專利名稱：親脂性多聚核苷酸綴合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于將多聚核苷酸遞送至細胞從而用于治療、研究和/或診斷目的的親脂性的核酸綴合物。本發(fā)明在某些實施方案中涉及靶向內源性微小RNAOiiicroRNA)功能的多聚核苷酸的遞送。
背景技術：
寡核苷酸治療策略依賴于將親水性、高度帶電荷的以及陰離子核酸分子通過跨越構成細胞膜的疏水性磷脂雙層遞送至細胞質。已經研究了疏水性寡核苷酸綴合物增強細胞攝取的能力。例如膽固醇綴合物可以與脂蛋白結合，更具體地為IDL和LDL顆粒。所述顆粒含有ApoE和ApoB-IOO脂蛋白，其靶向LDL細胞表面受體并因此可以通過脂蛋白介導的胞吞作用而內攝(internalize)。這些受體主要在肝臟中發(fā)現(xiàn)，但也在脂肪組織、心臟和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)。另外，親脂性側基可以通過嵌入至磷脂雙層中從而協(xié)助將它們的綴合物“錨定”至細胞膜上，從而協(xié)助寡核苷酸的被動內攝作用。為了保持用于其所需的治療作用的多聚核苷酸的功能上和結構上的完整性，這樣的親脂性分子或取代基必須與多聚核苷酸一起制造或連接至多聚核苷酸上。例如治療性多聚核苷酸可以通過與大的和/或復雜的核糖核蛋白(RNP)復合物之間發(fā)生相互作用而起作用，和/或可以靶向這些復合物的RNA組分。因此，親脂性修飾應當不損壞用于與細胞因子和分子靶標之間發(fā)生相互作用的多聚核苷酸的易接近性。微小RNA(miR)已經牽涉至很多生物學過程中，包括調節(jié)發(fā)育時機、凋亡、脂肪代謝以及造血細胞分化等，并由此代表了相對新的類型的治療靶標。miR為小的、非蛋白編碼的長度為約18至約25個核苷酸的RNA，并且當mRNA的序列完全互補時通過促進其降解，或當它們的序列含有錯配時通過抑制翻譯而起靶標mRNA阻抑物的作用。成熟的miRNA鏈結合至RNA誘導沉默復合體(RISC)中，在此其通過堿基對的互補性與其靶標RNA相結合。需要用于有效地將治療性多聚核苷酸，包括miR和miR抑制劑遞送至細胞，同時不實質上或顯著性地削弱與分子靶標之間的相互作用的組合物和方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了親脂性多聚核苷酸綴合物，以及將治療性多聚核苷酸遞送至需要治療的哺乳動物細胞或哺乳動物患者的方法。本發(fā)明進一步提供合成親脂性多聚核苷酸綴合物的方法。根據本發(fā)明，所述綴合物包括設計為模擬或靶向細胞miRNA的膽固醇和多聚核苷酸的綴合物。親脂性部分，諸如膽固醇或膽固醇衍生物通過烴基與多聚核苷酸相間隔。由于親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子，本發(fā)明增強了親脂性部分和細胞膜之間的相互作用從而實現(xiàn)了有效地進入細胞中。綴合物并不實質上或顯著性地破壞多聚核苷酸發(fā)揮其治療作用的能力。在一個方面，本發(fā)明提供親脂性多聚核苷酸綴合物以及包含其的藥物組合物和制齊U。根據該方面，親脂性部分可以為膽固醇或本申請所描述的類似的親脂性結構，或與膜磷脂相結合的其它分子。多聚核苷酸可以是基于DNA或RNA的，和/或可以體現(xiàn)為一種或多種核酸修飾形式，例如諸如經修飾的多聚核苷酸主鏈或一種或多種經修飾的核苷單元。例如經修飾的主鏈可以為完全或部分的硫代磷酸酯(phosphorothioate)修飾的主鏈。例如可以為通過反義抑制模擬miRNA或靶向miRNA而設計多聚核苷酸序列。多聚核苷酸和親脂性部分通過基本上呈線性的烴部分(例如連接基)相間隔以及共軛連接。例如，烴連接基可以綴合至多聚核苷酸的5’和/或3’末端。本發(fā)明的綴合物在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團，諸如具有可交換質子的基團。例如，烴可以通過相對非極性的基團諸如醚或硫醚連接鍵綴合至親脂性部分(例如膽固醇)，并且疏水性連接基可以包括約3至約15個碳原子。在親脂性部分附近缺少顯著極性例如具有可交換質子的基團使該部分在遞送至細胞或患者時更好地嵌入至膜磷脂中。在第二個方面中，本發(fā)明提供將多聚核苷酸遞送至哺乳動物細胞的方法，以及用于在哺乳動物患者中治療或預防病癥進展的方法。在該方面中，本發(fā)明包括給藥多聚核苷酸，其作為與膽固醇或本申請所描述的其它親脂性部分的綴合物。多聚核苷酸可以為miRNA 或miRNA抑制劑(例如具有設計為抑制miRNA的表達或活性的核苷酸序列)。在這樣的實施方案中，患者患有與RNA表達諸如miRNA表達有關的病癥。這樣的病癥包括，例如心臟肥大、心肌梗死、心力衰竭(例如充血性心力衰竭)、血管損傷、再狹窄、和/或病理性心纖維化寸寸。在第三方面，本發(fā)明提供用于合成多聚核苷酸綴合物的方法。本發(fā)明提供合成在 5’和/或3’末端結合，或沿著多聚核苷酸主鏈通過烴部分或連接基綴合的親脂性部分的多聚核苷酸的方法。在某些實施方案中，若親脂性部分為醇，諸如留醇，親脂性部分與具有合適的末端官能團的烴成醚。該醚連接的中間體可以進一步反應從而制備合適的與固相核酸合成相容的試劑。例如醚連接的中間體可以進一步反應從而制備用于轉化成磷酸酯(例如在多聚核苷酸的合成期間偶聯(lián)至核苷酸的5’羥基)的末端亞磷酰胺(例如通過醚連接)。 可替換地，或者另外，醚連接的中間體可以進一步反應從而制備合適的用于偶聯(lián)(例如通過酰胺化)至用于核酸合成的合適的支持物的端基?？商鎿Q地，本發(fā)明提供用于在多聚核苷酸的合成完成之后，使用例如羰基加成-消除/還原胺化、酰胺化、馬來酰亞胺-巰基偶聯(lián)、水性狄爾斯-阿爾德(aqueous Diels-Alder)和“點擊”化學的方法合成膽固醇與多聚核苷酸的綴合物的方法。


圖1圖示了與傳統(tǒng)綴合物進行比較的本發(fā)明示例性的親脂性(膽固醇)綴合物。根據本發(fā)明，膽留烯環(huán)結構的附近不具有極性基團，諸如具有可交換質子的那些。圖2圖示了根據本發(fā)明的示例性的綴合物的合成，包括用于在5’位(6)偶聯(lián)至核苷酸的亞磷酰胺中間體以及用于偶聯(lián)至固體支持物(7)的琥珀酸酯中間體的制備。圖3圖示了示例性的3’ -膽固醇與錨定至固體支持物上的膽固醇連接的中間體的綴合物(1-(( 二 G-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基))-12-(膽留-5-烯-3β-氧基) 十二-3-醇功能化的CPG)的合成。圖4圖示了當寡核苷酸被互補的官能團功能化時，膽甾-5-烯-3-氧基烷醇(A) 可以經修飾得到可經常規(guī)的生物綴合技術諸如酰胺化(B)、狄爾斯-阿爾德生物綴合(C)和 “點擊”生物綴合⑶修飾的官能團。圖5為響應于用示于表2中的化學物質進行的IV注射的miR-208的Northern分析。圖6顯示了與注射了鹽水的動物相比較響應于用標明的化學物質進行的IV注射的miR-208敲低的實時定量結果。
具體實施例方式主動和/或被動細胞轉運機制可得益于親脂性側基，包括對于磷脂雙層而言是天然的那些，其應當會有效地填充于雙層中。因此，本發(fā)明提供綴合物，其含有足夠疏水性的連接基以有效地填充于磷脂雙層中，從而增強多聚核苷酸綴合物對細胞膜的親和力，或可替換地，提供可作為遞送媒介物的脂質體或膠束。寡核苷酸-膽固醇型的綴合物通常使用膽甾醇基氨基甲酸酯連接(1 inkage)，所述連接導致含有緊密靠近留環(huán)結構的可交換質子的極性基團。這些綴合物并不具有最佳的親脂性質，且極性連接點可能會阻礙有效的磷脂雙層的填充。本發(fā)明提供了親脂性多聚核苷酸綴合物，以及將治療性多聚核苷酸遞送至需要治療的哺乳動物細胞或哺乳動物患者的方法。本發(fā)明進一步提供合成親脂性多聚核苷酸綴合物的方法。根據本發(fā)明，綴合物可被設計成靶向細胞RNA，包括miRNA。例如，綴合物可通過反義抑制靶向細胞miRNA，或可被設計成模擬miRNA。親脂性部分，諸如膽固醇或其它親脂性基團，通過烴連接基與多聚核苷酸相間隔。由于在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子，本發(fā)明促進親脂性部分與膜磷脂之間的相互作用，從而提供向細胞中的有效進入。綴合物并不實質上或顯著性地破壞多聚核苷酸發(fā)揮其治療作用的能力。親脂性部分和烴間隔物親脂性部分為能夠嵌入至磷脂雙層諸如細胞膜中的可溶于脂肪的部分，或遞送媒介物諸如本申請所披露的脂質體或膠束。親脂性部分可以通過醚或硫醚連接鍵綴合至烴間隔物(如下所述)。示例性的親脂性部分包括膽固醇和膽固醇衍生物(包括膽留烯、膽甾烷和膽留二烯)、膽汁酸(諸如膽酸、去氧膽酸和去氫膽酸)、留醇、類固醇，或其它可溶于脂肪的醇或硫醇。在某些實施方案中，親脂性部分為膽固醇或膽固醇衍生物，或如美國專利7，202，227中披露的膽酸或膽酸衍生物，其引入本申請中作為參考。這樣的衍生物包括 C1-C4烷基(例如甲基)取代的膽固醇或膽酸結構。例如，在某些實施方案中，膽固醇或衍生物可具有下述結構
權利要求
1.親脂性多聚核苷酸綴合物，包括多聚核苷酸和親脂性部分，其中親脂性部分與多聚核苷酸通過烴連接基相間隔，從而在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子。
2.權利要求1的綴合物，其中親脂性部分能夠嵌入至磷脂雙層中。
3.權利要求1或2的綴合物，其中親脂性部分為膽留醇基醚或其衍生物。
4.權利要求1或2的綴合物，其中親脂性部分為膽留烯、膽留烷或膽留二烯。
5.權利要求1或2的綴合物，其中親脂性部分為膽汁酸。
6.權利要求5的綴合物，其中膽汁酸為膽酸、去氧膽酸和去氫膽酸。
7.權利要求1或2的綴合物，其中親脂性部分為留醇或類固醇。
8.權利要求1或2的綴合物，其中親脂性部分為可溶于脂肪的醇或可溶于脂肪的硫醇。
9.權利要求1-8任一項的綴合物，其中烴連接基使顯著極性的基團和/或可交換質子與親脂性部分通過3至約15個原子相分隔。
10.權利要求9的綴合物，其中烴連接基使顯著極性的基團和/或可交換質子與親脂性部分通過6、7、8或9個原子相分隔。
11.權利要求10的綴合物，其中烴連接基包括環(huán)烴。
12.權利要求1-11任一項的綴合物，其中烴連接基通過醚或硫醚連接鍵綴合至親脂性部分。
13.權利要求1-12任一項的綴合物，其中烴連接基包括任選取代的C2-C15亞烷基或任選取代的C2-C15亞烯基。
14.權利要求13的綴合物，其中烴連接基包括C4-C10飽和烴或C4-C8飽和烴。
15.權利要求1-14任一項的綴合物，其中烴連接基在碳鏈中含有一個或多個雜原子。
16.權利要求15的綴合物，其中烴連接基在與親脂性部分相對的末端上綴合至多聚核苷酸。
17.權利要求16的綴合物，其中烴連接基通過磷酸酯或醚連接鍵綴合至多聚核苷酸上。
18.權利要求17的綴合物，其中烴連接基通過多聚核苷酸的5’位綴合。
19.權利要求17的綴合物，其中烴連接基通過多聚核苷酸的3’位綴合。
20.權利要求1-19任一項的綴合物，其中綴合物具有選自結構(I)-(XIII)的結構。
21.權利要求1-20任一項的綴合物，其中多聚核苷酸為基于DNA的。
22.權利要求1-20任一項的綴合物，其中多聚核苷酸為基于RNA的。
23.權利要求1-22任一項的綴合物，其中多聚核苷酸具有經修飾的多聚核苷酸主鏈。
24.權利要求23的綴合物，其中多聚核苷酸含有一個或多個硫代磷酸酯修飾。
25.權利要求I-M任一項的綴合物，其中多聚核苷酸具有一個或多個經修飾的核苷單兀。
26.權利要求1-25任一項的綴合物，其中多聚核苷酸具有一個或多個單鏈區(qū)域和一個或多個雙鏈區(qū)域。
27.權利要求沈的綴合物，其中多聚核苷酸為反義寡核苷酸、短干擾RNA(siRNA)、雙鏈 RNA (dsRNA)、單鏈 RNA(ssRNA)、微小 RNA(miRNA)、短發(fā)夾 RNA(shRNA)或核酶。
28.權利要求27的綴合物，其中多聚核苷酸為antagomir。
29.權利要求27或28的綴合物，其中多聚核苷酸在長度上為約5-約50個核苷酸。
30.權利要求27或觀的綴合物，其中多聚核苷酸在長度上為約18-約30個核苷酸。
31.權利要求27或28的綴合物，其中多聚核苷酸包括與成熟miRNA至少約75%互補的序列。
32.權利要求27或觀的綴合物，其中多聚核苷酸包括與列于表1的成熟miRNA至少約 75%互補的序列。
33.權利要求27或觀的綴合物，其中多聚核苷酸包括與成熟miRNA100%互補的序列。
34.權利要求27或28的綴合物，其中多聚核苷酸包括與列于表1的成熟miRNA100% 互補的序列。
35.權利要求27或觀的綴合物，其中多聚核苷酸具有設計為模擬細胞miRNA的序列。
36.權利要求27或觀的綴合物，其中多聚核苷酸具有設計為模擬列于表1的miRNA的序列。
37.權利要求1-36任一項的綴合物，其中多聚核苷酸在2’或4’位包括一個或多個鎖核酸、核酸肽主鏈和/或糖修飾。
38.權利要求1-37任一項的綴合物，其中綴合物具有1-5個親脂性部分。
39.藥物組合物，包括為遞送至患者而制備的權利要求1-38任一項的綴合物。
40.權利要求39的藥物組合物，其中綴合物被制備成膠態(tài)分散系統(tǒng)，大分子復合物、納米膠囊、微球、珠子、水包油乳劑、膠束、混合膠束或脂質體的形式。
41.權利要求40的藥物組合物，其中親脂性部分將多聚核苷酸綴合物錨定至脂質體中。
42.權利要求39-41任一項的藥物組合物，其中組合物被制備成用于皮內遞送、皮下遞送、肌內遞送、腹膜內或靜脈內遞送的形式。
43.權利要求42的藥物組合物，其中組合物被制備成用于通過心臟導管系統(tǒng)給藥的形式。
44.用于將多聚核苷酸遞送至哺乳動物細胞的方法，包括給藥根據權利要求1-38任一項的綴合物形式的多聚核苷酸。
45.用于將多聚核苷酸遞送至哺乳動物患者的方法，包括給藥根據權利要求1-38任一項的綴合物形式的多聚核苷酸。
46.權利要求44或45的方法，其中多聚核苷酸為miRNA或miRNA抑制劑。
47.權利要求46的方法，其中患者患有與miRNA表達有關的病癥。
48.權利要求47的方法，其中所述病癥為下述的一種或多種心臟肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管損傷和病理性心纖維化。
49.用于合成親脂性多聚核苷酸綴合物的方法，包括制備帶有基本上呈線性的烴鏈的親脂性部分由此來制備第一中間體，其中所述烴鏈具有末端官能團，其中所述親脂性部分通過烴連接基與末端官能團相間隔，從而在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子，從所述的第一中間體制備具有適合于結合至多聚核苷酸鏈的官能團的第二中間體， 在固相合成期間將第二中間體結合至多聚核苷酸鏈。
50.權利要求49的方法，其中親脂性部分為留醇，且第一中間體為醚連接的中間體。
51.權利要求49或50的方法，其中基本上呈線性的烴連接基為C3-C15烷基、C3-C15 烯基、C3-C15炔基，并且其中所述烴為任選取代的。
52.權利要求51的方法，其中基本上呈線性的烴連接基為C4-C8烷基、C4-C8烯基、 C4-C8炔基，并且其中所述烴為任選取代的。
53.權利要求49-52任一項的方法，其中使第一中間體反應以制備作為第二中間體的亞磷酰胺。
54.權利要求53的方法，其中亞磷酰胺在固相多聚核苷酸合成期間被轉化成磷酸酯。
55.權利要求49-M任一項的方法，其中使第一中間體反應以制備用于偶聯(lián)至支持物的合適的端基，從而形成多聚核苷酸鏈的3’末端。
56.權利要求49-55任一項的方法，其中第二中間體是從具有通過至少一個碳原子隔開的兩個相互區(qū)別的羥基基團的化合物制備的。
57.用于合成多聚核苷酸綴合物的方法，包括制備帶有烴鏈的親脂性部分從而制備中間體，其中所述烴鏈具有末端官能團，其中親脂性部分通過烴連接基與末端官能團相間隔，從而在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子，將中間體偶聯(lián)至多聚核苷酸。
58.權利要求57的方法，其中所述中間體通過選自羰基加成-消除/還原胺化、酰胺化、馬來酰亞胺-巰基偶聯(lián)或水性狄爾斯-阿爾德的反應或反應系列偶聯(lián)至多聚核苷酸。
全文摘要
本申請公開了包括多聚核苷酸-膽固醇綴合物的親脂性多聚核苷酸綴合物，以及采用所述綴合物將治療性多聚核苷酸遞送至需要治療的哺乳動物細胞或哺乳動物患者的方法。本公開進一步提供了合成親脂性多聚核苷酸綴合物的方法。所述綴合物被設計為模擬或靶向細胞miRNA。所述親脂性部分，諸如膽固醇或膽固醇衍生物，與多聚核苷酸通過基本上呈線性的烴基團相間隔。由于在親脂性部分附近缺少顯著極性的基團和/或可交換質子，所述親脂性部分和細胞膜之間的相互作用增強了，以提供向細胞中的有效進入。
文檔編號C07H21/00GK102459301SQ201080029886
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權日2009年5月5日
發(fā)明者K.瓦格爾, W.S.馬沙爾 申請人:米拉根醫(yī)療公司