專利名稱：化學(xué)可編程免疫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及為任何期望抗原提供立即免疫的組合物和方法。本文用到的“免疫”表示免疫組分功能性的結(jié)合特定靶標(biāo)。特定靶標(biāo)不同于首先產(chǎn)生免疫的物質(zhì)或者結(jié)構(gòu)上與其無關(guān)，并且事實(shí)上，通過本文公開的方法，靶標(biāo)的性質(zhì)不僅由免疫原決定，還由稱作“接頭” 的藥物實(shí)體決定?！敖宇^”通過接頭上的兩個結(jié)構(gòu)識別位點(diǎn)連接由一個實(shí)體——通用免疫原引起的免疫反應(yīng)與另一個實(shí)體——靴標(biāo)。這些位點(diǎn)的第一個與免疫反應(yīng)的識別組分結(jié)合。 這些位點(diǎn)中的第二個與靶標(biāo)結(jié)合。靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)可以是適配體，并且在一些實(shí)施方案中適配體在磷酸酯骨架上可包括一些或者全部修飾的磷酸酯如硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯。
背景技術(shù)：
免疫已經(jīng)用于保護(hù)人體和動物抵抗疾病超過了一百年。傳統(tǒng)免疫的前提是針對抗原或者包含抗原的病原體最有效的免疫反應(yīng)，在相同抗原攻擊個體兩次或者多次后發(fā)生。 這種現(xiàn)象稱為免疫記憶或者第二次免疫反應(yīng)。當(dāng)免疫成功，個體得到了保護(hù)從而免受抗原來源的病原體的影響。例如，一旦個體成功的免疫了來源于細(xì)菌生物的抗原，該個體中的免疫反應(yīng)是已接觸抗原的并且當(dāng)遇到細(xì)菌時就準(zhǔn)備對該細(xì)菌應(yīng)答。成功的免疫需要抗原位于細(xì)菌中位于接近個體免疫系統(tǒng)的區(qū)域。當(dāng)免疫成功，免疫系統(tǒng)應(yīng)答，細(xì)菌被殺死、包含、中和或者從體內(nèi)清除，同時細(xì)菌生物的感染導(dǎo)致很少或者沒有疾病。這種保護(hù)的關(guān)鍵是抗原免疫必須發(fā)生在暴露于抗原來源的細(xì)菌生物之前。因此，傳統(tǒng)免疫方法通常包括注射抗原至個體內(nèi)，等待適量的時間，并且允許個體形成免疫反應(yīng)。對于大多數(shù)抗原，形成免疫反應(yīng)需要的時間是約兩個周至幾個月之間。大多數(shù)情況下，需要抗原的加強(qiáng)施用以維持免疫反應(yīng)。這種加強(qiáng)一般在抗原起始施用的幾周或者幾個月后提供。因此，如果暴露于抗原或者病原體之前的幾個月就提供常規(guī)免疫，其在提供保護(hù)上是高度成功的，但是當(dāng)個體暴露于個體以前沒有暴露過的新抗原并且需要立即有效的免疫反應(yīng)時，常規(guī)免疫是沒有用的。此種情況一個好的實(shí)例是軍隊(duì)需要針對生物恐怖主義試劑的保護(hù)。盡管個體群體可以在任何潛在暴露于生物恐怖主義試劑之前接種針對此試劑的疫苗，但是常規(guī)的接種疫苗不是一個簡單的答案。群體的常規(guī)接種疫苗在一些人中產(chǎn)生有害的反應(yīng)，并且有可能群體永遠(yuǎn)不會暴露于該試劑，于是產(chǎn)生了風(fēng)險。另外，政府在邏輯上不可能開發(fā)、生產(chǎn)和對重要的人員接種針對每一種可能的生物恐怖主義試劑的疫苗。需要在個體與病原體接觸或者疑似接觸之前或者之后立即施用的組合物，所述組合物的施用允許個體中產(chǎn)生立即保護(hù)性或者有效免疫反應(yīng)。以前已經(jīng)構(gòu)建免疫接頭和通用免疫原，如完整并入本文作為參考的美國專利公開20030017165和20040146515描述，該免疫接頭和通用免疫原提供基本上立即免疫。這些以前描述的免疫接頭可以摻入適配體核酸作為靶結(jié)合元件。使用適配體核酸作為靶結(jié)合位點(diǎn)的一個缺點(diǎn)是核酸分子易受核酸酶的降解。這減少了這些分子的半壽期，并且進(jìn)而減少了它們提供的治療益處的持續(xù)時間。以前的研究已經(jīng)表明修飾的多核苷酸在一定程度上可以抗核酸酶的降解。寡核苷酸的修飾如寡核苷酸磷酰氧的巰化可以賦予核酸酶抗性(Gorenstein (Farschtschi，N. and Gorenstein, D.G., Tetrahedron Lett. (1988)29 :6843,禾口 Nielsen,等人’ Tetrahedron Lett. (1988)29 291)。多種骨架修飾如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯使該試劑有更強(qiáng)的核酸酶抗性(Verma 和 Eckstein ;Annu Rev Biochem, 199867 :99-134) 不幸的是，具有高硫代磷酸骨架替換的寡核苷酸看起來與一般的磷酸酯相比對蛋白質(zhì)“更有粘性的”，歸因于可能基于磺酸化核苷酸的電荷特征的非特異相互作用。因此，巰化的ODNs增加的粘性導(dǎo)致特異性的喪失，從而使得通過適配體技術(shù)提供特異靶定的期望失敗。特異性的喪失在DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與DNA的相互作用中是關(guān)鍵的，因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)和它們的DNA結(jié)合位點(diǎn)之間大部分的直接接觸是磷酸基。作為進(jìn)一步的復(fù)雜化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某種硫取代可以導(dǎo)致在雙鏈體結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)干擾(Cho，等人，J. Biomol. Mruct. Dyn. (1993) 11,685-702)。因此核苷酸限制的巰化可能增加核酸酶的抗性，然而這不能為治療的應(yīng)用如體內(nèi)施用提供可觀的循環(huán)半壽期而不犧牲結(jié)合特異性。因此需要免疫接頭，其具有適配體結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)通過在多核苷酸骨架上基本上包括所有的硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯穩(wěn)定化而沒有減少的結(jié)合特異性。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于可編程免疫的組合物和方法，其可以提供個體針對靶標(biāo)如病原體或者其他不希望物質(zhì)的基本上立即免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)具有體內(nèi)治療應(yīng)用的穩(wěn)定性和靶標(biāo)特異性。因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了立即有效的免疫反應(yīng)，這些組合物可以在個體接觸病原體之前的任何時間或者甚至在個體接觸病原體之后施用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明解決了軍隊(duì)面對的在保護(hù)他們的人員免受生物恐怖主義試劑危害方面的許多問題。相對于常規(guī)免疫技術(shù)，本發(fā)明的組合物和方法也提供了一個優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榇朔椒ú恍枰獙⑿揎椀牟≡w或者病原體部分施用到個體中以得到針對該病原體的有效的免疫。此夕卜，包含適配體靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的本文描述的免疫接頭可具有修飾的磷酸酯骨架，其為體內(nèi)施用提供了增加的穩(wěn)定性。這些修飾包括磷酸酯骨架修飾，其包括基本上所有的硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。發(fā)現(xiàn)這些修飾的適配體靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)具有對于治療施用的明顯的穩(wěn)定性和循環(huán)半壽期以及靶結(jié)合特異性。相對于以前描述的免疫接頭，這些修飾的適配體、更特別地硫代適配體、免疫接頭提供了改進(jìn)，包括明顯的穩(wěn)定性以及伴隨的結(jié)合特異性，其中所述結(jié)合特異性以前認(rèn)為是一種折衷。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括免疫接頭，其包含結(jié)合免疫反應(yīng)組分的至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)；并且包含結(jié)合靶標(biāo)的至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)。這些接頭組合物利用個體中現(xiàn)有的免疫反應(yīng)并且將該現(xiàn)有的免疫反應(yīng)與不同的靶標(biāo)連接，該靶標(biāo)與現(xiàn)有的免疫反應(yīng)是不相關(guān)，通過免疫接頭提供的它們之間的連接除外?，F(xiàn)有的免疫反應(yīng)針對包含免疫接頭的第一結(jié)合位點(diǎn)的抗原，并且在個體中可以通過包含第一結(jié)合位點(diǎn)的通用病原體的施用來誘導(dǎo)。免疫反應(yīng)與靶標(biāo)的連接允許立即的連接的免疫反應(yīng)而不需要針對靶標(biāo)的初次頁
免疫反應(yīng)。免疫接頭可以是化學(xué)或者生物材料的任何類型，其包括微生物、噬菌體、蛋白質(zhì)、 核酸、多糖、合成材料或者上述物質(zhì)的組合。在一個實(shí)施方案中，至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)物理的或者化學(xué)的連接或者綴合到包含至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)的分子。在此實(shí)施方案中，在第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)之間可能存在間隔區(qū)分子。在另一個實(shí)施方案中，免疫接頭是單一分子，其包含至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)和至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)。在現(xiàn)有的免疫反應(yīng)的起始或者產(chǎn)生之后，如果個體暴露或者疑似暴露于期望針對其的立即免疫的新的化合物或者病原體時，對個體施用本文描述的免疫接頭，所述免疫接頭包含相應(yīng)于通用免疫原的第一結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合新的化合物或者病原體的第二結(jié)合位點(diǎn)。免疫接頭在一個第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合在現(xiàn)有的免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)組分，并且其也在至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)處結(jié)合新的化合物或者病原體，因此提供了結(jié)合免疫接頭的免疫反應(yīng)組分的免疫復(fù)合體，所述免疫接頭又與新的化合物或者病原體結(jié)合。個體的免疫系統(tǒng)識別這些免疫接頭復(fù)合體并且將它們從體內(nèi)除掉或者清除。因此，通過施用包含本文描述的免疫接頭的組合物，個體的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)從通用免疫原轉(zhuǎn)向新的化合物或者病原體。如上所述，本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是只需要一種起始免疫分子或者通用免疫原來引發(fā)個體免疫系統(tǒng)的后續(xù)抗原特異免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明可降低為個體目前推薦或者需要的接種疫苗的數(shù)目(并且可能降低制劑的復(fù)雜性)。本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是免疫接頭和通用免疫原制備的容易性。本發(fā)明的免疫接頭可容易裝配并且提供給衛(wèi)生保健專家用于對這些公共衛(wèi)生需要如大范圍傳染、生物恐怖主義的威脅或者特異病原體的有限爆發(fā)的快速反應(yīng)。本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是個體可以免疫的化合物的廣泛性。免疫接頭可以制備成與任何化合物或者外源物質(zhì)如抗原、病原體、化學(xué)物或者內(nèi)源物質(zhì)如病毒感染或者癌癥中發(fā)現(xiàn)的改變的細(xì)胞結(jié)合。本發(fā)明可以使用個體中存在的免疫反應(yīng)并且將免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向至不同的靶標(biāo)以提供穩(wěn)定的和特異的立即免疫。因此，如果個體已經(jīng)免疫了特定的抗原，可以制備免疫接頭分子，其具有包含或者相應(yīng)于個體免疫所針對抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)并且具有針對不期望的病原體、化學(xué)物或者試劑的第二結(jié)合位點(diǎn)。在閱讀了公開的實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述后，本發(fā)明的這些和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。附圖簡述

圖1.在70%的胎牛血清存在下或者核酸酶存在下，提供未修飾(UN)和修飾的 (硫代磷酸酯(PA)適配體混合物的圖像。圖2.提供了條形圖，其顯示單獨(dú)培養(yǎng)基(對照)、單獨(dú)致死毒素(LeTx)或LeTx與非硫化修飾的保護(hù)抗原適配體組合(Thio Apt/LeTx)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。分別在鼠巨噬細(xì)胞 (RAW沈4.7細(xì)胞)上在溫育過夜后，加入到細(xì)胞的單獨(dú)的LeTx或者與非硫化修飾或者硫化修飾的適配體混合的 LeiTx (LeTx 0/N, Reg Apt/LeTx 0/N, Thio Apt/LeTx 0/N)。攻擊后 24小使用XTT細(xì)胞增殖測定評估細(xì)胞存活力。圖3.提供了用和不用多西環(huán)素和巰化的抗致死因子免疫接頭，暴露于炭疽芽孢桿菌的小鼠組的存活曲線圖。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于立即免疫人或者動物的組合物和方法，所述免疫針對本文稱作靶標(biāo)的任何分子或者有機(jī)物。這稱作化學(xué)可編程免疫或者可編程免疫。可編程免疫與經(jīng)典免疫的不同在于可編程免疫允許針對一種抗原的現(xiàn)有的免疫轉(zhuǎn)向針對靶標(biāo)。使用本發(fā)明的免疫接頭使免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向。除非上下文清楚指出，本文和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個”、“這個”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如參考“一個化合物”是針對一個或者多個這樣的化合物的指代并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物等等。本發(fā)明的免疫接頭包含至少兩個位點(diǎn)；(1)結(jié)合個體中的至少一種免疫反應(yīng)組分的第一結(jié)合位點(diǎn)，以及O)結(jié)合靶標(biāo)的第二結(jié)合位點(diǎn)。在免疫接頭施用于個體之前在個體中就存在免疫反應(yīng)組分。例如，免疫反應(yīng)組分可以是以前免疫反應(yīng)的部分的抗體，所述以前免疫反應(yīng)針對第一結(jié)合位點(diǎn)，或者一個分子，或者一大組分子，或者甚至是包含第一結(jié)合位點(diǎn)的微生物。因此，術(shù)語“現(xiàn)有的免疫反應(yīng)”指的是針對第一結(jié)合位點(diǎn)或者與第一結(jié)合位點(diǎn)免疫學(xué)相似表位的免疫反應(yīng)。也就是說，“現(xiàn)有的免疫反應(yīng)”是這樣的免疫反應(yīng)，其中產(chǎn)生或者存在與第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的免疫反應(yīng)組分。現(xiàn)有的免疫反應(yīng)可以通過以前施用給個體相應(yīng)于第一結(jié)合位點(diǎn)的通用免疫原產(chǎn)生或者不用這樣施用就在個體中存在。因此，本發(fā)明包括將個體中的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)從針對第一個抗原轉(zhuǎn)向至針對靶標(biāo)的方法，其包括向個體施用有效量的包含一種或多種免疫接頭的組合物，其中所述接頭包含至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)和至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)，并且其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)，并且其中所述第一抗原包含第一結(jié)合位點(diǎn)或者其免疫等同物。本發(fā)明也包含增強(qiáng)針對靶標(biāo)的免疫反應(yīng)的方法，其包括向個體施用有效量的包含一種或多種免疫接頭的組合物， 其中所述接頭包含至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)和至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)，并且其中第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)，并且其中所述個體具有針對第一結(jié)合位點(diǎn)或者它的免疫等同物的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)。通用免疫原“相應(yīng)于”第一結(jié)合位點(diǎn)的通用免疫原可以與第一結(jié)合位點(diǎn)相同、可以包含整個第一結(jié)合位點(diǎn)、可以包含第一結(jié)合位點(diǎn)的部分或者可以是第一結(jié)合位點(diǎn)的免疫等同物。當(dāng)涉及兩個或者多個分子時，術(shù)語“免疫等同物”此處指相同免疫反應(yīng)組分結(jié)合的分子。本發(fā)明只需要由通用免疫原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)組分也結(jié)合第一結(jié)合位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，通用免疫原以足夠的親和力結(jié)合免疫反應(yīng)組分，導(dǎo)致能起始或者參與免疫反應(yīng)的復(fù)合體的產(chǎn)生。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)組分與非通用免疫原和非第一結(jié)合位點(diǎn)的分子的交叉反應(yīng)最小。通用免疫原可以是任何分子、生物或者化合物，個體形成針對該通用免疫原的免疫反應(yīng)并且該通用免疫原可以通過任何途徑施用。通用免疫原可以是但不限于分子、微生物、毒素或者來自其的類毒素、蛋白質(zhì)或者多肽、多核苷酸、多糖、合成材料或者上述物質(zhì)的組合。優(yōu)選地，通用免疫原在個體中引起提供長期免疫記憶的免疫反應(yīng)，所述通用免疫原可以以加強(qiáng)劑量再次施用于個體并且不會在個體中弓丨起疾病、病理或者長期患病。包含病原體的部分或者病原體的修飾部分的免疫原可以是通用免疫原，然而除了通用免疫原引起的互補(bǔ)免疫反應(yīng)，它不需要與任何事物有關(guān)。例如，人類通常用來自腮腺炎病毒、麻疹病毒、破傷風(fēng)類毒素和脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫原性抗原免疫。動物，如貓和狗通常用來自狂犬病病毒的免疫原性抗原來免疫。這些以及其他的常規(guī)免疫原可以用作通用免疫原，然而這將是方便性的問題而不是必要性的問題。備選地，非常規(guī)免疫原可以用作通用免疫原。優(yōu)選地，非常規(guī)免疫原不包含病原體的部分或者修飾部分。在一個實(shí)施方案中，通用免疫原是半抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)的部分?！鞍肟乖贝颂幎x為與特異抗體反應(yīng)的分子，但是其在結(jié)合載體蛋白或者其他大的抗原分子之前不能誘導(dǎo)額外的抗體的形成或者產(chǎn)生。大部分半抗原是小分子，但是一些大分子也可以行使半抗原的功能。在一個實(shí)施方案中，用于證實(shí)目的進(jìn)行并且如本文實(shí)施例1描述，半抗原是苯胂酸鹽并且通用免疫原是苯胂酸化蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，通用免疫原包含噬菌體或者噬菌體表位。免疫反應(yīng)組分可以結(jié)合噬菌體的任何部分，并且在一個實(shí)施方案中所述免疫反應(yīng)組分結(jié)合噬菌體表面上表達(dá)的肽。噬菌體通用免疫原可以通過任何途徑施用于個體，并且在一些實(shí)施方案中，噬菌體可以包含于細(xì)菌中作為方便的施用手段。m—竹口m二齢& .點(diǎn) PI ι 免,浦·_κ本發(fā)明能將針對通用免疫原的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向針對不同的抗原，部分是因?yàn)橥ㄓ妹庖咴瓕?yīng)于免疫接頭的第一結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)榈谝唤Y(jié)合位點(diǎn)是通用免疫原和免疫接頭分子的一部分，針對通用免疫原的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)或者現(xiàn)有的免疫系統(tǒng)組分也識別免疫接頭。免疫接頭的第一結(jié)合位點(diǎn)可以包含多肽、多核苷酸、多糖、有機(jī)化學(xué)品、微生物如噬菌體、細(xì)菌、病毒或者病毒顆粒、或原生動物、前述的任何片段或者部分、前述的任何組合或者被個體免疫系統(tǒng)識別或者個體中的免疫反應(yīng)組分結(jié)合的任何其他組合物。在一個實(shí)施方案中，第一結(jié)合位點(diǎn)是寡糖如α -Gal表位，即半乳糖基-α _1，3_半乳糖基-β -1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖。在另一個實(shí)施方案中，第一結(jié)合位點(diǎn)包含噬菌體的部分，更優(yōu)選地包含在噬菌體表面表達(dá)的多肽。第二結(jié)合位點(diǎn)可以包含多肽、多核苷酸、多糖、有機(jī)化學(xué)品、微生物如噬菌體、細(xì)菌、病毒或者病毒顆粒、原生動物、前述的任何片段或者部分、前述的任何組合或者與靶標(biāo)結(jié)合的任何其他組合物。在一個特別的實(shí)施方案中，第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn)包含在相同的微生物中。如本文使用的多核苷酸或者核酸指的是任何鏈構(gòu)象的DNA或者RNAH 單鏈、雙鏈、三鏈或者上述物質(zhì)的任何化學(xué)修飾，并且考慮核酸相關(guān)的蛋白質(zhì)的存在或者缺失?；瘜W(xué)修飾可以在核酸的擴(kuò)增或者合成前在個別的核苷酸中，或者在核苷酸摻入多聚體后加入到核苷酸中。此類修飾包括但不限于在胞嘧啶、外環(huán)胺的修飾、5-溴-尿嘧啶的取代、骨架修飾、甲基化、異常的堿基配對組合和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他修飾。在一個實(shí)施方案中，第二結(jié)合位點(diǎn)包含抗體或者抗體片段，優(yōu)選地包含抗體可變區(qū)的抗體片段，并且更優(yōu)選地Fab片段。在另一個實(shí)施方案中，第二結(jié)合位點(diǎn)包含噬菌體表達(dá)的多肽，并且更優(yōu)選地表達(dá)在噬菌體表面的多肽。在一個實(shí)施方案中，骨架修飾是包括硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯可以包括在基本上在多核苷酸磷酸骨架的全部或者磷酸骨架的部分中。 在一些實(shí)施方案中，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或者99%的磷酸骨架被巰化了。預(yù)期磷酸骨架被巰化而不用犧牲與靶標(biāo)的結(jié)合特異性。多核苷酸巰化的一個優(yōu)點(diǎn)是增加了對核酸酶降解的抗性，其增加了半壽期以及本文描述的免疫接頭提供的治療益處的持續(xù)時間。
如上所述，免疫接頭包括任何類型分子或者生物，其包含能結(jié)合免疫反應(yīng)組分的第一結(jié)合位點(diǎn)，并且包含能結(jié)合靶標(biāo)的第二結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，免疫接頭可以包含超過一個的第一結(jié)合位點(diǎn)和/或超過一個的第二結(jié)合位點(diǎn)。多個第一結(jié)合位點(diǎn)可以相同或者不同。多個第二結(jié)合位點(diǎn)也可以相同或者不同。結(jié)合位點(diǎn)在與不同分子的特異性或者與相同分子的親和力中可以不同。免疫接頭也可以經(jīng)修飾以減少它自己的免疫原性。第一個和第二結(jié)合位點(diǎn)分別與免疫反應(yīng)組分以及靶標(biāo)的結(jié)合可以通過任何相互作用完成，該相互作用包括通過其他分子如多糖或者核酸提供的結(jié)合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一結(jié)合位點(diǎn)是免疫反應(yīng)分子特異的并且第二結(jié)合位點(diǎn)是靶標(biāo)特異的。如上所述， 當(dāng)一個分子與另一個分子以足夠的親和力結(jié)合導(dǎo)致用于免疫系統(tǒng)目的的功能性復(fù)合體的產(chǎn)生時，所述一個分子是另一個分子特異。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個第二結(jié)合位點(diǎn)與非靶標(biāo)的分子的交叉反應(yīng)性是最小的。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個第一結(jié)合位點(diǎn)與非免疫反應(yīng)組分的分子的交叉反應(yīng)是最小的。在對個體施用免疫接頭后，形成了包含免疫反應(yīng)組分、免疫接頭和靶標(biāo)的免疫接頭復(fù)合體。免疫接頭與免疫系統(tǒng)組分的結(jié)合之前或之后，免疫接頭可以結(jié)合靶標(biāo)。在免疫接頭復(fù)合體的形成之后，靶標(biāo)通過免疫系統(tǒng)途徑清除。抗原的“清除”此處指的是抗原的除去、失活或者修飾以使它不再對機(jī)體有害。在另一個實(shí)施方案中，免疫接頭包含第一結(jié)合位點(diǎn)，其相應(yīng)于α-半乳糖基或者 α -Gal,如 Galili, U.禾口 Avila，J. L.，Alpha-Gal, Subcellular Biochemistry, Vol. 32， 1991中描述的表位。異種移植研究已經(jīng)確定人形成針對α-半乳糖基表位的免疫反應(yīng)，其在人體中不常發(fā)現(xiàn)但在其他的動物和許多微生物中發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明一個特別的實(shí)施方案中，α -半乳糖基表位綴合到包含抗體的Fab片段或者巰化的適配體多核苷酸的第二結(jié)合位點(diǎn)。在另一個實(shí)施方案中，免疫接頭包含噬菌體。第一結(jié)合位點(diǎn)可以相應(yīng)于噬菌體的任何部分，但是優(yōu)選地相應(yīng)于噬菌體表達(dá)的第一條多肽。噬菌體上的第二結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)于結(jié)合靶標(biāo)的第二個和不同的噬菌體表達(dá)的多肽。第一條和第二條多肽都在噬菌體表面表達(dá)。下面的實(shí)施例3提供了噬菌體免疫接頭的實(shí)例，其可以與噬菌體通用免疫原結(jié)合使用。在一些實(shí)施方案中，免疫接頭包含通過噬菌體淘選方法從野生噬菌體得到的重組噬菌體。第一結(jié)合位點(diǎn)由野生噬菌體的任何部分組成，所述部分在受試者最初暴露于野生噬菌體時有免疫原性功能的并且仍被重組噬菌體保留作為接頭使用。在重組噬菌體上用作接頭的第二結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)于重組噬菌體表達(dá)的肽，所述肽被選擇是因?yàn)樗Y(jié)合靶標(biāo)。在另一個實(shí)施方案中免疫接頭是作為第一結(jié)合位點(diǎn)的α -Gal表位和作為第二結(jié)合位點(diǎn)的合成肽的綴合物，所述合成肽的序列源于噬菌體淘選實(shí)驗(yàn)，其中通過附著到固相支持體的期望抗原，從展示重組噬菌體集合的隨機(jī)肽庫中淘選所述合成肽。在其他實(shí)施方案中，第一個和/或第二結(jié)合位點(diǎn)包含適配體核酸，并且更優(yōu)選地通過SELEX方法產(chǎn)生的適配體。SELEX代表通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)性進(jìn)化。SELEX 方法在本領(lǐng)域已知并且至少在下列出版的美國專利中描述美國專利號5，475，096; 6，261，774 ；6，395，888 ；6，387，635 ；6，387，620 ；6，376，474 ；6，346，611 ；6，344，321 ； 6，344，318 ；6，331398 ；6，331，394 ；6，329，145 ；6，300，074 ；6，280，943 ；6，280，932 ；
86，261，783 ；和 6，232，071。一般，SELEX方法涉及鑒定特異地結(jié)合三維靶標(biāo)的核酸。核酸具有足夠的能力用于形成多種二維和三維結(jié)構(gòu)，并且在它們的單體中可得到足夠的化學(xué)多樣性以至可以發(fā)現(xiàn)一些序列幾乎特異地結(jié)合任何化學(xué)化合物。為生物液體中穩(wěn)定的目的，優(yōu)選的適配體包含一個或者多個修飾的核苷酸如2’-氟或者2’-氨基-2’-脫氧嘧啶。在體內(nèi)使用這些堿基的核酸比天然形成的核酸更穩(wěn)定。見 M. Famulok 和 G. Mayer, Cur. Top. Micro. Immunobiol. 243 123-146，1999。通過相似方法得到的 Spiegelmers (見 Vater，A.和 Klussmann，S. Current Opin. Drug Discov Devel. 2003Mar ；6 (2) :253-61)也因?yàn)樗鼈冊谘逯泄逃械姆€(wěn)定性而被使用。在一個實(shí)施方案中，用于SELEX方法的寡核苷酸文庫用來自Roche (曼海姆市，德國)的通過商業(yè)途徑可得到的試劑盒如GS FLX Titanium系列方案和試劑如擴(kuò)增子文庫制備方案制備。GS FLX Titanium融合引物(Roche，曼海姆市，德國)可以用于對鑒定出的適配體測序，盡管其他測序方法在本領(lǐng)域已知并且也可以使用。如上所述，本發(fā)明包括基本上由所有巰化的核苷酸制成的免疫接頭適配體。(見美國專利號 6，867，289 ；Yang,等人，J. Bioorganic &Med. Chem. Lett (1997) 7 :2651 ；美國專利號 5，218，088 ；Nielsen，等人 ^Tetrahedron Lett. (1998)29 :2911 ))其在本文中整體并入作為參考)。硫代磷酸酯的核苷酸間的連接比磷酸二酯鍵對核酸酶更穩(wěn)定，這種特征使它在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)使用中有用。通過制備具有巰化核苷酸的適配體，得到的巰化免疫接頭一般在體內(nèi)具有更長的半壽期，因此增加了巰化免疫接頭的有效活性。如上文所述，巰化適配體免疫接頭可以包含基本上全部巰化的核苷酸或者可以包含巰化核苷酸的部分。在一個特定的實(shí)施方案中，免疫接頭分子包括第一結(jié)合位點(diǎn)，其具有通過連接分子或者直接的共價鍵連接第二結(jié)合位點(diǎn)的α-半乳糖基表位。第二結(jié)合位點(diǎn)包括針對炭疽病致死因子的適配體并且具有如下的序列5，-GGG GTT TTT GTT TTT TTC TT TTT CTC ACT CTA TTTTTCTGT3'-C3-0H(SEQ ID NO 1)適配體多核苷酸任選地通過磷酸骨架的巰化修飾以提供更長的半壽期以便延長持續(xù)時間，通過所述磷酸骨架的巰化修飾免疫接頭具有治療效應(yīng)。此處描述的第一和第二結(jié)合位點(diǎn)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法連接或者綴合。術(shù)語“綴合的”或者“綴合”此處定義為指共價或者其他形式連接兩個或者多個分子。綴合可以通過任何方法包括但不限于化學(xué)方法、基因工程方法或者通過體內(nèi)生物學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。第一和第二結(jié)合位點(diǎn)可通過雙鏈核酸、多肽、化學(xué)結(jié)構(gòu)、或者任何其他合適的結(jié)構(gòu)連接，或者通過簡單的化學(xué)鍵連接。在一個特別的實(shí)施方案中，接頭的第一和第二結(jié)合位點(diǎn)在體外以如此方式進(jìn)化， 所述方式使得在第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)后第一結(jié)合位點(diǎn)只與免疫反應(yīng)組分相互作用。導(dǎo)致這種行為的別構(gòu)作用在蛋白質(zhì)和其他大分子中是眾所周知的，并且接頭的在體外進(jìn)化中可以是選擇方法的組分。免疫反應(yīng)組分如上所述，免疫接頭的一個或者多個第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合免疫反應(yīng)組分。此處使用的術(shù)語“免疫反應(yīng)組分”指的是個體免疫反應(yīng)中涉及的任何分子或者細(xì)胞。術(shù)語“個體”包括動物和人。免疫反應(yīng)組分的非限制性的實(shí)例是抗體、淋巴細(xì)胞，包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞，包括但不限于嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞、和任一前述細(xì)胞上的受體，包括但不限于T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體。術(shù)語抗體包括抗體的所有類型和亞類，Ig G、Ig M、Ig A、IgD, IgE等，抗體的分泌型和排出型，抗體片段，包括可變區(qū)、高變區(qū)和恒定區(qū)、重鏈和輕鏈、片段組合和片段混合物和完整抗體。這些抗體可以是人源化的、多克隆或者單克隆的、天然來源的或者合成的抗體。在一個實(shí)施方案中，至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合免疫反應(yīng)組分的活性結(jié)合位點(diǎn)。 例如，如果免疫反應(yīng)組分是如Ig G分子的抗體，那么免疫接頭的第一結(jié)合位點(diǎn)是抗原表位， Ig G分子可變區(qū)的活性結(jié)合位點(diǎn)通常結(jié)合所述抗原表位。靶標(biāo)免疫接頭的一個或多個第二結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)，并且優(yōu)選地第二結(jié)合位點(diǎn)是該靶標(biāo)特異性的。此處術(shù)語“靶標(biāo)”指的是任何組合物，個體中增強(qiáng)其的免疫反應(yīng)是所期望的。在一個實(shí)施方案中，抗原是還沒有暴露于對象個體的化合物或者生物。然而，抗原也可以是化合物或者生物，該化合物或者生物已經(jīng)暴露于對象個體但還沒有形成針對該化合物或者生物的最優(yōu)免疫反應(yīng)。靶標(biāo)包括但不限于微生物、病原體、病毒、病毒顆粒、細(xì)菌、多肽、有毒化學(xué)品、非自身分子和上述物質(zhì)的任何片段、部分或者組合。此處使用的靶標(biāo)也包括在個體中免疫反應(yīng)通常不靶定的分子或者組合物，如識別為自身的分子、太小不能引起免疫系統(tǒng)應(yīng)答的分子、 非免疫原性的化合物或者化學(xué)物、和與免疫系統(tǒng)的免疫原性組分隔離的分子或者物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，靶標(biāo)是免疫系統(tǒng)的抗體或者細(xì)胞組分，個體想要將其除去以減輕自身免疫病癥。在另一個實(shí)施方案中，靶標(biāo)是細(xì)菌毒素。這些細(xì)菌毒素包括但不限于破傷風(fēng)毒素、肉毒桿菌毒素、白喉毒素、霍亂毒素、毒素B、毒素A、fragilysin(來自脆弱擬桿菌 (Bacteroides fragilis))、致死因子、水腫因子、來自炭疽桿菌的保護(hù)性抗原、來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素和熱穩(wěn)定毒素、來自索氏梭菌(C. sordelli)的致死毒素或者出血性毒素。其他產(chǎn)毒素的細(xì)菌和它們的毒素在下表1中提供。表1 產(chǎn)毒素細(xì)菌和它們的毒素
權(quán)利要求
1.免疫接頭分子，其包含結(jié)合免疫系統(tǒng)分子的至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合靶標(biāo)的至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)， 其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)是巰化的適配體。
2.權(quán)利要求1的免疫接頭分子，其中所述第一位點(diǎn)與抗體結(jié)合。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體來自針對第一位點(diǎn)已經(jīng)預(yù)免疫過的人或者動物。
4.權(quán)利要求1的免疫接頭分子，其中所述靶標(biāo)是微生物。
5.權(quán)利要求4的免疫接頭分子，其中所述微生物是細(xì)菌、病毒或者真菌。
6.權(quán)利要求1的免疫接頭分子，其中所述化合物或者分子是細(xì)菌毒素。
7.權(quán)利要求6的免疫接頭分子，其中所述細(xì)菌毒素選自破傷風(fēng)毒素、肉毒桿菌毒素、白喉毒素、霍亂毒素、毒素B、毒素A、fragilysin、炭疽桿菌致死因子、炭疽桿菌水腫因子、炭疽桿菌保護(hù)性抗原、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素、大腸桿菌熱穩(wěn)定毒素、索氏梭菌致死毒素或者索氏梭菌出血性毒素。
8.針對分子或者化合物免疫人或者動物的方法，其包括對人或者動物施用免疫接頭分子，所述免疫接頭分子包含與免疫系統(tǒng)分子結(jié)合的至少一個第一位點(diǎn)，以及與靶標(biāo)結(jié)合的第二位點(diǎn)，其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)是巰化的適配體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述人或者動物已經(jīng)針對免疫接頭分子上的第一位點(diǎn)預(yù)免疫。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所期望的化合物或者分子是微生物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述微生物是細(xì)菌、病毒或者真菌。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述化合物或者分子是藥物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫接頭分子是適配體。
14.增強(qiáng)個體中對靶標(biāo)的免疫反應(yīng)的方法，其包括對個體施用有效量的包含一種或多種免疫接頭的組合物， 其中所述接頭分子包含至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)和至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)， 其中所述個體具有針對第一結(jié)合位點(diǎn)的現(xiàn)有的免疫反應(yīng)，并且其中所述第二結(jié)合位點(diǎn)是與靶標(biāo)結(jié)合的巰化適配體。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述個體是人并且第一結(jié)合位點(diǎn)包含α-半乳糖基表位。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述個體在施用所述免疫接頭之前不能產(chǎn)生針對靶標(biāo)的有效的免疫反應(yīng)。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物包含不同免疫接頭群，其中所述第一結(jié)合位點(diǎn)在以下方面不同a)它們對免疫反應(yīng)組分上不同表位的特異性，或者b)它們對免疫反應(yīng)組分上相同表位的親和力。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述免疫反應(yīng)組分是抗體。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述組合物包含不同免疫接頭群，其中所述不同免疫接頭群包含第二結(jié)合位點(diǎn)，所述第二結(jié)合位點(diǎn)在以下方面不同a)它們對靶標(biāo)上不同表位的特異性，或者b)它們對靶標(biāo)上相同表位的親和力。
全文摘要
提供了針對任何分子或化合物的立即免疫個體的方法和組合物。本發(fā)明涉及具有至少兩個位點(diǎn)的免疫接頭；(1)與個體中的免疫反應(yīng)組分結(jié)合的至少一個第一結(jié)合位點(diǎn)，以及(2)與期望化合物或者分子——靶標(biāo)特異結(jié)合的至少一個第二結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，第二結(jié)合位點(diǎn)是巰化適配體，其具有增加的穩(wěn)定性、抗降解和更長的循環(huán)半壽期的優(yōu)點(diǎn)。也提供了制備和使用包括免疫接頭分子的藥物組合物的方法，該免疫接頭分子具有巰化適配體。
文檔編號C07H19/00GK102459298SQ201080027363
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日
發(fā)明者J·L·基爾, J·維韋卡南達(dá), K·B·穆利斯, R·M·庫克 申請人:阿爾特姆恩科技責(zé)任有限公司