專利名稱：用于miRNA抑制劑和模擬物的化學(xué)修飾基序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微小RNA (miRNA或miR)抑制劑及模擬物的化學(xué)基序，且尤其是涉及化學(xué)修飾的miRNA有義和反義多核苷酸，當(dāng)施用于患者時(shí)，所述多核苷酸在效力、穩(wěn)定性和/或毒性方面具有優(yōu)勢(shì)。
背景技術(shù)：
微小RNA(miR)涉及多種生物過(guò)程，包括心臟功能的調(diào)節(jié)和維持(參見 Chien KR， Molecular Medicine MicroRNAs and the tell-tale heart, Nature 447，389-390 (2007) ) 因此，miR代表了一類相對(duì)新的用于諸如心臟肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管損傷以及病理性心臟纖維化等病癥的治療靶標(biāo)。miRNA是長(zhǎng)度為約18至約25個(gè)核苷酸的小的、非蛋白編碼RNA，其通過(guò)以下方式作為靶mRNA的阻遏劑發(fā)揮作用當(dāng)它們的序列精確互補(bǔ)時(shí)促進(jìn)靶mRNA的降解，或當(dāng)它們的序列含有錯(cuò)配時(shí)則抑制翻譯。成熟的miRNA鏈摻入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)中，在這里其通過(guò)堿基對(duì)互補(bǔ)性而與其靶RNA關(guān)聯(lián)?？赏ㄟ^(guò)反義多核苷酸或通過(guò)模擬miRNA功能的多核苷酸(“miRNA模擬物”)治療性地靶向miRNA功能。然而，當(dāng)將多核苷酸引入完整細(xì)胞時(shí)，它們受到核酸酶的攻擊并降解，從而導(dǎo)致活性的損失。盡管已制備了多核苷酸類似物試圖避免它們的降解，例如通過(guò)2’取代的方式(B. Sproat 等，Nucleic AcidsResearch 17 (1989), 3373-3386),但修飾通常影響多核苷酸預(yù)期生物作用的效力。在每種情況下，此類降低的效力可能是由于該修飾的多核苷酸不能與靶RNA形成穩(wěn)定的二聚體，和/或喪失了與細(xì)胞機(jī)制的相互作用。需要用于改進(jìn)miRNA抑制劑和miRNA模擬物的穩(wěn)定性、效力和/或毒性概況的化學(xué)模式或基序，用于有效地靶向治療背景中的miRNA功能。發(fā)明概述本發(fā)明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相對(duì)于它們作為miRNA抑制劑或miRNA模擬物的用途而言提供改進(jìn)的穩(wěn)定性、效力和/或毒性的化學(xué)模式。本發(fā)明還提供了包含該多核苷酸的藥物組合物或制劑，以及治療患有miRNA相關(guān)或mRNA表達(dá)相關(guān)病癥的患者的方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有一個(gè)或多個(gè)在2’位置的核苷酸修飾，和至少一個(gè)末端或“帽”修飾的多核苷酸。該化學(xué)修飾基序可消除對(duì)完全硫代磷酸酯連接的多核苷酸和/或全長(zhǎng)反義或有義miRNA序列的需求。該多核苷酸是miRNA抑制劑或miRNA模擬物，并且如本文所顯示的那樣，其提供了與未修飾的多聚核糖核苷酸相比和/或與其他可能的多核苷酸修飾相比經(jīng)改進(jìn)的效力。例如，該多核苷酸可以是具有如本文所述2’修飾之一或組合的miRNA抑制劑或miRNA模擬物，諸如選自O(shè)-烷基(0-alkyl)(例如，0-甲基或“OMe”)、鹵素(例如，氟)、脫氧(H)和鎖核酸(locked nucleic acid)的那些，以及在一些實(shí)施方案中,基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均被修飾。在一些實(shí)施方案中，末端或帽修飾可以是5’和/或3’硫代磷酸酯單磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)和/或無(wú)堿基部分,或本文描述的其他帽結(jié)構(gòu)。該多核苷酸不需要完全是硫代磷酸酯連接的，但是在此類連接存在時(shí)，此連接可例如置于5’末端的兩個(gè)末端核苷酸和3’末端的兩個(gè)末端核苷酸之間。該核苷酸序列相對(duì)于成熟miRNA而言可以是全長(zhǎng)的，或全長(zhǎng)反義miRNA (成熟形式)，但在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸包含截短的miRNA序列或截短的miRNA反義序列。此類修飾的截短序列可顯示出高水平的效力，甚至當(dāng)與更長(zhǎng)的(未修飾或常規(guī)修飾的)對(duì)應(yīng)物相比也如此。該多核苷酸可以是具有與miR-15b、miR-21、miR-208a或本文描述的其它(的全部或部分)互補(bǔ)的反義序列的antagomir。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸和可藥用載劑的藥物組合物或制劑。可將該藥物組合物配制為各種可藥用形式，包括膠體分散體系、大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠子、水包油乳劑、膠束、混合膠束或脂質(zhì)體。該組合物可包括與膽固醇和其他 分子(諸如靶向配體)的綴合物，用于將該多核苷酸遞送至靶標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在第二方面，本發(fā)明提供了用于治療具有miRNA相關(guān)或mRNA表達(dá)相關(guān)病癥的患者的方法。例如，該病癥可以是心臟肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管損傷以及病理性心臟纖維化的一種或多種。此類病癥通過(guò)施用本發(fā)明的多核苷酸或組合物而得以治療、預(yù)防或改善。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸和組合物用于治療miRNA相關(guān)或mRNA表達(dá)相關(guān)病癥的用途。


圖I是示出了示范性miRNA修飾模式的表格。所示序列是成熟miR15b的反義序列(全長(zhǎng)或截短的)。簡(jiǎn)寫的描述提供于表3中。每一示例性RNA的“別名”包括:miRNA靶標(biāo)(例如，15b) ;2’結(jié)構(gòu)(0-甲基、“OMe”;或0-甲基和氟、“Me/F”;或0-甲基和脫氧、“Me/!1”;或鎖核酸“11^”)；多核苷酸的大小(代表全長(zhǎng)的FL或16-聚體)；以及在末端或內(nèi)部的連接的結(jié)構(gòu)，包括P0為磷酸二酯連接的，PS為硫代磷酸酯連接的，PS EO為每隔一個(gè)為硫代磷酸酯連接的，PS EC為硫代磷酸酯末端-帽，無(wú)堿基，以及POS為5’和3’硫代磷酸酯單磷酸酯。圖2顯示了應(yīng)用雙-螢光素酶測(cè)試法在Hela細(xì)胞中兩個(gè)濃度即10nM(每一組中的左柱)和0. InM(每一組中的右柱)的圖I中修飾的多核苷酸的體外測(cè)試結(jié)果。螢光素酶比率越大，抑制劑的效力越好。通過(guò)長(zhǎng)度即16-聚體和全長(zhǎng)對(duì)結(jié)果分組。高性能的化學(xué)物顯不于表4中。圖3顯示了在雙螢光素酶測(cè)試法中，IOnM(每組的左柱)和0. InM(每組的右柱)的硫代磷酸酯單磷酸酯修飾的多核苷酸與磷酸二酯或硫代磷酸酯骨架直接相比較的結(jié)果。PO是磷酸二酯連接的，PS是硫代磷酸酯連接的，以及PO POS是在3’和5’末端均有末端硫代磷酸酯單磷酸酯的磷酸二酯連接。圖4顯不了在小鼠中用來(lái)自表5的多核苷酸5-14敲低miR_15b。測(cè)定了肝臟(每組的左柱)和心臟(每組的右柱)中的miR-15b豐度，并與用鹽水注射的小鼠相比較。
圖5顯示了在新生大鼠心肌細(xì)胞中用修飾的反義多核苷酸抑制miR_208a。圖5中的結(jié)果是PMHC表達(dá)的定量PCR。左柱顯示了 IOOnM抑制劑的結(jié)果，以及右柱顯示了 InM抑制劑的結(jié)果。圖6顯示了在雙螢光素酶測(cè)試法中通過(guò)具有各種修飾的反義多核苷酸抑制miR-21。圖7顯示了以所示劑量注射大鼠后4種不同的修飾的miR_15b反義多核苷酸的體內(nèi)組織分布。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了多核苷酸，所述多核苷酸具有相對(duì)于它們作為miRNA抑制劑或miRNA模擬物的用途而言提供改進(jìn)的穩(wěn)定性、效力和/或毒性的化學(xué)模式。本發(fā)明還提供了包含該多核苷酸的藥物組合物或制劑，以及治療患有miRNA相關(guān)或mRNA表達(dá)相關(guān)病癥的患者的方法。 修飾的多核苷酸該多核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)在2’位置的核苷酸修飾，以及至少一個(gè)末端修飾或“帽”，如下文所示。該多核苷酸是miRNA抑制劑或miRNA模擬物，并且展示出與未修飾的多聚核糖核苷酸相比、和/或與其他可能的多核苷酸修飾相比的經(jīng)改進(jìn)的效力。如本文所述,“miRNA抑制劑”是具有與成熟單鏈miRNA或其部分反義(互補(bǔ)或如本文所述部分互補(bǔ))的序列的多核苷酸?！癿iRNA模擬物”是具有相應(yīng)于(相同或如本文所述基本相同)成熟單鏈miRNA或其部分的序列的多核苷酸。該多核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)在2’位置的核苷酸修飾(就2’羥基而言)。摻入2’修飾的核苷酸(例如在反義寡核苷酸中)可增加寡核苷酸對(duì)核酸酶的抗性以及它們與互補(bǔ)RNA的熱穩(wěn)定性二者。在2’位置處的各種修飾可獨(dú)立地選自提供了升高的核酸酶敏感性、而不影響與RNA靶標(biāo)或細(xì)胞機(jī)制的分子相互作用的那些。此類修飾可基于它們?cè)隗w外或體內(nèi)升高的效力而進(jìn)行選擇。本文描述了用于確定miRNA抑制的升高效力的示例性方法(例如，IC50)。在一些實(shí)施方案中，2’修飾可獨(dú)立地選自0-烷基(其可以是被取代的)、鹵素、脫氧(H)和鎖核酸。在某些實(shí)施方案中，基本上所有、或所有的核苷酸2’位置均是被修飾的，例如，獨(dú)立地選自0-烷基(例如，0-甲基)、鹵素(例如，氟)、脫氧(H)和鎖核酸。例如，2’修飾可每一個(gè)獨(dú)立地選自0-甲基和氟。在示例性實(shí)施方案中，每一個(gè)嘌呤核苷酸具有2’OMe，并且每一個(gè)嘧啶核苷酸具有2’-F。在某些實(shí)施方案中，剩下I至約5個(gè)2’位置、或約I至約3個(gè)2’位置未修飾(例如，2’羥基)。根據(jù)本發(fā)明的2’修飾可包括小烴取代基。該烴取代基包括烷基、烯基、炔基和烷氧燒基，其中燒基(包括燒氧基的燒基部分)、稀基和塊基可以是被取代的或未被取代的。該烷基、烯基和炔基可以是Cl至ClO烷基、烯基或炔基，諸如C2或C3。該烴取代基可包括一個(gè)或兩個(gè)或三個(gè)非碳原子，其可獨(dú)立地選自N、0和/或S。該2’修飾可進(jìn)一步包括烷基、烯基和炔基，如0-烷基、0-烯基和0-炔基。根據(jù)本發(fā)明的示例性2’修飾包括2’ -0-烷基(C1-3烷基，諸如2’ OMe或2’ OEt) >2 1 _0_ 甲氧乙基(2' _0_M0E) >2 1 _0_ 氣丙基(2' _0_AP) >2 1 _0_ _■甲基氣乙基C -0-DMA0E),2/ -0-二甲基氨丙基C -0-DMAP)、2' -0-二甲基氨乙基氧乙基(2' -0-DMAE0E)或 2' -O-N-甲基乙酰氨基(2' -0-NMA)。2’修飾可以是在所有核苷酸殘基上、或在所有嘌呤核苷酸上的OMe。在某些實(shí)施方案中，該多核苷酸含有至少一個(gè)2’ -鹵素修飾(例如，替代2’羥基)，諸如2’-氟、2’-氯、2’-溴和2’ -碘。在一些實(shí)施方案中，2’鹵素修飾是氟。該多核苷酸可含有I至約20個(gè)2’ -鹵素修飾(例如，氟)、或I至約10、或I至約5個(gè)2’ -鹵素修飾(例如，氟)。在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸全部含有2’ -氟核苷酸、或在所有嘧啶核苷酸上含有2’-氟。在某些實(shí)施方案中，2’-氟基團(tuán)獨(dú)立地是二甲基化、三甲基化或未甲基化的。多核苷酸可具有一個(gè)或多個(gè)2’ -脫氧修飾(例如，2’羥基的H)，但可含有I至約20個(gè)2’ -脫氧修飾，或I至約10、或I至約5個(gè)2’ -脫氧修飾。在一些實(shí)施方案中，該多核苷酸全部含有2’ -脫氧核苷酸。 在某些實(shí)施方案中，多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)“構(gòu)象上被約束的”或二環(huán)糖核苷修飾(BSN)，其賦予含有BSN的多核苷酸與他們的互補(bǔ)微小RNA靶標(biāo)鏈之間形成的復(fù)合物以增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)鎖核酸(LNA)殘基。LNA例如描述于美國(guó)專利6，268，490、美國(guó)專利6，316，198、美國(guó)專利6，403，566、美國(guó)專利6，770，748、美國(guó)專利6，998，484、美國(guó)專利6，670，461以及美國(guó)專利7，034，133中，所有這些專利均通過(guò)引用全文并入本文?！版i核酸”(LNA)是經(jīng)修飾的核苷酸或核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之間含有額外的橋聯(lián)，從而導(dǎo)致“鎖住的”構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)具有如結(jié)構(gòu)A所示結(jié)構(gòu)的LNA。在另一實(shí)施方案中，該多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)具有如結(jié)構(gòu)B所示結(jié)構(gòu)的LNA。在再另一實(shí)施方案中，該多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)具有如結(jié)構(gòu)C所示結(jié)構(gòu)的LNA。
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-I .f f = 、 d'x6 c其他可用于本發(fā)明的多核苷酸中的合適BSN修飾包括在美國(guó)專利6，403, 566和美國(guó)專利6，833，361中描述的那些，這兩個(gè)專利均通過(guò)引用全文并入本文。在某些實(shí)施方案中，該多核苷酸包括約I至約10個(gè)鎖核酸，或約2至約5個(gè)鎖核酸。在示例性實(shí)施方案中，該多核苷酸含有如2’ OMe那樣修飾的2’位置。備選地，嘌呤核苷酸在2’位置如2’ OMe那樣修飾，而嘧啶核苷酸在2’位置如2’ -氟那樣修飾。
該多核苷酸進(jìn)一步包含至少一個(gè)末端修飾或“帽”。該帽可以是5’和/或3’帽結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“帽”或“末端帽”包括在多核苷酸任一端(就末端核糖核苷酸而言)的化學(xué)修飾，并且包括在5’末端最后兩個(gè)核苷酸以及3’末端最后兩個(gè)核苷酸之間連接處的修飾。本文描述的帽結(jié)構(gòu)增加了寡核苷酸對(duì)核酸外切酶的抗性，而不影響與RNA靶或細(xì)胞機(jī)制的分子相互作用。此類修飾可基于它們?cè)隗w外或體內(nèi)升高的效力而進(jìn)行選擇。本文描述了用于確定miRNA抑制的升高效力的示例性方法(例如，IC50)。帽可存在于5 ’ -端(5 ’ -帽)或3 ’ -端(3 ’ -帽)，或可存在于兩端。在某些實(shí)施方案中，5’ -和/或3’帽獨(dú)立地選自硫代磷酸酯單磷酸酯、無(wú)堿基殘基(部分)、硫代磷酸酯連接、4’ -硫核苷酸、碳環(huán)核苷酸、二硫代磷酸酯連接、翻轉(zhuǎn)核苷酸(inverted)或翻轉(zhuǎn)無(wú)堿基部分(2’ -3’或3’ -3’ )、二硫代磷酸酯單磷酸酯以及甲基膦酸酯部分。當(dāng)作為帽結(jié)構(gòu)的一部分時(shí)，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接通常位于5’末端兩個(gè)末端核苷酸以及3’末端兩個(gè)末端核苷酸之間。在某些實(shí)施方案中，除了一個(gè)或多個(gè)上述2’修飾之外，多核苷酸還具有至少一個(gè)末端硫代磷酸酯單磷酸酯。該硫代磷酸酯單磷酸酯可通過(guò)抑制外切核酸酶的作用從而支持 miRNA抑制劑和miRNA模擬物的更高的效力，并且在一些實(shí)施方案中，消除對(duì)完全硫代磷酸酯(phosphorotioate)連接的多核苷酸和/或全長(zhǎng)抑制劑的需求。硫代磷酸酯單磷酸酯可位于寡核苷酸的5’和/或3’末端。硫代磷酸酯單磷酸酯由以下結(jié)構(gòu)定義，其中B是堿基，以及R是如本文所述2’修飾
權(quán)利要求
1.具有一個(gè)或多個(gè)在2’位置的核苷酸修飾，以及至少一個(gè)末端帽結(jié)構(gòu)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含miRNA或miRNA反義核苷酸序列。
2.權(quán)利要求I的多核苷酸，其中所述末端帽結(jié)構(gòu)包含硫代磷酸酯單磷酸酯(phosphorothioate monophosphate)或末端無(wú)喊基殘基。
3.權(quán)利要求I或2的多核苷酸，其中所述一種或多種在2’位置的核苷酸修飾獨(dú)立地選自0-甲基、氟、脫氧和鎖核酸。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中基本上所有核苷酸2’位置均經(jīng)修飾。
5.權(quán)利要求4的多核苷酸，其中每個(gè)核苷酸2’修飾獨(dú)立地選自0-甲基和氟。
6.權(quán)利要求4的多核苷酸,其中每個(gè)核苷酸2’修飾是0-甲基。
7.權(quán)利要求4的多核苷酸，其中每個(gè)嘌呤核苷酸具有2’0_甲基，并且每個(gè)嘧啶核苷酸具有2’ -F。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有至少一個(gè)末端硫代磷酸酯單磷酸酯。
9.權(quán)利要求8的多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’末端和5’末端二者均具有末端硫代磷酸酯單磷酸酯。
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多核苷酸,其中所述多核苷酸具有至少一個(gè)末端無(wú)堿基核苷酸。
11.權(quán)利要求10的多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’末端和5’末端二者均具有末端無(wú)堿基核苷酸。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸不含內(nèi)部硫代磷酸酯連 接。
13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部硫代磷酸酯連接。
14.權(quán)利要求13的多核苷酸,其中所述多核苷酸僅在5’末端的兩個(gè)末端核苷酸和3’末端的兩個(gè)末端核苷酸之間含有內(nèi)部硫代磷酸酯連接。
15.權(quán)利要求13的多核苷酸，其中所述硫代磷酸酯連接與磷酸二酯連接交替。
16.權(quán)利要求1-15的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含截短的成熟miRNA序列或截短的成熟miRNA反義序列。
17.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含全長(zhǎng)成熟miRNA序列或全長(zhǎng)成熟miRNA反義序列。
18.權(quán)利要求16或17的多核苷酸，其中所述多核苷酸為5至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
19.權(quán)利要求18的多核苷酸，其中所述多核苷酸為12至18個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
20.權(quán)利要求18的多核苷酸,其中所述多核苷酸為約16個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
21.權(quán)利要求16或17任一項(xiàng)的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含miRNA反義序列,其中所述反義序列與選自以下miR的成熟miRNA序列至少約75%互補(bǔ)l、133a、133b、143、.145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424 和 486。
22.權(quán)利要求21的多核苷酸，其中所述miRNA反義序列與選自以下miR的成熟miRNA序列 100% 互補(bǔ)l、133a、133b、143、145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、.424 和 486。
23.權(quán)利要求16或17的多核苷酸，其中所述反義序列與成熟miR-15b、miR-21或miR-208a 互補(bǔ)。
24.權(quán)利要求23的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有圖I或表6所示的序列和/或結(jié)構(gòu)。
25.權(quán)利要求16或17任一項(xiàng)的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含miRNA序列,其中所述miRNA序列與選自以下miR的成熟miRNA序列至少約75%相同1、133a、133b、143、145、.15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424 和 486。
26.權(quán)利要求25的多核苷酸，其中所述miRNA序列與選自以下miR的成熟miRNA序列.100%相同:l、133a、133b、143、145、15a、15b、16、195、206、208a、208b、21、29a、29b、29c、424和 486。
27.包含權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的多核苷酸和可藥用載劑的藥物組合物。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，其中所述組合物配制為膠體分散體系、大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠子、水包油乳劑、膠束、混合膠束或脂質(zhì)體。
29.權(quán)利要求27或28的藥物組合物，其中所述組合物配制用于皮內(nèi)遞送、皮下遞送、肌內(nèi)遞送、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)遞送。
30.權(quán)利要求27或28的藥物組合物，其中所述組合物配制為通過(guò)心臟導(dǎo)管系統(tǒng)施用。
31.用于治療具有miRNA表達(dá)相關(guān)病癥的患者的方法，包括向所述患者施用權(quán)利要求.27-30中任一項(xiàng)的藥物組合物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述病癥是心臟肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管損傷和病理性心臟纖維化中的一種或多種。
33.權(quán)利要求31或32的方法，其中所述組合物通過(guò)心臟導(dǎo)管施用。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有化學(xué)模式的多核苷酸，其提供了相對(duì)于它們作為miRNA抑制劑或miRNA模擬物的用途而言的改進(jìn)的穩(wěn)定性、效力和/或毒性。本發(fā)明還提供了包含該多核苷酸的藥物組合物和制劑，以及治療患有miRNA或mRNA表達(dá)相關(guān)病癥的患者的方法。
文檔編號(hào)C07H21/04GK102803284SQ201080035109
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者C.亞馬達(dá), W.S.馬沙爾 申請(qǐng)人:米拉根醫(yī)療公司