎn)的DNA序列示于SEQ ID NO 11。所獲的這個(gè)載體命名為pECFP-小鼠Epac2表達(dá)載體。分別地，青色熒光蛋白(ECFP)的cDNA序列示于SEQ ID NO 12，其氨基酸序列示于 SEQ ID NO :13ο構(gòu)建青色和黃色熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體-步驟2 使用黃色熒光蛋白表達(dá)載體pEYFP-Nl (圖5，克隆泰克公司)作為模板(該載體多克隆位點(diǎn)的 DNA 序列示于 SEQ ID NO :14)，用引物 GFP-fw(5' -atggtgagcaagggcg-3 ‘ SEQ ID NO 15)和引物 GFP_rv(5' -cttgtacagctcgtccat-3‘ :SEQ IDNO :16)進(jìn)行 PCR 以擴(kuò)增黃色熒光蛋白EYFP的cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 1 分鐘)，30 個(gè)循環(huán)(94°C :30 秒，52°C :30 秒，68°C 1 分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C :5分鐘)組成。使用通過PCR獲得的EYFP的cDNA作為模板，用引物 EcoRI-EYFP(5‘ -gaattcatggtgagcaagg-3‘ :17)禾口弓|物 EYFP-EcoRI(5' -gaattccttgta cagctcgt-3' =SEQ ID NO :18)進(jìn)行 PCR 以擴(kuò)增加上一個(gè) EcoRI 位點(diǎn)的 EYFP cDNA。黃色熒光蛋白(EYFP)的cDNA序列示于SEQ ID NO 19，其氨基酸序列示于SEQ ID NO :20。在所述cDNA中，除了終止密碼子“tag”外的前端13個(gè)堿基和最后14個(gè)堿基是引物序列。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C :30秒，55°C :30秒，72°C :1分鐘)，30 個(gè)循環(huán)(94°C 30秒，52°C 30秒，68°C 1分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C 5分鐘)組成。 所述擴(kuò)增的加入EcoRI位點(diǎn)的EYFP cDNA用EcoRI酶切并插入到已用EcoRI酶切的前述 PECFP-小鼠Epac2表達(dá)載體中。所獲的載體用作熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體。構(gòu)建突變型熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體-步驟1 使用前述突變型小鼠Epac2表達(dá)載體(pFLAG-EpaC2 G114E G422D)作為模板， 用引物 Bgl II-Epac2 (前述的 5 ‘ -agatctatggtcgctgcgca-3 ‘，SEQ ID NO 9)和引物 Epac2-EcoRI(前述的 5' -gaattctggccttcgagg-3 ‘ :SEQ ID NO 10)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)以擴(kuò)增突變型小鼠Epac2cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C :30秒， 550C 30 #, 680C 2 分鐘),30 個(gè)循環(huán)(94°C 30 秒，50°C :30 秒，68°C 3 分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C 5分鐘)組成。所述擴(kuò)增的突變型小鼠Epac2cDNA用BglII和EcoRI酶切， 之后插入到PECFP-Cl載體中(克隆泰克公司)。所獲的這個(gè)載體命名為突變型pECFP-小鼠Epac2表達(dá)載體。構(gòu)建突變型熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體-步驟2 使用所述pEYFP-Nl載體(克隆泰克公司)作為模板，用引物 GFP-fw(前述的 5 ‘ -atggtgagcaagggcg-3 ‘ =SEQ ID NO 15)和引物 GFP-rv (5 ‘ -cttgtacagctcgtccat-3 ‘ :SEQ ID NO 16)進(jìn)行 PCR 以擴(kuò)增所述黃色熒光蛋白EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C :30秒，55°C :30秒， 72°C:1分鐘)，30個(gè)循環(huán)(94°〇:30秒，521:30秒，681:1分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C 5分鐘)組成。然后使用通過PCR獲得的EYFP cDNA作為模板，用引物EcoRI-EYFP(前述的 5 ‘ -gaattcatggtgagcaagg-3 ‘ :SEQ ID NO 17)禾Π 弓丨物 EYFP-EcoRI (前述的 5' -gaattccttgtacagctcgt-3‘ :SEQ ID NO 18)進(jìn)行 PCR 以擴(kuò)增加入 EcoRI 位點(diǎn)的 EYFP cDNA。使用PfuDNA聚合酶，所述PCR程序由10個(gè)循環(huán)(95°C :30秒，55°C :30秒，72°C 1 分鐘)，30個(gè)循環(huán)(94°C 30秒，52°C :30秒，68°C 1分鐘)和之后的最終反應(yīng)(68°C 5分鐘)組成。所述擴(kuò)增的加入EcoRI位點(diǎn)的EYFP cDNA用EcoRI酶切并插入到已用EcoRI酶切的所述突變型PECFP-小鼠Epac2表達(dá)載體中。所獲的這個(gè)載體命名為熒光標(biāo)記的突變CN 102395677 A
說明書
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型小鼠Epac2表達(dá)載體。圖6是熒光標(biāo)記的小鼠Epac2和熒光標(biāo)記的突變型小鼠的Epac2的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化在5% CO2下將MIN6和C0S-1細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)入包含10%熱滅活胎牛血清的杜爾伯科改良伊勾培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified Eagle' s medium, DMEM)中。用 FuGENE6 轉(zhuǎn)染試劑(羅氏分子生物化學(xué)公司，瑞士巴塞爾)進(jìn)行所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。通過FRET技術(shù)對熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的觀察和動(dòng)態(tài)分析測量前兩天，用熒光標(biāo)記的小鼠Epac2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞并培養(yǎng)。測量前一天，將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到直徑25mm的玻璃培養(yǎng)皿上繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后約48小時(shí)，用 HEPES-KRB 緩沖液替代培養(yǎng)基(HEPES 緩沖液包含 133. 4mM NaCU 4. 7mM KCl、1. 2mM KH2PO4, 1. 2mM MgSO4,2. 5mM CaCl2,5. OmM NaHCO3,2. 8mM 葡萄糖禾口 0. 2% BSA(pH 7. 4))。通過裝有 UPlanSApo物鏡(100倍油鏡/1. 40NA)的共聚焦顯微鏡(FV1000，奧林巴斯公司(Olympus Corporation))觀察所述細(xì)胞，將所述物鏡焦點(diǎn)設(shè)置在細(xì)胞上，并用波長440nm的激發(fā)光照射，使用440nm LD激光器(FV5-LDPSU，奧林巴斯公司)，功率0. 5%。如此激發(fā)的熒光標(biāo)記小鼠Epac2所發(fā)出的熒光通過兩個(gè)熒光濾片480DF30 (用于480nm光)和535DF25 (用于 535nm光)觀察，作為每5秒的熒光雙重圖像用于所述發(fā)出熒光的動(dòng)態(tài)分析。每次測量中在首次計(jì)算535nm與480nm的熒光強(qiáng)度的比率R后(535nm強(qiáng)度/480nm強(qiáng)度的比率)，所述動(dòng)態(tài)分析的結(jié)果用所述比率除以初始值Rtl導(dǎo)出的值表示，即R/Ro。所有觀察在室溫下進(jìn)行。硫酰脲類結(jié)合實(shí)驗(yàn)用小鼠Epac2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化COS 1細(xì)胞。轉(zhuǎn)化兩天后，用緩沖液QOmM HEPES，包含 119mM NaCl,4. 7mM KCl，2· 5mM CaCl2,1. 2mM KH2PO4,1. 2mM MgSO4,5. OmM NaHCO3, (pH 7. 4)) 清洗所述細(xì)胞兩次并將其以2. 5-5. 2xl05細(xì)胞/400 μ 1的濃度懸浮于同一緩沖液中。所述細(xì)胞再分成每管400μ 1，在加入氚標(biāo)記的格列本脲后室溫靜置1小時(shí)。同時(shí)加入未標(biāo)記的格列本脲或甲苯磺丁脲等，與氚標(biāo)記的格列本脲競爭。破裂C0S-1細(xì)胞，且在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合到蛋白上的氚標(biāo)記的格列本脲通過真空過濾被吸收到沃特曼GF/C膜上(沃特曼(Whatman) 公司，英國梅德斯通市)。用冰冷卻的相同緩沖液清洗所述膜四次，然后在液體閃爍計(jì)數(shù)器上測量放射活性。GTP-RAPl 牽出實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)Shibasaki T.等 Proc. Natl. Acad. ki. USA 104，19333-9 Q007)所述的方法進(jìn)行GTP-RAPl牽出實(shí)驗(yàn)。即，預(yù)先在HEPES-KRB緩沖液中靜置30分鐘的MIN6細(xì)胞在包含感興趣的試劑和2. SmM葡萄糖的HEPES-KRB緩沖液中繼續(xù)培養(yǎng)15分鐘。然后破裂上述細(xì)胞，在所獲細(xì)胞裂解物中加入結(jié)合有GST-RalGDS-RID的谷胱甘肽樹脂(西格瑪公司)。 4°C孵育90分鐘后，離心分離所述樹脂，用HEPES-KRB緩沖液清洗數(shù)次，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。所述SDS-PAGE凝膠電泳后，進(jìn)行Western印跡以將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并且用抗Rapl抗體(圣克魯茲生物技術(shù)公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，美國)檢測轉(zhuǎn)移到所述膜上的Rapl。胰島素分泌實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺β細(xì)胞分離自野生型小鼠(C57BL/6)或Epac2缺陷小鼠并培養(yǎng)兩天。所述小鼠胰腺β細(xì)胞在含2. 8mM葡萄糖的HEPES-KRB緩沖液中靜置30分鐘。然后以每孔包含5個(gè)相似大小的胰島的方式將所述細(xì)胞分配到92孔板上，并在包含感興趣的試劑和 2. SmM葡萄糖的100 μ 1 HEPES-KRB緩沖液中培養(yǎng)15分鐘。用胰島素實(shí)驗(yàn)試劑盒(醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室有限公司(Medical Biological Laboratories Co. Ltd.))測量釋放入上述培養(yǎng)基中的和細(xì)胞中的胰島素量。分泌的胰島素量用細(xì)胞中的胰島素量標(biāo)準(zhǔn)化?？诜咸烟悄褪軠y試禁食16小時(shí)的小鼠單獨(dú)口服給予1. 5g/kg體重的葡萄糖或1. 5g/kg體重的葡萄糖加上100mg/kg體重的甲苯磺丁脲。在預(yù)定時(shí)間提取外周血樣本，并用ELISA試劑盒(莫林納加(Morinaga)公司制造)和安特森III (Antsense III)糖分析儀(拜爾醫(yī)藥有限公司Bayer Yakuhin, Ltd.)分別測量血清胰島素濃度和血糖濃度。用FRET技術(shù)觀察熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的三維結(jié)構(gòu)變化當(dāng)轉(zhuǎn)化有熒光標(biāo)記小鼠Epac2表達(dá)載體的所述C0S-1細(xì)胞(表達(dá)熒光標(biāo)記小鼠 Epac2的C0S-1細(xì)胞)在包含有ImM或IOmM 8-溴-cAMP (cAMP類似物)的緩沖液中用FRET 技術(shù)進(jìn)行6分鐘測量時(shí)，觀察到R/禮值有濃度依賴性的降低(圖7a)。認(rèn)為R/禮值的所述降低是FRET改變的結(jié)果，所述改變是熒光標(biāo)記小鼠Epac2與8-溴-cAMP的結(jié)合導(dǎo)致其三維結(jié)構(gòu)的改變引起的。另一方面，當(dāng)用同樣的方法測量轉(zhuǎn)化有熒光標(biāo)記突變型小鼠Epac2 表達(dá)載體(其cAMP結(jié)合位點(diǎn)被破壞)的所述C0S-1細(xì)胞時(shí)，沒有觀察到R/%值的降低(圖 7b)。認(rèn)為這是由于8-溴-cAMP不能結(jié)合到所述突變型熒光標(biāo)記的小鼠Epac2上，沒有造成所述突變型熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這就沒有導(dǎo)致FRET的變化。此外，在沒有加入8-溴-cAMP作培養(yǎng)時(shí)，上述兩種情況下都沒有觀察到R/%的變化(圖7a、 7b)。這些結(jié)果證明由8-溴-cAMP與之結(jié)合造成的熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可通過所述FRET技術(shù)在細(xì)胞中觀察到。因此，cAMP和Epac2的結(jié)合是通過Epac2的信號(hào)傳導(dǎo)的步驟之一，用表達(dá)熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的細(xì)胞可隨著時(shí)間觀察到所述結(jié)合步
馬聚οSU劑和熒光標(biāo)記的小鼠Epac2的結(jié)合當(dāng)有SU劑(甲苯磺丁脲或格列甲嗪)存在下，用FRET技術(shù)測量轉(zhuǎn)化有熒光標(biāo)記小鼠Epac2表達(dá)載體的MIN6細(xì)胞時(shí)，觀察到R/&值有濃度依賴性的降低。因?yàn)橐阎鯯U 劑通過與SURl (Katp通道的組分)結(jié)合表現(xiàn)其功能，所以不排除這里觀察到的所述R/R。值的降低可能是SURl的間接效應(yīng)。因此，在有一種不同的SU劑存在下，用FRET技術(shù)測量表達(dá)熒光標(biāo)記小鼠Epac2而不表達(dá)SURl的C0S-1細(xì)胞，并且該測量顯示有甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰環(huán)己脲和格列甲嗪存在下觀察到R/&降低(圖9a_e)。該結(jié)果說明這些SU劑不是通過 SURl作用而是直接作用在Epac2上以改變其高級(jí)結(jié)構(gòu)。這是令人意外的，因?yàn)閺奈搭A(yù)期 Epac2是SU劑的靶標(biāo)。另一方面，有格列齊特和那格列奈存在下沒有觀察到R/禮值的變化，盡管它們也是SU劑。這說明這些試劑不是直接作用在Epac2上造成其高級(jí)結(jié)構(gòu)變化的 (圖9f-g)。因?yàn)镋pac2是在胰島素分泌中起作用的信號(hào)傳輸器，所以上述結(jié)果說明SU劑可因其作用機(jī)制而有不同組，一種通過Epac2起作用和另一種不是。之后，為了驗(yàn)證SU劑是否直接與Epac2結(jié)合，用氚標(biāo)記的格列本脲進(jìn)行硫酰脲類結(jié)合測試。所述轉(zhuǎn)化有小鼠Epac2表達(dá)載體的C0S-1細(xì)胞在濃度為1_40ηΜ的氚標(biāo)記的格列本脲存在下培養(yǎng)，之后破裂所述細(xì)胞以測量結(jié)合到C0S-1的胞內(nèi)因子上的氚標(biāo)記格列本脲的放射活性。與濃度為100 μ M的非放射性標(biāo)記的格列本脲共存培養(yǎng)時(shí)，氚標(biāo)記的格列本脲的非特異性結(jié)合量即為所測的放射活性。結(jié)果顯示，氚標(biāo)記的格列本脲的特異性結(jié)合量以濃度依賴性方式增加(圖IOa)。另一方面，在正常C0S-1細(xì)胞中觀察到非特異性結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明格列本脲與Epac2特異結(jié)合。接下來，轉(zhuǎn)化有小鼠Epac2表達(dá)載體的C0S-1細(xì)胞在未標(biāo)記的格列本脲(GLB)、甲苯磺丁脲(TLB)或8-溴-cAMP(8-Br-cAMP)和IOnM氚標(biāo)記的格列本脲共存下培養(yǎng)以使它們競爭結(jié)合Epac2。結(jié)果顯示，非標(biāo)記的格列本脲的IC5tl為25nM，甲苯磺丁脲的IC5tl為240 μ Μ, 且8-溴-cAMP幾乎沒有觀察到競爭性(圖IOb)。這些結(jié)果說明格列本脲對Epac2的親和力比甲苯磺丁脲高。此外，它們還說明Epac2分子上的格列本脲結(jié)合位點(diǎn)與cAMP結(jié)合位點(diǎn)沒有重疊。這些結(jié)果表明用FRET技術(shù)，利用熒光標(biāo)記的Epac2作為傳感器有可能觀察到試劑 (包括SU劑)是否結(jié)合Epac2。Epac2 參與 SU 劑激活 Rap 1 Epac2有GEF活性且通過將Rapl與GTP結(jié)合使其轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的Rapl而激活 Rapl0所述反應(yīng)組成β細(xì)胞中胰島素分泌的信號(hào)傳輸?shù)囊徊糠?。因此，用源于β?xì)胞的 ΜΙΝ6細(xì)胞檢測Rapl是否被SU劑激活。使用GTP-RAPl牽出實(shí)驗(yàn)，通過測定GTP結(jié)合的Rapl 來檢測Rapl的激活。使用稱為Rapl激活劑化合物的8-溴-cAMP和TPA作為陽性對照。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰環(huán)己脲和格列甲嗪在MIN6細(xì)胞中以濃度依賴性的方式提高GTP結(jié)合的Rapl含量，即激活了 Rapl (圖lla_e)。 然而，雖然格列本脲直到濃度為IOOnM都提高GTP結(jié)合的Rapl含量，但它在更高的濃度沒有提高作用(圖lib)。另一方面，沒有發(fā)現(xiàn)格列齊特在MIN6細(xì)胞中對GTP結(jié)合的Rapl的含量有影響，即未激活Rapl (圖11)。全部激活Rapl的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰環(huán)己脲和格列甲嗪是用FRET技術(shù)觀察到R/R0值降低的SU劑，而沒有激活Rapl的格列齊特是沒有觀察到 R/R0值降低的SU劑。這些結(jié)果表明SU劑對Rapl的激活通過SU劑結(jié)合Epac2進(jìn)行。然后，用Epac2缺乏的胰腺β細(xì)胞檢測Rapl是否被SU劑激活。使用GTP-RAPl 牽出實(shí)驗(yàn)，通過測定GTP結(jié)合的Rapl的含量來檢測Rapl的激活。用已知可激活Rapl的 8-溴-cAMP和TPA作為陽性對照。結(jié)果顯示，在MIN6細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)激活Rapl的甲苯磺丁脲、格列本脲、氯磺丙脲、乙酰苯磺酰環(huán)己脲和格列甲嗪在上述Epac2缺乏的胰腺β細(xì)胞中沒有激活Rapl (圖12a)。然而，當(dāng)在用小鼠Epac2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Epac2缺乏的胰腺β細(xì)胞后進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有上述試劑激活Rapl (圖12b)。這些結(jié)果說明所述SU劑是通過Epac2激活Rapl的。另一方面，即使在小鼠Epac2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的Epac2缺乏的胰腺β細(xì)胞中，用FRET技術(shù)檢測到對R/Ro值沒有影響的那格列奈也沒有激活Rapl (數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明使用熒光標(biāo)記的Epac2作為傳感器，采用FRET技術(shù)觀察到結(jié)合 Epac2的上述試劑通過Epac2激活Rapl。即，所述結(jié)果表明使用熒光標(biāo)記的Epac2作為傳感器的FRET技術(shù)可用于篩選通過Epac2激活Rap 1的試劑。
SU劑通過Epac2對胰島素分泌的影響利用胰島，在胰島素分泌試驗(yàn)中測量SU劑通過Epac2對胰島素分泌的影響。首先， 用葡萄糖刺激獲自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰島，并測量胰島素分泌量。結(jié)果顯示， 二者之間的胰島素分泌沒有發(fā)現(xiàn)顯著不同(圖13a)。用KCl進(jìn)行刺激后的結(jié)果一樣(圖 13a)。然后，用FRET技術(shù)中檢測能降低R/禮值的甲苯磺丁脲(IOOnM)或格列本脲(IOnM) 刺激獲自野生型小鼠和Epac2缺乏小鼠的胰島，并用同樣的方法測量胰島素分泌量。結(jié)果顯示，這些試劑刺激后，Epac2缺乏小鼠的胰島與野生型小鼠的胰島相比表現(xiàn)出明顯較低的胰島素分泌(圖13b，c)。另一方面，用FRET技術(shù)中未檢測到R/&值變化的格列齊特的兩組之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯不同(圖13d)。這些結(jié)果表明通過Epac2的通路對于采用FRET技術(shù)測定到R/Ro值降低的那些SU劑表現(xiàn)其全部藥理學(xué)效果是必須的。為了檢測通過Epac2的SU劑的體內(nèi)效果，依照口服葡萄糖耐受測試，在口服給予葡萄糖后測量甲苯磺丁脲對血清胰島素和血糖濃度的影響。首先，對野生型小鼠和Epac2 缺乏小鼠單獨(dú)給予葡萄糖，并測量其血清胰島素和血糖濃度，其結(jié)果顯示兩組間沒有顯著差異(圖14a)。接下來，葡萄糖和甲苯磺丁脲一起給予，并用同樣的方法進(jìn)行測量。結(jié)果顯示與野生型小鼠相比，Epac2缺乏小鼠的血清胰島素濃度較低(圖14b)。同時(shí)，與所述血清胰島素濃度相對應(yīng)，Epac2缺乏小鼠的血糖濃度高于野生型小鼠(圖14b)。上述結(jié)果表明通過Epac2的SU劑也在體內(nèi)表現(xiàn)出效果，且激活EpaC2/Rapl信號(hào)傳輸通路對于某些SU劑(包括甲苯磺丁脲)完全表現(xiàn)其效果是必須的。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橥ㄟ^Epac2激活Rapl的試劑可采用以熒光標(biāo)記的Epac2作為傳感器的FRET技術(shù)進(jìn)行篩選， 所以可用相同的方法篩選通過Epac2增強(qiáng)胰島素分泌的試劑。例如，因?yàn)榭捎米髦委熑狈?Katp通路的糖尿病患者的藥劑的SU劑局限于激活Epac2/Rapl信號(hào)傳輸通路的那些試劑，所以可用本方法篩選此類試劑。相反，也可篩選不能激活Epac2/Rapl信號(hào)傳輸通路的試劑。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可用作篩選應(yīng)用于糖尿病患者的胰島素分泌增強(qiáng)劑的材料，也可用作所述篩選的方法。
0140]序列表自由文字0141]SEQIDNO1 =小鼠野生型Epac20142]SEQIDNO3 =人野生型Epac20143]SEQIDNO5 = pFLAT-CMV-2 全長 DNA0144]SEQIDNO6 =多克隆位點(diǎn)，pFLAT-CMV-20145]SEQIDNO7 =小鼠突變型 Epac2(Epac2 G114E G422D)0146]SEQIDNO9 =引物 BglII-Epac20147]SEQIDNO10 =引物 Epac2-EcoRI0148]SEQIDNO:11 =多克隆位點(diǎn)，PECFP-Cl0149]SEQIDNO12 = ECFP0150]SEQIDNO13 =合成的構(gòu)建體0151]SEQIDNO14 =多克隆位點(diǎn)，pEYFP-Nl0152]SEQIDNO15 =引物 GFP-fw0153]SEQIDNO16 =引物 GFP-rv
SEQIDNO:17=引物 EcoRI-EYFP
SEQIDNO:18=引物 EYFP-EcoRI
SEQIDNO:19=EYFP
SEQIDNO:20=合成的構(gòu)建體
權(quán)利要求
1.一種編碼熒光標(biāo)記的Epac2的DNA，包含編碼發(fā)出波長彼此不同的熒光的兩種不同熒光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA，其特征在于，所述兩種不同熒光蛋白是青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA，其特征在于，編碼所述青色熒光蛋白的DNA和編碼所述黃色熒光蛋白的DNA分別與編碼Epac2的DNA的5'-和3'-末端融合。
4.如權(quán)利要求2或3所述的DNA，其特征在于，所述青色熒光蛋白是ECFP且所述黃色熒光蛋白是EYFP。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述載體包含如權(quán)利要求1-4所述的摻入DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
7.一種細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是攜帶有如權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是哺乳細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞不表達(dá)SURl基因。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是COS細(xì)胞。
11.一種熒光標(biāo)記的Epac2，其是融合蛋白，包含Epac2和與之融合的兩種不同的熒光蛋白，其中，所述兩種不同的熒光蛋白發(fā)出彼此波長不同的熒光。
12.一種熒光標(biāo)記的Epac2，其是融合蛋白，包含兩種不同的的熒光蛋白和Epac2，其中，所述融合蛋白在如權(quán)利要求7-10中任一所述的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
13.—種篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，所述方法包括以下步驟提供胰島素分泌增強(qiáng)劑的候選化合物，使各候選化合物與如權(quán)利要求7-10之一所述的細(xì)胞接觸，在所述候選化合物與所述細(xì)胞接觸前后用所述兩種不同熒光蛋白中的短波長熒光蛋白的激發(fā)光照射所述細(xì)胞以測量所述細(xì)胞中包含在熒光標(biāo)記的Epac2內(nèi)的所述兩種不同熒光蛋白各自發(fā)出的熒光強(qiáng)度，檢測所述候選化合物與所述細(xì)胞接觸前后的所述兩種不同熒光之間強(qiáng)度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強(qiáng)劑。
14.一種篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，所述方法包括以下步驟提供胰島素分泌增強(qiáng)劑的候選化合物，使各候選化合物與如權(quán)利要求11或12所述的熒光標(biāo)記Epac2接觸，在所述候選化合物與所述Epac2接觸前后用所述兩種不同熒光蛋白中的短波長熒光蛋白的激發(fā)光照射所述Epac2以測量包含在所述熒光標(biāo)記Epac2內(nèi)的所述兩種不同熒光蛋白各自發(fā)出的熒光強(qiáng)度，檢測與所述候選化合物接觸前后的所述兩種不同熒光之間強(qiáng)度比率的變化，和篩選引起變化的候選化合物作為胰島素分泌增強(qiáng)劑。
全文摘要
揭示了一種篩選胰島素分泌加強(qiáng)劑的新方法以及進(jìn)行該篩選的工具該工具包括編碼熒光標(biāo)記的Epac2的DNA，包含編碼發(fā)出波長彼此不同的熒光的兩種不同熒光蛋白的兩種不同DNA和編碼Epac2的DNA，這些DNA同框融合，和轉(zhuǎn)化該DNA的細(xì)胞。還揭示了篩選胰島素分泌增強(qiáng)劑的方法，該方法包括將一種候選化合物與轉(zhuǎn)化有所述DNA的細(xì)胞接觸，并檢測該化合物是否結(jié)合Epac2。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102395677SQ20108001707
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者加藤惠, 張長亮, 柴崎忠雄, 清野進(jìn) 申請人:國立大學(xué)法人神戶大學(xué), 日本化學(xué)研究株式會(huì)社