專利名稱：運(yùn)載新城疫病毒的禽疫苗的制作方法
運(yùn)載新城疫病毒的禽疫苗援引加入本申請要求2009年4月3日提交的US臨時(shí)申請系列No. 61/166，481的權(quán)利。技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括運(yùn)載NDV的禽疫苗或組合物，尤其是禽流感疫苗。疫苗可為經(jīng)加工的
禽疫苗。
背景技術(shù)：
近年的幾項(xiàng)研究點(diǎn)燃了新城疫病毒(NDV)用作禽疾病的疫苗載體的潛力 (Krishnamurthy et al.，Virology 278，168—182，2000 ；Huang et al.，J.Gen. Virol. 82, 1729-1736,2001 ；Nakaya et al. , J. Virol. 75,11868-11873,2001 ；Park et al. PNAS 103,8203-8208,2006 ；Veits et al PNAS 103，8197-8202，2006 ;Ge et al. J. Virol. 81, 150-158,2007 ;Romer-Oberdorfer et al. Vaccine 26，2307—2313，2008)。NDV屬于副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)和禽副粘病毒屬(Avulavirus)。NDV 在呼吸和消化道中，在輸卵管中，及對于一些分離物，在神經(jīng)系統(tǒng)中復(fù)制。傳播是產(chǎn)氣的，且通過口及糞便途徑。NDV導(dǎo)致高度接觸傳染及致死的疾病，其影響全部物種的鳥，及可感染一些哺乳動(dòng)物種。疾病可從臨床不明顯變化到高度強(qiáng)毒形式，依賴于病毒株和宿主物種。 由NDV株顯示的毒力的連續(xù)譜致使將它們分為3種不同致病型組緩發(fā)型，中發(fā)型及速發(fā)型(Alexander, D. J.，Diseases of Poultry, Iowa State Uni· Press，Ames IA，541-569， 1997)。緩發(fā)型株通常不在成年雞中導(dǎo)致疾病，且在美國和其他國家在家禽工業(yè)中作為活疫苗廣泛使用。中間毒力的病毒稱之為中發(fā)型，而導(dǎo)致高死亡率的病毒稱之為速發(fā)型。疾病具有世界性分布，且對商業(yè)家禽生產(chǎn)保持恒定的主要威脅。NDV基因組是約151Λ的RNA的非-分段的陰性鏈?；蚪MRNA含有編碼依序以下蛋白的6個(gè)基因核殼蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，融合蛋白(F)，血細(xì)胞凝集素-神經(jīng)酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)。P基因轉(zhuǎn)錄期間通過RNA編輯產(chǎn)生未知的功能的 2 種額外的蛋白，V 和 W(Steward et al.，1993，Journal of General Virology 74: 2539-2547)。近年建立了自克隆的cDNA完全恢復(fù)非-分段的陰性RNA病毒的方法的開發(fā)，開啟了遺傳操作此病毒組，包括 NDV 的可能性(Conzelmann，K. K. ,Ann. Rev. Genet. 32，123-162， 1998 ；Roberts and Rose, Virology 247，1-6，1998)。此獨(dú)特分子遺傳方法，稱之為“反向遺傳學(xué)”，提供不僅研究各種病毒-編碼的基因的功能的手段(Palese et al. , PNAS 93， 11354-11358,1996 ；Nagai, Y.，Rev. Med. Virol. 9，83-99，1999)，而且允許使用這些病毒來表達(dá)異源基因(Bukreyev et al.，J. Virol. 70，6634-6641，1996 ；Mebatsion et al.，PNAS 93,7310-7314,1996 ；Schnell et al. ,PNAS 93,11359-11365,1996 ；Hasan et al. , J. Gen. Virol. 78,2813-2820,1997 ；He et al. ,Virology 237,249-260,1997 ；Sakai et al. ,FEBS Lett. 45，221-226，1999)。此提供產(chǎn)生改善的疫苗和疫苗載體的新方法。
2個(gè)獨(dú)立小組在1999年同時(shí)報(bào)道了基于NDV的緩發(fā)型疫苗株(LaSota)自克隆的 cDNA 恢復(fù)系統(tǒng)(Peeters et al.，1999 ；Romer-Oberdorfer et al.，1999)。在第 1 報(bào)道的系統(tǒng)中，將自LaSota株(ATCC-VR699)的全長NDV cDNA組裝進(jìn)含有T7DNA-依賴性-RNA聚合酶啟動(dòng)子的P0LTV5轉(zhuǎn)錄載體。將NDV轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物的個(gè)體克隆(NP，P和L)在真核表達(dá)載體中克隆。共轉(zhuǎn)染流程在感染的單層細(xì)胞中產(chǎn)生了幾個(gè)感染中心(Peeters et al., J. Virol. 73，5001-5009，1999)。第2系統(tǒng)報(bào)道了自克隆的cDNA的緩發(fā)型NDV的恢復(fù)，基本上使用組裝全長反基因鏈表達(dá)質(zhì)粒及支持質(zhì)粒的相同的策略(Romer-Oberdorfer et al.， Journal of General Virology, 80, 2987-2995,1999) 最近開發(fā)其他系統(tǒng)來恢復(fù) NDV 的緩發(fā)型HitchnerBl (Nakaya等人，2001)或LaSota株(Huang等人，2001)。可對于重組體中發(fā)型NDV的恢復(fù)有用的系統(tǒng)僅被Krishnamurthy等人描述Q000)。此系統(tǒng)利用痘苗病毒重組(MVA)和用于轉(zhuǎn)染的HEP-2細(xì)胞。使用中發(fā)型株Beaudette C的全長克隆和自相同的株的支持質(zhì)粒(N，P和L)用于轉(zhuǎn)染。將編碼CAT報(bào)告子基因的額外的轉(zhuǎn)錄單元放置在HN和 L基因之間。表達(dá)CAT基因的rNDV的生長延遲及病毒衰減。CAT報(bào)告子基因在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定地表達(dá)幾代。禽流感(AIV)，有時(shí)稱之為禽流感(Avian flu)，且通常認(rèn)識為鳥流感，指由適應(yīng)于鳥的流感病毒導(dǎo)致的流感。AIV是分段的，單-鏈，負(fù)義RNA病毒，屬于正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)，及分類為A型流感病毒。A型病毒是動(dòng)物和人流感的最頻繁的病原。 此類型在主要基于2種表面脂質(zhì)-包裹的膜蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)分化的許多株或亞型中發(fā)生。HA，輔助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，及NA輔助后代病毒從感染的細(xì)胞釋放 (de Jong et al. ,J Clin Virol.35(1) :2-13, 2006) A 型病毒流感基于它們的特定 HA 和 NA含量分為亞型。有16種不同HA亞型，及9種不同NA亞型。許多不同HA和NA蛋白的組合是可能的。流感A病毒亞型根據(jù)它們的HA和NA表面蛋白命名。例如，“H7N2病毒”指具有H7亞型的HA蛋白和自N2亞型的NA蛋白的流感A亞型。類似地，“H5m ”病毒具有H5 亞型的HA和自附亞型的NA。H5W亞型特別相關(guān)于新近在亞洲，俄羅斯，中東，歐洲和非洲的暴發(fā)(Olsen et al.，Science21 ；312 (5772) :384-8,2006) 流感A病毒可感染人，豬，馬，海豹，鯨，家禽，貓，狗，雪貂及其他動(dòng)物，但野生鳥是它們的天然的宿主。水生鳥構(gòu)成主要流感攜帶者，由此病毒系進(jìn)化及適應(yīng)它們的宿主，例如，人，豬及馬流感。宿主特異性不是絕對的，且物種間傳播可發(fā)生，如通過高度病原性禽流感(HPAI)H5W亞型感染人，貓，狗和豬物種的能力例證。高度病原性流感A病毒亞型H5m病毒是全球關(guān)心的作為潛在流行病威脅的新出現(xiàn)的禽流感病毒。H5m已經(jīng)在越來越多的貫穿亞洲，歐洲和非洲的國家殺了幾百萬家禽。 不像B型流感，A型流感經(jīng)歷抗原位移(至少2種不同株的病毒組合而形成新亞型)，且流行病學(xué)家，感染性疾病研究者，及其他健康專家急切關(guān)注，人流感病毒和禽流感病毒(尤其 H5N1)的共-存在可提供遺傳物質(zhì)在物種-特異性病毒之間交換的機(jī)會(huì)，可能創(chuàng)建容易傳染禾口對人致死的新強(qiáng)毒、流感株(Food Safety Research Information Office. “ A Focus on Avian Influenza" . Created May 2006, Updated November 2007)。由于在1997年發(fā)生首次H5m暴發(fā)，已有越來越多的HPAI H5W鳥-至-人傳播導(dǎo)致臨床嚴(yán)重的和致死的人感染。但是，因?yàn)橛续B和人之間存在的顯著物種屏障，病毒不容易跨到人。盡管自其被發(fā)現(xiàn)，幾百萬的鳥已被所述病毒感染，在印度尼西亞，老撾，越南，羅馬尼亞，中國，土耳其和俄羅斯總共僅約200人死于禽流感?？紤]到動(dòng)物，包括人對AIV的的感受性，防止AIV感染及保護(hù)動(dòng)物的手段是必要的。因此，有對抵抗流感的有效疫苗的需求。本申請中任何文獻(xiàn)的引用或鑒定不是認(rèn)可該文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于申請人的發(fā)現(xiàn)，由新城疫病毒(NDV)的向腸AVINEW 株表達(dá)的AIV 血凝素基因在禽中是高度免疫原性的。本發(fā)明涉及運(yùn)載NDV的禽疫苗或組合物，其可包含有效量的具有固有腸向性的經(jīng)加工的NDV載體，其包含及表達(dá)某些禽抗原，更特別禽流感抗原，及藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。向腸NDV可為由Merial Limited商業(yè)化的AVINEW 修飾的活疫苗的 NDV 株。禽流感抗原可為血凝素。禽流感HA抗原可為自H5亞型的HA。本發(fā)明也涉及免疫接種禽的方法，包括給禽施用有效量的疫苗，其可包含有效量的重組NDV載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。施用可通過卵內(nèi)，眼滴，噴霧，飲用水或腸胃外(皮下，肌內(nèi)，經(jīng)皮)施用。本發(fā)明涉及修飾Avinew NDV的基因組來產(chǎn)生經(jīng)加工的Avinew NDV的方法，其中方法包括在Avinew NDV基因組的非必要區(qū)內(nèi)將分離的多核苷酸導(dǎo)入Avinew NDV基因組。 非必要區(qū)可為編碼非必要蛋白的開放閱讀框或開放閱讀框的非-必要的部分；或位于NP基因上游的非翻譯(或非-編碼)區(qū)，或2個(gè)基因(基因間區(qū))之間，或自Avinew NDV基因組的L基因的下游。本發(fā)明還涉及使用初施-追施流程施用疫苗或組合物。本發(fā)明涉及在施用可包含有效量的經(jīng)加工的NDV載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)的本發(fā)明的疫苗之前，用禽流感疫苗初施禽?；蛘?，本發(fā)明還涉及在施用禽流感疫苗之前，用本發(fā)明的疫苗 (表達(dá)至少一種禽流感抗原的經(jīng)加工的NDV載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體)初施。本發(fā)明還包括實(shí)施引發(fā)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的試劑盒，其可包含任何一種重組流感免疫學(xué)組合物或疫苗，或滅活的免疫學(xué)組合物或疫苗，及用于實(shí)施方法的使用說明。因此，本發(fā)明的目的是不在本發(fā)明之內(nèi)包括任何之前知道的產(chǎn)品，制造產(chǎn)品的方法，或使用產(chǎn)品的方法，以至于申請人保留權(quán)益及由此公開放棄任何之前知道的產(chǎn)品， 處理或方法。還應(yīng)注意，本發(fā)明不旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)包括不符合書面描述及啟動(dòng) USPTO(35U. S. C. § 112，第1段落)或EPO(EPC的第83條)要求的任何產(chǎn)品，處理或產(chǎn)品的制造或使用產(chǎn)品的方法，以至于申請人保留權(quán)益及由此公開放棄任何之前描述的產(chǎn)品，制造產(chǎn)品的方法，或使用產(chǎn)品的方法。這些和其他實(shí)施方式被以下詳述公開或顯而易見和含蓋。
以下詳述，通過例的方式給出，但不旨在單獨(dú)限制本發(fā)明到描述的特定實(shí)施方式， 可通過附圖最好理解，其中圖IA描繪全長NDV基因組的遺傳圖譜；圖IB描繪顯示有流感HA插入到2個(gè)代表性轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)到全長NDV基因組的2種經(jīng)加工的NDV的遺傳圖譜的圖譜；圖IC是NDV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的流程圖的例；圖ID描繪使用NDV反向遺傳學(xué)恢復(fù)經(jīng)加工的NDV感染性粒子的方式。圖2描繪將AVINEW全基因組克隆到用于反向遺傳學(xué)開發(fā)的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和允許容易轉(zhuǎn)基因克隆的獨(dú)特限制性位點(diǎn)(I^acI&Fsel)插入到P和M基因之間的示意圖。圖3描繪質(zhì)粒pIV(^9的質(zhì)粒圖譜。圖如 4ο提供質(zhì)粒pIV0291的插入子序列。斜體字指非AVINEW 序列，及加下劃線的斜體字指P和M基因之間的內(nèi)部I^cl-Fsel插入，斜體字指HDV核酶(3’端)及加下劃線的斜體字指Τ7啟動(dòng)子(5’端)和終止子(3’端)。在圖譜中指出轉(zhuǎn)錄開始序列(GS =基因開始)和轉(zhuǎn)錄終止序列(GE =基因結(jié)束)，及給序列加了下劃線。環(huán)繞的T (圖如中的第3190位)指環(huán)繞的核苷酸(在I^acl-Fsel插入之前)這是組裝的AVINEW 基因組進(jìn)轉(zhuǎn)錄載體的T (SEQ ID NO 24的第3190位)(T來自用于創(chuàng)建PacI和FseI限制性位點(diǎn)的引物)。在共有AVINEW 基因組(SEQ ID NO=D中，在對應(yīng)第3150位的核苷酸是C。圖5描繪質(zhì)粒pIV32的質(zhì)粒圖譜。圖6描繪質(zhì)粒pIV33的質(zhì)粒圖譜。圖7描繪質(zhì)粒pIV034的質(zhì)粒圖譜。圖8描繪質(zhì)粒pNS151的質(zhì)粒圖譜。圖9描繪將AIV HA基因經(jīng)NDV插入盒導(dǎo)入NDV基因組的示意方法。圖10描繪質(zhì)粒pIV039的質(zhì)粒圖譜。圖IlA和IlB描繪由經(jīng)加工的NDV vAVW02的HA表達(dá)。將不含有插入子的vAVWOl 用作陰性對照。通過病毒-接種的含胚的蛋的尿囊液中(圖IlA中的左圖)或自感染的CHO 細(xì)胞裂解物(圖IlA的右圖)的蛋白印跡或通過感染的CHO細(xì)胞中的免疫熒光(圖11B) 使用對感染的CHO細(xì)胞的抗-H5陽性雞血清檢測HA表達(dá)。圖12顯示分配給DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。圖13描繪免疫接種的SPF層的不同組的一日齡雞后代中的抗-NDV和抗-AI (針對H5m C12或H5N9LP抗原)母源的抗體(MDA)HI滴度。圖14描繪評估SPF雞中由經(jīng)加工的NDV誘導(dǎo)的禽流感保護(hù)的疫苗接種/攻擊時(shí)間線及流程。圖15顯示在日齡用vAVW01(v01或01 ；無插入的基因)或vAVW03 (v03或03 ；AI HA插入子)免疫接禾中的無MDA (SPF)或NDV MDA (21A)，或NDV和H5MDA或H5僅MDA (21B) 雞的死亡率的動(dòng)力學(xué)表。 圖16描繪自用vAVWO 1或vAVW03免疫接種的無(SPF)或有MDA的雞中的口(&C) 和泄殖腔(B&D)拭子的AIV脫落的比較。C和D中的結(jié)果表示為在不同時(shí)間點(diǎn)攻擊之后， vAVWOl-免疫的雞的HPAI H5N1攻擊脫落和vAVW03_免疫的雞的那些的平均水平之間的以 IoglO的比。圖17描繪疫苗接種(D21)之后和攻擊￠3 之后對vAVW03_誘導(dǎo)的AIV HI滴度 (使用 H5N9 (A)或 H5m 分化體 2. 2 (B)抗原)的 NDV MDA 效應(yīng)(SPF 無 MDA ；NDV 抗-NDV MDA) 0書寫在圖上的編號對應(yīng)于測試的陽性血清/總和的編號。在NDV MDA存在下，相比無NDV MDA的SPF雞中的結(jié)果，AIV HI滴度在疫苗接種之后更高且在攻擊之后不增加。圖 18 描繪在無 MDA (SPF)，AI H5N9 禾口 NDV MDA (H5N9+NDV), NDV MDA(NDV)或 AIH5N1 (H5N1)MDA ；NDV MDA 的雞中用 vAVWOl 或 vAVW03 疫苗接種后(在 D0)D21NDV HI 滴度對由vAVWOl或vAVW03誘導(dǎo)的NDV HI滴度水平不具有負(fù)面效應(yīng)。圖 19 描繪在 DO 和 D21 用 AVINEff(Gl)，vAVW02 (G2)和 vAVW03 (G3) 2 次疫苗接種后的NDV HI滴度。圖20描繪在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接種后的AI H5N1HI滴度。圖21描繪在DO和D21用vAVW02 (G2)或vAVW03 (G3) 2次疫苗接種后的AI H5N1SN 滴度。圖22A和22B分別描繪通過vAVW03的1次(在DO)或2次(在DO和D14)眼滴劑施用誘導(dǎo)的NDV HI滴度和AIV SN滴度。圖23A 23D描繪自未疫苗接種的(組1)或免疫接種的(組2 在D0，1次施用 vAVW03 ；組 3 在 DO 禾Π D14 2 次施用 vAVW03 ；組 4 在 DO 用 vFP89 和在 D14 用 vAVW03 初施-追施)在第觀天用HPAIH5m分離物攻擊的俄國小鴨的口咽(A和C)和泄殖腔(B和 D)拭子中的病毒載量(A和B)及陽性樣品的百分率(C和D)的動(dòng)力學(xué)。圖24A 24D描繪自未疫苗接種的(組1)或免疫接種的(組2 1次施用vAVW03 在DO ；組3 :2次施用vAVW03在DO和D14 ；組4 在DO用vFP89和在D14用vAVW03初施-追施)在第42天用HPAIH5m分離物攻擊的俄國小鴨的口咽(A和C)和泄殖腔(B和D)拭子中的病毒載量(A和B)及陽性樣品的百分率(C和D)的動(dòng)力學(xué)。圖25提供在氨基酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之間的序列比對。圖沈提供在核酸水平禽流感HA蛋白和序列同一性百分率之間的序列比對。發(fā)明詳述需知，在此公開中和特別在權(quán)利要求和/或段落中，術(shù)語例如“包括 (comprises) ”，“包括(comprised) ”，“包括(comprising) ”等可具有美國專利法中規(guī)定的含義；例如，它們可表示“包括(includes)”，“包括(included) ”，“包括(including) ”，等； 及that術(shù)語例如“基本上由...組成(consisting essentially of) ”和“基本上由...組成(consists essentially of) ”具有美國專利法中規(guī)定的含義，例如，它們允許因素不明確地?cái)⑹?，但排除見于現(xiàn)有技術(shù)或影響本發(fā)明的基本或新特征的因素。除非另外解釋，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。除非背景明顯另外指示，單數(shù)術(shù)語“a”，“an”和“the”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。類似地，詞匯“或”旨在包括“及”，除非背景明顯另外指示。在本發(fā)明中，將AVINEW疫苗株用作載體。AVINEff是世界上廣泛使用的活NDV疫苗 (Merial Limited)。此疫苗株①天然地?zé)o毒力及呈現(xiàn)雙呼吸和腸向性。此外，AVINEW株屬于可感染鴨的NDV基因組(II類，基因型I)。相比LaSota (其向性基本上針對呼吸道)，其不誘導(dǎo)呼吸性副反應(yīng)。本發(fā)明涉及可包含有效量的經(jīng)加工的NDV載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)的禽疫苗。本發(fā)明包括任何表達(dá)在動(dòng)物，例如禽中引發(fā)免疫原性應(yīng)答的蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的經(jīng)加工的NDV載體。蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可為流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如但不限于在動(dòng)物，例如禽中引發(fā)，誘導(dǎo)或刺激應(yīng)答的蛋白，多肽，肽或其片段。說道“動(dòng)物”期望是哺乳動(dòng)物，鳥，等。動(dòng)物或宿主包括哺乳動(dòng)物和人。動(dòng)物可選自馬(例如，馬)，狗(例如、狗、狼、狐、山狗、豺)，貓(例如，獅、虎、家養(yǎng)貓、野生貓、其他大貓、及其他貓包括獵豹和山貓)，綿羊(例如，綿羊)，牛(例如，牛)，豬(例如，豬)，禽(例如，雞、鴨、鵝、火雞、鵪鶉、雉雞、鸚鵡、雀、鷹、烏鴉、鴕鳥、鴯鹋和鶴鴕)，靈長類動(dòng)物(例如， 狐猴、跗猴、猴、長臂猿、猿)和魚。術(shù)語“動(dòng)物”也包括在全部發(fā)育階段，包括胚胎和胚胎階段的個(gè)體動(dòng)物。在一實(shí)施方式中，禽流感免疫學(xué)組合物或疫苗包含經(jīng)加工的載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的賦形劑，載體或媒質(zhì)。經(jīng)加工的載體可為可包含編碼流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的NDV表達(dá)載體。流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，可為血凝素，基質(zhì)蛋白，神經(jīng)氨酸酶，非結(jié)構(gòu)性蛋白，核蛋白，聚合酶或其任何片段。在另一實(shí)施方式中，流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于經(jīng)流感或禽流感株感染的禽。禽流感蛋白，抗原，表位或免疫原可為血凝素(HA)例如但不限于HA前體，H1， H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 或 H16 蛋白，基質(zhì)蛋白(例如但不限于基質(zhì)蛋白Ml或M2)，神經(jīng)氨酸酶(例如但不限于NAl，NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7， NA8或NA9)，非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白(例如但不限于NSl或NS2)，核蛋白(NP)和聚合酶(例如但不限于PA聚合酶，PBl聚合酶1或PB2聚合酶2)。禽流感抗原可為血凝素，例如H5HA。在一實(shí)施方式中，H5分離自H5WA/火雞/ 土耳其/1/2005(分化體2.幻，A/雞/印度尼西亞/7/2003(分化體2. 1)，A/鴨/老撾 /3295/2006 (分化體 2. 3)，A/ 雞 / 西爪哇 /PWT-ffIJ/2006 (分化體 2. 1)株。在另一實(shí)施方式中，禽流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原可源于經(jīng)源自任何亞型的新近分離物的流感或禽流感株感染的禽。本文使用的術(shù)語“抗原”或“免疫原”是指在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)特定免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖砂瑲⑺赖?，衰減的或活的全生物；生物的亞單位或部分；含有表達(dá)有免疫原性性質(zhì)的表位，多肽，肽，蛋白或其片段的插入子的重組載體；呈遞給宿主動(dòng)物后能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的核酸的碎片或片段；蛋白，多肽，肽，表位，半抗原，或其任何組合?；蛘撸庖咴蚩乖砂舅鼗蚩苟舅?。本文使用的術(shù)語“免疫原性蛋白或肽”也包括免疫學(xué)活躍的肽和多肽，意為一旦施用到宿主，其能引發(fā)針對蛋白的體液和/或細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答。優(yōu)選蛋白片段為其與總蛋白具有基本上相同的免疫學(xué)活性。由此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段包含至少一個(gè)表位或抗原決定簇，或基本上由其組成或由其組成。術(shù)語表位，也稱為抗原決定簇，是被免疫系統(tǒng)識別的及能誘導(dǎo)體液類型(B細(xì)胞)和/或細(xì)胞類型(T細(xì)胞)的免疫反應(yīng)的大分子的部分。術(shù)語“免疫原性蛋白或肽”還涵蓋序列的缺失，添加和置換，只要多肽如本文定義發(fā)揮產(chǎn)生免疫學(xué)應(yīng)答的功能。在這點(diǎn)上，特別優(yōu)選的置換會(huì)通常是性質(zhì)上保守的，即，在氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。例如，氨基酸通常分為的4個(gè)家族(1)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非-極性一丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不帶電的極性一甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，絲氨酸蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳族氨基酸。 可合理預(yù)測，用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸，或反之；用谷氨酸單獨(dú)取代天冬氨酸或反之；用絲氨酸單獨(dú)取代蘇氨酸或反之；或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸的氨基酸的類似保守性取代，不會(huì)對生物學(xué)活性具有主要效應(yīng)。因此，與參照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影響蛋白的免疫原性的少數(shù)氨基酸置換的蛋白在參照多肽的定義內(nèi)。術(shù)語表位是被免疫系統(tǒng)識別的及能誘導(dǎo)體液類型(B細(xì)胞)和/或細(xì)胞類型(T細(xì)胞)的免疫反應(yīng)的大分子的部分。該術(shù)語也與"抗原決定簇"或"抗原決定簇位點(diǎn)"互換使用。認(rèn)識相同的表位的抗體可在顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結(jié)合的能力的簡單免疫測定中鑒定。對組合物或疫苗的"免疫學(xué)應(yīng)答"是在宿主中發(fā)展的對目標(biāo)組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，“免疫學(xué)應(yīng)答"包括但不限于一種或更多以下效應(yīng)特別針對包括在目標(biāo)組合物或疫苗中的抗原的抗體，B細(xì)胞，輔助性T細(xì)胞，和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。優(yōu)選地，宿主會(huì)展示治療性或保護(hù)性免疫學(xué)應(yīng)答，以至于對新感染的抗性會(huì)增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重性減小。該保護(hù)會(huì)展示為由感染的宿主正常顯示的癥狀的減小或缺乏，更快恢復(fù)時(shí)間和/或感染的宿主中降低的病毒滴度。本文使用的術(shù)語"免疫原性"蛋白或多肽也指引發(fā)以上描述的免疫學(xué)應(yīng)答的氨基酸序列。本文使用的"免疫原性"蛋白或多肽包括蛋白的全長序列，其類似物，或其免疫原性片段。說道"免疫原性片段"是指包括一種或更多表位，由此引發(fā)上述免疫學(xué)應(yīng)答的蛋白的片段。該片段可使用本領(lǐng)域熟知的任意數(shù)的表位標(biāo)位技術(shù)鑒定。見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66(Glenn E. Morris, Ed.， 1996)。例如，線性表位可如下測定，例如，在固體支持物上同時(shí)合成大量肽，對應(yīng)蛋白分子的部分的肽，及使肽與抗體反應(yīng)而肽仍附接到支持物。該技術(shù)本領(lǐng)域已知及描述于，例如， U. S.專利No. 4，708，871 ；Geysen等人，1984 ；Geysen等人，1986，全部通過引用整體并入本文。類似地，通過測定氨基酸的空間構(gòu)象，例如通過，例如，χ-射線晶體學(xué)和2維核磁共振容易鑒定構(gòu)象表位。見，例如，Epitope Mapping ftx)tocols，見上。尤其可應(yīng)用于小泰勒蟲 (T. parva)蛋白的方法完全描述于PCT申請系列No。PCT/US2004/022605，通過引用整體并入本文。合成抗原也包括在定義內(nèi)，例如，多表位，側(cè)接表位，及其他重組體或合成來源的抗原。見，例如，Bergmann 等人，1993 ；Bergmann 等人，1996 ；Suhrbier, 1997 ；Gardner 等人， 1998。免疫原性片段，為本發(fā)明的目的，會(huì)通常包括分子的至少約3個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約5 個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少約10 15個(gè)氨基酸，及最優(yōu)選約15 25個(gè)氨基酸或更多氨基酸。 片段長度無關(guān)鍵上限，其可包含蛋白序列的幾乎全長，或甚至包含蛋白的至少一個(gè)表位的融合蛋白。因此，表達(dá)表位的多核苷酸的最小結(jié)構(gòu)是其包含編碼流感蛋白或多聚蛋白的表位或抗原決定簇的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。編碼總蛋白或多聚蛋白的片段的多核苷酸，更有利地，包含編碼總蛋白或多聚蛋白的序列的最小15個(gè)核苷酸，有利地約30 45個(gè)核苷酸，及優(yōu)選約45 75，至少57，87或150個(gè)連續(xù)或連續(xù)的核苷酸，或基本上由其組成或由其組成。表位確定方法，例如，產(chǎn)生重疊肽庫(Hemmer等人，1998)， Pepscan (Geysen et al. , 1984 ；Geysen et al. ,1985 ；Van der Zee R. et al. ,1989 ； Geysen, 1990 ；Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot 等人，1999)和在PCT申請系列No.PCT/US2004/02^05，均通過引用并入本文，無需過度實(shí)驗(yàn)而可用于本發(fā)明的實(shí)踐。也可諮詢本文引用的及合并的其他文獻(xiàn)有關(guān)測定免疫原或抗原的表位由此編碼該表位的核酸分子的方法?！岸嗪塑账帷笔呛幸匀魏谓M合的脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和類似物的任何長度的核苷酸的聚合物形式。多核苷酸可具有3維結(jié)構(gòu)，及可實(shí)施知道的或未知的任何功能。 術(shù)語“多核苷酸”包括雙_，單鏈和三-鏈化的螺旋分子。除非別有指定或需要，本文所述的發(fā)明的任何實(shí)施方式是包括雙鏈形式和已知或預(yù)測組成DNA，RNA或雜交體分子的雙鏈形式的各2個(gè)互補(bǔ)形式的多核苷酸。術(shù)語“密碼子優(yōu)化”指最佳配置編碼用于在選定的宿主表達(dá)/翻譯的蛋白，多肽， 抗原，表位，結(jié)構(gòu)域或片段的核酸序列的過程。一般而言，基因表達(dá)水平依賴于許多因素，例如啟動(dòng)子序列和調(diào)控元件。最重要因素之一是將轉(zhuǎn)錄物基因的密碼子利用適應(yīng)到宿主的典型密碼子利用(Lithwich, G. and Margalit, H.，Genome Res. 13,2665-2673,2003) 因此，原核生物基因組中在翻譯選擇下高度表達(dá)的基因具有顯著的密碼子使用偏好。這是因?yàn)樗鼈兪褂帽蛔钬S富的tRNA物種識別的小子集的密碼子(Ikemura，Τ.，J. Mol. Biol. 151， 389-409，1981)。調(diào)節(jié)此密碼子適應(yīng)的力稱為翻譯選擇，且其強(qiáng)度在快速_生長細(xì)菌中重要(Rocha, E.P. ， Genome Res. 14,2279-2286,2004 ；Sharp, P.M. et al. ， Nucleic Acids Res. 33,1141-1153)。如果基因含有宿主罕見使用的密碼子，其表達(dá)水平不會(huì)最大。此可為異源蛋白表達(dá)(Gustafsson,C. et al. ,Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)和 DNA疫苗開發(fā)(Ivory, C. and Chadee，K.，Genet. Vaccines Ther. 2，17，2004)的限制之一。已重新設(shè)計(jì)大量合成基因來增加它們的表達(dá)水平。合成基因數(shù)據(jù)庫(S⑶B) (ffu, G. et al.，Nucleic Acids Res. 35，D76-D79，2007)含有自多于200個(gè)公布的對于合成基因的實(shí)驗(yàn)的信息。在會(huì)插入新宿主來以最佳量表達(dá)某些蛋白的核酸序列的設(shè)計(jì)過程中，密碼子利用優(yōu)化通常是第 1 步驟之一 (Gustafsson, C.，Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)。密碼子利用優(yōu)化基本上涉及改變靶基因中的罕見密碼子，從而無需修飾編碼的蛋白的氨基酸序列而使它們更緊密反映宿主的密碼子利用(Gustafsson,C. ,Trends Biotechnol. 22，346-353，2004)。通常用于優(yōu)化處理的信息因此是待優(yōu)化的DNA或蛋白序列及宿主的密碼子利用表(參照組)。有幾個(gè)公共網(wǎng)頁服務(wù)器和獨(dú)立申請?jiān)试S由本領(lǐng)域技術(shù)人員一些密碼子優(yōu)化。 iGeneDesign' (Richardson, S. Μ. et al. , Genome Res. 16, 550-556,2006), 'Synthetic Gene Designer' (ffu, G.et al. , Protein Expr. Purif. 47,441-445,2006)禾口 ‘Gene Designer，(Villalobos, A. et al.，BMC Bioinformatics 7，285，2006)是提供用于合成基因設(shè)計(jì)，包括密碼子優(yōu)化步驟的平臺的包裝。有關(guān)可在各服務(wù)器或程序中得到的密碼子利用優(yōu)化的方法，開發(fā)的第1個(gè)程序僅使用‘一個(gè)氨基酸-一個(gè)密碼子’方法。更新近程序和服務(wù)器現(xiàn)在還包括創(chuàng)建一些密碼子利用變異性的方法。此變異性反映天然高度表達(dá)的基因的密碼子利用變異性及致使在優(yōu)化過程中導(dǎo)入額外的標(biāo)準(zhǔn)(例如限制性位點(diǎn)的回避)。本文所述的多數(shù)申請及網(wǎng)頁服務(wù)器提供3種密碼子優(yōu)化方法全部密碼子的完全優(yōu)化，使用 Monte Carlo方法的基于參照組的相對密碼子利用頻度的優(yōu)化，和設(shè)計(jì)為用查詢及優(yōu)化的序列之間的最小變化最大化優(yōu)化的新方法。在本文中的一實(shí)施方式中，編碼NDV的蛋白補(bǔ)體的序列是用于在禽細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼NDV P，L和 NP的核酸序列是用于在禽細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。在再一實(shí)施方式中，編碼重組蛋白， 抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位的核酸序列是用于在禽中表達(dá)優(yōu)化的密碼子。在另一實(shí)施方式中，密碼子優(yōu)化的序列編碼用于禽表達(dá)的AIV蛋白，抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位。在再一實(shí)施方式中，密碼子優(yōu)化的序列編碼用于禽表達(dá)的AIV HA和/或N蛋白，抗原，肽，多肽，片段，結(jié)構(gòu)域或表位。以下是多核苷酸的非限制性例基因或基因片段，外顯子，內(nèi)含子，mRNA, tRNA, rRNA, siRNA,核酶，cDNA,重組多核苷酸，分支的多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離的 DNA，任何序列的分離的RNA，核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物，尿嘧啶，其他糖和連接基，例如氟核糖和硫醇鹽，及核苷酸分支。 核苷酸序列可還在聚合之后修飾，例如通過與標(biāo)記組分綴合。包括在此定義中的其他類型的修飾是加帽，一個(gè)或更多天然存在的核苷酸用類似物置換，及多核苷酸附接到蛋白，金屬離子，標(biāo)簽組分，其他多核苷酸或固體支持物的手段的導(dǎo)入。多核苷酸可通過化學(xué)合成得到或源自微生物。本發(fā)明還包括編碼流感蛋白，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互補(bǔ)鏈?；パa(bǔ)鏈可為聚合物及任何長度，及可含有以任何組合的脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和類似物。術(shù)語“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文使用互換來指任何長度的氨基酸殘基的聚合物。聚合物可為線性或分支的，其可包含修飾的氨基酸或氨基酸類似物，及其可由非氨基酸的化學(xué)部分打斷。術(shù)語也包括已天然地或通過干擾修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成，糖基化，脂質(zhì)化，乙?；姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，例如與標(biāo)簽或生物活性組分綴合?！胺蛛x的”多核苷酸或多肽是基本上無在其天然環(huán)境中與其相聯(lián)的物質(zhì)的多核苷酸或多肽?；旧蠠o，是指至少50 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，或至少95 %無這些物質(zhì)。雜交反應(yīng)可在不同“嚴(yán)格度”條件下進(jìn)行。熟知增加雜交反應(yīng)的嚴(yán)格度的條件。見例如，"Molecular Cloning :A Laboratory Manual，，，第 2 版(Sambrook 等人，1989)。關(guān)聯(lián)條件的例包括(為了增加嚴(yán)格度):25°〇，371，501和681的溫育溫度；10XSSC，6XSSC， 1 X SSC, 0. 1 X SSC的緩沖液濃度(其中SSC是0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)和使用其他緩沖液系統(tǒng)的它們的相當(dāng)體；0^,25%, 50%和75%的甲酰胺濃度；溫育時(shí)間自5分鐘到24小時(shí)；1，2或更多次洗滌步驟；1，2或15分鐘的洗滌溫育時(shí)間；及6XSSC，1XSSC， 0. IXSSC或去離子水的洗滌溶液。本發(fā)明還包括編碼流感多肽的功能性地相當(dāng)?shù)淖凅w和衍生物和可增強(qiáng)，降低或不顯著影響由此編碼的多肽的固有性質(zhì)的功能性地相當(dāng)體片段的多核苷酸。這些功能性地相當(dāng)?shù)淖凅w，衍生物和片段顯示保留流感活性的能力。例如，不改變編碼的氨基酸序列的DNA 序列的變化，以及導(dǎo)致氨基酸殘基的保守性置換，一個(gè)或更少氨基酸缺失或添加，及氨基酸殘基被氨基酸類似物置換的那些是不會(huì)顯著影響編碼的多肽的性質(zhì)的那些。保守性氨基酸置換是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/甲硫氨酸；賴氨酸/精氨酸；及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。在一實(shí)施方式中，變體與目標(biāo)流感多核苷酸或多肽具有至少50%，至少55 %，至少60 %，至少65 %， 至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%或至少99%同源性或同一性。
一方面，本發(fā)明提供流感多肽，特別禽流感多肽。在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO 15,17，19，21或23所示的序列的多肽，及其變體或片段。在另一方面，本發(fā)明提供多肽與本發(fā)明的禽HA多肽，特別與具有SEQ ID NO :15， 17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少 90%，至少 95%，96%，97%，98%或 99%序列同一性。在再一方面，本發(fā)明提供以上鑒定的流感多肽的片段和變體(SEQ ID NO =15,17, 19，21和23)，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用良好-知道的分子生物學(xué)技術(shù)容易制備。變體是具有與本發(fā)明的抗原性多肽，特別與SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的氨基酸序列具有至少約75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %或99 %同一性的氨基酸序列的同源多肽。流感多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO :2,4,5,8,10，12或14所示的序列的流感多肽的至少8，10，15或20個(gè)連續(xù)氨基酸，至少21個(gè)氨基酸，至少23個(gè)氨基酸，至少 25個(gè)氨基酸，或至少30個(gè)氨基酸，或其變體。在另一實(shí)施方式中，流感多肽的片段包括見于全長流感多肽的特定抗原性表位。在另一方面，本發(fā)明提供編碼流感HA多肽的多核苷酸，例如編碼具有SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供編碼與具有SEQ ID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽，或保守性變體，等位基因變體，同源物或包含這些多肽之一的至少8或至少10連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，或這些多肽的組合具有至少 70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。編碼流感HA多肽的多核苷酸可經(jīng)密碼子-優(yōu)化用于在特定動(dòng)物種中表達(dá)。HA蛋白可在自高度病原性禽流感序列(多堿性氨基酸RERRRKKR-SEQ ID NO 25)到低病原性禽流感序列(RETR-SEQ ID NO 26)的切割位點(diǎn)修飾。在另一方面，本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO :14，16，18，21，22所示的核苷酸序列， 或其變體的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供與具有SEQ ID N0:14，16，18，21，22所示的序列的多核苷酸之一，或其變體具有至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %， 至少95 %，至少95 %，96 %，97 %，98 %或99 %序列同一性的多核苷酸。為本發(fā)明的目的，通過當(dāng)比對以最大化重疊及同一性而最小化序列間隔時(shí)比較序列來測定序列同一性或同源性。尤其是，序列同一性可使用許多數(shù)學(xué)算法之任何測定。用于比較2個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性例是如在Karlin等人，1993中修飾的Karlin等人， 1990的算法。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一例是Myers等人，1988的算法。該算法合并入 ALIGN程序O. 0版)，其為GCG序列比對軟件包裝的部分。當(dāng)利用用于比較氨基酸序列的 ALIGN程序時(shí)，可使用PAM120加權(quán)殘基表，12的間隔長度罰分，及4的間隔罰分。用于鑒定局部序列相似性區(qū)和比對的再一有用的算法是描述于Pearson等人，1988的FASTA算法。一般而言，氨基酸序列的比較通過將已知的結(jié)構(gòu)的多肽的氨基酸序列與未知結(jié)構(gòu)的多肽的氨基酸序列比對來實(shí)現(xiàn)。然后比較序列中的氨基酸及同源的氨基酸組分在一組。 此方法檢測多肽的保守的區(qū)及解釋氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之間的同源性可通過使用可商購的算法(也見以上同源性描述)測定。除了本文另外提及的那些之外，提及由美國生物技術(shù)信息中心提供的程序BLAST，空位BLAST，BLASTN，BLASTP和PSI-BLAST。這些程序在本領(lǐng)域中為此目的廣泛使用，和可比對2個(gè)氨基酸序列的同源區(qū)。
套件中的全部搜索程序，空位比對常規(guī)整合到數(shù)據(jù)庫搜索本身。如果需要，空位可關(guān)閉。長度1的間隔的默認(rèn)罰分⑴)，對于蛋白和BLASTP是Q = 9，及對于BLASTN是Q = 10，但可在任何整數(shù)中變化。對于延伸間隔(R)的默認(rèn)每-殘基罰分，對于蛋白和BLASTP是 R = 2，及對于BLASTN是R = 10，但可在任何整數(shù)中變化?？墒褂肣和R的值的任何組合以便比對序列，以最大化重疊及同一性而最小化序列間隔。默認(rèn)氨基酸比較矩陣是BL0SUM62， 但可利用其他氨基酸比較矩陣?yán)鏟AM。 替代性地或額外地，術(shù)語“同源性，，或“同一性”，例如，有關(guān)核苷酸或氨基酸序列， 可指2個(gè)序列之間的同源性的定量測量。百分率序列同一性可計(jì)算為(NMf-Ndif)*100/Nref， 其中 是當(dāng)比對時(shí)2個(gè)序列中非-同一殘基的總數(shù)，且其中是序列之一中的殘基數(shù)。 因此，DNA序列AGTCAGTC會(huì)與序列AATCAATC (NMf = 8 ；Ndif = 2)具有75%的序列同一性。替代性地或額外地，“同源性”或“同一性”有關(guān)序列可指具有同一核苷酸或氨基酸的位置數(shù)除以2個(gè)序列中較短者的核苷酸或氨基酸數(shù)，其中2個(gè)序列的比對可根據(jù)Wilbur 和Lipman算法測定(Wilbur等人，1983，通過引用并入本文)，例如，使用20個(gè)核苷酸的窗口大小，4個(gè)核苷酸的字長，及4的間隔罰分，及包括比對的序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)-輔助的分析和解析可使用可商購的程序(例如，Vector NTI軟件TM，Invitrogen Inc. CA,USA)便利地進(jìn)行。當(dāng)說到RNA序列類似，或與DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性，DNA序列中的胸苷⑴認(rèn)為是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此，RNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)，且可源于DNA序列，通過DNA序列中的胸苷(T)認(rèn)為是等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。并且，無需過度實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助許多其他程序或參照用于測定百分率同源性。本發(fā)明還包括含有在載體分子或表達(dá)載體內(nèi)和運(yùn)作性連接到啟動(dòng)子元件和任選地連接到增強(qiáng)子的流感多核苷酸。“載體”指包含待體外或體內(nèi)遞送到靶細(xì)胞的異源多核苷酸的重組DNA或RNA質(zhì)粒，噬菌體或病毒。異源多核苷酸可包含預(yù)防或治療目的的目標(biāo)序列，及可任選地以表達(dá)盒形式。如本文使用，載體不需能在最后靶細(xì)胞或受試者中復(fù)制。術(shù)語包括用于克隆的載體以及病毒載體。術(shù)語“經(jīng)加工的”或“重組的”是指不天然存在或以不見于天然的排列連接到另一多核苷酸的半合成，或合成起源的多核苷酸?！爱愒础笔侵冈从谧韵啾容^的其余實(shí)體遺傳不同的實(shí)體。例如，多核苷酸可通過遺傳加工技術(shù)合并到源自不同來源的質(zhì)粒或載體，且由此是異源多核苷酸。自其天然編碼序列移出的且運(yùn)作性連接到非天然序列的編碼序列的啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。本發(fā)明的多核苷酸可在相同的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)包含附加序列，例如額外的編碼序列， 控制元件例如啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，5’ UTR, 3' UTR，轉(zhuǎn)錄終止子，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，在相同的或不同啟動(dòng)子控制下的額外的轉(zhuǎn)錄單元，允許克隆，表達(dá)，同源重組，及宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的序列，及可期望提供本發(fā)明的實(shí)施方式的任何該構(gòu)建體。本發(fā)明的載體中有利地存在用于表達(dá)流感多肽，抗原，表位或免疫原的元件。以最小方式，此包含起始密碼子(ATG)，終止密碼子和啟動(dòng)子，及任選地用于某些載體的多聚腺苷酸化序列，例如質(zhì)粒和某些病毒載體，例如，非痘病毒的病毒載體，基本上由其組成或由其組成。當(dāng)多核苷酸有利地，在載體中編碼多聚蛋白片段，例如流感肽時(shí)，ATG放置在閱讀框的5'處，和終止密碼子放置在3'處。可存在用于控制表達(dá)的其他元件，例如增強(qiáng)子序列，穩(wěn)定化序列，例如內(nèi)含子及或未翻譯的5 ‘或3 ‘序列和允許蛋白分泌的信號序列。
制造和/或施用用于體內(nèi)或體外表達(dá)本發(fā)明的基因的基因產(chǎn)物的載體或重組體或質(zhì)粒的方法可為任何期望的方法，例如，方法是通過或類似于公開于下列文獻(xiàn)，或公開于下列文獻(xiàn)中引用的文獻(xiàn)的方法美國專利No. 4，603，112 ；4, 769，330 ；4, 394，448 ；4, 722，848 ； 4，745，051 ；4，769，331 ；4，945，050 ；5，494，807 ；5，514，375 ；5，744，140 ；5，744，141 ； 5，756，103 ；5，762，938 ；5，766，599 ；5，990，091 ；5，174，993 ；5，505，941 ；5，338，683 ； 5，494，807 ；5，591，639 ；5，589，466 ；5，677，178 ；5，591，439 ；5，552，143 ；5，580，859 ；
6，130，066 ；6，004，777 ；6，130，066 ；6， 6，387，376 ；6，376，473 ；6，368，603 ；6， 6，217，883 ；6，207，166 ；6，207，165 ；6，
497，883 ；6，464，984 ；6，451，770 ；6，391，314 348，196 ；6，306，400 ；6，228，846 ；6，221，362 159，477 ；6，153，199 ；6，090，393 ；6，074，649
6，045，803 ；6，033，670 ；6，485，729 ；6，103，526 ；6，224，882 ；6，312，682 ；6，348，450 ； 6，312，683，及6，596，279 ;1986年10月16日提交的美國專利申請系列No. 920，197 ；WO 90/01543 ；W091/11525 ；WO 94/16716；WO 96/39491 ；WO 98/33510 ；EP 265785 ；EP 0 370 573 ；Andreansky 等人，1996 ；Ballay 等人，1993 ；Feigner 等人，1994 ；Frolov 等人，1996 ； Graham, 1990 ；Grunhaus 等人，1992 Ju 等人，1998 ；Kitson 等人，1991 ；McClements 等人， 1996 ；Moss,1996 ；Paoletti，1996 ；Pennock 等人，1984 ；Richardson(Ed)，1995 ；Smith 等人，1983 ；Robertson 等人，1996 ；Robinson 等人，1997 ；及 Roizman, 1996。本文引用的及通過引用文獻(xiàn)并入本文的，除了提供本發(fā)明的實(shí)踐中有用的載體的例之外，也可提供用于待由在本發(fā)明的組合物中或在本發(fā)明的組合物中包括的載體表達(dá)的非-流感肽或其片段的源。本發(fā)明也涉及包含載體，例如表達(dá)載體的制備物，例如，預(yù)防劑或治療組合物。制備物可包含一種或更多包含一種或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原，基本上由其組成或由其組成(及有利地表達(dá))的載體，例如，表達(dá)載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，基本上由其組成或由其組成。載體在藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)中含有及表達(dá)包含編碼(及有利地表達(dá))流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其組成或由其組成的多核苷酸。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，制備物中的其他載體包含編碼，及在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下，載體表達(dá)一種或更多流感多肽，抗原，表位或免疫原(例如，血凝素，神經(jīng)氨酸酶，核蛋白)或其片段的其他蛋白的多核苷酸，或基本上由其組成或由其組成，。根據(jù)另一實(shí)施方式，制備物中的載體包含編碼流感多肽，抗原，表位或免疫原的一種或其更多蛋白或片段的多核苷酸，表達(dá)多核苷酸的載體，或基本上由其組成或由其組成。 本發(fā)明的制備物包含至少2種包含自編碼相同的蛋白和/或不同蛋白的不同流感分離物的多核苷酸，基本上由其組成或由其組成，及有利地在適當(dāng)?shù)臈l件或適合的條件下或在適合的宿主細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)的載體，基本上由其組成或由其組成。制備物含有一種或更多載體包含流感多肽，抗原，融合蛋白或其表位，基本上由其組成或由其組成多核苷酸編碼，及有利地體內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明也針對載體混合物，其含有，基本上由其組成或由其組成，編碼，及表達(dá)，不同流感蛋白，多肽，抗原，表位或免疫原，例如，自不同物種例如但不限于人，馬，豬，海豹，鯨，除了包括雞，火雞，鴨和鵝的禽物種之外的流感多肽，抗原，表位或免疫原。
術(shù)語質(zhì)粒覆蓋任何DNA轉(zhuǎn)錄單元，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和在期望的宿主或靶細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)表達(dá)必需的元件；及，在這點(diǎn)上，需知，超螺旋的質(zhì)粒和全部其拓?fù)洚悩?gòu)體，開環(huán)質(zhì)粒，以及質(zhì)粒的線性形式，旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。各質(zhì)粒包含或含有或基本上由其組成，除了編碼重組蛋白，抗原，表位或免疫原的異源多核苷酸之外，任選地與編碼異源肽序列，變體，類似物或片段的多核苷酸融合，運(yùn)作性連接到啟動(dòng)子或在啟動(dòng)子控制下或依賴于啟動(dòng)子。一般而言，有利地采用在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能的強(qiáng)啟動(dòng)子。優(yōu)選的強(qiáng)啟動(dòng)子是人或鼠起源，或任選地具有另一起源例如大鼠或豚鼠的立即早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-IE)。CMV-IE啟動(dòng)子可包含實(shí)際啟動(dòng)子段，其可或可不相聯(lián)于增強(qiáng)子段?？蓞⒖糆P-A-260 148，EP-A-323 597，美國專利No. 5，168，062， 5，385，839和4，968，615，以及參考PCT申請No W087/03905。CMV-IE啟動(dòng)子有利地是人 CMV-IE(Boshart 等人，1985)或鼠 CMV-IE。在更通常情況下，啟動(dòng)子是病毒或細(xì)胞起源的?？稍诒景l(fā)明的實(shí)踐中有用地采用的非CMV-IE的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子是SV40病毒的早期/晚期啟動(dòng)子或Rous肉瘤病毒的LTR啟動(dòng)子。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用地采用的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子可為細(xì)胞骨架基因的啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Kwissa等人，2000)，或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Miyazaki等人，1989)。這些啟動(dòng)子的功能亞片段，S卩，維持充足的啟動(dòng)活性的這些啟動(dòng)子的部分，包括在本發(fā)明內(nèi)，例如根據(jù)PCT申請No. W098/00166或美國專利No. 6，156，567的截短的CMV-IE 啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的實(shí)踐。在本發(fā)明的實(shí)踐中啟動(dòng)子隨之包括維持充足的啟動(dòng)活性和因此發(fā)揮啟動(dòng)子的作用，優(yōu)選基本上類似于衍生出衍生物或亞片段的實(shí)際或全長啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，例如，類似于美國專利No. 6，156，567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子的活性，類似于全長 CMV-IE啟動(dòng)子的活性的全長啟動(dòng)子的衍生物及亞片段。由此，在本發(fā)明的實(shí)踐中CMV-IE啟動(dòng)子可包含全長啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分，以及衍生物及亞片段，或基本上由其組成或由其組成。優(yōu)選地，質(zhì)粒包含其他表達(dá)控制元件，或基本上由其組成。特別有利地合并穩(wěn)定化序列，例如，內(nèi)含子序列，優(yōu)選hCMV-IE的第1內(nèi)含子(PCT申請No.W089/01036)，兔β-珠蛋白基因的內(nèi)含子II (van Ooyen等人，1979)。作為質(zhì)粒和非痘病毒的病毒載體的多聚腺苷酸化信號(多聚A)，可利用牛生長激素(bGH)基因的聚(A)信號(見美國專利No. 5，122，458)，或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信號或SV40病毒的聚(A)信號。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，表達(dá)載體是用于在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系統(tǒng)中體外表達(dá)蛋白的表達(dá)載體。表達(dá)的蛋白可在分泌之后或非在分泌之后(如果無分泌，細(xì)胞裂解一般發(fā)生或進(jìn)行)在培養(yǎng)上清中或自培養(yǎng)上清收獲，任選地通過濃縮方法例如超濾濃縮和/或通過純化手段，例如親和性，離子交換或凝膠過濾-類型層析方法純化。“宿主細(xì)胞”表示已遺傳改變的，或能通過施用外源多核苷酸，例如重組質(zhì)粒或載體遺傳改變的原核生物或真核細(xì)胞。當(dāng)指遺傳改變的細(xì)胞時(shí)，術(shù)語兼指原本改變的細(xì)胞和其后代。有利的宿主細(xì)胞包括，但不限于，幼侖鼠腎(BHK)細(xì)胞，結(jié)腸癌(Caco-2)細(xì)胞，C0S7 細(xì)胞，MCF-7 細(xì)胞，MCF-10A 細(xì)胞，Madin-Darby 狗腎(MDCK)系，貂肺(MvlLu)細(xì)胞，MRC-5 細(xì)胞，U937細(xì)胞和VERO細(xì)胞。包含期望的序列的多核苷酸可插入適合的克隆或表達(dá)載體， 及載體，進(jìn)而可導(dǎo)入用于復(fù)制和擴(kuò)增的適合的宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^任何本領(lǐng)域知道的手段將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^許多適當(dāng)?shù)氖侄沃魏螌⒑心繕?biāo)多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，包括直接攝取，胞吞，轉(zhuǎn)染，交配，電穿孔，采用氯化鈣，氯化銣，磷酸鈣，DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微投射物轟擊；脂轉(zhuǎn)染；及感染(其中載體是感染性的，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體)。引導(dǎo)載體或多核苷酸的選擇會(huì)常常依賴于宿主細(xì)胞的特征。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，載體是新城疫病毒(NDV)載體。也稱之為禽副粘病毒1的新城疫病毒(APMV1，副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科 (Paramyxovirinae)，禽副粘病毒屬(Avulavirus))是禽病原體，其天然存在的株呈現(xiàn)廣范圍的疾病嚴(yán)重性。NDV作為用于獸醫(yī)學(xué)使用的疫苗載體特別有利，因?yàn)檩d體本身作為需要的家禽疫苗。NDV株致病型是無癥狀腸性(例如Ulster2C，Queensland V4)，緩發(fā)型(例如，Hitchner Bi, F(例如，Asplin)，La Sota)，中發(fā)型(例如，株 H，Mukteswar, Roakin, Beaudette C)或速發(fā)型(例如，Texas GB,NY parrot 70181，Italien，Milano，Herts33/56) 的?；贜DV載體的禽流感載體疫苗的優(yōu)勢包括，但不限于，(1)誘導(dǎo)廣免疫，包括體液，細(xì)胞和粘膜應(yīng)答⑵不表達(dá)NP和M蛋白，由此與DIVA(區(qū)分自免疫接種的動(dòng)物感染的)策略相容，(3)誘導(dǎo)免疫的快速發(fā)作，(4) 二價(jià)，和( 產(chǎn)生位置相比意外釋放中滅活的疫苗對環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)更少。NDV的某些特征提示，表達(dá)外源病毒蛋白的重組NDV (rNDV)或經(jīng)加工的NDV會(huì)是非常良好的疫苗候選體。NDV在許多細(xì)胞系和蛋中生長到非常高滴度，及其引發(fā)強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答體內(nèi)。NDV天然地感染經(jīng)呼吸道和食道粘膜表面，因此，遞送呼吸性疾病病原體，例如AIV的保護(hù)性抗原尤其有用。此外，在美國和多數(shù)其他國家廣泛使用可商購的活NDV疫苗?；诨頝DV重組體的疫苗也可相比其他活重組疫苗載體具有優(yōu)勢。首先，外源蛋白隨僅少量NDV蛋白表達(dá)。相反，痘和皰疹病毒載體自它們的大-尺寸基因組表達(dá)大量的額外的蛋白。對于疫苗應(yīng)用中特定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，可有利地使僅有限數(shù)量的蛋白表達(dá)。第2， NDV無DNA期地在感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，其消除病毒基因組整合到宿主細(xì)胞DNA的問題。病毒不經(jīng)歷可檢測的遺傳重組。反向遺傳學(xué)的另一應(yīng)用是開發(fā)如本文所述的更有效和更佳NDV疫苗。當(dāng)前NDV疫苗利用天然存在的緩發(fā)型株，例如Hitchner Bl和LaSota。如其他活衰減的疫苗所面對的， 當(dāng)前NDV疫苗仍可由于毒力逆轉(zhuǎn)而導(dǎo)致疾病。NDV疫苗株作為載體的選擇是重要的，由于以 Hitchner BlNDV株報(bào)道的首次數(shù)據(jù)是令人失望的。其后，以LaSotaNDV株獲得的數(shù)據(jù)是鼓舞人心，且基于此株的疫苗候選體現(xiàn)場用于中國和墨西哥。本發(fā)明描述了申請人利用NDV AVINEW 疫苗株作為用于將源于重組體的抗原遞送到禽的載體。更特別抗原可為禽流感病毒(AIV)抗原。AVINEW 是全世界使用的由Merial Ltd.開發(fā)的活NDV疫苗。此疫苗株天然地?zé)o毒力，且呈現(xiàn)雙呼吸和腸向性。禽中的趨異向性可給重組NDV (rNDV)或經(jīng)加工的NDV疫苗提供獨(dú)特生物學(xué)特征，其利用AVINEW 主鏈用于在禽中基因遞送，有關(guān)自母源抗體(MDA)到NDV本身的干涉。該對MDA的抗性可允許可固有地具有顯著水平的NDV-特異性MDA和另外反抗更常規(guī)重組NDV免疫的商業(yè)和野生型禽的活躍的免疫。此外，AVINEW 株屬于可感染鴨的NDV基因組或類型O類，基因型I)。相比 LaSota (其向性基本上針對呼吸道)，AVINEW 株不誘導(dǎo)呼吸性副反應(yīng)。在一實(shí)施方式中，NDV載體是NDV AVINEW 。NDV載體也可為美國專利No. 5，118，502的載體，尤其是作為ATCC No. VR 2239保藏的株。本發(fā)明的一實(shí)施方式提供AVINEW的基因組DNA序列及編碼的蛋白序列。AVINEW NDV株的基因組DNA序列具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。AVINEW基因組cDNA序列(SEQ ID NO 1)不同于 VG/GA 序列(GenBank 登錄 No. EU289028)。AVINEff (SEQ ID NO: 1)和VG/GA(EU289028)基因組序列之間的序列同一性是89. 6 %。Avinew株和VG/GA株的蛋白之間的氨基酸序列同一性是對于NP蛋白(Avinew的SEQ ID NO :3和GenBank No. ABZ80386)是 95. 9%，對于 P 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 5 GenBankABZ80387)是 89. 7%，對于 M 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO :7GenBank No. ABZ80388)是 94. 2%，對于 F 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO :9GenBank No. ABZ80389)是 92. 4%，對于 HN 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 11 GenBank No. ABZ80390)是 88. 1 %，及對于 L 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 13 GenBank No. ABZ80391)是 96. 9%。Avinew株及 VG/GA株的基因之間的核酸序列同一性是對于NP基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :2E似890 的 122 1591bp)是90. 6%， 對于 P 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :4E似890 的 1887 3074bp)是 88. 6%，對于 M 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :6E似890 的 3290 4384bp)是90. 1%，對于F基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :8E似890 的 4544 6205bp)是 90. 0%，對于 HN基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :10EU289028 的 6412 8145bp)是 84. 7%，及對于 L 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 12EU289028的8381 149%bp)是90. 9%。完全基因組和個(gè)體基因序列與其他可得到的 NDV參照序列的比較顯示，AVINEW NDV株與澳大利亞緩發(fā)型株98-1154和Queensland V4 遺傳緊密相關(guān)。NDV 98-1154全基因組序列示于GenBank AY935491。ANIVEW (SEQ ID NO: 1)和AY93M91基因組序列之間的序列同一性是98. 8%。Avinew株和VG/GA株的蛋白之間的氨基酸序列同一性是對于NP蛋白(Avinew v.的SEQ ID NO 3 GenBank No. AAX45376) 是 99. 8%，對于 P 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 5 GenBank No. AAX45377)是 97. 7%， 對于 M 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO 7 GenBank No. AAX45378)是 98. 4%，對于 F 蛋白 (Avinew v.的 SEQ ID NO 9 GenBank No. AAX45379)是98. 7%，對于HN蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO: IlGenBank No. AAX45380)是 92. 4%，及對于 L 蛋白(Avinew v.的 SEQ ID NO: 13 GenBank No. AAX45381)是99. 5 %。Avinew株及VG/GA株的基因之間的核酸序列同一性是對于 NP 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :2AY935491 的 122 1591bp)是 99. 0%，對于 P 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :4AY935491 的 1887 3074bp)是 98. 2%，對于 M 基因 (Avinew v.的 SEQ ID NO :6AY935491 的 3290 4384bp)是 98. 6%，對于 F 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :8AY935491 的 4544 6205bp)是 98. 8%，對于 HN基因(Avinew v.的 SEQ ID NO :10AY935491 的 6412 8154bp)是 93. 1%，及對于 L 基因(Avinew v.的 SEQ ID NO: 12AY935491 的 8381 14995bp)是 98. 8%。對于 Queensland V4，僅部分序列可在 GenBank 得到。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有SEQ ID而1，2，4，6，8，10，12或?qū)λ镜男蛄?，及其變體或片段的多核苷酸。本發(fā)明還包括與本文所述的多核苷酸的互補(bǔ)鏈。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有SEQ ID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽，及其變體或片段。在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO M所示的序列的AVINEW 的基因組cDNA。在再一實(shí)施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 所示的序列的多核苷酸的反向互補(bǔ)鏈。在再一實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸的反向互補(bǔ)鏈與具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO : 所示的序列的多肽具有至少70%，至少75%， 至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供編碼AVINEW多肽的多核苷酸的片段，例如編碼具有 SEQ ID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本發(fā)明提供編碼與具有SEQ ID NO :3,5,7,9,11或13所示的序列的多肽，或保守性變體，等位基因變體， 同源物或包含這些多肽之一的至少8或至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的免疫原性片段，或這些多肽的組合具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%， 98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供具有SEQ ID而1，2，4，6，8，10，12或?qū)λ镜暮塑账嵝蛄械亩嗪塑账?，或其變體。在再一實(shí)施方式中，多核苷酸是具有SEQ ID NO :1，2，4，6，8，10， 12或?qū)λ镜男蛄械亩嗪塑账岬姆聪蚧パa(bǔ)鏈。在再一方面，本發(fā)明提供與具有SEQ ID NO 1，2，4，6，8，10，12或M所示的序列的多核苷酸之一，或其變體具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多核苷酸或多核苷酸的反向互補(bǔ)鏈。一方面，本發(fā)明涉及用于在用疫苗或組合物接種的宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫學(xué)應(yīng)答的藥物組合物或疫苗，組合物包括藥物可接受的載體和修飾的AVINEW重組病毒。在本發(fā)明的再一方面，經(jīng)加工的AVINEW病毒，在病毒基因組的非必要區(qū)內(nèi)，包括編碼源自病原體的抗原性蛋白的異源DNA序列，其中當(dāng)疫苗施用給宿主時(shí)，能誘導(dǎo)特異于由病原體編碼的蛋白的免疫學(xué)應(yīng)答。術(shù)語“非必要區(qū)”指對于病毒在組織培養(yǎng)中的復(fù)制和繁殖不是必要的及其缺失或滅活可減少在各種動(dòng)物系統(tǒng)中的毒力的病毒基因組區(qū)。任何非必要區(qū)或其部分可自AVINEW 基因組缺失或外源序列可插入其中，及由缺失或插入所致的經(jīng)加工的AVINEW的活力和穩(wěn)定性可用于確定是否刪除的區(qū)或其部分的確非必要。在另一實(shí)施方式中，AVINEW基因組的非必要區(qū)是AVINEW基因組的P基因和M基因之間的區(qū)，或M基因和F基因之間的區(qū)。在再一實(shí)施方式中，非必要區(qū)可在SEQ ID NO :1的第3075 第3289核苷酸或第4385 第4543 核苷酸，SEQ ID NO 24的第3115 第3353核苷酸或第4449 第4607核苷酸的區(qū)內(nèi)。本發(fā)明的一方面涉及表達(dá)禽抗原的NDV載體?？乖蔀榍萘鞲锌乖Ｇ萘鞲锌乖蔀檠?，例如H5HA。本發(fā)明也涵蓋表達(dá)禽流感基因的NDV載體，例如兼有自HPAIV野生鳥分離物的野生型及突變的HA開放閱讀框(ORF)，A/斑頭雁/青海/3/2005 (H5m)插入到LaSota NDV疫苗株的P和M基因之間的基因間區(qū)的表達(dá)H5亞型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA) 的 NDV 的構(gòu)建體(例如，Ge et al.，Journal of Virology, Jan. 2007，vol. 81，no. 1， pp. 105-158)，以登錄號No. AF375823提交到GenBank的表達(dá)流感病毒的新城疫病毒(NDV) 疫苗株 Hitchner Bl 的完全 cDNA 克隆(見，例如，Nakaya et al.，Journal of Virology, Dec. 2001，pp. 11868-11873)，表達(dá) HPAIV A/雞 / 越南/P41/05 (H5m)的 H5 蛋白的 NDV 重組體(NDVH5Vm)(見例如，Romer-OberdSrfer et al. ,Vaccine. 2008 May2 ；26 (19) 2307-13. Epub 2008 Mar 18)，使用有自禽流感病毒(AIV) A/雞/NY/13142-5/94 (H7N2)的血凝素(HA)基因插入的緩發(fā)型副粘病毒1型載體(NDV Bl株)構(gòu)建的rNDV-AIV-H7(見，例如，Swayne et al. ,Avian Diseases 47 1047-1050，2003)，通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建的亞型H5 的 NDV-表達(dá)禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)(見，例如，Veits et al. ,PNAS5May 23，2006， vol. 103，no. 21，pp. 8197-8202)和基于緩發(fā)型 NDV 疫苗株 Clone 30 的 AIV A/ 雞 / 越南 / P41/2005(H5N1)的表達(dá)HA基因的重組NDV-H5 (見，例如，Veits et al.，Vaccine (2008) 26， 1688-1696)。在本發(fā)明的再一實(shí)施方式中，也涵蓋表達(dá)NDV基因的禽流感病毒，例如代替表達(dá) H7禽流感病毒血凝素的胞外域的H5W禽流感病毒或二價(jià)疫苗的神經(jīng)氨酸酶蛋白表達(dá)NDV 的血凝素-神經(jīng)氨酸酶基因的胞外域的嵌合禽流感病毒到成融及衰減的NDV基因(含僅其胞外域，具有源自NDV的F蛋白的跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)(見，例如，Park et al. ,PNAS,May 23，2006，vol. 103，no. 21，pp.8203—8308)。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明用于將治療有效量的用于遞送和表達(dá)蛋白，抗原，表位或免疫原的制劑施用到靶細(xì)胞。預(yù)防性地或治療有效量的確定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。在另一實(shí)施方式中，制劑包含包含表達(dá)流感抗原，表位或免疫原的多核苷酸表達(dá)載體的和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，媒質(zhì)或賦形劑。在另一實(shí)施方式中，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，媒質(zhì)或賦形劑輔助轉(zhuǎn)染和/或改善載體或蛋白的保存。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑。例如，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑可為無菌水，0.9% NaCl (例如，鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液?？捎糜诒景l(fā)明的方法的其他藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑包括，但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或媒質(zhì)或賦形劑可為輔助載體施用的任何化合物或化合物的組合(或自本發(fā)明的載體外表達(dá)的蛋白)；有利地，載體，媒質(zhì)或賦形劑可輔助轉(zhuǎn)染和/或改善載體(或蛋白)的保存。本文在一般描述中討論了劑量體積，且也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員自本公開以及本領(lǐng)域中的知識，無需任何過度實(shí)驗(yàn)確定。有利地但不排他性地適于質(zhì)粒的含有季銨鹽的陽離子脂質(zhì)，有利地是具有以下式的那些
CH3
I +
R1-O- CH2- CH-CH2-N-R2-X
II
OR1CH3其中Rl是具有12 18個(gè)碳原子的飽和的或不飽和的直鏈脂肪族自由基，R2是含有2或3個(gè)碳原子的另一脂肪族自由基，且X是胺或羥基，例如DMRIE。在另一實(shí)施方式中陽離子脂質(zhì)可與中性脂質(zhì)，例如DOPE相聯(lián)。這些陽離子脂質(zhì)中，偏好DMRIE(N42-羥乙基)_N，N-二甲基_2，3_雙(十四烷基氧基)"I"丙烷銨；W096/34109)，有利地與中性脂質(zhì)關(guān)聯(lián)，有利地為DOPE ( 二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr, 1994)，以形成 DMRIE-D0PE。有利地，無準(zhǔn)備地及有利地與施用制備物同時(shí)或在施用制備物之前不久形成具有佐劑的質(zhì)粒混合物；例如，在施用之前不久或之前，形成質(zhì)粒-佐劑混合物，有利地為了施用之前給足夠的時(shí)間用于混合物形成復(fù)合物，例如施用之前約10和約60分鐘之間，例如施用之前約30分鐘。當(dāng)DOPE存在時(shí)，DMRIE DOPE摩爾比有利地為約95 約5 約5 約95，更有利地約1 約1，例如，1 1。DMRIE或DMRIE-D0PE佐劑質(zhì)粒重量比可為約50 約1和約1 約10之間，例如約10 約1和約1 約5之間，及有利地約1 約1和約1 約2之間，例如，1 1和 1 2之間。在另一實(shí)施方式中，藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)可為油包水乳劑。 適合的油包水乳劑的例包括基于油的油包水疫苗乳劑，其穩(wěn)定和于4°C流動(dòng)，其含有6 50V/V%的含有抗原的水相，優(yōu)選12 25V/V%，50 94V/V%的含有(總共或部分)非-可代謝的油(例如，礦物油例如石蠟油)和/或可代謝的油(例如，植物油或脂肪酸，多元醇或醇酯)的油相，0. 2 20p/v%的表面活性劑，優(yōu)選3 8p/v%，后者總共或部分，或以混合物是聚甘油酯，所述聚甘油酯優(yōu)選為聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氫化的聚氧乙烯蓖麻毒素油。可用于油包水乳劑的表面活性劑的例包括乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如，聚氧乙烯(20)單油酸山梨糖醇酐(Tween 80 )，可得自AppliChem, Inc.，Cheshire，CT)和山梨糖醇酐酯(例如，單油酸山梨糖醇酐(Span 80 )，可得自Sigma Aldrich Jt. louis，M0)。此外，有關(guān)油包水乳劑，也見US專利No. 6，919，084，例如，其實(shí)施例8，通過引用并入本文。在一些實(shí)施方式中，含有抗原的水相包含鹽溶液包含一種或更多緩沖劑。適合的緩沖溶液的例是磷酸鹽緩沖的鹽水。在有利的實(shí)施方式中，油包水乳劑可為水/油/水(W/0/W)三層乳劑(見，例如，美國專利No. 6，358，500，通過引用并入本文)。 其他適合的乳劑的例描述于美國專利No. 7，371，395，通過引用并入本文。免疫學(xué)組合物和疫苗根據(jù)本發(fā)明可包含一種或更多佐劑，或基本上由其組成。本發(fā)明的實(shí)踐中使用的適合的佐劑是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，馬來酐和烯基衍生聚合物，( 免疫刺激序列(ISS)，例如具有一個(gè)或更多非-甲基化的CpG單元的寡脫氧核苷酸序列(Klinman等人，1996 ；W098/16247), (3)水包油乳劑，例如描述于由M. Powell， Μ. Newman, Plenum Press 1995 出版的“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”的ρ 147的SPT乳劑，及描述于相同的文章的ρ 183的MF59乳劑，(4)含有季銨鹽的陽離子脂質(zhì)，例如，DDA(5)細(xì)胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，(7)皂苷或⑶引用的及通過引用合并到本申請的任何文獻(xiàn)中討論的其他佐劑，或⑶)其任何組合或混合物。水包油乳劑(3)，其尤其適于病毒載體，可基于輕液體石蠟油(歐洲藥典類型)， 類異戊二烯油，例如角鯊?fù)椋酋徬?，由烯，例如異丁烯或癸烯的寡聚化產(chǎn)生的油，具有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯 /癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或分支的，脂肪醇或酸的酯，尤其是異硬脂酸酯。油與乳化劑聯(lián)用而形成乳劑。乳化劑可為非離子表面活性劑，例如一方面是山梨糖醇酐的酯，二縮甘露醇(例如無水甘露糖醇油酸酯)，甘油，聚甘油或丙二醇，而另一方面是油酸，異硬脂酸，蓖麻油酸或羥基硬脂酸，所述酯任選地是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如，L121。類型(1)佐劑聚合物中，偏好交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其通過糖或多元醇的聚烯基醚的交聯(lián)。這些化合物已知名稱為卡波姆(Pharmeuropa，vol.8, No. 2, 1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國專利No. 2，909，462，其提供通過具有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不多于8個(gè)該基團(tuán)，被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和的，脂肪族自由基取代的至少3個(gè)羥基的氫原子的聚羥基化合物交聯(lián)的該丙烯酸聚合物。優(yōu)選的自由基是含有2 4個(gè)碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其他乙烯鍵合地不飽和基團(tuán)。不飽和的自由基也可含有其他取代基，例如甲基。尤其適合以名稱卡波泊爾售的產(chǎn)品(BF Goodrich, Ohio, USA)。它們通過烯丙基蔗糖或通過烯丙基季戊四醇交聯(lián)。它們之中，參考卡波泊爾974P， 934P 和 971P。有關(guān)馬來酐-烯基衍生共聚物，偏好EMA(Monsanto)，其是直鏈或交聯(lián)的乙烯-馬來酐共聚物，且它們，例如，通過二乙烯基醚交聯(lián)。也參考J. Fields等人，1960。有關(guān)結(jié)構(gòu)，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA優(yōu)選通過具有以下式的基本單元形
成
權(quán)利要求
1.組合物，其包含(i)經(jīng)加工的NDV載體、和( )藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中經(jīng)加工的NDV載體包含編碼禽流感HA抗原的異源多核苷酸或其變體。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中經(jīng)加工的NDV載體包含與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.權(quán)利要求2或3的組合物，其中禽流感HA抗原是H5HA多肽。
5.權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)的組合物，其中HA抗原具有修飾的切割位點(diǎn)。
6.權(quán)利要求2 5中任一項(xiàng)的組合物，其中HA抗原與具有SEQID NO :15，17，19，21或 23所示的序列的多肽具有至少80%氨基酸序列同一性。
7.權(quán)利要求2 6中任一項(xiàng)的組合物，其中異源多核苷酸與具有SEQID NO =14,16, 18,20或22所示的序列的多核苷酸具有至少80%序列同一性。
8.修飾NDV的基因組來產(chǎn)生經(jīng)加工的NDV載體的方法，其中方法包括將分離的多核苷酸在NDV基因組的非必要區(qū)內(nèi)導(dǎo)入NDV基因組中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中NDV包含與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中非必要區(qū)選自由下列組成的區(qū)位于NP基因上游， APMV基因組的2個(gè)基因之間，及L基因的下游的非翻譯區(qū)。
11.權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)的方法，其中非必要區(qū)位于P和M基因之間或M和F基因之間。
12.引發(fā)禽的保護(hù)性應(yīng)答或針對至少一種禽病原體而給禽免疫接種的方法，包括給禽施用表達(dá)至少一種抗原的經(jīng)加工的NDV載體和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，賦形劑或媒質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中NDV載體包含與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸、或和與具有SEQ ID NO :1所示的序列的多核苷酸具有至少90%序列同一性的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中抗原是禽流感抗原。
15.權(quán)利要求14的方法，其中禽流感抗原是血凝素(HA)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中禽HA抗原與具有SEQID NO 15，17，19，21或23所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性。
17.權(quán)利要求12 16中任一項(xiàng)的方法，其中施用是通過眼滴，噴霧，飲用水，卵內(nèi)，肌內(nèi)或皮下施用。
18.權(quán)利要求12 17中任一項(xiàng)的方法，其中施用是初施-追施。
19.權(quán)利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物，及追加-施用包含含有及體內(nèi)表達(dá)禽病原體抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或包含禽病原體抗原的滅活的病毒疫苗，或包含禽病原體抗原(亞基)的疫苗或組合物，或含有或表達(dá)禽病原體抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物。
20.權(quán)利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用包含含有及體內(nèi)表達(dá)禽病原體抗原的重組病毒載體的疫苗或組合物，或包含禽病原體抗原的滅活的病毒疫苗，或包含禽病原體抗原(亞基)的疫苗或組合物，或含有或表達(dá)禽病原體抗原的DNA質(zhì)粒疫苗或組合物，及追加-施用權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，初次施用包括包含含有及表達(dá)禽流感抗原的痘病毒的組合物，而追加施用包括包含禽流感抗原的權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物。
22.權(quán)利要求18的方法，其中初施-追施包括 初次施用權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物，和追加施用權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)的組合物。
23.權(quán)利要求12 22中任一項(xiàng)的方法，其中禽是雞或鴨。
24.經(jīng)加工的NDV載體，其包含與SEQID NO :1具有至少90%序列同一性的多核苷酸。
25.分離的多核苷酸，其選自(a)與具有SEQID NO :1，2，4，6，8，10，12或M所示的序列的多核苷酸具有至少90% 序列同一性的多核苷酸；(b)與編碼具有SEQID N0:3，5，7，9，ll或13所示的序列的多肽的多核苷酸具有至少 90%序列同一性的多核苷酸；以及(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明包括經(jīng)加工的新城疫病毒(NDV)疫苗或組合物。疫苗或組合物可為重組疫苗。本發(fā)明也包括編碼及表達(dá)禽病原體抗原，更特別禽流感蛋白，表位或免疫原的重組載體。該疫苗或組合物可用于保護(hù)動(dòng)物，尤其是禽，免于疾病。
文檔編號C07K14/11GK102428099SQ201080022159
公開日2012年4月25日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者F·雷納爾, F-X·勒格羅斯, M·巴布洛特 申請人:梅里亞有限公司