專利名稱：針對(duì)肌鈣蛋白i的抗體及其使用方法
針對(duì)肌鈣蛋白I的抗體及其使用方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及針對(duì)肌鈣蛋白I的抗體及其使用方法。背景信息肌鈣蛋白I是可以在例如心肌梗死之后或過程中的心肌損傷測定中使用的肌肉蛋白質(zhì)。特別地，肌鈣蛋白I是肌鈣蛋白復(fù)合物的3個(gè)亞單位之一，其定位于肌肉收縮器的細(xì)絲上。這種復(fù)合物在控制肌肉收縮的過程中具有主要作用。其他2個(gè)亞單位(即，T和 C)在心臟以及骨骼肌組織中也由肌鈣蛋白I固定在細(xì)肌絲上。測量人血清中的心臟肌鈣蛋白I的測定已得到描述。例如，放射性測定已用于這個(gè)目的(Cummins 等人，Am Heart Tournal 113:1333-1344(1987)。然而，該測定利用與骨骼形式的肌鈣蛋白I具有顯著交叉反應(yīng)性的多克隆抗體。進(jìn)一步地，已利用了使用2種不同單克隆抗體的夾心測定(Bodar等人，Clinical Chemistry 38:2203-2214(1992)；還參見美國專利號(hào)7，觀5，418)。不幸的是，此種測定具有非常高的不精確性。因此，當(dāng)然存在關(guān)于對(duì)于肌鈣蛋白I高度特異性且靈敏的免疫測定的需要。這些免疫測定還必須利用對(duì)骨骼組織中發(fā)現(xiàn)的肌鈣蛋白I不具有交叉反應(yīng)性的抗體。特別地，需要此種免疫測定，從而使得合適療法可以由治療醫(yī)生利用，從而對(duì)受累患者給予最佳的可能預(yù)后。本文提及的所有專利和出版物在此整體弓I入作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠與心臟肌鈣蛋白I結(jié)合的結(jié)合蛋白，特別是抗體。特別地，這些抗體與肌鈣蛋白I的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生且例如在診斷測定中使用這些結(jié)合蛋白或其部分的方法。特別地，本發(fā)明包含中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，稱為iTnI 19C7AM1 hGl CHO 204，由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)指定保藏號(hào) PTA-9816，以及由這種細(xì)胞系產(chǎn)生的重組抗體。另外，本發(fā)明包括與肌鈣蛋白I結(jié)合的包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的結(jié)合蛋白， 所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括包含選自下述的氨基酸序列的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR) GYTFTDYNLH(SEQ ID NO :52)、YIYPYNGITGYNQKFKS(SEQ ID NO 53),DAYDYDLTD(SEQ ID NO: 54)、RTSKNVGTNIH(SEQ ID NO :55)、YASERLP (SEQ ID NO :56)和 QQSNNWPYT (SEQ ID NO :57)。 本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以包括例如這些CDRs中的至少3個(gè)。進(jìn)一步地，這種結(jié)合蛋白還可以包括人接納體構(gòu)架或支架。這種結(jié)合蛋白可以選自例如免疫球蛋白分子、單克隆抗體、嵌合抗體、⑶R嫁接的抗體、人源化抗體、Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體、雙抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體、抗獨(dú)特型抗體、雙特異性抗體或這些實(shí)體中的任何一種的功能上活性的表位結(jié)合片段。本發(fā)明還包含編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變重鏈的氨基酸序列與SEQ ID NO. :25具有至少70%同一性(參見

圖12)。這種分子還可以包括與 SEQ ID N0. 28具有至少70%同一性的可變輕鏈(參見圖12)。
此外，本發(fā)明包括編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO. :25ο另外，本發(fā)明包括編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO. :28。這種分子可以進(jìn)一步包括編碼可變重鏈的分離的核酸分子，其中所述重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO. :25。本發(fā)明還包括包含與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)附著的上述一種或多種核酸分子的載體，以及包括這種載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明包括產(chǎn)生能夠與肌鈣蛋白I結(jié)合的上述任何一種結(jié)合蛋白的方法， 所述方法包括在足以產(chǎn)生目的結(jié)合蛋白的時(shí)間和條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過這種方法產(chǎn)生的結(jié)合蛋白。此外，本發(fā)明包括包含上述任何一種或多種結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。同樣，本發(fā)明包括檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法。這種方法包括步驟 在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使測試樣品與抗體接觸，所述抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合并且包括SEQ ID NO. :25;并且檢測復(fù)合物的存在，所述復(fù)合物的存在指示所述測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在?？贵w可以進(jìn)一步包括SEQ ID NO. :28?？贵w可以通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系產(chǎn)生。本發(fā)明還包括檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟在足以形成第一種抗體/抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使測試樣品與第一種抗體接觸，所述第一種抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合并且包括SEQ ID N0:25 ；在足以形成第一種抗體/抗原/第二種抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，將綴合物添加到第一種抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包括與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著的第二種抗體；和檢測通過信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)的存在，所述信號(hào)的存在指示所述測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在。第一種抗體可以進(jìn)一步包括SEQ ID N0:28，并且可以通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系產(chǎn)生。同樣，本發(fā)明包括檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使肌鈣蛋白I抗原與針對(duì)肌鈣蛋白I 的抗體接觸，其中所述抗體包括SEQ ID NO :25，并且由能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物標(biāo)記；在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體/肌鈣蛋白I測試樣品抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，將測試樣品添加到所述肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物中；并且檢測通過信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)的存在，所述信號(hào)的存在指示測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在。再次，該抗體可以進(jìn)一步包括SEQ ID NO :28，并且可以通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系產(chǎn)生。本發(fā)明還包含檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的另一種方法。這種方法包括步驟在足以形成肌鈣蛋白I參考抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使測試樣品與1)肌鈣蛋白I參考抗原和2、針對(duì)肌鈣蛋白I抗原的抗體接觸，其中所述抗原與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著，且其中所述抗體包括SEQ ID NO :25;并且檢測通過信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)，其中測試樣品中檢測到的肌鈣蛋白I抗原的量與結(jié)合抗體的肌鈣蛋白I 參考抗原的量成反比。再次，該抗體可以進(jìn)一步包括SEQ ID NO :28，并且可以通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系產(chǎn)生。此外，本發(fā)明包括包含上述任何一種或多種結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明還包含診斷懷疑具有這些狀況之一的患者中的急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的方法。這種方法包括步驟從患者中分離生物學(xué)樣品；在足以形成肌鈣蛋白I抗原 /抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使生物學(xué)樣品與抗體接觸，所述抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合且包括SEQ ID NO 25 ；檢測肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的存在；使復(fù)合物中存在的肌鈣蛋白 I抗原與所述復(fù)合物中存在的抗體解離；并且測量所解離的肌鈣蛋白I抗原的量，其中大于正常群體第99百分位的肌鈣蛋白I值約1-5倍的肌鈣蛋白I抗原的量指示患者中急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的診斷。本發(fā)明包括診斷懷疑具有這些狀況之一的患者中的急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的另外方法。這種方法包括步驟從患者中分離生物學(xué)樣品；在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使生物學(xué)樣品與第一種抗體接觸，所述第一種抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合且包括SEQ ID N0:25 ；在足以允許綴合物與結(jié)合的肌鈣蛋白I抗原結(jié)合的時(shí)間和條件下，將綴合物添加到所得到的肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物中，其中所述綴合物包括與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著的第二種抗體；通過檢測通過所述信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)，檢測所述生物學(xué)樣品中可能存在的肌鈣蛋白I抗原的存在；并且通過測量信號(hào)的強(qiáng)度，測量測試樣品中存在的肌鈣蛋白I抗原的量，大于正常群體第99百分位值約1-5倍的肌鈣蛋白I抗原的量指示患者中急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的診斷。本發(fā)明還包括包含上述任何一種或多種單克隆抗體或結(jié)合蛋白和若必要的話描述使用這種試劑盒的方式的說明書的試劑盒。另外，本發(fā)明包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括包含選自下述的氨基酸序列的至少一個(gè)CDR CDR-VHl。^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID N0:63)，其中X1 是 G ；& 是 Y ；& 是 T 或 S ；& 是 F ；X5^T ；& 是 D;X7 是 Y ；& 是 N ；X9 是 I 或 L ；和X10 是 H。CDR-VH2。X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-XI5-XI6-Xit(SEQ ID N0:64)，其中X1 是 Y ；X2 是 I ；& 是 Y ；CDR-VH3。X1-X2-JC3-X4-)C5-X6-X7-X8-)C9-X1()(SEQ ID NO :6 ，其中&是P ；
&是Y ；
&是N;
X7 是 G ；
X8 是 I ；
X9 是 T ；
X10 是 G ；
X11 是 Y ；
)(12 是 N ；
X13 是 Q ；
X14 是 K ；
Xl5 是 F ；
)(16是1^;和
Xl7 是 So
CDR-VH3o X1-X2
&是0 ；
&是A或F ；
X3 是 Y ；
&是D ；
&是Y或S ;
&是D ；
X7 是 W、Y 或 A ；
X8 是 L ；
X9是A或T ；和
)(1(1是￥或D。
CDR-VLl。\「\
X1 是 R ；
&是A或T ；
X3 是 S ；
&是Q或K ；
&是S或N ；
&是I或V ；
X7 是 G ；
X8 是 τ ；
X9 是N;
X10是I ；和
X11是Y或H。
CDR-VL2。^C1-X
&是￥ ；
CDR-VLl0 X1 -X2-X3-X4-X5-X6-X7-Xr-VX1 η(SEQ ID NO :66)，其中
.2 八3八4八5八6八7 ‘
& 是 A 或 G ；)(3是3 或T;& 是 E ；& 是 S 或 R ；X6 是 I、L或 V;和X7 是 S、P 或 F。和CDR-VL3。^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID N0:68)，其中X1 是 Q ；& 是 Q ；& 是 S ；X4 是N;& 是 N ；)(6 是 W ；X7 是 P ；)(8是￥;和X9 是 T。附圖簡述圖1是顯示用于鑒定且產(chǎn)生對(duì)于肌鈣蛋白I具有改善的親和力的抗體的步驟的流程圖。圖2是野生型TnI 19C7單鏈可變片段(“scFv”)的核苷酸描述(SEQ ID NO :109 和 SEQ ID NO :110)。圖3顯示表達(dá)全長TnI 19C7單鏈可變片段(scFv)的酵母與稱為 scTnI-C-2 (Spectral Diagnostics, RP-3700)的單鏈肌鈣蛋白 I (沘-llOaa)-接頭-肌鈣蛋白C結(jié)合。更具體而言，該圖顯示TnI 19C7 scFv表達(dá)酵母與scTnI-C-2或抗V5—起溫育，隨后分別為抗肌鈣蛋白mAb和山羊抗小鼠藻紅蛋白(GAM:PE)(圖3B)或GAM:PE(圖 3A)。流式細(xì)胞術(shù)直方圖舉例說明如通過抗V5檢測的TnI 19C7 scFv的全長表達(dá)和TnI 19C7 scFv與scIW-C-〗結(jié)合的能力。PE-A單位(橫坐標(biāo))ΙΟ2、103、IO4和105。計(jì)數(shù)單位 (縱坐標(biāo)):102、IO3UO4 和 IO50圖4顯示TnI 19C7 scFv解離速率(off-rate)測量。更具體而言，表達(dá)TnI 19C7 scFv的酵母與飽和濃度的scTnI-C-2 —起溫育。細(xì)胞洗滌2次，并且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰，洗滌且與抗TnI mAb—起溫育。在30分鐘后，細(xì)胞再次洗滌且與山羊抗小鼠藻紅蛋白一起溫育。再次在30分鐘后，細(xì)胞洗滌且在流式細(xì)胞儀上分析。一階衰變方程用于擬合個(gè)別時(shí)間點(diǎn)，其中ml是在時(shí)間0時(shí)的理論最高限度平均熒光單位(“MFU”)，m2是解離速率(“koff”)，m3是由于自身熒光的本底MFU，并且其為時(shí)間x(x是被測量的時(shí)間)的 MO是獲得測量的時(shí)間χ。使用下述計(jì)算與TnI-C-2結(jié)合的TnI 19C7 scFv的半衰期(t1/2) t1/2 = ln2/k。ff。5乘半衰期是用于分選TnI 19C7 scFv⑶R誘變文庫的時(shí)間。圖5顯示 ιΙ 19C7 scFv平衡解離常數(shù)(KD)測量。更具體而言，表達(dá)TnI 19C7 scFv的酵母與不同濃度的scTnI-C-2—起溫育。細(xì)胞用PBS pH6. 8/2 % BSA/0. 02 %Standapol ES-I洗滌2次，并且與抗TnI mAb —起溫育30分鐘。細(xì)胞再次洗滌且與山羊抗小鼠藻紅蛋白一起溫育30分鐘。最后，細(xì)胞洗滌且在流式細(xì)胞儀上分析。圖6是顯示簡并寡核苷酸為何如此設(shè)計(jì)的示意描述，從而使得制備此種引物，以便對(duì)于每個(gè)CDR，70%核苷酸殘基保持為野生型殘基，并且30%是其他3種殘基的混合物。 對(duì)于每個(gè)文庫生成2種PCR產(chǎn)物摻料(sp) PCR產(chǎn)物和非摻料PCR產(chǎn)物。摻料和非摻料PCR 產(chǎn)物組合，以生成完整的⑶R誘變的scFv文庫。圖7是顯示TnI 19C7 scFv文庫如何使用酵母同源重組進(jìn)行構(gòu)建的示意描述。更具體而言，摻料的CDR PCR產(chǎn)物和切除的酵母展示載體轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母(S. cerevisiae) 菌株EBY100內(nèi)。在色氨酸缺陷葡萄糖培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化的克隆。圖8是顯示用于生成scFv構(gòu)建體的PCR弓丨物(tpVHfor直到tpVLrev)，用于生成⑶R摻料的文庫的那些(19HlSpfor直到pYD41reW)和用于生成組合文庫的那些 (19FRH2for至19FRL3)的概括(參見SEQ ID Nos:l_22)。引物的粗體和擴(kuò)大區(qū)域代表其中在制備引物時(shí)摻入“70%野生型、30%其他核苷酸混合物”的那些區(qū)域。此種“摻料的”引物生成在文庫內(nèi)的多樣性。圖9顯示如上文圖5中所述測定的所選TnI 19C7 scFv的平衡解離常數(shù)(KD)測量。圖10顯示作為抗原50% (Ag50)測量的相對(duì)抗體親和力的結(jié)果。通過將可變結(jié)構(gòu)域克隆到免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域上，將4個(gè)TnI 19C7克隆轉(zhuǎn)變成小鼠IgG2ak抗體?？贵w在瞬時(shí)HEK 294細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。Ag50是在其下50%最大限度信號(hào)的scTnl-C濃度，且代表所選1^11907 AM候選物的相對(duì)親和力分級(jí)。TnI 19C7 AMl例示與TnI 19C7野生型抗體相比較的最緊密相關(guān)的親和力。圖 11 舉例說明在 ARCHITECT 測定形式(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中TnI 19C7 AMI與scTnl-C結(jié)合的能力。TnI 19C7用吖啶錨(acridinium)標(biāo)記且使用抗TnI捕獲珠測定與scTnl-C的結(jié)合。(X =用給定校準(zhǔn)物濃度的scTnl-C生成的信號(hào)； X/A=校準(zhǔn)物X信號(hào)與校準(zhǔn)物A信號(hào)的比；RLU=相對(duì)光單位)。TnI 19C7 AMl在這個(gè)測定形式中顯示與野生型TnI 19C7抗體相比較，對(duì)于校準(zhǔn)物范圍更佳的結(jié)合。圖12舉例說明單克隆抗體iTnI 19C7 AMl的重(SEQ ID NO 25)和輕(SEQ ID NO 28)鏈以及特別地互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的核苷酸(SEQ ID NO 23、SEQ ID NO :24(互補(bǔ)體)、 SEQ ID NO丨6和SEQ ID NO :27(互補(bǔ)體))和編碼的氨基酸序列。圖13舉例說明在TnI 19C7⑶Rs的重和輕鏈內(nèi)可以由除圖12中所示那些外的氨基酸取代的位置(SEQ ID Nos 29-49)。發(fā)明詳述除非本文另有定義，連同本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語的含義和范圍應(yīng)當(dāng)清晰，然而，在任何潛在不明確性的情況下，本文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外來定義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。在本申請(qǐng)中，除非另有說明，“或”的使用意味著“和/或”。此外，術(shù)語“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同樣，除非另有具體說明，術(shù)語例如“元件”或“組分”涵蓋包含一個(gè)單位的元件和組分以及包含超過一個(gè)亞單位的元件和組分。一般地，連同本文描述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)以及蛋白和核酸化學(xué)和雜交使用的命名法和其技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。 除非另有說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知，且如各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來進(jìn)行，所述參考文獻(xiàn)在本說明書自始至終引用和討論。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書、如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如本文所述來進(jìn)行。連同本文描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)使用的命名法、以及其實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知和通常使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制、和遞送、以及患者治療。為了本發(fā)明可以更容易地理解，選擇的術(shù)語在下文定義。如本文使用的，術(shù)語“多肽”指氨基酸的任何聚合鏈。術(shù)語“肽”和“蛋白，，可與術(shù)語多肽互換使用，且同樣指氨基酸的聚合鏈。術(shù)語“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。術(shù)語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或來源不與天然結(jié)合的組分結(jié)合，所述天然結(jié)合的組分在其天然狀態(tài)下與其伴隨；基本上不含來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或在自然界中不存在。因此，化學(xué)合成或在不同于其天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然結(jié)合的組分“分離的”。還可以通過分離，使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得蛋白基本上不含天然結(jié)合的組分。如本文使用的，術(shù)語“回收”指通過分離，例如使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得化學(xué)種類例如多肽基本上不含天然結(jié)合的組分的過程。本發(fā)明還包括編碼本文所述抗體的可變輕和重鏈的分離的核苷酸序列(或其片段)以及具有這樣的序列的那些核苷酸序列(或其片段)，所述序列包括、對(duì)應(yīng)于、等同于、 可雜交至或互補(bǔ)于與這些編碼核苷酸序列至少約70% (例如70% 71%,72%,73%,74%, 75%、76%、77%、78% 或 79% )、優(yōu)選至少約 80% (例如 80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、 85%、86%、87%、88%或89%)、且更優(yōu)選至少約90% (例如 91 %、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100% )的同一性。(關(guān)于百分比同一性，在70%和100%之間且包括70%和100%的所有整數(shù)(及其部分)被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。)此種序列可以衍生自任何來源(例如從天然來源中分離的，經(jīng)由半合成途徑產(chǎn)生的，或從頭合成的)。特別地，此種序列可以從除實(shí)施例中所述外的來源中分離或獲得(例如細(xì)菌、真菌、藻類、小鼠或人)。除上述核苷酸序列外，本發(fā)明還包括本文所述抗體的可變輕和重鏈的氨基酸序列 (或這些氨基酸序列的片段)。進(jìn)一步地，本發(fā)明還包括這樣的氨基酸序列(或其片段)， 其包括、對(duì)應(yīng)于、等同于或互補(bǔ)于與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列至少約70% (例如70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78% 或 79% )、優(yōu)選至少約 80% (例如 80%、 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或 89% )、且更優(yōu)選至少約 90% 同一性(例 ta 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% )。(再次，關(guān)于百分比同一性，在70%和100%之間且包括70%和100%的所有整數(shù)(及其部分)(如與上述核苷酸序列同一性結(jié)合敘述的)被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。)為了本發(fā)明的目的，核苷酸序列的“片段”定義為對(duì)應(yīng)于指定的核苷酸序列區(qū)域的大約至少6、優(yōu)選至少約8、更優(yōu)選至少約10個(gè)核苷酸、且甚至更加優(yōu)選至少約15個(gè)核苷酸的鄰接序列。術(shù)語“同一性”指在特定比較窗或區(qū)段上在逐核苷酸基礎(chǔ)上的2個(gè)序列的相關(guān)性。因此，同一性定義為2個(gè)DNA區(qū)段(或2個(gè)氨基酸序列)的相同鏈(有義或反義)之間的相同、對(duì)應(yīng)或等價(jià)程度。“序列同一性百分比”通過下述進(jìn)行計(jì)算在特定區(qū)域上比較2個(gè)最佳比對(duì)的序列，測定在其上等同堿基或氨基酸在2個(gè)序列中出現(xiàn)的位置數(shù)目，以獲得匹配的位置數(shù)目，將此種位置數(shù)目除以待比較的區(qū)段中的位置總數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100。序列的最佳比對(duì)可以通過下述進(jìn)行Smith&Waterman，Appl. Math. 2 :482(1981) 的算法，Needleman&Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的算法，Pearson&Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 :2444 (1988)的方法和實(shí)現(xiàn)相關(guān)算法的計(jì)算機(jī)程序(例如 Clustal Macaw Pileup(http//cmRm. Stanford. edu/biochem218/ll Multiple, pdf ； Higgins 等人，CABI0S. 5L151-153 (1989))、FASTDB(Intelligenetics)、BLAST (National Center for Biomedical Information ；Altschul 等人’ Nucleic Acids Research 25 3389-3402(1997))、PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI)或 GAP、BESTFIT、 FASTA 禾口 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. O, Genetics Computer Group，Madison，WI)。(參見美國專利號(hào) 5，912，120。)為了本發(fā)明的目的，“互補(bǔ)性”定義為2個(gè)DNA區(qū)段之間的相關(guān)性程度。它通過測量在合適條件下一個(gè)DNA區(qū)段的有義鏈與另一個(gè)DNA區(qū)段的反義鏈雜交以形成雙螺旋的能力進(jìn)行測定?！盎パa(bǔ)體”定義為基于規(guī)范堿基配對(duì)規(guī)則與給定序列配對(duì)的序列。例如，在一條核苷酸鏈中的序列A-G-T與另一條鏈中的T-C-A “互補(bǔ)”。在雙螺旋中，腺嘌呤在一條鏈中出現(xiàn)，胸腺嘧啶在另一條鏈中出現(xiàn)。類似地，無論哪里在一條鏈中發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤，在另一條中就發(fā)現(xiàn)胞嘧啶。2個(gè)DNA區(qū)段的核苷酸序列之間的相關(guān)性越大，2個(gè)DNA區(qū)段的鏈之間形成雜交雙鏈體的能力越大。2個(gè)氨基酸序列之間的“相似性”定義為在2個(gè)序列中一系列等同以及保守氨基酸殘基的存在。2個(gè)氨基酸序列之間的相似性程度越高，2個(gè)序列的對(duì)應(yīng)、相同或等價(jià)越高。 (2個(gè)氨基酸序列之間的“同一性”定義為在2個(gè)序列中一系列確切相同或不變的氨基酸殘基的存在。)“互補(bǔ)性”、“同一性”和“相似性”的定義是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的?！坝?.....編碼”指編碼多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含來
自由核酸序列編碼的多肽的至少3個(gè)氨基酸、更優(yōu)選至少8個(gè)氨基酸、和甚至更加優(yōu)選至少 15個(gè)氨基酸的氨基酸序列。如本文使用的，“生物學(xué)活性”指針對(duì)肌鈣蛋白I的抗體或肌鈣蛋白I的所有固有生物學(xué)特性。此種特性包括例如抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合的能力和本文描述的功能上相關(guān)的抗體。如本文使用的，關(guān)于抗體、蛋白、或肽與第二種化學(xué)種類相互作用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”，意指相互作用取決于化學(xué)種類上特定結(jié)構(gòu)(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識(shí)別且與特定蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合而不是一般地與蛋白結(jié)合。如果抗體對(duì)表位“A”特異，那么在包含標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中，包含表位A的分子(或游離的，未標(biāo)記的A)的存在將減少與抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量。如本文使用的，術(shù)語“抗體”廣泛地指包含4條多肽鏈-2條重(H)鏈和2條輕(L) 鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位結(jié)合特征的任何功能片段、突變體、變體或衍生。此種突變體、變體或衍生抗體實(shí)體是本領(lǐng)域已知的，其非限制性實(shí)施方案在下文討論。在全長抗體中，每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，用稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的較保守區(qū)域點(diǎn)綴。每個(gè) VH和VL由3個(gè)⑶Rs和4個(gè)FRs組成，以下列順序從氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和IgY)、種類(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類，并且可以來自任何物種(例如小鼠、人、雞、大鼠、兔、羊、鯊魚和駱駝科動(dòng)物(camelid))。本發(fā)明的抗體的⑶Rs顯示于下表1和2中表1 關(guān)于 TnI 19C7 AMl 的重鏈的 CDRs
權(quán)利要求
1.一種中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，稱為TnI 19C7 AMI hGl CHO 204，由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)指定保藏號(hào)PTA-9816。
2.一種通過權(quán)利要求1的所述CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的重組抗體。
3.一種包括與肌鈣蛋白I結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括包含選自下述的氨基酸序列的至少一個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(OtR) =GYTFTDYNLH(SEQ ID NO :52)、YIYPYNGITGYNQKFKS(SEQ ID NO 53)、DAYDYDYLTD (SEQ ID NO :54)、 RTSKNVGTNIH(SEQ ID NO :55)、YASERLP(SEQ ID NO :56)和 QQSNNWPYT(SEQ ID NO :57)。
4.權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包括至少3個(gè)CDRs。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包括至少6個(gè)CDRs。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白，其進(jìn)一步包括人接納體構(gòu)架。
7.一種編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變重鏈的氨基酸序列與SEQ ID NO. :25具有至少70%同一性。
8.權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變輕鏈的氨基酸序列與SEQ ID NO. J8具有至少70%同一性。
9.一種編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變重鏈的氨基酸序列是 SEQ ID NO. :25。
10.一種編碼結(jié)合蛋白的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白的可變輕鏈的氨基酸序列是 SEQ ID N0. :28ο
11.權(quán)利要求10的分離的核酸分子，其中所述結(jié)合蛋白進(jìn)一步包括包含SEQID Ν0. 25的氨基酸序列的可變重鏈。
12.一種包括SEQ ID NO. :25的氨基酸序列的分離的結(jié)合蛋白。
13.—種包括SEQ ID NO. 的氨基酸序列的分離的結(jié)合蛋白。
14.一種包括權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的所述分離的核酸分子的載體。
15.一種包括權(quán)利要求14的所述載體的分離的宿主細(xì)胞。
16.一種產(chǎn)生能夠與肌鈣蛋白I結(jié)合的結(jié)合蛋白的方法，其包括在足以產(chǎn)生所述結(jié)合蛋白的時(shí)間和條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15的所述宿主細(xì)胞。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的方法產(chǎn)生的分離的蛋白質(zhì)。
18.—種藥物組合物，包括權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。
19.一種檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟a)在足以形成抗體/抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述測試樣品與抗體接觸，所述抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合并且包括SEQ ID N0. 25的氨基酸序列；和b)檢測所述復(fù)合物的存在，所述復(fù)合物的存在指示所述測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包括SEQID NO. 的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗體通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO細(xì)胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 產(chǎn)生。
22.—種檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟a)在足以形成第一種抗體/抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述測試樣品與第一種抗體接觸，所述第一種抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合并且包括SEQ ID NO 25 ；b)在足以形成第一種抗體/抗原/第二種抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，將綴合物添加到所述第一種抗體/抗原復(fù)合物中，其中所述綴合物包括與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著的第二種抗體；和c)檢測通過所述信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)的存在，所述信號(hào)的存在指示所述測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述第一種抗體進(jìn)一步包括SEQID NO :28。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述第一種抗體通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO 細(xì)胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 產(chǎn)生。
25.一種檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟a)在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使肌鈣蛋白I抗原與針對(duì)肌鈣蛋白I的抗體接觸，其中所述抗體包括SEQ ID NO :25的氨基酸序列，并且由能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物標(biāo)記；b)在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體/肌鈣蛋白I測試樣品抗原復(fù)合物的時(shí)間和條件下，將所述測試樣品添加到所述肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物中；和c)檢測通過所述信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)的存在，所述信號(hào)的存在指示所述測試樣品中肌鈣蛋白I抗原的存在。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包括SEQID NO :28的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求M的方法，其中所述抗體通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO細(xì)胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 細(xì)胞系產(chǎn)生。
28.一種檢測測試樣品中的肌鈣蛋白I抗原的方法，其包括步驟a)在足以形成肌鈣蛋白I參考抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述測試樣品與 1)肌鈣蛋白I參考抗原和2、針對(duì)肌鈣蛋白I抗原的抗體接觸，其中所述抗原與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著，且其中所述抗體包括SEQ ID N0:25的氨基酸序列；和b)檢測通過所述信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)，其中所述測試樣品中檢測到的肌鈣蛋白 I抗原的量與結(jié)合所述抗體的肌鈣蛋白I參考抗原的量成反比。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述抗體進(jìn)一步包括SEQID NO :28的氨基酸序列。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述抗體通過具有ATCC保藏指名PTA-9816的CHO細(xì)胞系 TnI 19C7 AMI hGl CHO 204 產(chǎn)生。
31.一種診斷懷疑具有這些狀況之一的患者中的急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的方法，其包括步驟a)從所述患者中分離生物學(xué)樣品；b)在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述生物學(xué)樣品與抗體接觸，所述抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合且包括SEQ ID NO 25的氨基酸序列；c)檢測所述肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的存在；d)使所述復(fù)合物中存在的所述肌鈣蛋白I抗原與所述復(fù)合物中存在的所述抗體解離；和e)測量所解離的肌鈣蛋白I抗原的量，其中大于正常群體第99百分位的肌鈣蛋白I值約1-5倍的肌鈣蛋白I抗原的量指示所述患者中急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的診斷。
32.—種診斷懷疑具有這些狀況之一的患者中的急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的方法，其包括步驟a)從所述患者中分離生物學(xué)樣品；b)在足以形成肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物的時(shí)間和條件下，使所述生物學(xué)樣品與第一種抗體接觸，所述第一種抗體與肌鈣蛋白I結(jié)合且包括SEQ ID NO 25的氨基酸序列；c)在足以允許綴合物與結(jié)合的肌鈣蛋白I抗原結(jié)合的時(shí)間和條件下，將所述綴合物添加到所得到的肌鈣蛋白I抗原/抗體復(fù)合物中，其中所述綴合物包括與能夠生成可檢測信號(hào)的信號(hào)生成化合物附著的第二種抗體；d)通過檢測通過所述信號(hào)生成化合物生成的信號(hào)，檢測所述生物學(xué)樣品中可能存在的肌鈣蛋白I抗原的存在；和e)通過測量所述信號(hào)的強(qiáng)度，測量所述測試樣品中存在的肌鈣蛋白I抗原的量，大于正常群體第99百分位值約1-5倍的肌鈣蛋白I抗原的量指示所述患者中急性冠狀動(dòng)脈綜合征或心肌梗死的診斷。
33. 一種試劑盒，其包括包含權(quán)利要求2的所述重組抗體或權(quán)利要求3的所述結(jié)合蛋白的容器。
34.
35. 一種包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括包含選自下述的氨基酸序列的至少一個(gè)⑶R CDR-VHl· A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:63)，其中X1 是 G ；X2 是 Y ；X3是T或S ；X4是？；&是丁 ；&是0 ；X7是 Y;&是1X9是I或L ；和Xio 是 H.CDR-VH2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-VX8-X9-XIO-Xii-XI2-XI3-XI4-XI5-XI6-XI7(SEQ ID N0:64)，其中 &是I ； )(4是？；X7 是 G; &是I ； X9 是 T ； X10 是 G ；A1是Y X12 是 N )(13是0 )(14是1( X15 是 F X16^K Xl7 是 S.CDR-VH3. ^C1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11 (SEQ ID NO :66)，其中X2是A或F ；)(4是0 ；X5是Y或S ；&是0 ；X7 是 W、Y 或 A ；X8 是 L ；X9是A或T ；和Xltl 是 Y 或 D.CDR-VL1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID N0:66)，其中 X1 是 R ； X2是A或T ； X3 是 S ； X4是Q或K X5是S或N X6是I或V X7 是 G ； Xs 是 T ； X9 是N; X10是I ；和 X11是Y或H.CDR-VL2. A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10 (SEQ ID N0:67)，其中X2是A或G ； X3是S或T ； X4 是 E ； X5是S或R ； 父6是I、L或V ；和 X7 是 S、P 或 F. 禾口CDR-VL3. A-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID N0:68)，其中&是Q; ；&是1 )(6是1; X7 是 P ； X8是Y ；和 Xg 是 T。
36.權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白選自免疫球蛋白分子、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR嫁接的抗體、人源化抗體、Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、單結(jié)構(gòu)域抗體、雙抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體、抗獨(dú)特型抗體、雙特異性抗體及其功能上活性的表位結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)肌鈣蛋白I的抗體及其使用方法。特別地，此種抗體可以用于檢測患者中的肌鈣蛋白I，并且還可以用于例如心肌梗死或急性冠狀動(dòng)脈綜合征的診斷中。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102421795SQ201080017906
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者D·黃, J·D·泰納, R·N·齊曼, S·E·布羅菲, 涂伯林 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司