專利名稱：優(yōu)化抗體的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽生產(chǎn)和純化領(lǐng)域。提供了用于通過層析方法分離抗體分子與抗體變體(例如為了增強治療功效)來生產(chǎn)純化的抗體的通用方法，其通過例如選擇特定的收獲時間點和/或特定的純化方案來進行。
背景技術(shù)：
單克隆抗體具有很大的治療潛力，并且在當(dāng)今的醫(yī)學(xué)資財中發(fā)揮重要的作用。在過去十年期間，制藥業(yè)的顯著趨勢已經(jīng)是開發(fā)單克隆抗體(單抗)作為治療劑以治療多種疾病，諸如癌癥、哮喘、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等。最近的報告指示了 376個單抗開發(fā)項目 (從臨床前至銷售)，而且單克隆抗體目前占臨床試驗中的所有生物藥物的約20%。單克隆抗體主要以重組蛋白在經(jīng)遺傳工程化改造的哺乳動物細胞培養(yǎng)物中制造。通常，使用攪拌罐式生物反應(yīng)器來生產(chǎn)分泌性單抗，即上游工藝，其接著有由收獲、層析捕捉和精制 (polishing)步驟組成的下游工藝。然后，通常為液體的藥物物質(zhì)被配制為藥物產(chǎn)品。對于人應(yīng)用，每種藥用物質(zhì)必須滿足獨特的標(biāo)準(zhǔn)。為了確保生物藥劑對人的安全性，制造工藝后必須接著一個或多個純化步驟。因此，下游工藝開發(fā)的目的是開發(fā)產(chǎn)生高純度產(chǎn)物的高產(chǎn)量的、穩(wěn)健的、可縮放的、且可靠的工藝。工藝中的典型污染物包括DNA、宿主細胞蛋白(HCP)、病毒、聚集的和片段化的產(chǎn)物、和殘留的培養(yǎng)基組分。分離抗體產(chǎn)物與這些污染物需要利用各種純化模式的正交純化工藝。一般地，單抗純化工藝牽涉過濾和層析步驟的各種組合。除純度之外，通量和收率在確定制藥業(yè)中的合適純化工藝中發(fā)揮重要的作用。單克隆抗體的大約40-60%的生產(chǎn)成本源自下游工藝。依照國際協(xié)調(diào)會議(International Conference on Harmonization, ICH)指導(dǎo)文件，藥物物質(zhì)異質(zhì)性限定其質(zhì)量，并且應(yīng)當(dāng)監(jiān)測并表征程度和概況以確保批次間一致性。 因此，單抗的微不均一性是生產(chǎn)，特別是下游加工的關(guān)注。產(chǎn)物的表征對于測定變體是必需的，所述變體可以以相似的特性存在，并且可以使純化變得復(fù)雜(參見例如Ahrer，K.和 Jungbauer，A.，J. Chromatogr. B841 (2006) 110-122)。例如，單抗的微不均一性源自靶蛋白的翻譯后修飾、酶促修飾、錯誤翻譯、及通過加工和改變引起的修飾。每種修飾可以影響終產(chǎn)物的生物學(xué)活性或穩(wěn)定性。如此，需要快速的、可靠的、且定量的分析方法來解析蛋白質(zhì)的數(shù)種變體。例如，層析和電泳方法是用于解析蛋白質(zhì)變體的工具。蛋白質(zhì)中的天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的側(cè)變化的非酶促脫酰胺化經(jīng)常造成重組蛋白的電荷異質(zhì)性。這些氨基酸的不帶電荷的側(cè)鏈被修飾成異-谷氨酸和異-天冬氨酸殘基或者谷氨酸和天冬氨酸殘基。因此，每處修飾對蛋白質(zhì)引入額外的電荷(Aswald， D. W.等，J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 21 (2000) 1129—1136)。對于重組單克隆抗體，脫酰胺化可以在自在細胞內(nèi)部、分泌后、純化期間、貯存期間、和在不同應(yīng)激條件下的任何階段發(fā)生。已經(jīng)報告了天冬酰胺的脫酰胺化牽涉單克隆抗體的電荷異質(zhì)性，其根據(jù)在堿性PH下于升高的溫度溫育抗體或其分離的級分后觀察到更具酸性種類得到(綜述見Liu，H.等，J. Pharmac. Sciences 97 (2008) 2426-2447) 0 脫酰胺化對抗體引入一個額外的負電荷，并且生成酸性種類，其一般導(dǎo)致陽離子交換層析上較早的洗脫。抗體的其它典型修飾關(guān)注其糖基化樣式(生成糖變體)，其例如可以在細胞培養(yǎng)過程中或者由于培養(yǎng)條件而變化(關(guān)于綜述，參見Beck，Α.等，Curr. Pharm. Biotechnol. 9(2008)482-501)。對于純化重組生成的免疫球蛋白，經(jīng)常采用不同柱層析步驟的組合。一般地，親和層析步驟繼之以一個、兩個或者甚至更多個別的分離步驟。最終的純化步驟是所謂的“精制步驟”，其用于除去痕量雜質(zhì)和污染物，如聚集的免疫球蛋白、殘留的HCP(宿主細胞蛋白)、 DNA(宿主細胞核酸)、病毒、或內(nèi)毒素。Tsai, P. K.等，Pharmac. Res. 10(1993) 1580-1586 描述了抗人 CD18 單克隆抗體的等電異質(zhì)性。電荷異質(zhì)性推測為源自免疫球蛋白重鏈的序貫脫酰胺化。Moorhouse, K. G.等(J. Pharmac. Biomed. Anal. 16(1997)593-603)討論了 HPLC 用于分析抗人CD20單克隆抗體的電荷異質(zhì)性的用途。Kaltenbrunner, 0.等，J. Chrom 639(1993)41-49 使用與鹽梯度組合的線性 pH 梯度來分離在其Pl值上不同的抗體變體。在WO 2006/084111 (Glaxo Group Ltd，)中，提及了依照脫酰胺化多肽的量來計算收獲時間點的方法。Robinson, D. K.等，Biotech, and Bioeng. 44(1994)727-735 披露了一種生成數(shù)種酸性單克隆抗體種類的補料-分批方法，其中發(fā)生取決于培養(yǎng)條件。已經(jīng)使用中性pH的線性NaCl梯度通過陽離子交換層析來解析在重鏈C 端的賴氨酸殘基的存在方面不同的三種單抗變體(Weitzhandler，Μ.，Proteomics 1(2001) 179-185) οrhuMAb HER2 或曲妥單抗(Trastuzumab)(以商標(biāo)赫賽汀(Here印tin) 出售)是一種用于治療HER2過表達/HER2基因擴增型轉(zhuǎn)移性乳腺癌的重組人源化抗HER2 單克隆抗體(本文中為her2抗體)。曲妥單抗與Hudziak，R. Μ.等，Mol. Cell. Biol 9 (1989) 1165-1172中所描述的鼠抗HER2抗體4D5特異性結(jié)合相同的HER2表位。曲妥單抗是鼠抗HER2抗體4D5的重組人源化型式，稱為rhuMAb 4D5或曲妥單抗，而且在已經(jīng)接受廣泛的先前抗癌療法的HER2過表達型轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中是有臨床活性的(BaselgaJ.等， J. Clin. Oncol. 14(1996)737-744)。曲妥單抗及其制備方法記載于 US 5，821，337。HER 受體酪氨酸激酶家族是細胞生長、分化和存活的重要介導(dǎo)物。受體家族包括四種獨特的成員， 包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbBl、或 HER1)、HER2 (ErbB2 或 pl85neu)、HER3 (ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。發(fā)現(xiàn)單克隆her2抗體(其針對herf/neu基因的基因產(chǎn)物)以7種不同變體存在。 重組生成的her2抗體的脫酰胺化和其它酸性變體導(dǎo)致電荷異質(zhì)性，使得可以使用洗脫用離子強度的線性增加通過陽離子交換層析來分離變體。除了主峰外，可以使用分析技術(shù)，尤其是離子交換層析(IEC)的組合來指派所有6種次要形式。Harris R. J.等(J. Chromatogr. B 752(2001),233-245)報告了 IEC-峰3具有73. 8%的峰面積，并且代表her2抗體的活性形式，其是最豐富的變體。脫酰胺化和其它酸性變體占所分離的所有抗體的約25%。EP107M88B1和EP1308455B9報告了在以第四電導(dǎo)率洗脫(結(jié)合-洗脫方式)前使用具有不同電導(dǎo)率的清洗步驟通過陽離子交換層析來純化her2抗體。由此，獲得her2抗
6體的組合物，其中組合物中的酸性變體的量是降低的。類似地，WO 2004/024866 (Genentech Inc.)披露了特別地使用梯度清洗通過陽離子交換層析來純化her2抗體。依照目前的規(guī)格，出售的赫賽汀 必須含有大于等于65%的活性形式(IEC峰 3/3*)和小于等于20%的無活性形式，其對應(yīng)于分析用離子交換層析概況(參見圖2和表 1)中的峰4。發(fā)明_既述如此，本發(fā)明的目的是提供用于純化重組生成的抗體及用于相對于其抗體變體富集抗體分子的另一種方法。憑借依照本發(fā)明的方法，可以獲得關(guān)于成本和治療功效的平衡。已經(jīng)進一步發(fā)現(xiàn)了可以通過在抗體組合物的制造期間引入過程中控制步驟來獲得優(yōu)化，其中測定抗體分子和/或其變體的存在和/或抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率， 之后收獲或確定純化方案。憑借此方法，針對變體樣式或抗體來源材料的質(zhì)量改編收獲時間點和純化方案。因此，本發(fā)明的第一方面是一種用于生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物的方法，包括下列步驟a)提供包含抗體分子及其變體的樣品，b)在所述樣品的等分試樣中測定抗體分子及其變體的存在和/或抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，c)基于步驟b)中獲得的數(shù)據(jù)，確定隨后的收獲時間點和/或抗體純化方案，由此，生產(chǎn)包含分子抗體及其變體的抗體組合物。本發(fā)明的另一方面是對包含多肽的樣品的等分試樣使用分析用離子交換層析以確定隨后的所述樣品的多肽純化方案。發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)抗體組合物的方法，其以高收率且高度經(jīng)濟地實現(xiàn)包含高百分比抗體分子的抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的第一方面是一種用于生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物的方法，包括下列步驟a)提供包含抗體分子及其變體的樣品，b)測定抗體分子及其變體的存在和/或抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，c)基于步驟b)中獲得的數(shù)據(jù)，確定隨后的收獲時間點和/或抗體純化方案，由此，生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括對包含多肽的樣品的等分試樣使用分析用離子交換層析以確定隨后的所述樣品的多肽純化方案。本發(fā)明的實踐會采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。此類技術(shù)在文獻中全面解釋。參見例如 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，Cold Spring Harbor，NY ；Glover, D. M.(編)， DNA Cloning-Α Practical Approach,第 I 卷和第 II 卷，IRL Press Limited(1985)；Gait，Μ· J.(編)，Oligonucleotide Synthesis-Α Practical Approach，IRL Press Limited(1984) ；Hames, B. D.禾口 Higgins，S. J.(編)，Nucleic acid hybridisation, IRL Press Limited(1984) ；Freshney，R. I.(編)Animal cell culture-a practical approach，IRL Press Limited(1986) ；Perbal，B.，A practical guide to molecular cloning，Wiley Interscience (1984)；叢書 Methods in Enzymology (Academic Press， Inc.) ；Miller, J. H.禾口 Calos，M.P.(編)，Gene transfer vectors for mammalian cells， Cold Spring Harbor Laboratory (1987) ；Methods in Enzymology，第 154 卷禾口第 155 卷 (分另U為 Wu 禾口 Grossman，及 Wu 編)；Mayer 禾口 Walker (編)，Immunochemical methods in cell and molecular biology, Academic Press，London(1987) ；Scopes，R. K.，Protein Purification-Principles and Practice，第二 片反，Springer-Verlag, N. Y. (1987)；及 Weir, D. Μ.禾口 Blackwel 1，C.(編)，Handbook of Experimental Immunology，第 I 卷-第 IV 卷，Blackwell Scientific Publications (1986)。通用的層析方法及其用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。參見例如 Heftmann, E.(編)，Chromatography,第五版，Part A !Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ；Deyl, Ζ·(編)，Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998) ；Poole, C. F.禾口 Poole, S. K. , Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York(1991) ；Scopes, R. K. , Protein Purification-Principles and Practice, Springer-Verlag, N. Y. (1987) ；Sambrook, J.等(編)，Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989) ；Ausubel, F. Μ.等(編)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York ；或 Freitag, R. , Chromatographical Techniques in the Downstream Processing of(Recombinant) Proteins, Methods in Biotechnology,第 24 卷Animal Cell Biotechnology :Methods and Protocols，第 2 版，Humana Press Inc. (2007)，第 421 頁-第 453 頁。用于純化多肽的方法是完善建立且普遍使用的。它們單獨或組合采用。例如， 此類方法是使用微生物衍生的蛋白質(zhì)的親和層析(例如，蛋白A或蛋白G親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合式交換層析)、親硫吸附(例如，用β-巰基乙醇和其它SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析(例如，用苯基-S印harose、親氮雜芳烴(aza-arenophilic)樹脂、或間氨基苯硼酸)、金屬螯合物親和層析(例如用Ni (II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析、 和制備用電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi，Μ. Α.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。對于純化重組生成的免疫球蛋白，經(jīng)常采用不同柱層析步驟的組合。一般地，蛋白 A親和層析繼之以一個或兩個別的分離步驟。最終的純化步驟是所謂的“精制步驟”，其用于除去痕量雜質(zhì)和污染物，如聚集的免疫球蛋白、殘留的HCP (宿主細胞蛋白)、DNA (宿主細胞核酸)、病毒、或內(nèi)毒素。對于此精制步驟，經(jīng)常使用流過模式的陰離子交換材料。除非另有指示，下列術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為具有以下意義術(shù)語“宿主細胞”涵蓋植物細胞和動物細胞。動物細胞涵蓋無脊椎動物、非哺乳動物脊椎動物(例如，鳥類、爬行類和兩棲類)和哺乳動物細胞。無脊椎動物細胞的例子包括下列昆蟲細胞草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti) (蚊)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)、和家蠶(Bombyx mori)(參見例如 Luckow，V. Α.等，Bio/Technology 6(1988)47-55 ； Miller, D. W.等，Genetic Engineering, Setlow, J. K.等(編)， 第 8 卷，Plenum Publishing(1986)，第 277 頁-第 298 頁；及 Maeda，S.等，Nature 315(1985)592-594)。術(shù)語“表達”指宿主細胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和翻譯。宿主細胞中的產(chǎn)物基因的表達水平可以基于存在于細胞中的相應(yīng)mRNA的量或由細胞中表達的結(jié)構(gòu)基因編碼的多肽的量測定。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“培養(yǎng)”意指已經(jīng)實施宿主細胞發(fā)酵，即異源多肽生成的容器的全部內(nèi)容物。這包括培養(yǎng)液中存在的所生成的異源多肽、其它蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段、宿主細胞、細胞碎片、和以營養(yǎng)培養(yǎng)基供應(yīng)并在培養(yǎng)期間由宿主生成的所有組分。術(shù)語“細胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”指用于在多細胞生物體或組織的外部的人工體外環(huán)境中維持、培養(yǎng)、增殖、或擴充細胞的營養(yǎng)溶液?？梢葬槍μ囟ǖ募毎囵B(yǎng)用途優(yōu)化細胞培養(yǎng)基，包括例如配制為促進細胞生長的細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基，或者配制為促進重組蛋白生成的細胞培養(yǎng)生成培養(yǎng)基。如本文中所使用的，術(shù)語“補料分批細胞培養(yǎng)”和“補料分批培養(yǎng)”指如下的細胞培養(yǎng)，其中最初對培養(yǎng)容器供應(yīng)細胞，優(yōu)選地哺乳動物和培養(yǎng)基，并且在或不在培養(yǎng)終止前周期性收獲細胞和/或產(chǎn)物的情況中在培養(yǎng)期間對培養(yǎng)物連續(xù)或以離散的增量補入額外的培養(yǎng)營養(yǎng)物。補料可以基于特定的細胞培養(yǎng)成分的消耗。本文中的術(shù)語要純化的“樣品”包括感興趣的多肽和一種或多種污染物。組合物可以例如是“部分純化的”(即，已經(jīng)進行過一個或多個純化步驟，諸如蛋白A層析)或者例如可以自生成多肽的宿主細胞或生物體直接獲得(例如組合物可以包含收獲的細胞培養(yǎng)液)。術(shù)語“污染物”指存在于溶液諸如加載流體中的任何外來的或不想要的分子。污染物可以是與所純化的感興趣的蛋白質(zhì)不同的生物學(xué)大分子諸如DNA、RNA、或蛋白質(zhì)，其也存在于所純化的感興趣的蛋白質(zhì)的樣品中。污染物包括例如不想要的蛋白質(zhì)變體，諸如聚集的蛋白質(zhì)、錯折疊的蛋白質(zhì)、二硫化物鍵合不足的蛋白質(zhì)、高分子量種類；來自分泌所純化的蛋白質(zhì)的宿主細胞的其它蛋白質(zhì)、宿主細胞DNA、來自細胞培養(yǎng)基的組分、在先前的純化步驟期間浸入樣品中的作為親和層析的吸附劑組的一部分的分子，例如蛋白A ；內(nèi)毒素； 核酸；病毒；或前述任一項的片段。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“層析材料”意指包含優(yōu)選地通過共價鍵來附著層析官能團的大體積核心材料的固體材料。大體積核心材料理解為不牽涉層析過程，即要分離的多肽與層析材料的層析官能團間的相互作用。它僅僅提供一種三維框架，其附著層析官能團，而且其確保含有要分離的物質(zhì)的溶液可以接近層析官能團。優(yōu)選地，所述大體積核心材料是固相。如此，優(yōu)選地，所述“層析材料”是優(yōu)選地通過共價鍵附著層析官能團的固相。優(yōu)選地，所述“層析官能團”是可電離的疏水基團、或疏水基團、或組合不同層析官能團以僅結(jié)合某種類型的多肽的復(fù)合基團，或共價結(jié)合的帶電荷的基團。“固相”意指非流體物質(zhì)，并且包括由諸如聚合物、金屬(順磁性、鐵磁性顆粒)、玻璃、和陶瓷等材料制成的顆粒(包括微粒和珠)；凝膠物質(zhì)諸如硅土、氧化鋁、和聚合物凝膠；沸石和其它多孔物質(zhì)。固相可以是固定的組分，諸如填充的層析柱，或者可以是非固定的組分，諸如珠和微粒。此類顆粒包括聚合物顆粒諸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)； 金顆粒諸如金納米顆粒和金膠體；和陶瓷顆粒諸如硅土、玻璃、和金屬氧化物顆粒。參見例如 Martin，C. R.等，Analytical Chemistry-News & Features (1998)322A—327A。術(shù)語“疏水性電荷誘導(dǎo)層析”或“HCIC”(它們在本申請內(nèi)可以互換使用)意指采用“疏水性電荷誘導(dǎo)層析材料”的層析方法?！笆杷噪姾烧T導(dǎo)層析材料”是包含層析官能團的層析材料，所述層析官能團可以在一個PH范圍中與要分離的物質(zhì)形成疏水鍵，并且其在其它PH范圍中帶正電荷或帶負電荷，即HCIC使用可電離的疏水基團作為層析官能團。一般地，在中性PH條件下將多肽結(jié)合疏水性電荷誘導(dǎo)材料，然后通過改變pH值來產(chǎn)生電荷排斥，從而將其回收。例示性的“疏水性電荷誘導(dǎo)層析材料”是BioSepra MEP或HEA Hypercell(Pall Corp.，USA)。術(shù)語“疏水性相互作用層析”或“HIC”(其在本申請內(nèi)可互換使用)意指采用“疏水性相互作用層析材料”的層析方法?！笆杷韵嗷プ饔脤游霾牧稀笔墙Y(jié)合疏水基團，諸如丁基、辛基、或苯基基團作為層析官能團的層析材料。多肽根據(jù)其表面暴露的氨基酸側(cè)鏈(其可以與疏水性相互作用層析材料的疏水基團相互作用)的疏水性來分離。多肽與層析材料間的相互作用可以受到溫度、溶劑、和溶劑的離子強度影響。例如，溫度升高支持多肽與疏水性相互作用層析材料間的相互作用，因為氨基酸側(cè)鏈的運動增加，并且于較低溫度掩埋于多肽內(nèi)部的疏水性氨基酸側(cè)鏈變得可接近。疏水性相互作用也受親液鹽(kosmotropic salt)促進，并且受離液鹽(chaotropic salts)降低。“疏水性相互作用層析材料”是例如苯基 S印harose CL_4B、6FF、HP、苯基 Superose、辛基 S印harose CL_4B、4FF、和丁基 Sepharose 4FF (均可獲自GEHealthcare Life Sciences，德國)，其經(jīng)由與大體積材料的縮水甘油醚偶聯(lián)獲得。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“親和層析”意指采用“親和層析材料”的層析方法。在親和層析中，多肽基于其生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)來分離，這取決于與層析官能團形成靜電相互作用、疏水鍵、和/或氫鍵形成。為了自親和層析材料回收特異性結(jié)合的多肽，添加競爭配體或者改變層析條件，諸如緩沖液的PH值、極性或離子強度?！坝H和層析材料”是包含組合不同單一層析官能團以僅結(jié)合某種類型的多肽的復(fù)合層析官能團的層析材料。此層析材料特異性結(jié)合某種類型的多肽，這取決于其層析官能團的特異性。例示性的“親和層析材料”是“金屬螯合層析材料”諸如含有Ni (II) -NTA或Cu (II) -NTA的材料，用于結(jié)合含有六組氨酸標(biāo)簽的融合多肽或具有大量表面暴露的組氨酸、半胱氨酸、和/或色氨酸殘基的多肽，或“抗體結(jié)合層析材料”諸如蛋白A、或抗原、或“酶結(jié)合層析材料”諸如包含酶底物類似物、酶輔因子、或酶抑制劑作為層析官能團的層析材料、或“凝集素結(jié)合層析材料”諸如包含多糖、細胞表面受體、糖蛋白、或完整的細胞作為層析官能團的層析材料。在本文中使用時，術(shù)語“蛋白A”涵蓋自其天然來源回收的蛋白A、合成生成的蛋白 A(例如通過肽合成或者通過重組技術(shù)得到)及其保留結(jié)合具有CH2/CH3區(qū)的蛋白質(zhì)的能力的變體。例如，蛋白A可以在商業(yè)上購自GEHealthcare Life Sciences (德國)。“蛋白A親和層析”指使用蛋白A來分離或純化物質(zhì)和/或顆粒，其中一般將蛋白 A在固相上固定化。包含CH2/Ch3區(qū)的蛋白質(zhì)可以可逆地被蛋白A結(jié)合或吸附。在本文中的蛋白A親和層析中使用的蛋白A親和層析柱的例子包括固定化至受控孔玻璃骨架上的蛋白A、在聚苯乙烯固相上固定化的蛋白A，例如POROS 50A(TM)柱(Applied BioSystems Inc.)；或在瓊脂糖固相上固定化的蛋白A，例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOff(TM)或 MABSELECT(TM)柱(GE Healthcare Life Sciences，德國)。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“金屬螯合物層析”意指采用“金屬螯合物層析材料” 的層析方法。金屬螯合物層析基于在金屬離子諸如Cu(II)、Ni(II)或Si(II)(其作為層析官能團被結(jié)合至大體積材料)與多肽，特別是具有含有咪唑的側(cè)鏈和含有硫醇基團的側(cè)鏈的多肽的表面暴露氨基酸側(cè)鏈的電子供體基團間形成螯合物。螯合物在至少部分沒有使那些側(cè)鏈質(zhì)子化的PH值形成。通過PH值的變化，即通過質(zhì)子化自層析材料回收結(jié)合的多肽。 例示性的“金屬螯合層析材料”是HiTrap螯合HP (GE Healthcare Life Sciences，德國)， 或 Fractogel EMD(EMD Chemicals Inc，USA)。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“離子交換層析”意指采用“離子交換層析材料”的層析方法。術(shù)語“離子交換層析材料”涵蓋(根據(jù)陽離子是否在“陽離子交換層析”中交換)“陽離子交換層析材料”或(根據(jù)陰離子是否在“陰離子交換層析”中交換)“陰離子交換層析材料”。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“離子交換層析材料”意指攜帶共價結(jié)合的帶電荷的基團作為層析官能團的固定的高分子量固相。為了總電荷中性，非共價結(jié)合的反荷離子與之結(jié)合。“離子交換層析材料”具有用其非共價結(jié)合的反荷離子交換周圍溶液的帶相似電荷的離子的能力。根據(jù)其可交換反荷離子的電荷，“離子交換層析材料”稱為“陽離子交換層析材料”或者稱為“陰離子交換層析材料”。進一步根據(jù)帶電荷基團的性質(zhì)，“離子交換層析材料”在例如陽離子交換的情況中稱為具有磺酸基團( 或羧甲基基團(CM)的層析材料。根據(jù)帶電荷基團的化學(xué)性質(zhì)，“離子交換層析材料”可以另外分類為強或弱離子交換層析材料，這取決于共價結(jié)合的帶電荷取代基的強度。例如，強陽離子交換層析材料具有磺酸基團作為層析官能團，而弱陽離子交換層析材料具有羧酸基團作為層析官能團?！瓣栯x子交換層析材料”例如以不同名稱可獲自多家公司，諸如例如Bio-Rex、MaCro-Pr印CM(可獲自 BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)、弱陽離子交換體 WCX 2 (可獲自 Ciphergen， Fremont, CA, USA)、Dowex MAC-3 (可獲自 Dow 化學(xué)公司液體分離，Midland, MI, USA)、 Mustang C(可獲自 Pall Corporation,East Hills，NY，USA)、纖維素 CM-23、CM_32、CM_52、 Hyper-D、禾口 Partisphere (可獲自 Whatman pic, Brentford, UK)、Amberlite IRC 76、 IRC 747、IRC 748、GT 73 (可獲自 iTosoh Bioscience GmbH, Stuttgart，德國)、CM 1500、 CM 3000(可獲自 BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA)、禾口 CM S印harose 快速流動 (Fast Flow)(可獲自GE Healthcare, Life Sciences，德國)。商品化的陽離子交換樹脂進一步包括羧基-甲基-纖維素、Bakerbond ABX 、在瓊脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如，SP-Sepharose 快速流動 或 SP-S印harose 高效(High Performance) ,可獲自 GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg,德國)禾口在瓊月旨糖上固定化的磺酰(例如，S-S印harose快速流動 ，其可獲自GE Healthcare, Life Sciences，德國)。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“羥磷灰石層析”意指采用某種形式的磷酸鈣作為層析材料的層析方法。例示性的羥磷灰石層析材料是Bio-Gel HT, Bio-Gel HTP, Macro-Prep Ceramic (可獲自 BioRad Laboratories)、羥磷灰石 I 型、II 型、HA Ultrogel (Sigma Aldrich Chemical Corp.，USA)、羥磷灰石快速流動和高解析(High Resolution) (Calbiochem)、或TSK 凝膠 HA-1000 (Tosoh Haas Corp.，USA)。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“緩沖的，，意指通過緩沖物質(zhì)使由于添加或釋放酸性或堿性物質(zhì)所致的PH變化成為水平的溶液?？梢允褂卯a(chǎn)生此類效應(yīng)的任何緩沖物質(zhì)。優(yōu)選地，使用藥學(xué)可接受緩沖物質(zhì)，諸如例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉或其鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、或三(羥甲基)氨基甲烷 (TRIS)或其鹽。特別優(yōu)選的是磷酸或其鹽、或乙酸或其鹽、或檸檬酸或其鹽、或組氨酸或其鹽。任選地，緩沖溶液可以包含別的鹽，諸如例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉、或檸檬酸鉀。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“膜”意指微孔性或大孔性膜兩者。膜自身由聚合材料諸如例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺(尼龍，例如ktapore 、N66 Posidyne )、聚酯、乙酸纖維素、再生纖維素、纖維素復(fù)合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳基砜、聚苯基砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、非編織物和編織物(例如 Tyvek )、纖維材料構(gòu)成，或者由無機材料諸如沸石(zeolithe)、SiO2, A1203、TiO2、或羥磷灰石構(gòu)成。“加載緩沖液”指用于將包含感興趣的多肽分子和一種或多種污染物的組合物加載至離子交換樹脂上的緩沖液。加載緩沖液具有一定電導(dǎo)率和/或PH，使得感興趣的多肽分子(和一般地一種或多種污染物)結(jié)合至離子交換樹脂。術(shù)語“清洗緩沖液”指用于在洗脫感興趣的多肽分子前清洗或再平衡層析材料，例如離子交換樹脂的緩沖液。清洗緩沖液和加載緩沖液可以是相同的，但是這不是必須的?！跋疵摼彌_液”指用于自固相洗脫感興趣的多肽的緩沖液。例如，改編洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH，使得可以自層析材料，例如離子交換樹脂洗脫感興趣的多肽。術(shù)語“再生緩沖液”指可以用于再生層析材料，例如離子交換或蛋白A樹脂，使得其可以再次使用的緩沖液。術(shù)語“電導(dǎo)率”指水溶液在兩根電極間傳導(dǎo)電流的能力。電導(dǎo)率的測量單位是mS/ cm，并且可以使用電導(dǎo)率計來測量?？梢酝ㄟ^改變其中的離子量來改變?nèi)芤旱碾妼?dǎo)率。例如，可以改變?nèi)芤褐械木彌_劑的量和/或鹽(例如NaCl)的量以實現(xiàn)期望的電導(dǎo)率。自包含多肽和一種或多種污染物的溶液“純化”抗體或多肽意指通過自組合物除去至少一種污染物來提高溶液中的抗體或多肽的純度。多肽的“pi”或“等電點”指蛋白質(zhì)不攜帶凈電荷的pH。在等電點之下，蛋白質(zhì)攜帶凈正電荷，在其之上，攜帶凈負電荷。等電點在蛋白質(zhì)純化中是有意義的，并且可以例如用等電聚焦或用計算機程序來測定。此外，分析用離子交換層析可以解析具有非常相似的 Pl值，即僅相差例如0. 1個Pl單位的蛋白質(zhì)變體。使分子“結(jié)合”層析材料，例如離子交換材料意指在合適的條件(pH/電導(dǎo)率)下將分子暴露于離子交換材料，使得依靠分子與離子交換材料的一種或多種帶電荷的基團間的離子相互作用將分子在層析材料，例如離子交換材料之中或之上可逆地固定化?！扒逑础辈牧弦庵笇⒑线m的緩沖液在層析材料之中或之上通過，例如離子交換材料。“洗脫”分子意指依靠溶劑例如自層析材料分離一種物質(zhì)(例如，多肽或污染物) 與另一種(例如抗體)的作用。
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如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“結(jié)合-和-洗脫模式”及其語法等同用語意指層析方法的操作模式，其中使含有感興趣的物質(zhì)的溶液與固定相，優(yōu)選地固相接觸，由此感興趣的物質(zhì)結(jié)合固定相。因此，感興趣的物質(zhì)保留在固定相上，而不感興趣的物質(zhì)與流過物或上清液一起除去。然后，在第二步中自固定相洗脫感興趣的物質(zhì)，并且由此用洗脫溶液自固定相回收。這不必意指除去100%不感興趣的物質(zhì)，但是除去基本上100%不感興趣的物質(zhì)， 即除去至少50%不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地除去至少75%不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地除去至少 90 %不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地除去超過95 %不感興趣的物質(zhì)。如本發(fā)明內(nèi)所使用的，術(shù)語“流過模式”及其語法等同用語意指層析方法的操作模式，其中使含有感興趣的物質(zhì)的溶液與固定相，優(yōu)選地固相接觸，由此感興趣的物質(zhì)不結(jié)合所述固定相。因此，感興趣的物質(zhì)在流過物或上清液中獲得。不感興趣的物質(zhì)(其也存在于溶液中)結(jié)合固定相，并且自溶液除去。這不必意指自溶液除去100%不感興趣的物質(zhì)， 但是除去基本上100%不感興趣的物質(zhì)，即自溶液除去至少50%不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地自溶液除去至少75%不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地自溶液除去至少90%不感興趣的物質(zhì)，優(yōu)選地自溶液除去超過95 %不感興趣的物質(zhì)。術(shù)語“梯度洗脫”、“梯度洗脫模式”、“連續(xù)洗脫”和“連續(xù)洗脫方法”(它們在本申請內(nèi)可互換使用)在本文中意指如下的層析方法，其中例如連續(xù)提高或降低引起洗脫(即自層析材料分離結(jié)合的物質(zhì))的物質(zhì)的量，即通過一系列小梯級改變所述量，每個所述小梯級不大于引起洗脫的物質(zhì)的量的2%，優(yōu)選地的變化。在此“梯度洗脫”中，可以線性改變、或以指數(shù)改變、或以漸近線改變一種或多種條件，例如層析方法的PH、離子強度、鹽量、和/或流動。優(yōu)選地，變化是線性的?？梢酝ㄟ^固定相來分離這些線性變化。此外，線性變化的陡度在洗脫期間可以有所變化。特定層析步驟中的梯度洗脫后可以接著有梯級洗脫(st印elution)以自特定柱洗脫結(jié)合的分子，如下文所描述的。術(shù)語“梯級洗脫”、“梯級洗脫模式”和“梯級洗脫方法”(它們在本申請內(nèi)可互換使用)意指如下的層析方法，其中例如一次性提高或降低引起洗脫(即自層析材料分離結(jié)合的物質(zhì))的物質(zhì)的量，即從一個數(shù)值/水平直接至下一個數(shù)值/水平。在此“梯級洗脫” 中，一種或多種條件，例如層析方法的PH、離子強度、鹽量、和/或流動均一次性從第一，例如起始數(shù)值變化至第二，例如最終數(shù)值。梯級的變化大于引起洗脫的物質(zhì)的量的5%，優(yōu)選地10%的變化?！疤菁壪疵摗币庵概c線性變化相反，遞增地，即逐步地改變條件。在每次增加后，維持條件，直至洗脫方法中的下一個步驟。術(shù)語“僅梯級洗脫”指在相應(yīng)的層析步驟中通過僅使用用于洗脫多肽的梯級洗脫而不使用梯度洗脫從某種層析柱的洗脫?！皢尾襟E”意指如下的方法，其中一種或多種條件，例如層析方法的pH、離子強度、 鹽量、和/或流動均一次性從起始數(shù)值變化至最終數(shù)值，即與線性變化相反，遞增地，即逐步地改變條件。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“應(yīng)用于”及其語法等同用語意指純化方法的部分步驟，其中使含有要純化的感興趣物質(zhì)的溶液與固定相接觸。這意指a)將溶液添加至固定相定位的層析裝置，或者b)將固定相添加至溶液。在情況a)中，含有要純化的感興趣物質(zhì)的溶液流過固定相，容許固定相與溶液中的物質(zhì)間的相互作用。根據(jù)條件，諸如例如pH、電導(dǎo)率、鹽量、溫度、和/或流速，溶液的一些物質(zhì)結(jié)合固定相，并且如此自溶液除去。其它物質(zhì)保留于溶液中?？梢栽诹鬟^物中找到保留于溶液中的物質(zhì)?！傲鬟^物”意指在通過層析裝置后獲得的溶液。優(yōu)選地，層析裝置是柱或盒?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法，諸如例如沉淀、鹽析、超濾、滲濾、凍干、親和層析、或溶劑體積減少以獲得濃縮的溶液自流過物回收未結(jié)合固定相的感興趣物質(zhì)。在情況b)中，將固定相例如以粉末添加至含有要純化的感興趣物質(zhì)的溶液，容許固定相與溶液中的物質(zhì)間的相互作用。在相互作用后，例如通過過濾取出固定相，并且在上清液中獲得未結(jié)合固定相的感興趣物質(zhì)。如本申請內(nèi)所使用的，術(shù)語“不結(jié)合”及其語法等同用語意指感興趣的物質(zhì)，例如免疫球蛋白在與固定相，例如離子交換材料接觸時保留于溶液中。這不必意指100%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，而是基本上100%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，即至少50%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，優(yōu)選地至少65%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，優(yōu)選地至少80%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，優(yōu)選地至少90%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中，優(yōu)選地超過95%的感興趣物質(zhì)保留于溶液中。術(shù)語“過程中控制參數(shù)” αη-Process-Control Parameter, IPC)是應(yīng)用于過程驗證的用于監(jiān)測反應(yīng)過程的參數(shù)?？梢岳缭诒磉_抗體的細胞培養(yǎng)過程中監(jiān)測IPC。通過測量或測定“過程中控制參數(shù)”，獲得對反應(yīng)過程觸發(fā)特定作用的數(shù)值。例如，“IPC”的例子是抗體發(fā)酵期間的氧和葡萄糖水平、PH和(X)2值。通過測量這些參數(shù)觸發(fā)的作用可以例如是對氧和葡萄糖供應(yīng)的反饋控制。其它IPC可以產(chǎn)生關(guān)于要生產(chǎn)的抗體的信息，例如培養(yǎng)液中的量、質(zhì)量，例如活性和無活性變體的百分比、或特定糖變體的含量。為了測定特定的 IPC，可以例如自培養(yǎng)液取出樣品，或者可以在發(fā)酵期間在線測定IPC?！岸嚯摹笔怯赏ㄟ^肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，無論是天然或是合成生成的。 小于約20個氨基酸殘基的多肽可以稱為“肽”，而由兩個或更多個多肽組成或者包含超過 100個氨基酸殘基的一個多肽的分子可以稱為“蛋白質(zhì)”。多肽還可以包含非氨基酸組分， 諸如碳水化合物基團、金屬離子、或羧酸酯。非氨基酸組分可以由表達多肽的細胞添加，并且可以隨細胞類型而變化。多肽在本文中根據(jù)其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)或其編碼核酸限定。添加諸如碳水化合物基團一般不規(guī)定，但是仍然可以存在。術(shù)語“重組多肽”指已經(jīng)在已經(jīng)用編碼多肽的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，或者由于同源重組而生成多肽的宿主細胞中生成的多肽。術(shù)語“異源DNA”或“異源多肽”指在給定細胞內(nèi)不天然存在的DNA分子或多肽，或 DNA分子群體或多肽群體。對于特定細胞而言異源的DNA分子可以含有自細胞種類衍生的 DNA( S卩，內(nèi)源DNA)，只要細胞的DNA與非細胞的DNA( S卩，外源DNA)組合。例如，認為含有與包含啟動子的細胞DNA區(qū)段可操作連接的編碼多肽的非細胞DNA區(qū)段的DNA分子是異源 DNA分子。相反，異源DNA分子可以包含與外源啟動子可操作連接的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因。由非細胞DNA分子編碼的肽或多肽是“異源”肽或多肽。術(shù)語“抗體”指任何免疫球蛋白或其片段，并且涵蓋包含抗原結(jié)合位點的任何多肽。該術(shù)語包括但不限于多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、非特異性、人源化的、人的、 單鏈、嵌合的、合成的、重組的、雜合的、突變的、嫁接的、雙特異性、三特異性和體外生成的抗體?？贵w片段包括Fab、F(ab”)2、FV、ScFV、Fd、dAb，其可以保留抗原結(jié)合功能。通常，此類片段包含抗原結(jié)合域。如本文中所使用的，術(shù)語“量”對應(yīng)于多肽或抗體的數(shù)量。量可以以相對單位例如層析譜中的峰下面積，或者可以例如以Pg表述。如本文中所使用的，“抗體分子”指感興趣的抗體，其例如與其變體相比可以是最具活性的形式。變體和抗體分子自相同序列表達。如本文中所使用的，“活性抗體或活性變體”指具有較高生物學(xué)效力的抗體，8卩“活性變體”的活性是所有抗體變體(抗體變體自相同抗體序列表達)的平均活性的70-150%。 例如，不攜帶其天冬酰胺殘基的脫酰胺化或異構(gòu)化的赫賽汀變體(其對應(yīng)于離子交換層析譜(參見圖2和表1)中的主峰，即峰3/3*)與分離的其它變體相比具有最高的生物學(xué)效力?？贵w分子的“酸性變體”是比感興趣的抗體分子更具酸性(例如通過等電聚焦或離子交換層析來測定)的感興趣抗體分子的變體。酸性變體的例子是脫酰胺化的變體。還包括在離子交換層析期間與主峰相比在酸性區(qū)中洗脫的所有變體。多肽分子的“脫酰胺化”變體是如下的多肽，其中例如初始多肽的一個或多個天冬酰胺殘基已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成天冬氨酸，即中性酰胺側(cè)鏈已經(jīng)被轉(zhuǎn)化成具有總體酸性特征的殘基。例如，脫酰胺化的her2變體是具有氨基酸位置30處的天冬酰胺轉(zhuǎn)化成天冬氨酸的her2 抗體變體，例如其對應(yīng)于離子交換層析譜(圖2，表1)中的峰1。抗體分子的“堿性變體”是比感興趣的抗體分子更具堿性(例如通過等電聚焦或離子交換層析來測定)的抗體分子的變體。這里，還包括例如僅相差例如天冬酰胺異構(gòu)化的變體，其在理論上不應(yīng)改變抗體的總體理論電荷，但是其可以產(chǎn)生抗體的如下構(gòu)象，使得抗體在離子交換層析期間與未修飾的抗體相比在更堿性的區(qū)域中洗脫。例如，峰4(圖2，表 1)中解析的赫賽汀變體正是該情況。術(shù)語糖變體指以與抗體分子相比不同糖基化樣式為特征的抗體變體。那意味著附著于抗體的多糖(聚糖)的類型和分布在糖變體間不同。若抗體分子的糖變體的Pi值與抗體分子不同，則它也可以落入范疇堿性或酸性變體中。所有抗體變體與抗體分子自相同序列表達，并且如此是例如體內(nèi)或體外翻譯后修飾的。如本文中所使用的，術(shù)語“閾值比率”指做出特定決定的抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率。例如，閾值比率對純化方案或發(fā)酵期間的收獲時間點可以是決定性的?；蛘?，對于實施的陽離子交換層析的類型是決定性的，即在閾值比率之下，與在比率高于閾值比率時實施的洗脫不同地實施洗脫(例如梯度對梯級洗脫)。術(shù)語“抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率”指與某個體積中的抗體分子或其變體的量與相同體積中的抗體分子及其變體的量的商對應(yīng)的比率。如此，相對于抗體分子的量及其變體的總量之和設(shè)置抗體分子或其變體的量。如此，對于含有抗體的溶液中的每種抗體變體和抗體分子，可以歸于某個比率，并且所有這些比率的和必須是100%?？梢岳缱噪x子交換層析譜(如圖2中所顯示的，其中將UV吸收繪圖)，或者在經(jīng)由蛋白質(zhì)測量來測定抗體含量后測定此類比率。絕對蛋白質(zhì)測量對于測定比率不是必要的(因為它僅是比率而不是絕對值)，而是僅UV吸收(其對應(yīng)于某個蛋白質(zhì)量)對于計算比率可以是足夠的。例如，可以使用層析譜下的峰面積來測定抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體之和的比率。然后，所有峰(抗體分子和變體)的面積之和會對應(yīng)于分母，而單峰下的面積對應(yīng)于各自的分子。除非另有指明，術(shù)語“her2”在本文中使用時指人her2蛋白，并且“her2”指人her2基因。例如，人her2基因和her2蛋白記載于kmba等，PNAS(USA)82 :6497-6501(1985)及 Yamamoto 等 Nature 319 :230-234(1986) (Genbank 登錄號 X03363)。如本文中所使用的，術(shù)語“藥物產(chǎn)品”指用于治療患者的配制緩沖液中的純化的抗體。藥物產(chǎn)品含有最小水平的活性抗體變體和最大水平的無活性變體。在開發(fā)期間評估這些數(shù)值，并且將其提交給衛(wèi)生當(dāng)局?！爸委?處理”指治療性處理和防范性或預(yù)防性措施兩者。需要治療的個體包括已經(jīng)患有病癥的個體及要預(yù)防病癥的個體?！安“Y”指會受益于用如本文中所描述的那樣純化的多肽的治療的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物趨向于所討論的病癥的病理學(xué)狀況。在抗體發(fā)酵期間，不僅生成作為感興趣抗體的抗體分子，而且生成所述抗體的變體。與抗體分子相比，這些變體可以具有相似的活性，而且還可以有較小的活性，例如在患者中的治療期間，并且可能是大批藥物產(chǎn)品中不想要的。一個例子可以是脫酰胺化的抗體變體，其可以更易受體內(nèi)降解。關(guān)于不想要的變體，依照本發(fā)明的方法以高收率和高純度實現(xiàn)抗體分子的生產(chǎn)。依照本發(fā)明的方法基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即可以通過改編抗體的收獲時間點和/或隨后的抗體純化方案來關(guān)于變體分布(其可以表述為例如抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率)將抗體組合物向期望的方向轉(zhuǎn)換。如此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物的方法，包括下列步驟a)提供包含抗體分子及其變體的樣品，b)在所述樣品的等分試樣中測定抗體分子及其變體的存在和/或抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，c)基于步驟b)中獲得的數(shù)據(jù)，確定隨后的收獲時間點和/或抗體純化方案，由此，生產(chǎn)包含分子抗體及其變體的抗體組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，樣品是沒有細胞和細胞碎片的包含抗體分子及其變體的細胞培養(yǎng)液，或者是蛋白A親和層析步驟的洗脫物。在本發(fā)明的又一些方面，包含抗體分子及其變體的樣品是自用于抗體分離的其它柱，如陰離子交換柱、疏水性相互作用柱、羥磷灰石層析柱等獲得的洗脫物。在本發(fā)明的某些方面，抗體分子的變體是酸性變體、堿性變體、糖變體、或與抗體分子相比對限定的抗原具有不同結(jié)合親和力的變體。在又一個優(yōu)選的實施方案中，抗體分子的變體是比抗體分子自身具有更小活性的變體?；钚钥梢岳缭凇绑w外”測定法(例如，中和抗原的功效)或在例如動物模型中測量。在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗體分子的pi與抗體分子的pi相差0. 1至0. 5個 Pl單位。若例如要分析的蛋白質(zhì)的序列是已知的，則用理論軟件程序，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如例如等電聚焦來測定Pl值。在本發(fā)明的某個方面，提供包含培養(yǎng)基、細胞、抗體分子及其變體的樣品，包括下列步驟i)提供含有核酸分子的細胞，所述核酸分子包含編碼所述抗體分子的核酸序列，ii)將所述細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4- 天，iii)自培養(yǎng)液獲得樣品。
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在本發(fā)明的又一些方面，步驟ii)中的將細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少持續(xù)418天， 優(yōu)選地4-18天且最優(yōu)選地4-16天。在本發(fā)明的又一些方面，實施步驟ii)中的將細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至獲得特定的抗體濃度，即至少200mg，優(yōu)選地至少800mg/l，更優(yōu)選地至少1000mg/ml且最優(yōu)選地至少1500mg/ml。這些濃度取決于所表達抗體的種類等。在赫賽汀的情況中，至少200mg/l的抗體濃度是優(yōu)選的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，通過離子交換層析，例如通過分析用離子交換層析來測定抗體分子和/或其變體的存在和抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體之和的比率。此技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的，并且牽涉例如使用梯度洗脫的陽離子交換層析。對于計算抗體分子及其變體的相對量，對解析的各個峰測定峰下面積(關(guān)于可能的方法的詳情，參見下文的實施例)。測定抗體分子和/或其變體的存在是僅測定抗體分子和 /或其變體是否包含在特定樣品中。僅關(guān)于含有特定變體(不管其相對量)的觀察結(jié)果對于收獲時間點或純化方案可以是決定性的。在本發(fā)明的別的實施方案中，通過技術(shù)人員已知的其它合適方法，例如通過等電聚焦(在此背景中還可參見綜述Ahrer和Jungbauer J. of Chromatog. 2006，第841卷，第 110頁-第122頁)來測定抗體分子，即感興趣的抗體分子，或其變體的百分比。在本發(fā)明的別的方面，例如通過MALDI-T0F分析或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來測定糖變體的存在和/或量。在本發(fā)明的又一些方面，相對于最具活性的變體及其其它變體之和，測定最具活性的her2抗體變體(其對應(yīng)于離子交換層析譜中的峰3/3*)的量，參見例如圖2和表1 (參見 Harris, R. J.，J. Chromatogr. B 752 (2001) 233-245)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在發(fā)酵的例如第3天、第5天、或第7天后每天、 每隔一天、或者以其它限定的增量，或者在達到發(fā)酵培養(yǎng)液中的某個抗體濃度，即0. 2至 1. 5mg/ml后每天或每隔一天測定抗體分子和/或其變體的存在或比率。在本發(fā)明的又一些實施方案中，在發(fā)酵的某個長度后，優(yōu)選地對于赫賽汀在發(fā)酵的第10天、第11天或第12天后在發(fā)酵期間僅對活性抗體的相對量測定一次。在本發(fā)明的方法的某個實施方案中，使用技術(shù)人員已知的方法，如例如蛋白質(zhì)測量和ELISA來測定某個發(fā)酵日的抗體總量(樣品中的抗體分子和所有變體的量之和)。在本發(fā)明的另一方面，基于對先前的相似發(fā)酵運行知道的抗體總量的時間過程計算某個時間點時的抗體總量。在下文的實施例中，描述了用于測定樣品中的her2量的例示性方法。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，通過陽離子交換層析，任選地在實施親和層析步驟后純化抗體分子及其變體。然而，所使用的洗脫模式取決于來源材料的純度，即取決于抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，自陽離子交換柱洗脫抗體如下實施i)逐漸提高應(yīng)用于陽離子交換柱的緩沖液的電導(dǎo)率和/或pH，并ii)然后，若步驟al)中測定的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率低于閾值比率，則逐步提高應(yīng)用于陽離子交換柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH，或者若步驟al)中測定的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率高于閾值比率，則在沒有逐漸提高應(yīng)用于該柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中逐步提高電導(dǎo)率和/或pH。在本發(fā)明的上下文中的此閾值比率可以如下測定目標(biāo)是所述抗體的規(guī)格中所列的配制的治療性抗體藥物(大批藥物產(chǎn)品)，其具有預(yù)定的最小水平的感興趣抗體分子和預(yù)定的最大水平的其變體。例如，這些水平對于管理當(dāng)局是相關(guān)的。出于其它原因，在體內(nèi)可能例如具有較小活性的變體是不想要的。此閾值比率現(xiàn)在確定收獲時間點和純化方案， 特別地陽離子交換層析期間的洗脫模式。例如，在閾值比率之下，在陽離子交換層析步驟中通過梯度洗脫，接著是梯級洗脫來純化抗體以獲得足夠高的抗體分子純度和收率，并且在所述比率之上，會僅通過梯級洗脫來純化抗體以獲得高收率及還有滿足安全性標(biāo)準(zhǔn)的抗體。如此，設(shè)置閾值，使得不管來源材料的性質(zhì)，滿足管理當(dāng)局要求的抗體可獲得，而且使得可以獲得最高的可能的收率。在另一個優(yōu)選的實施方案中，閾值比率確定收獲時間點，使得例如僅在達到閾值數(shù)值之上的數(shù)值時實施收獲，參見下文，以在陽離子交換層析中總是使用僅梯級洗脫模式。本文的背景是在發(fā)酵期間，可以出現(xiàn)特定的抗體變體，并且在其相對量方面增加，而抗體分子的量在發(fā)酵期間可能降低。過程的閾值比率的數(shù)值取決于要純化的抗體、發(fā)酵條件、衛(wèi)生當(dāng)局的要求、和所使用的下游和配制規(guī)程(層析步驟、過濾等)等，并且如此必須個別地針對每種治療性抗體生產(chǎn)方法限定。在限定的閾值比率之下，某種例如不想要的變體的相對量是相對較高的，并且感興趣抗體分子的量是相對較低的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在此情況中，在同一個柱上的梯度洗脫模式， 接著是梯級洗脫適合于以如下的程度自變體純化抗體分子，使得可以獲得適合于銷售的藥物產(chǎn)品。然而，僅梯級洗脫模式在此情況中是不太合適的，這是由于抗體分子自其變體的純化程度較低。在最壞的情況中，若要純化的含有抗體的溶液具有在閾值比率之下的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，則梯級洗脫不會產(chǎn)生適合于銷售的藥物產(chǎn)品。參見下文的實施例。另一方面，若要純化的包含抗體的溶液中的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率高于閾值比率，則陽離子交換層析期間的僅梯級洗脫模式是優(yōu)選的，因為與梯度洗脫，接著進行梯級洗脫相比，此洗脫模式導(dǎo)致更高的收率，而且還可以獲得適合于銷售的藥物產(chǎn)品。換言之，由于應(yīng)用于陽離子交換柱的來源材料的質(zhì)量較高(以比率表述)， 可以選擇針對收率優(yōu)化的洗脫模式(梯級洗脫)。因為陽離子交換層析期間的梯級洗脫模式在收率方面是有利的，所以可以選擇收獲條件，使得抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率總是高于閾值比率，并且如此，梯級洗脫會總是產(chǎn)生可接受的藥物產(chǎn)品。優(yōu)選地，在抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率比閾值比率高 0-2%，并且最優(yōu)選地，它與閾值比率非常接近或相同時自細胞培養(yǎng)液回收抗體。由此，利用的正是盡可能長地持續(xù)發(fā)酵以獲得高絕對量的抗體，但是不太長以避免抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的不想要的比率。依照我們的發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的某個長度后，抗體分子的百分比降低，而其變體的百分比升高(參見關(guān)于赫賽汀的

圖1)。在本發(fā)明的某個方面，用于測定會通過陽離子交換層析用梯度，接著用梯級洗脫， 還是僅用梯級洗脫分離抗體的閾值比率是50至100%，優(yōu)選地范圍為60至80%，且最優(yōu)選地范圍為65至75%。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，閾值比率是67. 5%。
優(yōu)選地，通過重組手段來生成依照本發(fā)明的抗體。如此，本發(fā)明的一方面是編碼依照本發(fā)明的抗體的核酸，而另一方面是包含編碼依照本發(fā)明的抗體的所述核酸的細胞。用于抗體的重組生產(chǎn)的通用方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且包括在原核或真核細胞中的蛋白質(zhì)表達，隨后分離抗體，并且通常純化至藥學(xué)可接受產(chǎn)物(參見例如下列綜述 Makrides, S. C. , Protein Expr. Purif. 17,183-202 (1999) ；Geisse, S.等，Protein Expr. Purif. 8(1996)271-282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880)。對于在宿主細胞中表達如前述的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)的方法來將編碼相應(yīng)的經(jīng)修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達載體中。雜交瘤細胞可以充當(dāng)此類DNA和RNA的來源。一旦分離，可以將DNA插入表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)染入在其它情況中不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細胞諸如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、PER. C6細胞、酵母、 大腸桿菌細胞、或骨髓瘤細胞中，以獲得重組單克隆抗體在宿主細胞中的合成。在適合于表達異源多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，并且自細胞或培養(yǎng)物上清液分離異源多肽。一般地，本發(fā)明的方法和組合物可用于生產(chǎn)重組蛋白。重組蛋白是通過遺傳工程方法生成的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選的依照本發(fā)明的方法和組合物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)是基于蛋白質(zhì)的治療劑，又稱為生物制劑。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)作為胞外產(chǎn)物分泌。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，細胞是能夠表達異源多肽的重組細胞克隆。依照本發(fā)明的方法原則上適合于生產(chǎn)任何抗體。在一個實施方案中，用依照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的免疫球蛋白是重組免疫球蛋白。在其它實施方案中，免疫球蛋白是人源化的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白綴合物或嵌合免疫球蛋白。在本發(fā)明的另一方面，抗體選自下組單克隆和多克隆抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的另一方面是IgG或IgE類的免疫球蛋白的純化。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是單克隆抗體。在又一個實施方案中，通過依照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的抗體是治療性或診斷性抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體是治療性抗體?？捎糜谝勒毡景l(fā)明的用于生產(chǎn)異源多肽的方法的細胞原則上可以是任何真核細胞諸如例如酵母細胞或昆蟲細胞或原核細胞。然而，在本發(fā)明的一個實施方案中， 真核細胞是哺乳動物細胞。優(yōu)選地，所述哺乳動物細胞是CHO細胞系、或BHK細胞系、 或HEK293細胞系、或人細胞系，諸如PER.C6 。此外，在本發(fā)明的一個實施方案中，真核細胞是動物或人起源的連續(xù)細胞系，諸如例如人細胞系HeLaS3 (Puck，Τ. Τ.等，J. Exp. Meth. 103(1956)273-284)，(Nadkarni, J. S.等，Cancer 23 (1969) 64-79)、HT1080 (Rasheed， S.等，Cancer 33 (1974) 1027-1033)，或自其衍生的細胞系。在本發(fā)明的某個方面，在表達抗體的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。一般地，可以以任何期望的方式培養(yǎng)重組細胞克隆。依照本發(fā)明的此方面添加的營養(yǎng)物包含必需氨基酸，諸如例如谷氨酰胺、或色氨酸、或/和碳水化合物、和任選地非必需氨基酸、維生素、痕量元素、鹽、或/和生長因子諸如例如胰島素和/或肽，例如自植物衍生的。在一個實施方案中，在細胞的整個生長期(培養(yǎng))里添加營養(yǎng)物。在適合于培養(yǎng)的細胞的培養(yǎng)基中制備依照本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個實施方案中，培養(yǎng)的細胞是CHO細胞。適合于哺乳動物細胞的培養(yǎng)條件是已知的(參見例如Cleveland，W. L.等，J. Immunol. Methods
1956 (1983)，221-234)。此外，可以在無需過度實驗的情況中憑經(jīng)驗確定對于特定細胞系必需的培養(yǎng)基的營養(yǎng)物和生長因子(包括它們的量)，如由例如Mather (編)于MammaIian cell culture, Plenum Press, NY(1984) ；Rickwood, D.禾口 Hames, B. D.(編)，Animal cell culture :A Practical Approach,第2版，Oxford University Press,NY(1992) ；Barnes禾口 Sato, Cell 22 (1980) 649 所描述的。術(shù)語“在適合于表達的條件下”意指用于培養(yǎng)表達多肽的細胞，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是， 這些條件可以隨所培養(yǎng)的細胞類型和所表達的多肽類型而變化。一般地，將細胞于一定溫度，例如20°C和40°C間培養(yǎng)，且持續(xù)一段足以容許有效生成綴合物的時間，例如4至觀天。在本發(fā)明的一個實施方案中，培養(yǎng)物是懸浮培養(yǎng)物。此外，在另一個實施方案中， 將細胞在含有低血清含量，諸如例如最大(ν/ν)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)物是無血清培養(yǎng)物，例如在無血清的低蛋白質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基中(參見例如WO 96/35718)，并且在又一個優(yōu)選的環(huán)境中，培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)的和/或完全合成的。商品化培養(yǎng)基諸如 Ham 氏 FlO 或 F12 (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、 或Dulbecco氏改良的fegle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)(它們含有合適的添加劑)是例示性的營養(yǎng)溶液。這些培養(yǎng)基之任一種可以在必要時補充如上文所提及的組分。用于抗體的大或小規(guī)模生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)規(guī)程在本發(fā)明的背景內(nèi)是潛在有用的。可以使用以下規(guī)程，包括但不限于流化床式生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)、或攪拌罐式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，在后兩種系統(tǒng)中，與或不與微載體一起使用?？梢栽诜峙⒀a料-分批、拆分(split)-分批、連續(xù)、或連續(xù)-灌注模式之一中操作系統(tǒng)。在本發(fā)明的某些實施方案中，將培養(yǎng)作為依照培養(yǎng)要求補料的拆分-分批方法實施，其中在生長期后收獲培養(yǎng)液的一部分，并且將培養(yǎng)液的剩余部分保留于發(fā)酵罐中，隨后，用新鮮的培養(yǎng)基補充所述發(fā)酵罐，直至工作體積。依照本發(fā)明的方法使期望的抗體以非常高的收率收獲。依照本發(fā)明的另一方面，設(shè)計補料-分批或連續(xù)細胞培養(yǎng)條件以增強細胞培養(yǎng)的生長期中的哺乳動物細胞的生長。在生長期中，培養(yǎng)細胞，，培養(yǎng)的條件和時間在生長方面最大化。培養(yǎng)條件諸如溫度、PH、溶解氧(DO2)等是與特定宿主一起使用的，并且是技術(shù)人員已知的。依照本發(fā)明，控制細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期期間的細胞培養(yǎng)環(huán)境。通過以下參數(shù)限定要生產(chǎn)的抗體的培養(yǎng)條件a)基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)物的量和類型、任選的血漿組分、生長因子、鹽和緩沖液、核苷和堿基、蛋白質(zhì)水解物、抗生素和脂質(zhì)、合適的載體，b)碳水化合物的類型和量、溶解氧量、銨量、PH值、摩爾滲透壓濃度、溫度、細胞密度、生長狀態(tài)，c)任選地添加別的添加劑(例如，血漿組分、生長因子諸如例如血清組分、生長激素、肽水解物、小分子(如地塞米松(dexamethason)、皮質(zhì)醇(Cortisol)、鐵螯合劑等)、無機化合物(如硒(selene)等)、和已知具有糖基化概況效應(yīng)的化合物(如丁酸鹽或奎尼丁 (quinidine)、鏈烷酸(alkanoic acid)、或銅、胰島素、運鐵蛋白、EGF、激素、鹽、無機離子、 緩沖液、核苷和堿基、蛋白質(zhì)水解物、抗生素、脂質(zhì)，諸如例如亞油酸)。例如，別的添加劑是刺激細胞生長和/或增強細胞存活和/或以任何期望的方向操作糖基化抗體的糖基化概況的非必需化合物。一般地，多肽生成期在生長期開始后至少3小時開始，諸如在生長期開始后約 12至約224小時時，或者備選地在生長期開始后約120至192小時時。生成期可以持續(xù)例如4至14天?；蛘撸善诳梢允?8-21天或者甚至更長，例如多至觀天。在此期期間，細胞生長一般已經(jīng)達到平臺期，例如對數(shù)細胞生長已經(jīng)結(jié)束，并且蛋白質(zhì)生成是主要的 (primary)。在本發(fā)明的一個方面，可以采用培養(yǎng)液的間歇取樣，例如以測定特定的細胞培養(yǎng)參數(shù)(乳酸生成、抗體量)或所生成抗體的質(zhì)量檢查(測定活性和無活性變體的相對量)。在本發(fā)明的某個方面，在適合于表達特定抗體且導(dǎo)致抗體相對于其變體的某個百分比的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。此百分比在發(fā)酵期間可以變化，即可以增加或減少，為可預(yù)測的(例如線性減少/增加或依照特定的公式)或不可預(yù)測的。一般地，雖然編碼抗體的核酸是相同的，但是在發(fā)酵期間及后來通過不同過程修飾，由宿主細胞所生成的抗體在結(jié)構(gòu)和氨基酸序列方面不相同。常見的修飾是例如脫酰胺化和糖基化，其可以導(dǎo)致單一發(fā)酵批次中所生產(chǎn)的抗體的電荷異質(zhì)性。導(dǎo)致電荷異質(zhì)性的其它修飾是不完全的二硫鍵形成、N端焦谷氨酰胺環(huán)化、C端賴氨酸加工、異構(gòu)化、和氧化、及通過馬來酸一酰脲(maleuric acid)對N端氨基酸的不太常見的修飾和C端氨基酸的酰胺化。收獲時間點代表例如在抗體發(fā)酵期間收獲，即自培養(yǎng)物取出并冷凍或者自培養(yǎng)基分離抗體的時間點。依照本發(fā)明基于含有抗體的培養(yǎng)液的組成或質(zhì)量(其以抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率表述)選擇此時間點。例如，某種變體(例如酸性、堿性、糖變體)的存在或出現(xiàn)可以確定必須停止發(fā)酵，例如以避免在進一步發(fā)酵期間進一步富集不想要的(例如活性較小的)抗體變體。而且，某種變體與感興趣的抗體分子的相對量，即抗體分子的變體與抗體分子及其變體的量之和的比率可以確定收獲時間點以獲得確定一種優(yōu)選的純化方案的期望的抗體組合物。然后可以將所測定的比率與(限定的)閾值比率比較，在所述閾值比率，例如必須停止或者必須繼續(xù)發(fā)酵，使得可以遵循某種層析方案以獲得期望的抗體組合物。情況可能是例如在某個樣品中，某些不利的變體的相對量相對較高，或者感興趣的抗體分子的相對量較低，然后必須選擇純化方案，其容許純化感興趣的抗體分子，使得不利的變體低得耐受。另一方面，步驟b)中測定的比率可以指示必須進一步繼續(xù)發(fā)酵，直至獲得期望的比率。 可以重復(fù)實施比率的測定，但是也可以對進一步的培養(yǎng)外推比率，參見下文。生成抗體的細胞系的發(fā)酵持續(xù)時間和下游規(guī)程期間的條件是本文顯示為影響例如樣品中的脫酰胺化的變體與感興趣抗體分子相比的相對量的例示性參數(shù)，參見下文實施例。假設(shè)下游規(guī)程對緊密相關(guān)的抗體變體(其可以僅在單個氨基酸的電荷方面有所不同)的純化設(shè)置某種限制，然后，例如發(fā)酵培養(yǎng)液中的抗體分子水平不可落在某個閾值數(shù)值之下，使得下游規(guī)程仍以高收率產(chǎn)生足夠純的大批藥物產(chǎn)品。因此，發(fā)酵必須在特定的時間點時停止，例如在抗體分子量的相對量大于限定的閾值比率時，通過自細胞培養(yǎng)液回收抗體進行。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，自培養(yǎng)液回收抗體的時間點自先前限定的閾值比率的比較推導(dǎo)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，通過評估抗體分子或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率來確定收獲時間點，其通過假設(shè)抗體分子的相對量線性降低或升高某個每日百分比進行。特別地，在此情況中，通過分析用離子交換層析單次測量抗體分子或其變體與抗體分子及其變體的量之和的比率對于確定自培養(yǎng)液回收抗體的時間點可以是足夠的，因為可以計算該時間點，而不是自進一步測量推導(dǎo)。在某個實施方案中，通過假設(shè)培養(yǎng)液中的抗體分子的量在培養(yǎng)的某個長度后降低某個每日百分比來計算抗體回收的時間點。依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，實施取樣并測定抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，直至比率比某個閾值比率高0-2 %，和/或通過外推已經(jīng)獲得步驟 iii)中的樣品的那天后培養(yǎng)的培養(yǎng)液中的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率來完成，其通過依照以下公式計算所述比率來進行Rx = Rtl-CX (DX_D。)，其中D。是獲得步驟C)中的樣品的培養(yǎng)日，Dx是隊后的培養(yǎng)日，Rx是Dx時抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，R0是步驟iv)中測定的在D。時的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，且C是范圍為/天和5% /天的數(shù)值。然后，在培養(yǎng)液中的Rx比閾值比率高0-2%時，自培養(yǎng)液回收抗體分子。優(yōu)選地，在培養(yǎng)液中的民比閾值比率高0-2%時，最優(yōu)選地，在所述比率與閾值數(shù)值接近或甚至相同時，自培養(yǎng)液回收抗體分子。如上文所討論的，閾值比率取決于抗體分子的性質(zhì)及要在抗體組合物中獲得的純
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/又寸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，活性her2變體(其對應(yīng)于離子交換層析譜中的峰 3/3*)的量在培養(yǎng)某個時間后，例如培養(yǎng)的10天后每天降低約2% (參見圖1)。在本發(fā)明的某個方面，優(yōu)選地在收獲前不久(例如，在收獲前1-2天或者例如對于赫賽汀發(fā)酵在第11天時)，對Rx僅測定一次。若如此測定的Rx比閾值比率高例如2%，則將培養(yǎng)再實施一天，并且如此在測定Rx后一天發(fā)生抗體的收獲。在赫賽汀發(fā)酵的情況中， 然后，收獲時的Rx會非常接近閾值比率，因為比率自發(fā)酵的第11天至第12天降低約2%， 其自許多先前的發(fā)酵運行已知。然而，若第11天測定的Rx比閾值比率高小于2%，例如在發(fā)酵第11天(dll)比所述比率高1. 5%，則立即停止赫賽汀發(fā)酵以確保大批藥物產(chǎn)品的足夠高的質(zhì)量。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，獲得來自包含抗體分子及其變體的培養(yǎng)液的樣品。 在又一些實施方案中，將取樣實施超過一次，例如每天、每隔一天等，或者甚至超過每天一次?？梢噪S著培養(yǎng)開始立即或者在某個時間后，例如培養(yǎng)7或10天后開始此取樣。在此樣品中，測定例如抗體分子和/或其變體的量與抗體分子及其變體的量之和的比率，例如活性抗體變體的百分比?；蛘撸诖藰悠分袦y定其它參數(shù)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來實施取樣。在本發(fā)明的其它方面，還可以測定活性抗體的絕對量?？梢宰詣踊蚴謩油瓿扇印Ｔ诒景l(fā)明的某些實施方案中，自動實施取樣步驟。樣品體積范圍可以為例如1 μ 1至10000 μ 1。在本發(fā)明的另一個實施方案中，用所描述的方法可獲得的大批藥物產(chǎn)品中的活性 her2抗體變體的百分比大于等于65%，而無活性her2變體的百分比小于等于20%，其中活性her2變體對應(yīng)于離子交換層析譜中的峰3/3*，而此背景中的無活性變體對應(yīng)于此層析譜的峰4 (參見圖1)。在本發(fā)明的某個方面，所生產(chǎn)的抗體組合物中的抗體分子的量與抗體分子及其變體的量之和的比率是50-100%，優(yōu)選地60至100%且最優(yōu)選地65至100%。這些數(shù)值特別取決于要純化的抗體。在本發(fā)明的某個方面，優(yōu)選地，將感興趣的多肽自培養(yǎng)液以分泌性多肽回收，雖然它在沒有分泌性信號的情況中直接表達時也可以自宿主細胞溶胞物回收。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過自發(fā)酵培養(yǎng)液分離細胞來實施收獲，即自細胞培養(yǎng)液回收抗體。 作為第一步，例如將培養(yǎng)液或溶胞物離心以除去微粒細胞碎片和細胞。接著可以有深度過濾或其它過濾和/或離心步驟。然后，獲得沒有細胞和細胞碎片的含有抗體的溶液。然后，用合適的純化規(guī)程例示性的以下規(guī)程自污染物純化多肽在免疫親和和離子交換柱上分級；乙醇沉淀；反相HPLC ；在硅土上或者在陽離子交換樹脂諸如DEAE上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；使用例如kphadex G-75的凝膠過濾；和蛋白A kpharose柱以除去污染物。蛋白酶抑制劑諸如苯甲磺酰氟(PMSF)或EDTA也可以用于抑制純化期間的蛋白水解降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，適合于感興趣的多肽的純化方法可能需要修飾以解決重組細胞培養(yǎng)中表達后的多肽特征變化。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，抗體的純化牽涉親和層析，接著是陽離子交換層析。在這兩個層析步驟間，可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于純化抗體的別的層析和 /或過濾步驟及陽離子交換層析步驟之后及蛋白A親和步驟之前的別的層析和/或過濾步驟。還有可能反轉(zhuǎn)層析步驟的次序。在對純化方法的一個步驟(或者對隨后的步驟)應(yīng)用溶液前，必須調(diào)節(jié)參數(shù)諸如例如溶液的PH值或電導(dǎo)率。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，將含有抗體分子及其變體的培養(yǎng)液應(yīng)用于親和層析柱，并實施親和層析。仍在本發(fā)明的某些方面，采用作為最先純化步驟的親和層析步驟以除去大量宿主細胞蛋白和培養(yǎng)副產(chǎn)物。此步驟的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的某些方面，親和柱材料是蛋白A材料、蛋白G材料、金屬親和層析材料、疏水性電荷誘導(dǎo)層析材料(HCIC)、或疏水性相互作用層析材料(HIC，例如用苯基-S印harose、親氮雜芳烴樹脂、 或間氨基苯硼酸)。優(yōu)選地，親和柱材料是蛋白A材料或金屬親和層析材料。在本發(fā)明的某個方面，使用固定化于固相上的蛋白A來純化抗體。優(yōu)選地，固相是包含用于固定化蛋白A的玻璃或硅土表面的柱。優(yōu)選地，固相是受控孔玻璃柱或硅酸柱。 有時，為了阻止對該柱的非特異性粘附，已經(jīng)用試劑諸如甘油包被該柱。PROSEP A柱(在商業(yè)上可獲自Bioprocessing Limited)是用甘油包被的蛋白A受控孔玻璃柱的一個例子。 在本發(fā)明的某些方面，蛋白A材料以比25mg抗體/ml蛋白A材料高的結(jié)合性能為特征。在本發(fā)明的又一些方面，在親和層析步驟中采用高流動瓊脂糖基礎(chǔ)基質(zhì)，其經(jīng)由環(huán)氧活化在C 端半胱氨酸處偶聯(lián)蛋白A與基礎(chǔ)基質(zhì)。適合于依照本發(fā)明的方法的蛋白A材料的例示性材料是 Mabklect Sure 和 Mabklect Xtra (兩者都可獲自 GEHealthcare，Lifesciences，德國)。
在本發(fā)明的某個方面，用合適的緩沖液平衡蛋白A層析的固相。例如，平衡緩沖液可以是TRIS，NaCl, pH 7. 1。在本發(fā)明的某個方面，此緩沖液含有EDTA或另一種蛋白酶抑制劑和/或抗體穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的某個方面，使用可以與平衡緩沖液相同的加載緩沖液來將例如通過離心和/或過濾或深度過濾與細胞和細胞碎片分開的含有抗體的培養(yǎng)液在經(jīng)過平衡的固相上加載。隨著含污染物的制備物流過固相，蛋白質(zhì)被吸附至固定化的蛋白A，而其它污染物諸如中國倉鼠卵巢蛋白(CHOP)(在CHO細胞中生成所述蛋白質(zhì)時)和DNA非特異性結(jié)合固相。后來實施的下一步包括除去結(jié)合固相的污染物。在本發(fā)明的某些方面，清洗緩沖液包含清洗步驟中的疏水性電解質(zhì)溶劑，如例如TMAC和/或TEAC (約0. 1至約1. 0M)，或者可以包含二價離子或溶劑。適合于此目的的緩沖液包含例如TRIS、磷酸鹽、MES、和MOPSO 緩沖液(參見下文實施例)。在本發(fā)明的另一方面，清洗緩沖液包含中性或酸性PH的精氨酸。在上文提及的清洗步驟后，用合適的洗脫緩沖液自所述柱回收感興趣的蛋白質(zhì)。 例如，可以使用具有低PH，例如范圍為約2至約5的洗脫緩沖液自柱洗脫蛋白質(zhì)。出于此目的的洗脫緩沖液的例子包括檸檬酸鹽或乙酸鹽緩沖液?；蛘?，洗脫緩沖液包含精氨酸、二價鹽或溶劑。可以將洗脫的蛋白質(zhì)制備物進行別的純化步驟。例示性的進一步純化步驟包括羥磷灰石層析；透析、使用捕捉蛋白質(zhì)的抗體的親和層析、疏水性相互作用層析(HIC)、疏水性電荷相互作用層析(HCIC)、硫酸銨沉淀、陰離子或陽離子交換層析、乙醇沉淀；反相 HPLC ；硅土上的層析、層析聚焦和凝膠過濾。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，在親和層析后采用陽離子交換層析。在本發(fā)明的某個方面，親和層析步驟后直接接著陽離子交換層析，之間沒有其它層析步驟。在本發(fā)明的別的方面，在親和和陽離子交換層析間采用其它層析步驟和/或純化步驟。此陽離子交換層析步驟目的在于在含有要純化的蛋白質(zhì)的溶液中不僅降低不想要的抗體變體、宿主細胞蛋白(HCP)，而且降低浸出的蛋白A、其它浸出的材料、和/或病毒的量。依照本發(fā)明的某個方面，實施陽離子交換層析步驟以純化抗體。特別參考圖3(其顯示了可以在陽離子交換層析期間使用的例示性緩沖液概況)，相對于先前的緩沖液提高每種緩沖液的PH和/或電導(dǎo)率。使用加載緩沖液將包含感興趣的多肽和污染物的水溶液加載至陽離子交換樹脂上，所述加載緩沖液的PH和/或電導(dǎo)率使得多肽和污染物結(jié)合陽離子交換樹脂。加載緩沖液的例示性電導(dǎo)率可以是較低的，例如約5. 2至約6. 6mS/cm。加載緩沖液的例示性PH可以是5. 7mS/cm。在依照本發(fā)明的梯級或梯度洗脫模式中，可以用遞增的電導(dǎo)率和/或pH的清洗緩沖液清洗陽離子交換樹脂。在梯級洗脫模式中，第一清洗緩沖液可以與加載緩沖液具有相同的電導(dǎo)率和/或PH。在下文的例子中，用清洗緩沖液I (與加載緩沖液相同的電導(dǎo)率和 pH，即pH 5.6, κ =5，7 士 0，5mS/cm)，然后用清洗緩沖液II清洗陽離子交換柱，所述清洗緩沖液II具有第二電導(dǎo)率和/或PH，使得洗脫大部分污染物，但不洗脫感興趣的多肽。這可以通過提高清洗緩沖液的電導(dǎo)率或pH，或這兩者來實現(xiàn)。在本發(fā)明的某些方面，此緩沖液具有7. 0至8. 5mS/cm，優(yōu)選地7. 6+/-0. 5mS/cm的電導(dǎo)率。自清洗緩沖液I至清洗緩沖液II 的變化在梯級洗脫模式中是逐步的。例示性的清洗緩沖液II具有比加載緩沖液和清洗緩沖液I的電導(dǎo)率大的電導(dǎo)率。 或者，清洗緩沖液II的PH可以超過加載緩沖液和清洗緩沖液I的pH。在梯度洗脫模式中，在陽離子交換柱的清洗期間，例如通過用加載緩沖液中的限定百分比的洗脫緩沖液(在下文的實施例中，21%洗脫緩沖液至72%洗脫緩沖液)清洗來連續(xù)地，但不必是線性地提高PH和/或電導(dǎo)率。多斜率梯度在本發(fā)明中是優(yōu)選的。在清洗步驟后，在梯度或梯級洗脫模式中，用洗脫緩沖液實現(xiàn)洗脫，所述洗脫緩沖液具有一定的PH和/或電導(dǎo)率，使得期望的多肽不再結(jié)合陽離子交換樹脂，并且如此可以自柱洗脫。洗脫緩沖液的PH和/或電導(dǎo)率一般超過梯級洗脫模式的先前步驟中使用的加載緩沖液、清洗緩沖液I、和清洗緩沖液II的PH和/或電導(dǎo)率。洗脫緩沖液的例示性電導(dǎo)率范圍為約9. 5至約llmS/cm。抗體洗脫期間的電導(dǎo)率和/或pH變化對于梯級洗脫模式的洗脫是逐步的，而對于梯度洗脫是逐漸的。在本發(fā)明的某些方面，對于自陽離子交換柱梯級或梯度洗脫多肽和污染物兩者， 改變單一參數(shù)，即電導(dǎo)率或PH，而另一項參數(shù)(即分別為pH或電導(dǎo)率)保持大致恒定。在本發(fā)明別的某些方面，在洗脫多肽后用再生緩沖液再生離子交換樹脂，使得可以再使用該柱。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，用于陽離子交換層析步驟的陽離子交換材料是具有磺丙基基團的強陽離子交換體，如快速流動kpharose FF(GEHealthcare, Lifesciences, 德國)。在本發(fā)明的另一個方面，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合適的陽離子交換材料。在本發(fā)明的另一方面，在本發(fā)明方法中的陽離子交換層析步驟之前或之后在采用陰離子交換樹脂的親和層析之后分離蛋白質(zhì)。關(guān)于陽離子交換樹脂，電導(dǎo)率的變化一般如上文所描述的。然而，PH的變化方向?qū)τ陉庪x子交換樹脂是不同的。或者，以流過模式實施陰離子交換層析。若必要的話，可以將離子交換層析步驟后回收的抗體組合物進行進一步純化步驟，如上文所討論的。在本發(fā)明的某個方面，在以任何次序采用別的三種或更多種層析步驟，例如陽離子交換層析、陰離子交換層析和疏水性相互作用層析的親和層析后分離蛋白質(zhì)。本文所公開的層析方法特別可用于分離抗體分子與至少一種污染物，其中污染物和感興趣的抗體分子僅在其等電點方面略有不同，對于顯示例如由于脫酰胺化或異構(gòu)化所致的電荷異質(zhì)性的蛋白質(zhì)正是如此。憑借依照本發(fā)明的方法，若多肽和污染物的Pi僅相差約0. 05至約0. 2個pi單位，則可以將它們解析。在下文的實施例中，可以使用此方法來解析具有Pl 8. 87的her2抗體與具有pi 8. 79的其單一脫酰胺化的變體(參見Harris等 R. J.等 J. Chromatogr. B752 (2001)，233-245)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以使用所述方法來解析抗體分子與其糖變體， 例如以解析與非變體多肽相比具有不同唾液酸分布的多肽變體。
在本發(fā)明的另一方面，要分離的抗體與一種或多種異源分子綴合。此異源分子例如可以提高多肽的血清半衰期(例如PEG)、細胞毒性分子(例如，毒素、化療性藥物、或放射性同位素等)或者它可以是標(biāo)記物(例如，酶、熒光標(biāo)記物和/或放射性核素)。在本發(fā)明的某些方面，要純化的含有抗體的溶液可以是任何含有抗體的材料，其含有污染物和某種水平的活性抗體變體，例如通過過濾或?qū)游龇椒A(yù)先純化的樣品。在本發(fā)明的一個實施方案中，實施陽離子交換層析步驟，其采用單一層析步驟中的梯度洗脫，接著是梯級洗脫進行。在本發(fā)明的某個方面，要純化的抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的別的方面，抗體針對腫瘤抗原(例如生長因子受體和生長因子)，其選自下組EGFR、HER3、HER4、Ep-CAM, CEA、TRAIL、TRAIL 受體 1、TRAIL 受體 2、淋巴毒素-β 受體、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纖維細胞活化蛋白(FAP)、HepSin、黑素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、 VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、IGF1-R、TSLP-R、PDGF-R、TIE-I、TIE-2、TNF- α、TNF 樣凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、IL-1R，優(yōu)選地EGFR、CEA、⑶20、或IGF1-R、和牽涉腫瘤形成的生長因子，如 VEGF, EGF、PDGF, HGF 和血管生成素(angiopoietin)。在另一個實施方案中，單克隆抗體選自下組阿侖單抗(alemtuzumab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、依帕珠單抗(印ratuzumab)、加利昔單抗(galiximab)、吉姆單抗(gemtuzumab)、易普利單抗(ipilimumab)、拉貝珠單抗(Iabetuzumab)、帕尼單抗(panitumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、尼妥珠單抗 (nimotuzumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)禾口帕妥珠單抗 (pertuzumab)、ING-I、正由Xoma開發(fā)的抗Ep-CAM抗體，優(yōu)選地曲妥單抗、西妥昔單抗、和帕妥珠單抗，更優(yōu)選地曲妥單抗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，要純化的抗體是單克隆抗HER2抗體，即her2抗體， 優(yōu)選地曲妥單抗或帕妥珠單抗，更優(yōu)選地曲妥單抗。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，通過依照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的大批藥物her2產(chǎn)品具有大于65%的活性抗體和小于20%的無活性抗體(其分別對應(yīng)于離子交換層析譜中的峰3/3*和峰4 (參見圖幻)的含量。圖3a中顯示了單一層析步驟中的梯度洗脫，接著是梯級洗脫的例子。在梯度洗脫或連續(xù)洗脫中，依照本發(fā)明，電導(dǎo)率和/或PH是連續(xù)升高的，使得可以分離抗體與污染物。 這些變化可以是線性變化，并且可以通過固定期(stationary phase)來分離。此外，線性變化的斜度在洗脫期間可以變化，參見例如圖3a?；蛘?，變化也可以是非線性的，例如指數(shù)的。原則上，以梯級洗脫或梯度洗脫模式實施的陽離子交換層析采用相似的緩沖液(關(guān)于各個實施方案，參見上文)。在本發(fā)明的某些方面，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率范圍為約9. 5至約 llmS/cm。在本發(fā)明的某個方面，在單一層析步驟中，梯度洗脫步驟繼之以清洗步驟(例如， 與加載緩沖液相同的電導(dǎo)率和/或PH)，然后接著是梯級洗脫。在別的方面，用電導(dǎo)率范圍為9. 5至約llmS/cm的100%洗脫緩沖液實施梯度洗脫后的梯級洗脫。在本發(fā)明的又一些方面，通過在梯度洗脫后逐步提高電導(dǎo)率和/或PH自陽離子交換柱洗脫活性變體。
在本發(fā)明的某個方面，用于在陽離子交換層析步驟中洗脫抗體的梯度序貫牽涉以下緩沖液3. 9個柱體積21%至49. 4%洗脫緩沖液，3. 6個柱體積49. 4%至58. 8%洗脫緩沖液，7. 8個柱體積58. 8%至72%洗脫緩沖液，1個柱體積0%緩沖液B，6. 5個柱體積 100% B。在下文的實施例中，使用圖北中所顯示的緩沖液概況通過逐步提高電導(dǎo)率來洗脫活性her2變體。通過針對來源材料的純度，即活性變體的百分比改編陽離子交換層析步驟中的洗脫模式(梯度或梯級)，可以獲得足夠高質(zhì)量的高收率。在本發(fā)明的某些方面，針對關(guān)于活性her2變體百分比的純度改編洗脫模式。在本發(fā)明的又一些方面，針對要純化的溶液中的脫酰胺化、酸性或堿性變體的百分比，并且在本發(fā)明的某些方面，針對脫酰胺化的和酸性的her2變體的百分比改編洗脫模式。在本發(fā)明別的某些方面，針對關(guān)于測定的某些糖變體的百分比的純度改編洗脫模式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了憑借陽離子交換層析中的梯級洗脫，可以獲得與梯度洗脫，接著進行梯級洗脫相比更高的收率，但是與污染性變體的分離沒有在梯度洗脫模式，接著進行梯級洗脫的情況中那樣好。如此，前一種洗脫類型在要進一步純化的蛋白質(zhì)的純度已經(jīng)超過某個閾值的情況中是優(yōu)選的，由此利用與梯級洗脫相關(guān)的高收率。反之亦然，在要進一步純化的抗體的純度小于某個閾值的情況中，不采用梯級洗脫，這是由于與梯度洗脫，接著進行梯級洗脫相比解析較差，由此接受較低的收率。換言之，在要純化的樣品中最想要的抗體變體，即抗體分子的百分比高于某個百分比(或者不想要的抗體變體的相對量小于某個百分比)的情況中，只能通過梯度洗脫獲得治療功效和安全性需要的純度。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，收率(即在沒有逐漸提高應(yīng)用于柱的緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中通過逐步提高電導(dǎo)率和/或pH實施的陽離子交換層析生產(chǎn)的抗體組合物中的抗體分子及其變體的量與加載至陽離子交換層析上的含有抗體分子及其變體的步驟a2)的洗脫物中的抗體分子及其變體的量的比率)大于65%，優(yōu)選地大于70%，且最優(yōu)選地大于75%。在本發(fā)明的別的方面，在測定抗體分子的量與抗體分子和抗體變體的量的比率的步驟與陽離子交換層析步驟間實施蛋白A親和層析步驟?？梢詫游霾襟E后回收的蛋白質(zhì)在藥學(xué)可接受載體中配制，并且用于各種診斷、 治療或此類分子已知的其它用途。本發(fā)明的某個方面針對通過依照本發(fā)明的方法生產(chǎn)的包含her2抗體的組合物。提供以下例子、參考文獻、和圖以幫助理解本發(fā)明，其真實的范圍在所附權(quán)利要求書中列出。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明精神的前提下對列出的規(guī)程做出修飾。赫賽汀即一種her2抗體(W0 99/57134)在本發(fā)明時在我們的實驗室中以足夠的量可獲得，并且因此本發(fā)明以此免疫球蛋白例示。同樣地，本發(fā)明一般以免疫球蛋白可實施。此例示性的描述僅作為例子，而不作為本發(fā)明的限制完成。提供這些例子以幫助理解本發(fā)明，其真實的范圍在所附權(quán)利要求書中列出。附圖描述圖1 發(fā)酵期間的赫賽汀變體分布。顯示了分別歸于發(fā)酵第10天、第11天和第12 天(F10、F11和F12)的離子交換層析譜(參見圖3)中的峰1、3/3*和4的特定變體的百分比。顯示了來自15個發(fā)酵運行的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2 分析用離子交換層析譜。陽離子交換柱上的曲妥單抗分離。表1中給出了峰指派。圖3 用于陽離子交換層析步驟中的洗脫a)梯度洗脫，b)梯級洗脫的緩沖液概況。實施例1發(fā)酵期間的抗體變體樣式的變化在培養(yǎng)開始后第10天、第11天和第12天，對發(fā)酵期間的赫賽汀抗體的變體分布分析產(chǎn)生大批藥物產(chǎn)品的此抗體的大規(guī)模發(fā)酵。將樣品在第10天、第11天和第12天收集， 并通過分析用離子交換層析分析變體樣式和變體百分比。自獲得的相應(yīng)層析譜中的峰面積計算變體的百分比。如可以自圖1(其匯總了自15個大規(guī)模發(fā)酵運行獲得的數(shù)據(jù))看出的，自發(fā)酵的第10天至第12天，歸于離子交換層析譜(比較圖2和表1)中的峰1和4的變體存在著清楚的增加。峰1對應(yīng)于酸性、脫酰胺化的且活性較小的赫賽汀變體。峰4由具有天冬酰胺的異構(gòu)化和/或Lys450殘基的變體構(gòu)成。此外，同時，第10天至第12天收集的樣品中觀察到的主峰3/3*(其對應(yīng)于未修飾的、最具活性形式的赫賽汀)也存在著降低。如此，在發(fā)酵第10天至第11天間，存在著變體樣式的清楚變換，即變體的相對量增加， 而感興趣的抗體分子的相對量同時降低。表1 曲妥單抗陽離子交換層析峰級分的指派
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物的方法，包括下列步驟a)提供包含所述抗體分子及其變體的樣品，b)通過對所述樣品的等分試樣實施的分析方法來測定所述樣品中的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率，且步驟c)包括al)任選地，過濾和/或離心步驟a)的樣品，a2)任選地，實施親和層析，其通過在親和層析柱上應(yīng)用步驟al)的進一步過濾和/或離心的樣品或步驟a)的樣品，任選地清洗該柱，并自該柱洗脫所述抗體來進行，a3)實施陽離子交換層析，其通過任選地在調(diào)節(jié)PH和/或電導(dǎo)率后將含有所述抗體的步驟a)，al)的樣品或步驟U)的洗脫物加載至陽離子交換層析柱上，并且任選地清洗該柱來進行，a4)自所述陽離子交換層析柱洗脫所述抗體，其如下進行 i)逐漸提高應(yīng)用于所述陽離子交換柱的緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH，并 )然后，若步驟b)中測定得到的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率低于選自65至75%范圍的閾值比率，則逐步提高應(yīng)用于所述陽離子交換柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH， 或者若步驟al)中測定得到的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率高于選自65至75%范圍的閾值比率，則在沒有逐漸提高應(yīng)用于該柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中逐步提高電導(dǎo)率和/或pH，由此生產(chǎn)包含所述抗體及其變體的抗體組合物。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體分子的變體是酸性或堿性變體。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體分子的pi與所述變體的pi相差0.1至0. 5 個Pl單位。
4.依照權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中在步驟b)中，所述分析方法是離子交換層析、ELISA、或 MALDI-T0F 分析。
5.依照權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中步驟a)中的樣品是親和層析步驟的洗脫物或者是沒有細胞和細胞碎片的包含抗體及其變體的細胞培養(yǎng)液。
6.依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中提供樣品的步驟a)包括i)提供含有核酸分子的細胞，所述核酸分子包含編碼所述抗體分子的核酸序列， )將所述細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4- 天，iii)自所述培養(yǎng)基獲得樣品，由此提供包含所述培養(yǎng)基、所述細胞、所述抗體分子及其變體的樣品。
7.依照權(quán)利要求6的方法，其中權(quán)利要求1的步驟b)組成為iv)通過分析用離子交換層析在自權(quán)利要求6中的步驟ii)中的培養(yǎng)基獲得的樣品的等分試樣中測定所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率，ν)任選地重復(fù)步驟iii)和iv)，直至步驟iv)中測定得到的比率比選自65%至75% 范圍的閾值比率高0-2%，和/或外推特定培養(yǎng)日Dx的培養(yǎng)基中的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率，其通過依照下式計算所述比率來進行 Rx = R0-CX (Dx-D。)，其中 D。是獲得步驟c)中的樣品的培養(yǎng)日， Dx是隊后的培養(yǎng)日，Rx是Dx時所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率， R0是步驟iv)中測定得到的在D。時的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率，且C是范圍為/天和5% /天的數(shù)值，并且對應(yīng)于所述抗體分子量與所述抗體及變體量之和的比率的每日百分比變化，vi)在所述培養(yǎng)基中的Rx比選自65至75%范圍的閾值比率高0-2%時自所述培養(yǎng)基回收所述抗體分子，且權(quán)利要求1中的步驟a3)包括vii)實施陽離子交換層析，其通過任選地在調(diào)節(jié)PH和/或電導(dǎo)率后將含有所述抗體的步驟vi)的樣品加載至陽離子交換層析柱上，并且任選地清洗該柱來進行，viii)在沒有逐漸提高應(yīng)用于該柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中通過逐步提高電導(dǎo)率和/或PH自所述陽離子交換層析柱洗脫所述抗體，由此生產(chǎn)包含所述抗體分子及其變體的抗體組合物。
8.依照前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述閾值比率是67.5%。
9.依照權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所生產(chǎn)的抗體組合物中的所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率是50至100%，優(yōu)選地范圍為60至100%，且最優(yōu)選地范圍為65至100%。
10.依照權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中收率，即通過在沒有逐漸提高應(yīng)用于所述柱的緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中逐步提高電導(dǎo)率和/或pH實施的陽離子交換層析生產(chǎn)的抗體組合物中的所述抗體分子及其變體量與加載至所述陽離子交換層析上的含有所述抗體分子及其變體的步驟a4)的洗脫物中的所述抗體分子及其變體量的比率大于 65 %，優(yōu)選地大于70 %，且最優(yōu)選地大于75 %。
11.依照權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其特征在于若包括親和層析步驟，則親和層析是蛋白A、或蛋白G、或金屬親和層析。
12.依照權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
13.依照權(quán)利要求12的方法，其中所述單克隆抗體是her2抗體。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體是曲妥單抗。
15.分析用離子交換層析用于分析包含抗體分子及其變體的樣品以確定隨后的所述樣品的多肽純化方案的用途。
16.依照權(quán)利要求15的用途，其中在所述隨后的純化方案中，自陽離子交換柱洗脫抗體，其如下進行i)逐漸提高應(yīng)用于所述陽離子交換柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH，并 )然后，若所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率低于閾值比率，則逐步提高應(yīng)用于所述陽離子交換柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或pH，或者若所述抗體分子量與所述抗體分子及其變體量之和的比率高于閾值比率，則在沒有逐漸提高應(yīng)用于所述陽離子交換柱的洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH的情況中逐步提高電導(dǎo)率和/或pH。
17.依照權(quán)利要求16和17中任一項的用途，其中所述抗體是her2抗體。
全文摘要
提供了一種用于通過層析方法分離抗體分子與抗體變體(例如為了增強治療功效)來生產(chǎn)純化的抗體的通用方法，其通過例如選擇特定的收獲時間點和/或特定的純化方案來進行。如此，本發(fā)明報告了一種用于生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物的方法，包括下列步驟提供包含抗體分子及其變體的樣品，在所述樣品的等分試樣中測定抗體分子和/或其變體的存在和/或抗體分子或其變體量與抗體分子及其變體量之和的比率，基于之前獲得的數(shù)據(jù)確定隨后的收獲時間點和/或抗體純化方案，由此生產(chǎn)包含抗體分子及其變體的抗體組合物。
文檔編號C07K16/00GK102471377SQ201080032734
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者B.希爾格, C.沃勒里厄斯, F.澤特爾, J.伯格, L.斯蒂恩斯, T.凱澤, W.庫尼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司