專利名稱：用于治療或預(yù)防眼病的TNFα拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合的制作方法
用于治療或預(yù)防眼病的TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合
背景技術(shù)：
視力損耗(Vision loss)已經(jīng)成為發(fā)達經(jīng)濟的一個主要健康問題。失明或視力不良影響著超過300萬40歲以上的美國公民，且這隨著年齡顯著增加。例如，年齡為80歲或以上的那些人占美國人口的約8%，但是盡管如此，占失明的幾乎70%。通常與年齡有關(guān)的眼病包括年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、白內(nèi)障、糖尿病黃斑水腫、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)和青光眼。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是發(fā)達國家中失明的主要原因。AMD存在2個主要的臨床表現(xiàn)。萎縮性(干燥性)AMD的特征在于視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)和視神經(jīng)視網(wǎng)膜的變性。萎縮性AMD的早期與玻璃疣在RPE細胞層下的形成有關(guān)。早期的萎縮性AMD可以發(fā)展成晚期疾病，其中RPE徹底變性，并在黃斑區(qū)域中形成邊界清楚的RPE萎縮區(qū)域“地理性萎縮”。在該疾病形式中，RPE的變性導(dǎo)致黃斑視桿和視錐的繼發(fā)性死亡，且在這些情況下，這會導(dǎo)致嚴重的年齡相關(guān)的視力損耗。一部分AMD患者會發(fā)展，可以視作所述疾病的不同形式或另一種并發(fā)癥。大約10-20%的AMD患者會發(fā)展脈絡(luò)膜新血管生成(CNV)。當(dāng)發(fā)生時， 該疾病形式稱作“濕性AMD”，且這可以與一些最嚴重的視力損耗相關(guān)聯(lián)。在濕性AMD中，新的脈絡(luò)膜血管生長穿過玻璃膜中的裂縫，并增殖進入RPE和視神經(jīng)視網(wǎng)膜中以及下面。目前沒有確定的方式用于治療非常流行的萎縮型AMD，也沒有確定的方式用于防止早期干燥的 AMD 發(fā)展成地理性萎縮或濕性 AMD (Petrukhin K, Expert Opin Ther Targets (2007) 11: 625-639)。糖尿病黃斑水腫(DME)是糖尿病患者的閱讀視力損耗的最常見的原因。01^在四歲或以上的已經(jīng)具有糖尿病的個體中的患病率是大約30% (Klein R等人Ophthalmology 1984: 91; 1464-1474)。DME與IL-6、VEGF和其它細胞因子的水平的增加有關(guān)，存在血液-視網(wǎng)膜屏障的泛化故障，從異常的視網(wǎng)膜毛細血管滲漏，并在視網(wǎng)膜下空間形成微動脈瘤。當(dāng)前的DME治療的目標(biāo)是，減輕水腫和滲漏，產(chǎn)生提高的視敏度。良好的血糖控制和激光光凝術(shù)或抗血管生成治療的目標(biāo)是，防止或延遲糖尿病眼的中央黃斑區(qū)的進一步衰退。還已經(jīng)使用皮質(zhì)類固醇的玻璃體內(nèi)注射。在穿過視網(wǎng)膜靜脈的血流阻塞以后，發(fā)生視網(wǎng)膜靜脈阻塞。這可能是由于緊密關(guān)聯(lián)的視網(wǎng)膜動脈中的血塊形成或壓力增加(由糖尿病、青光眼或高血壓引起)。流出視網(wǎng)膜的血流量的減少，會導(dǎo)致眼血管中血壓的泛化增加和眼中氧水平的降低。這又會導(dǎo)致異常的血管生長、出血和水腫、組織損傷和視力損耗。RVO存在2個主要形式視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)。突然的視力模糊或視力損耗是RVO的常見特征。眼內(nèi)的皮質(zhì)類固醇已經(jīng)被用于治療RV0，盡管具有相關(guān)的白內(nèi)障發(fā)展和眼內(nèi)壓升高的危險(Kiernan DF 等人 Exp Opinion in Pharmacotherapy 2009 10(15) 2511-2525)。RVO 的患病率是 0. 2% (CRVO)至 0. 7% (BRVO)。葡萄膜炎主要影響工作年齡的人，且包括葡萄膜(虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜)的炎癥。前葡萄膜炎是葡萄膜炎的最常見形式，占葡萄膜炎病例的約75%，它主要影響虹膜和睫狀體。葡萄膜炎被視作一種自身免疫病，并且病原學(xué)仍然未知。在約50%的病例中，存在與HLA-B27的關(guān)聯(lián)。涉及后葡萄膜(即脈絡(luò)膜)的炎癥被稱作后葡萄膜炎，且視網(wǎng)膜的繼發(fā)累及是常見的。葡萄膜炎主要是，⑶4 T-細胞浸潤進眼隔室中的炎性疾病(Paroli MP等人2007 17(6) 938-942 Eur J Ophthalmology) 0皮質(zhì)類固醇仍然是治療的主要藥物，局部地眼周地或全身地給藥。TNF-α (腫瘤壞死因子-α)是一種促炎細胞因子，其已經(jīng)與許多眼炎癥相關(guān)聯(lián) (Theodossiadis ^A , Am. J. Ophthalmol. (2009) 147: 825—830)。已知VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)和VEGF-受體會刺激脈絡(luò)膜血管和視網(wǎng)膜血管的血管生成，并調(diào)節(jié)這些血管的血管滲透性(Gragoudas ，N. Engl. J. Med (2004) 351: 2805)。新生血管形成和滲漏是濕形式的年齡相關(guān)性黃斑變性的突出特征?，F(xiàn)在已經(jīng)批準(zhǔn)使用適體培加尼布(Macugen ，其中和VEGF-A亞型165)和ranibizumab (Lucentis ,其阻斷VEGF-A的所有亞型)。炎癥應(yīng)答也在新生血管形成中起重要的病理生理學(xué)作用(&ikuri藥乂，^west Ophthalmol Vis Sci (2003) 44: 5349-5354; Oh ^ Λ Invest Ophthalmol Vis Sci (1999) 40: 1891-1898; Shi ^A , Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334。與TNFa拮抗劑有關(guān)的參考文獻包括01son等>1，Arch Opthalmol (2007) 125: 1221-1224; Shi ^A , Exp Eye Res (2006) 83: 1325_1334Kociok 箏yl，Invest Ophthalmol Vis Sci (2006) 11: 5057-5065Markomichelakis ^ A km J Ophthalmol (2005) 139: 537-540。研究表明，英夫利昔單抗的玻璃體內(nèi)注射可能引起嚴重的眼內(nèi)炎癥反應(yīng)，所述炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為劑量相關(guān)的。使用阿達木單抗沒有觀察到這種不利事件(計劃4247， 海報D913，用于治療頑固性糖尿病黃斑水腫的玻璃體內(nèi)的TNF抑制劑來自泛美共同視網(wǎng)膜研究組的一項初步研究Gntravitreal TNF inhibitors in the Treatment of Refractory Diabetic Macular Edema: A Pilot Study from the Pan American Collaborative Retina Study Group)，和計劃4749，海報D1087,玻璃體內(nèi)的TNF 抑制劑的眼的和全身的安全性來自泛美共同視網(wǎng)膜研究組、視力和眼科學(xué)研究協(xié)會(ARVO)的一項初步石if究(Ocular and Systemic Safety of Intravitreal TNF Inhibitors: A Pilot Study From the Pan American Collaborative Retina Study Group, The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) )，2010 年 5 月 2—6 日· Ft. Lauderdale USA)。需要可有效地預(yù)防眼疾病進展并為更廣泛的患者群體提供改善的視力的治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合，具體地，所述組合用于治療眼病。抗-VEGF方案和抗-TNF方案都具有治療AMD的基礎(chǔ)，這些模態(tài)在機理上可能不重疊，所以對抗-VEGF方案療法沒有成功地做出應(yīng)答的患者可能對抗-TNF治療做出應(yīng)答，反之亦然。與抗-VEGF分子的抗-血管生成活性相組合的抗-TNF的抗炎益處，會在治療這樣
6的眼病中提供提高的效能。本發(fā)明涵蓋了施用單獨的TNF α拮抗劑和單獨的VEGF拮抗劑的組合(即分開的 TNFa和VEGF拮抗劑分子)。另外，本發(fā)明涵蓋了施用具有雙靶向功能性的單個構(gòu)建體，所述構(gòu)建體起TNFa拮抗劑和VEGF拮抗劑的作用(即能夠結(jié)合和抑制、優(yōu)選地阻斷TNF α或 TNFa受體的功能，并結(jié)合和抑制、優(yōu)選地阻斷VEGF或VEGF受體的功能)。單個構(gòu)建體可以基于抗體骨架或其它這樣的合適的骨架。受體-Fc融合體也被視作本發(fā)明的一部分。本發(fā)明具體地涉及抗原結(jié)合蛋白。具體地，本發(fā)明涉及TNF a /VEGF雙靶向單個構(gòu)建體，其中所述TNF α拮抗劑部分是或源自人抗-TNFa抗體。所述TNFa抗體可以是阿達木單抗或戈利木單抗。本發(fā)明具體地涉及用于治療眼病的抗原結(jié)合蛋白，其包含與一個或多個表位-結(jié)合域相連的蛋白骨架，其中所述抗原結(jié)合蛋白具有至少2個抗原結(jié)合位點，其中的至少一個是來自表位結(jié)合域，且其中的至少一個是來自成對的VH/VL結(jié)構(gòu)域，且其中至少一個抗原結(jié)合位點能夠結(jié)合TNF α或TNF α受體例如TNFR1，且至少一個抗原結(jié)合位點能夠結(jié)合 VEGF或VEGF受體例如VEGFR2。與一個或多個表位-結(jié)合域相連的受體-Fc融合體也是本發(fā)明的一部分，例如與 VEGF或VEGF受體-結(jié)合域相連的TNF α受體-Fc融合體，或與TNF α或TNF α受體-結(jié)合域相連的VEGF受體-Fc融合體。本發(fā)明提供了一種雙靶向抗原結(jié)合分子，其包含TNFa拮抗劑部分、VEGF拮抗劑部分以及使所述TNF α拮抗劑部分與所述VEGF拮抗劑部分相連的連接物，其中所述TNF a 拮抗劑部分包含在表1中列出的任一種TNFa拮抗劑的氨基酸序列；所述VEGF拮抗劑部分包含在表2中列出的任一種VEGF拮抗劑的氨基酸序列；所述連接物是長度為1 - 150個氨基酸的氨基酸序列；且所述雙靶向分子不是DMS4000或DMS4031。連接物也可以是基于非肽的連接物，包括，例如，聚乙二醇(PEG)和基于PEG的連接物。本發(fā)明也提供了一種編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸序列，例如編碼本文所述的任意抗原結(jié)合蛋白的重鏈的多核苷酸序列，和編碼本文所述的任意抗原結(jié)合蛋白的輕鏈的多核苷酸。這樣的多核苷酸代表與等效多肽序列相對應(yīng)的編碼序列。但是，應(yīng)該理解，可以將這樣的多核苷酸序列與起始密碼子、適當(dāng)?shù)男盘栃蛄泻徒K止密碼子一起克隆進表達載體中。本發(fā)明也提供了一種轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的重組宿主細胞，其包含一個或多個編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白(例如本文所述抗原結(jié)合蛋白的重鏈和輕鏈)的多核苷酸。本發(fā)明另外提供了一種用于生產(chǎn)本文所述的任意抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括下述步驟在合適的培養(yǎng)基(例如無血清的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)宿主細胞，所述宿主細胞包含至少一種含有編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸的載體，例如第一載體和第二載體，所述第一載體包含編碼本文所述的抗原結(jié)合蛋白的重鏈的多核苷酸，且所述第二載體包含編碼本文所述的抗原結(jié)合蛋白的輕鏈的多核苷酸。本發(fā)明提供了一種適合全身遞送或向眼局部遞送的藥物組合物，其包含本文所述的抗原結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可以另外包含其它的活性劑。本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療眼病的選自下述的TNFa拮抗劑阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、ESBA105、PEP1-5-19、PEP1-5-490、PEP1-5-493、SEQ ID NO: 2 的adnectin、戈利木單抗、塞妥珠單抗、ALK-6931以及包含SEQ ID NO:30的重鏈和SEQ ID N0:31的輕鏈的抗體，其中所述TNFa拮抗劑將與選自下述的VEGF拮抗劑組合施用 貝伐單抗、ranibizumab、r84、afliberc印t、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050、 PRS-051、MP0012、CT-322、ESBA903、EPI-0030、EPI-0010 和 DMS1571。本發(fā)明也提供了一種用于預(yù)防或治療眼病的選自下述的VEGF拮抗劑貝伐單抗、 ranibizumab、r84、afliberc印t、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050, PRS-051、 MPOO12, CT-322、ESBA903、EPI-0030, EPI-0010 和 DMS1571，其中所述 VEGF 拮抗劑將與選自下述的TNFa拮抗劑組合施用阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、ESBA105、 PEP1 -5-19, PEP1 -5-490, PEP1 -5-493, SEQ ID NO: 2 的 adnectin、戈利木單抗、塞妥珠單抗、 ALK-6931以及包含SEQ ID NO:30的重鏈和SEQ ID N0:31的輕鏈的抗體。本發(fā)明也提供了一種雙靶向抗原結(jié)合分子，其包含TNFa拮抗劑部分、VEGF拮抗劑部分以及使所述TNFa拮抗劑部分與所述VEGF拮抗劑部分相連的連接物，其中
所述TNFa拮抗劑部分包含在表1中列出的任一種TNFa拮抗劑的氨基酸序列； 所述VEGF拮抗劑部分包含在表2中列出的任一種VEGF拮抗劑的氨基酸序列； 所述連接物是長度為1 - 150個氨基酸的氨基酸序列；且所述雙靶向分子不是DMS4000或DMS4031。本發(fā)明也提供了一種雙靶向抗原結(jié)合分子，其包含TNFa拮抗劑部分、VEGF拮抗劑部分以及使所述TNFa拮抗劑部分與所述VEGF拮抗劑部分相連的連接物，其中
所述TNFa拮抗劑部分包含在表1中列出的任一種TNFa拮抗劑的氨基酸序列； 所述VEGF拮抗劑部分包含在表2中列出的任一種VEGF拮抗劑的氨基酸序列； 所述連接物是長度為1 - 150個氨基酸的氨基酸序列；且其中所述雙靶向抗原結(jié)合分子是用于預(yù)防或治療眼病，且每4-6周玻璃體內(nèi)地給藥。本發(fā)明也提供了一種抗原結(jié)合蛋白，其包含SEQ ID N0:69、70、71或72的重鏈序列和SEQ ID NO: 12的輕鏈序列。也提供了一種預(yù)防或治療遭受眼病的患者的方法，所述方法包括全身地或局部地向患者的眼施用預(yù)防或治療有效量的本文公開的組合物或雙靶向蛋白。


圖 1 顯示了抗-TNF α / 抗-VEGF mAb-dAb DMS4000 的 SDS-PAGE 分析。圖2顯示了抗-TNF α /抗-VEGF mAb-dAb DMS4000的尺寸排阻色譜曲線。圖3顯示了 DMS4000的抗-VEGF活性。圖4顯示了 DMS4000的抗-TNF α活性。圖5顯示了 DMS4000的藥代動力學(xué)(PK)性質(zhì)。圖6顯示了 ELISA的結(jié)果，并證實了雙特異性的BPC1821會結(jié)合VEGFR2和Β7-1。圖7顯示了 ELISA的結(jié)果，并證實了雙特異性的BPC1825顯示出與VEGF和Β7-1 的結(jié)合。圖8描述了用于構(gòu)建本發(fā)明的雙靶向抗原結(jié)合分子的矩陣。圖9顯示了 PEP-DOM構(gòu)建體的BIAcore分析。
圖10顯示了 PEP-DOM構(gòu)建體的BIAcore分析(圖9結(jié)合曲線的TNF/VEGF結(jié)合區(qū)的放大圖)。圖11是表10所示數(shù)據(jù)的圖解表示。以2μ1的體積，通過玻璃體內(nèi)注射，施用所有化合物。黑色條表示第7天的結(jié)果。白色條表示第14天的結(jié)果。圖12是表11所示數(shù)據(jù)的圖解表示。以2μ1的體積，通過玻璃體內(nèi)注射，施用所有化合物。黑色條表示第7天的結(jié)果。白色條表示第14天的結(jié)果。圖13顯示了在激光PC以后7天(第1次FS)和14天(第2次FS)時的紅外 (IR，左上圖)、自發(fā)熒光(AF，左下圖)和熒光素血管造影術(shù)(FS，大圖)——顯示了實施例圖像。1.媒介物治療的眼，2.用DMS1571治療的眼，8.用Enbrel 治療的眼。 值得注意的是，CNV損傷顯得比與DMS1571治療相對應(yīng)的損傷更突出和彌散性更低。圖14是表12所示數(shù)據(jù)的圖解表示。以2μ1的體積，通過玻璃體內(nèi)注射，施用所有化合物。圖15顯示了用EDl單抗(mab)染色的平坦固定的視網(wǎng)膜的實施例顯微照片。圖 1A-1B 和圖 Enbrel 8. 4 顯示了來自用抗-VEGF (DMS1571) (IA)、僅媒介物(IB)或 Enbrel (Enbrel 8.4)處理過的眼的視網(wǎng)膜的平坦固定。用EDl (⑶68，黑色)X20顯影與激光燒傷部位有關(guān)的巨噬細胞。圖ID顯示了視網(wǎng)膜的恒冷箱切片(20Mm)，它顯示了已經(jīng)滲入視網(wǎng)膜的內(nèi)核層(INL)中的與激光燒傷部位有關(guān)的巨噬細胞(ED1+，黑色)。RGC，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層；BV，血管。x20。定義
本文使用的術(shù)語‘蛋白骨架’包括、但不限于免疫球蛋白(Ig)骨架，例如IgG骨架，其可以是4鏈或2鏈抗體，或者其可以僅包含抗體的Fc區(qū)，或者其可以包含一個或多個抗體恒定區(qū)，所述恒定區(qū)可以屬于人或靈長類動物來源，或者其可以是人和靈長類動物恒定區(qū)的人工嵌合體。除了一個或多個恒定區(qū)以外，這樣的蛋白骨架可以包含抗原結(jié)合位點，例如其中所述蛋白骨架包含完整的IgG。這樣的蛋白骨架將能夠與其它蛋白結(jié)構(gòu)域相連，例如具有抗原結(jié)合位點的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如表位-結(jié)合域或^Fv結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語‘受體-Fc融合體’表示，與抗體的Fc區(qū)相連的受體或細胞表面蛋白的可溶性配體或胞外結(jié)構(gòu)域。在該定義內(nèi)包括受體或細胞表面蛋白的這種可溶性配體或胞外結(jié)構(gòu)域的片段，只要它們保留全長蛋白的生物學(xué)功能，即只要它們保留抗原結(jié)合能力。 “結(jié)構(gòu)域”是折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其具有獨立于蛋白的其余部分的三級結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負責(zé)蛋白的離散的功能性質(zhì)，并且在許多情況下，可以添加、去除或轉(zhuǎn)移給其它蛋白，而不喪失該蛋白的其余部分和/或該結(jié)構(gòu)域的功能?！翱贵w單個可變結(jié)構(gòu)域”是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域， 其包含抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列。因此，它包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域(例如，其中一個或多個環(huán)已經(jīng)被不是抗體可變結(jié)構(gòu)域特有的序列所置換)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少保留全長結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段?！叭嗽椿目贵w”表示一類工程化的抗體，其具有源自非人供體免疫球蛋白的CDR， 該分子的其余的免疫球蛋白-衍生的部分源自一種或多種人免疫球蛋白。此外，框架支持殘基可以被改變，以保持結(jié)合親和力(參見，例如，Queen等人Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgson 等人 Bio/technology, 9:421 (1991))。合適的人接受體抗體可以是選自常規(guī)數(shù)據(jù)庫的一種(通過與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列的同源性)， 所述常規(guī)數(shù)據(jù)庫例如KABAT 數(shù)據(jù)庫、Los Alamos數(shù)據(jù)庫和Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫。特征在于與供體抗體的框架區(qū)的同源性(在氨基酸的基礎(chǔ)上)的人抗體，可以適合提供重鏈恒定區(qū)和 /或重鏈可變框架區(qū)，用于插入供體CDR。以類似的方式，可以選擇能夠供給輕鏈恒定或可變框架區(qū)的合適的接受體抗體。應(yīng)當(dāng)指出，接受體抗體重鏈和輕鏈不需要源自相同的接受體抗體?，F(xiàn)有技術(shù)描述了生產(chǎn)這樣的人源化抗體的幾種方法，參見例如EP-A-0239400和 EP-A-054951.在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化的抗體?！阿荝”被定義為抗原結(jié)合蛋白的互補性決定區(qū)氨基酸序列。這些是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高變區(qū)。在免疫球蛋白的可變部分中，存在3個重鏈和3個輕鏈CDR (或CDR 區(qū))。因而，本文使用的“⑶R”表示所有3個重鏈⑶R、所有3個輕鏈⑶R、所有重鏈和輕鏈 ⑶R或至少2個⑶R?！阿荝變體”包括被至少一個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是氨基酸序列的化學(xué)改變或部分改變(例如改變了不超過10個氨基酸)，所述修飾允許變體保留未修飾的序列的生物學(xué)特征。例如，所述變體是結(jié)合和中和IL-18的功能變體。CDR氨基酸序列的部分改變可以是刪除或置換1個至幾個氨基酸，或添加或插入1個至幾個氨基酸， 或它們的組合(例如改變了不超過10個氨基酸)。所述CDR變體可以在氨基酸序列中含有1、2、3、4、5或6個氨基酸置換、添加或刪除的任意組合。所述CDR變體或結(jié)合單位變體可以在氨基酸序列中含有1、2或3個氨基酸置換、插入或刪除的任意組合。氨基酸殘基的置換可以是保守置換，例如，用一個疏水氨基酸置換一個被替代的疏水氨基酸。例如可以用纈氨酸或異亮氨酸置換亮氨酸。術(shù)語“人抗體”表示源自人免疫球蛋白基因序列的抗體。這些全人抗體會提供重新工程化的或去免疫的嚙齒動物單克隆抗體的替代品(例如人源化的抗體)，作為低免疫原性治療抗體的來源，且它們通常使用噬菌體展示或轉(zhuǎn)基因小鼠平臺來制備。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體。短語“免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域”表示抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH、VffinVJ 其獨立于不同的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位。免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以以含有其它不同的可變區(qū)或可變結(jié)構(gòu)域的形式(例如，同源多聚體或異源多聚體)存在，其中其它區(qū)域或結(jié)構(gòu)域不是單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合所必需的(即其中免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域與抗原的結(jié)合獨立于另外的可變結(jié)構(gòu)域)?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”或“dAb”與 “免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域”同義，后者作為本文所用的術(shù)語，能夠結(jié)合抗原。免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域可以是人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但是也包括來自其它物種的單個抗體可變結(jié)構(gòu)域，諸如嚙齒動物(例如，如在WO 00/29004中所公開的)、鉸口鯊和駱駝類Wamelid) VHHdAb。駱駝類Vhh是這樣的免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域多肽其源自包括駱駝、駱馬、羊駝、 單峰駱駝和原駝在內(nèi)的物種，且生產(chǎn)天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。根據(jù)本領(lǐng)域可利用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以人源化這樣的Vhh結(jié)構(gòu)域，且這樣的結(jié)構(gòu)域仍然被視作根據(jù)本發(fā)明的“結(jié)構(gòu)域抗體”。本文使用的“VH”包括駱駝類Vra結(jié)構(gòu)域。NARV是在包括鉸口鯊在內(nèi)的軟骨魚中鑒別出的另一類免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域也稱作新穎的抗原受體可變區(qū)(通常縮寫為V(NAR)或NARV)。關(guān)于其它細節(jié)，參見Mol. Immunol. (2006) 44: 656-665和 US20050043519Ao
術(shù)語“表位-結(jié)合域”表示這樣的結(jié)構(gòu)域其獨立于不同的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域而特異性地結(jié)合抗原或表位，這可以是結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，例如人、駱駝類或鯊魚免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，或它可以是作為選自下述的骨架的衍生物的結(jié)構(gòu)域CTLA-4 (Evibody)； 脂質(zhì)運載蛋白；蛋白A衍生出的分子諸如蛋白A(親和體、SpA)的Z-結(jié)構(gòu)域、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白諸如GroEl和GroES ；轉(zhuǎn)鐵蛋白(反體)；錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素)；人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結(jié)構(gòu)域；人蛋白酶抑制劑的全蝎毒素kimitz型結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白 (adnectin)；其已經(jīng)進行蛋白工程化，以便實現(xiàn)與除了天然配體以外的配體的結(jié)合。CTLA-4 (細胞毒性的T淋巴細胞-相關(guān)的抗原4)是主要在⑶4+ T-細胞上表達的CD28-家族受體。它的胞外結(jié)構(gòu)域具有可變結(jié)構(gòu)域-樣Ig折疊。可以用異源序列置換與抗體的CDR相對應(yīng)的環(huán)，以賦予不同的結(jié)合性質(zhì)。被工程化成具有不同的結(jié)合特異性的 CTLA-4 分子也稱作 Evibodies。關(guān)于其它細節(jié)，參見 Journal of Immunological Methods (2001) 248 (1-2): 31-45。脂質(zhì)運載蛋白是運輸小疏水分子(諸如類固醇、后膽色素、類視色素和脂質(zhì))的胞外蛋白家族。它們具有剛性的折疊二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在圓錐形結(jié)構(gòu)的開放末端處具有許多環(huán)，它們可以被工程化成結(jié)合不同的靶抗原。Anticalin的長度是160-180個氨基酸， 且源自脂質(zhì)運載蛋白。關(guān)于其它細節(jié)，參見Biochim Biophys Acta (2000) 1482: 337-350， US7250297B1 和 US20070224633。親和體是源自金黃色葡萄球菌的蛋白A的骨架，其可以被工程化成結(jié)合抗原。該結(jié)構(gòu)域由大約58個氨基酸的三螺旋束組成。通過表面殘基的隨機化，已經(jīng)制備了文庫。關(guān)于其它細節(jié)，參見 Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17: 455-462 和 EP1641818A1。Avimer是源自A-結(jié)構(gòu)域骨架家族的多結(jié)構(gòu)域蛋白。大約35個氨基酸的天然結(jié)構(gòu)域采取確定的二硫鍵連接的結(jié)構(gòu)。通過A-結(jié)構(gòu)域家族表現(xiàn)出的天然變體的重排 (shuffling)，產(chǎn)生多樣性。關(guān)于其它細節(jié)，參見 Nature Biotechnology (2205) 23(12) 1556 - 1561 禾口 Expert Opinion on Investigational Drugs (June 2007) 16(6): 909-917。轉(zhuǎn)鐵蛋白是單體的血清運輸糖蛋白。通過將肽序列插入允許的表面環(huán)中，可以將轉(zhuǎn)鐵蛋白工程化成結(jié)合不同的靶抗原。工程化的轉(zhuǎn)鐵蛋白骨架的實例包括反體 (Trans-body)。關(guān)于其它細節(jié)，參見 J. Biol. Chem (1999) 274: 24066-24073 設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins)源自錨蛋白，所述錨蛋白是介導(dǎo)完整的膜蛋白與細胞骨架的連接的蛋白家族。單個錨蛋白重復(fù)是由2個α-螺旋和1個轉(zhuǎn)角組成的33殘基基序。通過將每個重復(fù)的第一個α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角中的殘基隨機化，可以將它們工程化成結(jié)合不同的靶抗原。通過增加模塊的數(shù)目，可以增加它們的結(jié)合界面(親和力成熟方法)。關(guān)于其它細節(jié)，參見 J. Mol. Biol. (2003) 332: 489-503; PNAS (2003) 100(4) 1700-1705;和 J. Mol. Biol. (2007) 369: 1015-1028 和 US20040132028A1。纖連蛋白是可以被工程化成結(jié)合抗原的骨架。Adnectin由人纖連蛋白III型 (FN3)的15個重復(fù)單位的第10個結(jié)構(gòu)域的天然氨基酸序列主鏈組成?？梢怨こ袒讦?-夾心的一個末端處的3個環(huán)，以使Adnectin能夠特異性地識別目標(biāo)治療靶物。關(guān)于其它細節(jié)，參見Protein Eng. Des. Sel. (2005) 18: 4;35-444、US20080139791、W02005056764和US6818418B1。肽適體是組合的識別分子，其由恒定的骨架蛋白組成，所述骨架蛋白通常是含有插入在活性部位處的受限可變肽環(huán)的硫氧還蛋白(TrxA)。關(guān)于其它細節(jié)，參見Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5: 783-797。微體源自長度為25-50個氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白含有3-4個半胱氨酸橋，微蛋白的實例包括KalataBl和芋螺毒素和knottins。所述微蛋白具有一個環(huán)， 該環(huán)可以被工程化成包含最多25個氨基酸，而不影響微蛋白的總體折疊。關(guān)于工程化的 knottin結(jié)構(gòu)域的其它細節(jié)，參見W02008098796。其它表位結(jié)合域包括這樣的蛋白所述蛋白已經(jīng)被用作骨架，以工程化不同的靶抗原結(jié)合性質(zhì)，包括人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制劑的kimitz類型結(jié)構(gòu)域、Ras-結(jié)合蛋白AF-6的PDZ-結(jié)構(gòu)域、全蝎毒素(蝎毒素)、C_型凝集素結(jié)構(gòu)域(四 3^ ), =Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, Stefan Dubel H ) ψ 的第 7 章-Non-Antibody kaffolds，和 Protein Science (2006) 15:14-27。本發(fā)明的表位結(jié)合域可以源自這些替代性的蛋白結(jié)構(gòu)域中的任一種?！半p可變結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白(DVD-Ig) ”是雙特異性的、四價的免疫球蛋白G (IgG)-樣分子(Wu 箏yl Nature Biotechnology (2007) 25: 1290_1四7)。可以將 DVD-Ig 定義為包含多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二可變結(jié)構(gòu)域，C是恒定結(jié)構(gòu)域，Xl代表氨基酸或多肽(連接物)，X2代表Fc區(qū)，且η是0或1 (W0 2007024715)。在本發(fā)明的上下文中，VDI會結(jié)合 TNFa或TNF α受體，且VD2會結(jié)合VEGF或VEGF受體，或反之亦然。本文使用的術(shù)語“成對的Vh結(jié)構(gòu)域”、“成對的\結(jié)構(gòu)域”和“成對的VH/VL結(jié)構(gòu)域” 表示，當(dāng)與它們的配偶體可變結(jié)構(gòu)域成對時，僅特異性地結(jié)合抗原的抗體可變結(jié)構(gòu)域。在任一對中，總是存在一個Vh和一個\，術(shù)語“成對的Vh結(jié)構(gòu)域”表示Vh配偶體，術(shù)語“成對的 Vl結(jié)構(gòu)域”表示\配偶體，且術(shù)語“成對的VH/VL結(jié)構(gòu)域”表示在一起的2個結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語“抗原結(jié)合蛋白，，表示能夠結(jié)合TNF α和/或VEGF的抗體、抗體片段，例如結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、ScFv, FAb, FAb2和其它蛋白構(gòu)建體，諸如受體-Fc融合體。 抗原結(jié)合分子可以包含至少一個Ig可變結(jié)構(gòu)域，例如抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、多個結(jié)構(gòu)域抗體例如啞鈴狀體、dAb-dAb線內(nèi)融合體、Fab、Fab'、F(ab’) 2、Fv、kFv、雙特異抗體、mAbdAb、 DVD-Ig、親和體、異源綴合物抗體或雙特異性體，包括具有對TNF α或TNF α受體的第一特異性和對VEGF或VEGF受體的第二特異性的雙特異性抗體。在一個實施方案中，所述抗原結(jié)合分子是抗體。在另一個實施方案中，所述抗原結(jié)合分子是dAb，即免疫球蛋白單個可變結(jié)構(gòu)域，諸如VH、Vhh或\，其獨立于不同的V區(qū)或結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合抗原或表位?？乖Y(jié)合分子可以能夠結(jié)合2種靶物，即它們可以是雙靶向蛋白?？乖Y(jié)合分子可以是抗體和抗原結(jié)合片段的組合，例如，與單克隆抗體相連的一個或多個結(jié)構(gòu)域抗體和/或一個或多個ScFv。抗原結(jié)合分子也可以包含非-Ig結(jié)構(gòu)域，例如作為選自下述的骨架的衍生物的結(jié)構(gòu)域CTLA-4 (Evibody)；脂質(zhì)運載蛋白；蛋白A衍生的分子諸如蛋白A (親和體、SpA)的 Z-結(jié)構(gòu)域、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白諸如GroEl和GroES ；轉(zhuǎn)鐵蛋白(反體)；錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素) ’人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結(jié)構(gòu)域；人蛋白酶抑制劑的全蝎毒素kimitz類型結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白(adnectin)；它們已經(jīng)就那些蛋白工程化，以便實現(xiàn)與TNF α和/或VEGF的結(jié)合。 本文使用的“抗原結(jié)合蛋白”能夠拮抗和/或中和人TNFa和/或VEGF。另外，抗原結(jié)合蛋白可以如下阻斷TNF α和/或VEGF活性通過結(jié)合TNF α和/或VEGF，并阻止天然配體結(jié)合和/或活化受體。本文使用的“VEGF拮抗劑”包括能夠降低和/或消除VEGF的至少一種活性的任意化合物。作為實例，VEGF拮抗劑可以結(jié)合VEGF，且該結(jié)合可以直接地降低或消除VEGF活性，或它可以通過阻斷至少一種配體與受體的結(jié)合而間接地起作用。本文使用的“TNFa拮抗劑”包括能夠降低和/或消除TNF α的至少一種活性的任意化合物。作為實例，TNFa拮抗劑可以結(jié)合TNFa，且該結(jié)合可以直接地降低或消除TNF α 活性，或它可以通過阻斷至少一種配體與受體的結(jié)合而間接地起作用。與抗原結(jié)合蛋白關(guān)聯(lián)地使用的術(shù)語“特異性地結(jié)合”是指，該抗原結(jié)合蛋白會結(jié)合它的靶蛋白(例如TNF α、TNFR、BEGF, VEGFR)，且不結(jié)合或不顯著地結(jié)合其它的(例如，無關(guān)的)蛋白。但是，該術(shù)語不排除下述事實，即針對特定物種(例如人)中的靶蛋白的抗體也可能與其它物種(例如非人靈長類動物)中的其它靶蛋白形式交叉反應(yīng)。術(shù)語“KD”表示平衡解離常數(shù)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗原結(jié)合位點會以最大ImM的KD結(jié)合抗原，例如對于每個抗原10nM、lnM、500pM、200pM、IOOpM的KD (通過 Biacore 測得)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗原結(jié)合位點會以對于每個抗原IOnM 或更小、InM或更小、500pM或更小、200pM或更小、IOOpM或更小的KD (通過Biacore 測得) 結(jié)合抗原。本文使用的術(shù)語“抗原結(jié)合位點”表示能夠特異性地結(jié)合抗原的構(gòu)建體上的位點， 這可以是單個結(jié)構(gòu)域，例如表位-結(jié)合域，或它可以是在標(biāo)準(zhǔn)抗體上可以發(fā)現(xiàn)的成對的Vh/ 八結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的有些方面，單鏈Fv (ScFv)結(jié)構(gòu)域可以提供抗原結(jié)合位點。術(shù)語“mAb/dAb”和dAb/mAb”在本文中用于表示本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白。這2個術(shù)語可以互換使用，且意在具有本文使用的相同含義。術(shù)語“恒定的重鏈1”在本文中用于表示免疫球蛋白重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域CH1。術(shù)語“恒定的輕鏈”在本文中用于表示免疫球蛋白輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域Q。術(shù)語“文庫”表示異質(zhì)多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有單個多肽或核酸序列。就這一方面而言，“文庫”與“所有組分”同義?！巴ㄓ每蚣堋笔沁@樣的單個抗體框架序列其對應(yīng)著在Kabat所定義的序列 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest",美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部)中保守的抗體區(qū)域,或?qū)?yīng)著Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917所定義的人種系免疫球蛋白所有組分或結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式本發(fā)明提供了適用于眼的組合物，其包含TNF α拮抗劑和/或VEGF拮抗劑。本發(fā)明也提供了用于預(yù)防或治療眼病的TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合。本發(fā)明也提供了一 種預(yù)防或治療眼病的方法，其中施用與VEGF拮抗劑相組合的TNF α拮抗劑?？梢詥为毜亍?順序地或同時地施用TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑。本發(fā)明涵蓋了施用單獨的TNF α拮抗劑和單獨的VEGF拮抗劑的組合(即分開的TNFa和VEGF拮抗劑分子)。另外，本發(fā)明涵蓋了施用能夠結(jié)合2種或更多種抗原的單個分子或構(gòu)建體，例如本發(fā)明涵蓋了具有雙靶向功能性的分子，其起TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑的作用(即能夠結(jié)合和抑制、優(yōu)選地阻斷TNF α或TNFa受體的功能，并結(jié)合和抑制、 優(yōu)選地阻斷VEGF或VEGF受體的功能)。例如，本發(fā)明提供了一種雙靶向分子，其能夠結(jié)合 TNFa和VEGFR2等。在一個實施方案中，所述雙靶向分子能夠結(jié)合TNF受體和VEGF受體。本發(fā)明的TNF α拮抗劑可以使通過TNF受體的信號傳遞抑制了 30%、40%、50%、60%、 70%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。本發(fā)明的VEGF拮抗劑可以使通過VEGF受體的信號傳遞抑制了 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98% 或 100%。在一個實施方案中，所述TNFa拮抗劑是人抗原結(jié)合蛋白，具體地人抗-TNF α抗體或其片段或人抗-TNFR抗體或其片段。在一個實施方案中，所述VEGF拮抗劑是人抗原結(jié)合蛋白，具體地人抗-VEGF抗體或其片段或人抗-VEGFR抗體或其片段。在一個實施方案中， 所述抗原結(jié)合蛋白是TNFa/VEGF雙靶向單個構(gòu)建體，其中所述TNF α拮抗劑部分是人。在一個具體實施方案中，所述TNF拮抗劑是或源自阿達木單抗或戈利木單抗。所述拮抗劑可以基于本文所述的抗體骨架或其它這樣的合適的骨架。這樣的拮抗劑可以是抗體或表位結(jié)合域，例如dAb。受體-Fc融合體被視作本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的拮抗劑可以作為單獨分子的混合物共同施用，它們可以同時施用(同時地)，或者相互在指定的時間段內(nèi)施用(順序地)，例如相互在1個月、1周內(nèi)或M小時內(nèi)， 例如相互在20小時內(nèi)、或在15小時內(nèi)、或在12小時內(nèi)、或在10小時內(nèi)、或在8小時內(nèi)、或在6小時內(nèi)、或在4小時內(nèi)、或在2小時內(nèi)、或在1小時內(nèi)、或在30分鐘內(nèi)。本發(fā)明的拮抗劑可以作為分開的制劑或作為單個制劑(例如含有2種拮抗劑的脂質(zhì)體)共同施用。在本發(fā)明范圍內(nèi)的TNF α拮抗劑(其可以與本發(fā)明的VEGF拮抗劑組合施用，或其可以用于制備本發(fā)明的雙靶向分子)包括下面在表1中列出的那些。表1 TNFa拮抗劑
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療眼病的組合物，其包含TNF α拮抗劑和VEGF拮抗劑。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述TNFα拮抗劑和所述VEGF拮抗劑是抗原結(jié)合蛋白。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述TNFα拮抗劑和所述VEGF拮抗齊U以雙靶向蛋白形式存在。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白包含至少一對結(jié)合TNFα或 TNF α受體的VH/VL結(jié)構(gòu)域和至少一對結(jié)合VEGF或VEGF受體的VH/VL結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述雙靶向分子是DVD-Ig。
6.如權(quán)利要求3或4所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白是雙特異性抗體。
7.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白是dAb-dAb線內(nèi)融合體。
8.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白是與一個或多個表位結(jié)合域相連的受體-Fc融合體。
9.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述TNFα拮抗劑是抗-TNF α抗體。
10.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述VEGF拮抗劑是抗-VEGF抗體。
11.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白的TNFα拮抗劑部分是抗-TNF 抗體，且其中所述雙靶向蛋白的VEGF拮抗劑部分是抗-VEGF表位結(jié)合域。
12.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述雙靶向蛋白的VEGF拮抗劑部分是抗-VEGF 抗體，且其中所述雙靶向蛋白的TNFa拮抗劑部分是抗-TNF表位結(jié)合域。
13.如權(quán)利要求8、11或12所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域是dAb。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述dAb是人dAb。
15.如權(quán)利要求8、11或12所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域源自非-Ig骨架。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域選自CTLA-4(Evibody)； 脂質(zhì)運載蛋白；蛋白A衍生出的分子諸如蛋白A(親和體、SpA)的Z-結(jié)構(gòu)域、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白諸如GroEl和GroES ；轉(zhuǎn)鐵蛋白(反體)；錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素)；人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結(jié)構(gòu)域；人蛋白酶抑制劑的全蝎毒素kimitz型結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白 (adnectin)0
17.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求11-16中任一項所述的組合物，其中使用由1-30個氨基酸組成的連接物，將所述表位結(jié)合域直接連接至所述抗原結(jié)合蛋白上。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述連接物選自在SEQID NO: 3_8和25中所述的那些或它們的任意組合或多個。
19.根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域連接至抗原結(jié)合蛋白重鏈的N-端。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域連接至抗原結(jié)合蛋白輕鏈的N-端。
21.根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域連接至抗原結(jié)合蛋白重鏈的C-端。
22.根據(jù)權(quán)利要求11-18中任一項所述的組合物，其中所述表位結(jié)合域連接至抗原結(jié)合蛋白輕鏈的C-端。
23.根據(jù)權(quán)利要求2-7或8-22中任一項所述的組合物，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含 在SEQ ID NO: 10所述的重鏈中含有的CDRHU CDRH2和CDRH3，和在SEQ ID NO: 12所述的輕鏈中含有的CDRLl、CDRL2和CDRL3。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其包含SEQID NO: 14、15、47、69、70、71或72的重鏈序列和SEQ ID NO: 12的輕鏈序列。
25.在權(quán)利要求3-8或Il-M中任一項中要求保護的組合物，其中所述組合物每4-6周玻璃體內(nèi)地施用。
26.在權(quán)利要求1-25中任一項中要求保護的組合物，其中所述組合物包含其它活性齊U，任選抗炎劑。
27.在權(quán)利要求116中任一項中定義的組合物用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防或治療眼病。
28.一種用于預(yù)防或治療眼病的TNF α拮抗劑，其選自阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、ESBA105、PEPl-5-19、PEPl-5-490、PEPl-5-493、SEQ ID NO: 2 的 adnectin、戈利木單抗、塞妥珠單抗、ALK-6931以及包含SEQ ID N0:30的重鏈和SEQ ID N0:31的輕鏈的抗體，其中所述TNF α拮抗劑將與選自下述的VEGF拮抗劑組合施用貝伐單抗、ranibizumab、 r84、afliberc印t、CT01、D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050、PRS-051、MP0012、CT-322、 ESBA903、EPI-0030、EPI-0010 和 DMS1571。
29.一種用于預(yù)防或治療眼病的VEGF拮抗劑，其選自貝伐單抗、ranibizumab、r84、 aflibercept、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050, PRS-051, ΜΡ0012, CT-322, ESBA903、EPI-0030、EPI-0010和DMS1571，其中所述VEGF拮抗劑將與選自下述的TNF α拮抗劑組合施用阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、ESBA105、ΡΕΡ1-5-19、ΡΕΡ1-5-490、 PEP1-5-493, SEQ ID Ν0:2的adnectin、戈利木單抗、塞妥珠單抗、ALK-6931以及包含SEQ ID N0:30的重鏈和SEQ ID N0:31的輕鏈的抗體。
30.在權(quán)利要求28中要求保護的TNFα拮抗劑或在權(quán)利要求四中要求保護的VEGF拮抗劑，其中所述TNF α拮抗劑是阿達木單抗，且所述VEGF拮抗劑是ranibizumab。
31.一種藥物組合物，其包含在權(quán)利要求114中任一項中要求保護的組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
32.在權(quán)利要求31中要求保護的藥物組合物，其中所述組合物包含其它活性劑，任選抗炎劑。
33.一種多核苷酸序列，其編碼在權(quán)利要求2-M中任一項中要求保護的抗原結(jié)合蛋白。
34.一種多核苷酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求5、6或9-M中任一項所述的組合物的重鏈或輕鏈。
35.在權(quán)利要求34中要求保護的多核苷酸序列，其中所述序列如在SEQID NO: 11,13 或46中所述。
36.一種轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的重組宿主細胞，其包含在權(quán)利要求33-35中任一項中要求保護的一個或多個多核苷酸序列。
37.一種用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求2-M中任一項所述的組合物的方法，所述方法包括下述步驟培養(yǎng)如權(quán)利要求36所述的宿主細胞，和分離所述抗原結(jié)合蛋白。
38.在權(quán)利要求I-M中任一項中要求保護的組合物，其用于經(jīng)由玻璃體內(nèi)途徑進行遞送。
39.在權(quán)利要求I-M中任一項中要求保護的組合物，其用于經(jīng)由眼周途徑進行遞送。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其用于經(jīng)由跨鞏膜的、結(jié)膜下的、sub-tenon、眼球周的、局部的、眼球后的途徑進行遞送，或者其用于遞送至下直肌、上直肌或外直肌。
41.根據(jù)權(quán)利要求I-M中任一項所述的組合物，其中所述眼病是糖尿病黃斑水腫、囊樣黃斑水腫、葡萄膜炎、AMD (年齡相關(guān)性黃斑變性)、脈絡(luò)膜新生血管AMD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及其它黃斑病變和眼血管病變。
42.一種預(yù)防或治療遭受眼病的患者的方法，所述方法包括全身地或局部地向患者的眼施用預(yù)防或治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I-M中任一項所述的組合物或雙靶向蛋白。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述患者遭受至少一種下述的疾病或障礙糖尿病黃斑水腫、囊樣黃斑水腫、葡萄膜炎、AMD (年齡相關(guān)性黃斑變性)、脈絡(luò)膜新生血管AMD、 糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及其它黃斑病變和眼血管病變。
44.一種雙靶向抗原結(jié)合分子，其包含TNF α拮抗劑部分、VEGF拮抗劑部分以及使所述 TNFa拮抗劑部分與所述VEGF拮抗劑部分相連的連接物，其中所述TNFa拮抗劑部分包含在表1中列出的任一種TNFa拮抗劑的氨基酸序列；所述VEGF拮抗劑部分包含在表2中列出的任一種VEGF拮抗劑的氨基酸序列；所述連接物是長度為1 - 150個氨基酸的氨基酸序列；且所述雙靶向分子不是DMS4000或DMS4031。
45.一種雙靶向抗原結(jié)合分子，其包含TNF α拮抗劑部分、VEGF拮抗劑部分以及使所述 TNFa拮抗劑部分與所述VEGF拮抗劑部分相連的連接物，其中所述TNFa拮抗劑部分包含在表1中列出的任一種TNFa拮抗劑的氨基酸序列；所述VEGF拮抗劑部分包含在表2中列出的任一種VEGF拮抗劑的氨基酸序列；所述連接物是長度為1 - 150個氨基酸的氨基酸序列；且其中所述雙靶向抗原結(jié)合分子是用于預(yù)防或治療眼病，且每4-6周玻璃體內(nèi)地給藥。
46.在權(quán)利要求44或45中要求保護的雙靶向分子，其中所述連接物選自在SEQID NO: 3-8、25、66-68和145-162中所述的那些或它們的任意組合或多個。
47.在權(quán)利要求44-46中任一項中要求保護的雙靶向抗原結(jié)合分子，其由SEQID NO:62或SEQ ID NO 64的氨基酸序列組成。
48.一種抗原結(jié)合蛋白，其包含SEQ ID N0:69、70、71或72的重鏈序列和SEQ ID NO: 12 的輕鏈序列。
49.一種藥物組合物，其包含在權(quán)利要求48中要求保護的抗原結(jié)合蛋白和其它活性齊U，任選抗炎劑。
50.一種多核苷酸序列，其編碼如權(quán)利要求48所述的抗原結(jié)合蛋白。
51.在權(quán)利要求50中要求保護的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸包含SEQID NO:141、142、143 或 144 和 SEQ ID N0:11。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療眼病的TNFα拮抗劑和VEGF拮抗劑的組合，并提供了結(jié)合TNFα或TNFα受體和/或VEGF或VEGF受體的抗原結(jié)合蛋白。
文檔編號C07K16/24GK102458471SQ201080032439
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月28日
發(fā)明者W. 高夫 G., 斯圖爾德 M., F. 埃爾特爾 P., 亞當(dāng)森 P., 格爾馬謝夫斯基 V. 申請人:葛蘭素集團有限公司