專利名稱：肽硫酯的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽硫酯的制造方法。
背景技術(shù)：
在蛋白質(zhì)的合成上，已知有生物合成、化學(xué)合成、無細(xì)胞合成等各種方法。在生物合成方法中，通過利用大腸桿菌等的細(xì) 胞內(nèi)部，將編碼所要合成的蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部來表達(dá)而制得蛋白質(zhì)。在化學(xué)合成中，將氨基酸以有機(jī)化學(xué)方式依序鍵合來合成目的蛋白質(zhì)。無細(xì)胞合成則利用存在于大腸桿菌等各種細(xì)胞內(nèi)的酶等，以無細(xì)胞方式來合成蛋白質(zhì)。此等方法可依據(jù)蛋白質(zhì)的使用目的、尺寸、或所附加之性質(zhì)等來適當(dāng)?shù)胤珠_使用或組
口 o為了合成在氨基酸序列的中間部分均勻地具有糖鏈或脂質(zhì)等特定修飾的蛋白質(zhì)，目前已采用使用預(yù)先以糖鏈或脂質(zhì)等修飾的氨基酸，對(duì)其周邊的肽鏈進(jìn)行化學(xué)合成的方法。作為對(duì)肽鏈進(jìn)行化學(xué)合成的方法主要是采用固相合成法。然而，由固相合成法所得之肽鏈一般為短鏈，最長(zhǎng)也只是50個(gè)殘基左右而已。因此，為了合成具有修飾物的長(zhǎng)肽鏈，主要是采用分別制備短肽鏈后再將它們連接的方法。作為肽鏈連接方法雖報(bào)導(dǎo)有各種方法，但廣泛采用的方法之一為自然化學(xué)連接法(Native Chemical Ligation,NCL法)。已知的是，即使是無保護(hù)的這些肽鏈,彼此也可進(jìn)行NCL法，且NCL法已知為用于在連接部位(ligation部位)生成天然酰胺鍵(肽鍵)的有用方法(例如專利文獻(xiàn)I)。NCL法為在C末端上具有a羧基硫酯部分的第I肽與在N末端上具有半胱氨酸殘基的第2肽之間的化學(xué)選擇反應(yīng)，半胱氨酸之側(cè)鏈的硫醇基(SH基，亦稱為硫氫基)與硫酯基的羰基碳有選擇地進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)由硫醇交換反應(yīng)即生成硫酯鍵初期中間體。此中間體自發(fā)性地進(jìn)行分子內(nèi)重排(intramolecular rearragement)而在連接部位上提供天然酰胺鍵合，另一方面使半胱氨酸側(cè)鏈硫醇再次產(chǎn)生。此方法為能夠僅通過使無保護(hù)之肽在緩沖溶液中混合而經(jīng)由肽鍵將兩個(gè)肽鏈連接的方法。NCL法中，即使當(dāng)例如肽等具有許多官能基之化合物彼此間發(fā)生反應(yīng)，亦可有選擇地將其中一者的肽C末端與另一者的肽N末端連接。由此觀點(diǎn)而言，為了對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)合成，重要的是如何來利用NCL法。然而，利用NCL法的問題包括制備C末端上具有a羧基硫酯部分的肽硫酯來作為所需原料。肽硫酯的制備法雖報(bào)導(dǎo)有各種方法，但一般可分成基于固相合成法的兩種類型。第一種為在樹脂上建構(gòu)肽硫酯的方法。此方法中，可將肽鏈從建構(gòu)此肽后之樹脂切斷而制得肽硫酯(例如Boc固相合成法、Fmoc固相合成法)。第二種為經(jīng)由與硫酯等同的連接物(linker)將肽鏈建構(gòu)于固相上的方法(Safety Catch linker、Fujii法、Dawson法、Mercapto propanol 法、Kawakami 法、Danishefsky 法、Hojo 法、Aimoto 法等)。該方法中，將由連接物進(jìn)行適當(dāng)處理所建構(gòu)的肽鏈C末端活性化后，對(duì)肽鏈進(jìn)行硫解(thiolysis)而制得硫酯(非專利文獻(xiàn)I)。在這些之外，還報(bào)導(dǎo)有在合成由固相合成對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行保護(hù)，且僅C末端之羧基為游離的保護(hù)肽之后，再以適當(dāng)?shù)目s合條件進(jìn)行硫酯化之方法(例如專利文獻(xiàn)2)。以上任何方法皆為已確立之方法，并且在過去的各種蛋白質(zhì)合成中被采用。然而，由于任一種方法皆受限于固相合成法的限制，因此能夠合成出來的肽硫酯的尺寸便會(huì)受到限制。再者，在使用連接物的方法中，必須對(duì)非天然氨基酸衍生物或特別的衍生物進(jìn)行單獨(dú)的化學(xué)合成，因而其步驟未必稱得上是簡(jiǎn)便。在解決采用固相合成法之硫酯化 的限制的方法上已有內(nèi)含肽法(Intein法)(非專利文獻(xiàn)2)。此為可制得由細(xì)胞進(jìn)行生物合成之多肽片段作為硫酯的方法。在Intein法中，通過利用在特定蛋白質(zhì)序列中所產(chǎn)生之蛋白質(zhì)剪接(splicing)功能進(jìn)行肽鏈的硫酯化，從而制得多肽鏈作為硫酯。此方法的有用之處在于可制得長(zhǎng)鏈的肽硫酯。通過將此方法與化學(xué)合成法組合，可合成即使是到目前為止被認(rèn)為是難以合成的大型被修飾蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)3)。表達(dá)并獲得多肽鏈的方法已有大量研究，充分被確立為生物學(xué)上的基本技術(shù)。然而，在采用Intein法時(shí)，不僅要表達(dá)多肽，還要使蛋白質(zhì)剪接發(fā)揮功能，這就需要有作為標(biāo)的之肽序列，且所表達(dá)之內(nèi)含肽復(fù)合蛋白質(zhì)必須發(fā)生折疊而呈現(xiàn)固有的三維結(jié)構(gòu)。因此，依賴于所要表達(dá)的多肽序列，未必能制得肽硫酯，通常會(huì)伴隨著充分條件的優(yōu)化，作業(yè)上的麻煩便會(huì)跟隨而至。另一方面，作為肽的切斷方法，已知有使化合物與肽中之半胱氨酸殘基的SH基反應(yīng)，借此在上述半胱氨酸殘基的位置處切斷肽鏈的方法(非專利文獻(xiàn)4、5)、或使用連接物切斷與固相鍵合的肽的方法(非專利文獻(xiàn)6、7)。此外，已知有使用溴化氰(CNBr)切斷甲硫氨酸(methionine)殘基的C末端之一側(cè)的肽鍵的方法。然而，這些方法并非為制得作為硫酯的肽片段的方法。相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)[專利文獻(xiàn)I]國(guó)際公開W096/34878[專利文獻(xiàn)2]國(guó)際公開W02007/114454[非專利文獻(xiàn)][非專利文獻(xiàn) I] Ingenito et al.，J. Am. Chem. Soc. 1999，121，11369-11374[非專利文獻(xiàn) 2] Schwartz et al.，CHEM. C0MMUN.，2003 2087-2090[非專利文獻(xiàn) 3]Muir, Annu. Rev. Biochem. 2003. 72 :249-289[非專利文獻(xiàn) 4] Stark GR, Methods of Enzymology, 1977,47,129-132.[非專利文獻(xiàn) 5]Nakagawa et al. , J. Am. Chem. Soc. 1994,116, 5513-5514[非專利文獻(xiàn) 6] Sola et al.，J. Chem. Soc.，Chem. Commun.，1993,1786-1788[非專利文獻(xiàn) 7]Pascal et al. , Tetrahedron Letters, 1994, Vol. 35, No. 34,6291-629
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題在如上述背景技術(shù)所示的肽硫酯化法中，可進(jìn)行硫酯化之肽僅限于固相合成的肽鏈或作為蛋白質(zhì)剪接的標(biāo)的之肽鏈。此為任何這些方法皆需要有非天然氨基酸衍生物、連接物、特定三維結(jié)構(gòu)等之故。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種將多肽鏈以化學(xué)方式轉(zhuǎn)換成肽硫酯的新穎方法。用以解決問題的方式本發(fā)明人考慮到須有將肽序 列中的天然氨基酸殘基作為目標(biāo)，有選擇地使肽C末端活性化的方法。只要為此種方法，即使是以生物合成等任何方法所得之肽，亦可有選擇地使肽鏈活性化而進(jìn)行硫酯化。因此，本發(fā)明人著眼于天然氨基酸中作為特殊含硫氨基酸的半胱氨酸殘基。爾后發(fā)現(xiàn)如下圖所示在半胱氨酸殘基的硫醇基上導(dǎo)入_C( = X)-R:基，在有機(jī)溶劑中使具有以-NH-C ( = Y)NHR3表示之離去基團(tuán)的化合物與之反應(yīng)，以在半胱氨酸殘基之N末端側(cè)的肽鍵的羧基上附加-NH-C( = Y)NHR3基，由此將上述肽鍵切斷且C末端之一側(cè)的肽片段被切除。更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過下述與硫醇的交換反應(yīng)即可將所得肽鏈轉(zhuǎn)換成肽硫酯使硫醇化合物與附加有此-NH-C( = Y)NHR3基的肽鏈在緩沖溶液中反應(yīng)，由此使上述硫醇的硫醇基與已鍵合有-NH-C ( = Y) NHR3基的羰基碳鍵合，上述-NH-C ( = Y) NHR3基則脫離。作為上述一例，具體而言，首先在半胱氨酸殘基的硫醇基上導(dǎo)入硫代甲酸酯(thionoformate)基。然后，在有機(jī)溶劑中使此硫代甲酸酯基與N-乙酰胍(N_acetylguanidine)反應(yīng)，以在半胱氨酸殘基的N末端側(cè)發(fā)生肽鏈的切斷，即制得C末端附加有N-乙酰胍基的肽鏈。再者，使此附加有N-乙酰胍基之肽鏈在緩沖溶液中與硫醇R4-SH反應(yīng)，即轉(zhuǎn)換為肽硫酯。 又發(fā)現(xiàn)由上述所得之對(duì)C末端進(jìn)行N-乙酰胍化反應(yīng)之肽鏈及肽硫酯可利用于NCL法中。
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權(quán)利要求
1.肽硫酯的制造方法，包括以下步驟(a) (C) (a)步驟在具有半胱氨酸殘基的肽鏈中，使由以下式(I)表示的化合物A與所述半胱氨酸殘基的硫醇基反應(yīng)而使R2脫離，以制造第I中間體
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，X為硫原子。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，R1為-O-C6芳基。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，R2為鹵素原子或者取代或未取代的-S_C6_1(I 芳基。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，Y為NH基。
6.如權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，R3為乙?；?。
7.如權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述步驟(c)中，所述硫醇為由以下式(III)表示的硫醇 R4-SH (式 III) 式中，R4為選自取代或未取代之苯甲基、取代或未取代之芳基、及取代或未取代之烷基中的任一種基團(tuán)。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述肽鏈為重組蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述肽鏈為含有精制用標(biāo)記物的重組蛋白質(zhì)。
10.多肽的制造方法，包括將由權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的方法而得到的肽硫酯與N末端上具有半胱氨酸的肽鏈通過連接法結(jié)合的步驟。
11.第2中間體的制造方法，所述第2中間體用于權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的肽硫酯的制造方法，所述第2中間體的制造方法包括以下步驟(a)或(b) (a)步驟在具有半胱氨酸殘基的肽鏈中，使由以下式(I)表示的化合物A與所述半胱氨酸殘基的硫醇基反應(yīng)而使R2脫離，以制造第I中間體 X (I)
12.在C末端上具有-NH-C( = Y) NHR3基的肽鏈，其中，Y為氧原子或NH基，R3為氫原子、?；蛲檠豸驶?。
13.多肽的制造方法，包括將權(quán)利要求12所述的在C末端上具有-NH-C( = Y) NHR3基的肽鏈與N末端上具有半胱氨酸的肽鏈通過連接法結(jié)合的步驟。
14.除去附加于重組蛋白質(zhì)的C末端側(cè)的精制用標(biāo)記物的方法，包括以下步驟(a) (C) (a)步驟在C末端上含有精制用標(biāo)記物的重組蛋白質(zhì)中，使由以下式(I)表示的化合物A與半胱氨酸殘基的硫醇基反應(yīng)而使R2脫離，以制造第I中間體 X (I) 式中，X為硫原子或氧原子，R1及R2為離去基團(tuán)； (b)步驟在有機(jī)溶劑中，使由以下式(II)表示的化合物B與所述第I中間體反應(yīng)，以在所述半胱氨酸殘基與鄰接于所述半胱氨酸殘基之N末端側(cè)的氨基酸之間形成肽鍵的羧基上附加-NH-C ( = Y) NHR3基，并切斷所述肽鍵，從而制得作為第2中間體的比被切斷的所述肽鍵更靠近N末端側(cè)的肽片段 Y H2NN—R3H(I I) 式中，Y為氧原子、硫原子或NH基，R3為氫原子、?；蛲檠豸驶灰约? (c)步驟使硫醇與所述第2中間體反應(yīng)，以使C末端的-NH-C( = Y) NHR3基與硫醇基進(jìn)行交換，從而對(duì)所述第2中間體的C末端進(jìn)行硫酯化 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將肽鏈以化學(xué)方式轉(zhuǎn)換成肽硫酯的新穎方法。本發(fā)明人在肽鏈中著眼于半胱氨酸殘基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在半胱氨酸殘基的硫醇基上導(dǎo)入-C(＝X)-R1基，然后在有機(jī)溶劑中使所得肽與具有以-NH-C(＝Y(jié))NHR3表示的離去基團(tuán)的化合物反應(yīng)，在半胱氨酸殘基的N末端側(cè)肽鍵的羧基上附加-NH-C(＝Y(jié))NHR3基，由此將上述肽鍵切斷且將C末端側(cè)的肽片段切除。更進(jìn)一步，當(dāng)使所得的具有此-NH-C(＝Y(jié))NHR3基的肽鏈與硫醇在緩沖溶液中反應(yīng)，則會(huì)發(fā)生硫醇交換反應(yīng)，即，硫醇的硫醇基將鍵合至已鍵合有-NH-C(＝Y(jié))NHR3基的羰基碳，而使上述-NH-C(＝Y(jié))NHR3基脫離。由此即可轉(zhuǎn)換成肽硫酯。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102803286SQ20108002842
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者梶原康宏, 岡本亮, 坂本泉, 石井一之 申請(qǐng)人:大塚化學(xué)株式會(huì)社