專利名稱：抗-EpCAM抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與上皮細胞粘附分子(EpCAM)結(jié)合的結(jié)合蛋白以及它的所有用途。特別的，本發(fā)明涉及與EpCAM結(jié)合的抗體或抗體片段及其用途方法，包括癌癥治療。
背景技術(shù)：
在2000年，全世界約2200萬人患有癌癥，620萬人死于該類疾病。每年會多出 1000萬新患者，并且這一數(shù)值在未來15年內(nèi)會增長50% (WHO, World Cancer Report. Bernard W. Stewart 和 Paul Kleihues，編輯 IARC Press, Lyon, 2003) 由癌癥導(dǎo)致的死亡占全部人類死亡的13%。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的數(shù)據(jù)，在2007年，全世界有760萬人死于癌癥。目前最常見的癌癥治療措施一般限于創(chuàng)傷手術(shù)，放射療法和化學(xué)療法，這些治療措施會導(dǎo)致潛在的嚴重副作用，非特異性毒性和/或?qū)颊呱眢w形象和/或生命質(zhì)量帶來損傷性變化。癌癥可對化學(xué)療法產(chǎn)生耐受，從而降低了進一步治療的可能以及成功的概率。 某些癌癥具有相對較高的治療成功率，如乳腺癌，但也具有非常高的發(fā)病率，因此，仍是主要的殺手。還有很多種癌癥的實例，現(xiàn)在的治療措施由于缺乏療效和/或因為較高的發(fā)病率和嚴重的副作用而無法達到患者的需求。因此，對于具有較高安全性和療效的癌癥治療措施，仍然存在明確的需求。多種現(xiàn)行癌癥治療措施存在不足，其中一個原因在于，對于受影響的組織和細胞， 這些治療措施缺乏選擇性。外科切除術(shù)總會涉及切除明顯正常的組織作為“安全界限”，因為該處能夠增加發(fā)病率和并發(fā)癥的風(fēng)險。手術(shù)中也總會切除一些可能散布有腫瘤細胞的健康組織，這有可能維持或者重建受影響的器官或組織的功能。放射療法和化學(xué)療法由于它們非特異性的作用方式會殺死或損壞很多正常細胞。這會帶來嚴重的副作用，如嚴重的惡心，體重下降，精力減少，脫發(fā)等等，也會增加在以后的生命中獲得繼發(fā)性癌癥的風(fēng)險。對于癌細胞具有更高選擇性的治療方法可使正常細胞不受損害，如此便可改善結(jié)果，副作用范圍和生命質(zhì)量。采用對只在或大部分在癌細胞上出現(xiàn)，或在癌細胞上表達水平更高，或在癌細胞上過表達的分子特異的抗體，可提高癌癥治療的選擇性。因此，免疫治療方法，如對多種疾病，包括癌癥采用抗體療法，是目前研究和發(fā)展非?；钴S的領(lǐng)域，并且在取得成功治療效果方面顯示了良好的前景。這種抗體可用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并通過患者自身的免疫系統(tǒng)而提高對癌的識別和殺傷。到目前為止，大多數(shù)試驗的抗體，以鼠源單克隆抗體，有時是通過分子工程學(xué)的 “人源”的形式而針對已知的癌癥標記物。不幸的是，這些抗體為鼠源蛋白，會被患者的免疫系統(tǒng)識別為外源蛋白。繼而發(fā)生的免疫反應(yīng)和抗體反應(yīng)會導(dǎo)致效力損失或副作用。EpCAM (CD326)也可稱之為 EGP_2、17_1A、HEA125、MK-U GA733-2、EGP34、KSA、 TROP-1、ESA、TACSTD1和KS1/4，屬于最先被鑒定的腫瘤相關(guān)抗原之一。EpCAM抗原的特殊之處在于，它并不屬于任何主要的粘附分子家族，如鈣粘蛋白，選擇蛋白或整合蛋白的一員。 它屬于I型膜蛋白，314個氨基酸(aa)中只有沈個氨基酸在細胞質(zhì)側(cè)。EpCAM被認為是作為親同種細胞的粘附分子起作用，能夠干擾鈣粘蛋白介導(dǎo)的細胞-細胞接觸。EpCAM上調(diào) c-myc、細胞周期蛋白A和E、加快細胞周期和促進細胞增殖(Munz等，2004，Oncogene 23 5748-58)。在人類不同起源的人癌細胞中，EpCAM均得以大量和同樣地表達(Went等，2006， Br J Cancer 94 :1^-3 。對前列腺癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變進行的免疫組織化學(xué)研究顯示， EpCAM的表達可隨疾病的發(fā)展和增殖而增加。這一明顯的過表達在侵入性乳腺癌和卵巢癌患者中同樣得到了描述，并強烈預(yù)示了較差的無病生存率和總體生存率(Spizzo等，2004， Breast Cancer Res Treat 86 :207-13 ;Spizzo 等，2006，Gynecol Oncol 103:483-8)。在患有膽囊癌的患者中也觀察到了 EpCAM過表達和疾病進展之間相似的相互關(guān)系(Varga等， 2004, Clin Cancer Res 10:3131-6)。此外，在從結(jié)腸癌、乳腺癌、胰臟癌和前列腺癌中分離出來的癌起源或癌干細胞中，EpCAM均過表達(0' Brien等，2007，Nature 445 :106-10 ； Marhaba等，2008，Curr Mol Med 8:784-804)。這些數(shù)據(jù)強烈預(yù)示了將EpCAM作為免疫治療靶標以治療最常見的人類癌癥的潛在功用。在針對癌癥的免疫療法中，EpCAM同樣是一種經(jīng)過驗證的靶標。在這一方面， EpCAM的多種抗體已經(jīng)被用于免疫療法，雖然應(yīng)該提及多種抗體已經(jīng)由于種種原因在臨床試驗中失敗。這些EpCAM抗體有多種形式，包括裸抗體、免疫毒素和雙特異或三特異性抗體 (Baeuerle 禾口 Gires，Br. J. Cancer,2007,96 :417-423)。雖然雙特異性抗體方法(例如Micromet在他們MTllO抗體的方案中及Trion Pharma在Catumaxomab (Removab )的方案中所使用的)有多種優(yōu)點，人們?nèi)匀环浅ＯＭ_發(fā)具有單一特異性類型，也就是只有一種抗體特異性類型治療效果的抗體。同樣地，由于雙特異性或三特異性抗體與單一特異性類型的抗體的作用機制具有本質(zhì)的不同，直接的比較無法進行，也并不相關(guān)。在臨床試驗中已經(jīng)使用的另一種EpCAM抗體類型為免疫毒素類型(如Viventia 在ftOxiniunT/Vicinium 方案中所使用的)，也就是抗體的一部分與毒性分子結(jié)合，以產(chǎn)生殺滅腫瘤細胞的作用。ProxiniunT/Vicinium 是一種人源scFv(M0C31衍生)和假單胞菌外毒素(Di Paolo等，2003，Clin Cancer Res 9:2837-48)的融合蛋白。雖然這種抗體在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了令人鼓舞的效果，然而由于免疫原性副作用，無法進行全身施用，需要在腫瘤位置直接/局部施用。另外，由于免疫毒素與裸抗體的作用機制完全不同，直接比較確實不可行，也不相關(guān)。目前在臨床試驗中，最有效的裸類型的抗EpCAM的抗體為MT201 (Adecatumumab, 由Micromet公司開發(fā)，并授權(quán)給Merck Serono公司)，是一種完全人源的IgGl單克隆抗體。在前列腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌的I期及II期臨床試驗中，這種抗體表現(xiàn)出了有希望的結(jié)果，不像一些其他裸EpCAM抗體那樣(如ING-l，Xoma公司一種具有高度親和性的人源改造的IgGl)到目前為止患者沒有出現(xiàn)胰腺炎的跡象。其他試驗的抗EpCAM抗體已經(jīng)表現(xiàn)出了臨床上的不利之處。例如，對于Edrecolomab (17-1A ；Panorex )，盡管其具有良好的安全范圍，但其僅僅表現(xiàn)出輕微的臨床活性，并迅速被人體的抗-鼠源抗體(HAMA)反應(yīng)所中和。 M0C31 (Viventia公司一種正在被使用的人源化抗體)是另一種抗-EpCAM抗體，已受到廣泛的研究，是一種與鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)嵌合的抗體。由于EpCAM在正常上皮細胞中廣泛表達，因此如在高度親和力抗-EpCAM MAb ING-I看到的，機體無法承受EpCAM特異性的免疫毒素(ProxiniunT/Vicinium )及三功能抗體(Removab )，還有急性胰腺炎，與正常EpCAM表達的組織的附帶損傷情況相一致。另一方面，edrecolomab (Panorex )禾口 adecatumumab (MT201)表現(xiàn)出很好的承受力,似乎不會作用在正常的EpCAM表達的組織上。因此，抗EpCAM抗體的治療潛力是明確的，其挑戰(zhàn)在于，開發(fā)與本領(lǐng)域已知抗體，特別是現(xiàn)在明顯的領(lǐng)頭羊，MT201相比，表現(xiàn)出替代或改進特性的抗EpCAM抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人鑒定了一種可與EpCAM結(jié)合的抗體，與現(xiàn)有抗體相比，特別是與上面所述的MT201和M0C31相比，表現(xiàn)出改良的特性。例如，本發(fā)明中的抗體顯示了良好的親和力、良好的交叉反應(yīng)譜和出色的ADCC和CDCC活性。另外，優(yōu)選的是，這類抗體由于是完全人源化的蛋白，可與患者的免疫系統(tǒng)完全相容。本發(fā)明的抗體可用作診斷或治療用途 (特別是在癌癥方面)，或者可以之作為基礎(chǔ)，設(shè)計其他與靶抗原，EpCAM相結(jié)合的抗體或結(jié)合蛋白，如雙特異性抗體，免疫毒素或抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)。本發(fā)明中與EpCAM結(jié)合的抗體分子的氨基酸和/或DNA序列，它們的Vh和\結(jié)構(gòu)域，包括互補性決定區(qū)(⑶Rs)，會在本說明書中所附的多種SEQ ID NO中列出。本說明書中所描述的所有特異性抗體，其VH結(jié)構(gòu)域中均具有相同的CDRs，但其VL結(jié)構(gòu)域中CDRs會稍微有所不同。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括重鏈(VH)⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :5所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列?？蛇x的或者此外，在本發(fā)明的一個實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括一個重鏈 (VH)OTR2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :6所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列?？蛇x的或此外，在本發(fā)明的一個實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括一個重鏈 (VH)OTR3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :7所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。 由于抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域在與抗原結(jié)合方面經(jīng)常非常重要，因此本發(fā)明特別優(yōu)選具有基于 SEQ ID N0:7的VH⑶R3結(jié)構(gòu)域的抗體。實際上，這種序列出現(xiàn)在本說明書描述的所有特異性抗體中。可選的或此外，在本發(fā)明的一個實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括一個輕鏈 (VL)⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :8所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列?？蛇x的或此外，在本發(fā)明的一個實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括一個輕鏈 (VL)OTR2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :9所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。 在本發(fā)明的一個可選的實施例中，抗體包括一個輕鏈(VL) CDR2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 29所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。可選的或此外，在本發(fā)明的一個實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括一個輕鏈 (VL) OTR3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :10所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在本發(fā)明的可選實施例中，抗體包括一個輕鏈(VL) OTR3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :30、 SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 69 或 SEQ ID NO :82 所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。因此，在特定的實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括一個或多個重鏈CDR結(jié)構(gòu)域，其中重鏈CDR結(jié)構(gòu)域從一個組中選擇得到，該組包括(a)重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 5所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列；(b)重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 6所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列；以及(c)重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 7所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。本發(fā)明在某些實施例中同樣提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括一個或多個輕鏈⑶R結(jié)構(gòu)域，其中輕鏈⑶R結(jié)構(gòu)域從一個組中選擇得到，該組包括(a)輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 8所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列；(b)輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 29所列的氨基酸序列， 或一個與其大體上同源的序列；以及(c)輕鏈 CDR3 結(jié)構(gòu)域，包含如 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO 56,SEQ ID N0:69或者SEQ ID NO :82所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在某些優(yōu)選實施例中，與EpCAM結(jié)合的抗體包括如下兩種(a) 一種重鏈⑶R3，包含如SEQ ID NO 7所列的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列；以及(b) 一種輕鏈 CDR3，包含如 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 43,SEQ ID NO :56、SEQ ID NO 69或者SEQ ID NO 82所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。更優(yōu)選地，重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :5所列的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO 8所列的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO :6所列的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域包含如SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 29 所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，也同樣做了介紹。在一個優(yōu)選實施例中，重鏈⑶Rl包含如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，⑶R2包含如SEQ ID NO :6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列， 以及⑶R3包含如SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，這些可單獨出現(xiàn)或聯(lián)合出現(xiàn)。在又另外一個優(yōu)選實施例中，輕鏈⑶Rl包含如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，⑶R2包含如SEQ ID NO :9或者SEQ ID NO :29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，以及CDR3包含如SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO :69或者SEQ ID NO :82所列的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，這些可單獨出現(xiàn)或聯(lián)合出現(xiàn)。換一種方式來看，在某些實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包含重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，禾口 / 或一個輕鏈 CDR3 結(jié)構(gòu)域，包含如 SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :43、 SEQ ID NO 56,SEQ ID N0:69或者SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。所述抗體可以進一步包括重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，和/或進一步包括重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。換一種方式來看，在某些實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包含重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 9或者SEQ ID NO 29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。所述抗體可以進一步包括重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和 / 或輕鏈 CDR3 結(jié)構(gòu)域，包含如 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 56,SEQ ID N0:69或者SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，和 /或進一步包括重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 5的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。換一種方式來看，在某些實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包含重鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和/或輕鏈⑶Rl結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。 所述抗體可以進一步包括重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，和 / 或輕鏈 CDR3 結(jié)構(gòu)域，包含如 SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 56,SEQ ID N0:69或者SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，和 /或進一步包括重鏈⑶R2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO 6的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，和/或
輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，包含如SEQ ID NO :9或者SEQ ID NO : 的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。本發(fā)明中某些優(yōu)選的抗體包含一個或多個⑶Rs，這些⑶Rs從一個組中選擇而出， 這個組包含SEQ ID NOs :5、6、7、8、9及10，或者一個與前面任一個SEQ ID NOs大體上同源的序列。其他優(yōu)選的⑶Rs從一個組中選擇而出，這個組包括SEQ ID NOs : (對于VL⑶R2) 和 SEQ ID NOs 30、43、56、69 和 82 (對于 VL CDR3)。其他某些優(yōu)選的抗體包括兩個或更多個重鏈⑶Rs，這些重鏈⑶Rs包含如SEQ ID NOs :5、6或7，或者與前面任一個SEQ ID NOs大體上同源的序列。特別優(yōu)選的結(jié)合分子包括3個含SEQ ID NOs :5、6和7的重鏈⑶Rs，或者與前面任一個SEQ ID NOs大體上同源的序列(如每個上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或大體上同源的序列中的一個)。某些優(yōu)選的抗體包括兩個或更多個輕鏈⑶Rs，如含SEQ ID N0s:8(對于VL CDR1)、9或四(對于VL CDR2)，或10、30、43、56、69或82 (對于VL CDR3)，或者與前面任一個SEQ ID NOs大體上同源的序列。特別優(yōu)選的結(jié)合分子包含3個輕鏈⑶Rs，如含SEQ ID N0s:8(對于 VL 001 1)，9或四(對于 VL CDR2)，或 10、30、43、56、69 或 82 (對于 VL CDR3)， 或與前面任一個SEQ ID NOs大體上同源的序列(如每個上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或者與其大體上同源的序列中的一個)。某些特別優(yōu)選的抗體包括3個輕鏈⑶Rs，如含SEQ ID NOs 8 (對于VL⑶Rl)，9或 29 (對于VL 0 2)，或10，30，43，56，69或82(對于￥1^0)1 3)，或大體上與這些序列(如，每個上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或者大體上與之同源的序列中的一個)同源的序列，還包括3個重鏈⑶Rs，如含SEQ ID NOs :5，6或7，或者大體上與這些序列中的任一個同源的序列(如，每個上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或者大體上與之同源的序列)。某些特別優(yōu)選的抗體包括含SEQ ID NO 5的重鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，含SEQ ID NO 6的重鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，以及含SEQ ID NO 7的重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，或者大體上與任一上述序列同源的序列；和/或包括含SEQ ID NO 8的輕鏈CDRl結(jié)構(gòu)域，含SEQ ID NO 9的輕鏈CDR2結(jié)構(gòu)域，以及含SEQ ID NO 10的輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，或者大體上與任一個上述序列同源的序列。另一種優(yōu)選的輕鏈CDR組合物為SEQ ID N0:8(對于VL CDR1)和SEQ ID NO: 29 (對于 VL CDR2)和 SEQ ID NO 30 或者 SEQ ID NO 43 或者 SEQ ID NO 56 或者 SEQ ID NO 69或者SEQ ID NO 82 (對于VL⑶R3)，或者大體上與任一個上述序列同源的序列。在進一步優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，該抗體包括至少一個包含三個⑶Rs的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶Rs的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括(C)VH⑶R3，含有如SEQ ID NO 7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。在進一步優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，至少包括包含三⑶Rs的重鏈可變區(qū)，至少包括包含三⑶Rs的輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包括(a)VH⑶R1，含有如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(b)VH⑶R2，含有如SEQ ID NO :6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，以及(C)VH⑶R3，含有如SEQ ID NO 7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的一個優(yōu)選方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDRs從一個組中選出， 該組包括(d)可變輕鏈(VL)⑶R1，含有如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，以及(f) VL CDR3，含有如SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :56、 SEQ ID N0:69或SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的進一步優(yōu)選方面，兩個所述輕鏈可變區(qū)⑶Rs從一個組中選出，該組包括(d)可變輕鏈(VL)⑶Rl，含有如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，以及(f) VL CDR3，含有如SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :56、 SEQ ID N0:69或SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的另一個進一步優(yōu)選方面，三個所述輕鏈可變區(qū)⑶Rs從一個組中選出，該組包括(d)可變輕鏈(VL)⑶Rl，含有如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，以及(f) VL CDR3，含有如SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO :56、 SEQ ID N0:69或SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在進一步優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括至少一個包含三個⑶Rs的重鏈可變區(qū)和包括至少一個包含三個⑶Rs的輕鏈可變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括(i)可變輕鏈(VL)⑶Rl，含有如SEQ ID NO 8的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(ii)VL CDR2，含有如SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :29的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列，以及(iii)VL CDR3，含有如 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO :69或SEQ ID NO :82的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的一個優(yōu)選方面，一個或多個所述重鏈可變區(qū)⑶Rs從一個組中選出，該組包括(i)VH⑶R1，含有如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(ii)VH⑶R2，含有如SEQ ID NO 6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的進一步優(yōu)選方面，兩個所述重鏈可變區(qū)⑶Rs從一個組中選出，該組包括(i)VH⑶R1，含有如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(ii)VH⑶R2，含有如SEQ ID NO 6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。在本實施例的另一個進一步優(yōu)選方面，三個所述重鏈可變區(qū)⑶Rs從一個組中選出，該組包括(i)VH⑶R1，含有如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(ii)VH⑶R2，含有如SEQ ID NO 6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列， 以及(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。本發(fā)明的某些進一步優(yōu)選實施例提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，該抗體包括VH結(jié)構(gòu)域，包括一個、兩個或三個重鏈CDRs，該重鏈CDRs含SEQ ID N0s:5、6或7， 或者大體上與一個或多個SEQ ID NOs :5、6或7同源的序列，和/或VL結(jié)構(gòu)域，包含一個、兩個或三個輕鏈⑶Rs，該輕鏈⑶Rs含有SEQ ID NOs :8(對于 VL CDR1)、9 或者四(對于 VL CDR2)，或者 10、30、43、56、69 或者 82 (對于 VL CDR3)，或者與這些序列中的一個或多個大體上同源的序列。特別優(yōu)選的VH結(jié)構(gòu)域包括3個重鏈⑶Rs，該重鏈⑶Rs包含SEQ ID NOs :5、6和 7，或者與一個或多個與SEQ ID NOs :5、6或7大體上同源的序列(如，每個⑶R1、⑶R2和 CDR3或者大體上與其同源的序列)。特別優(yōu)選的VL結(jié)構(gòu)域包含3個輕鏈CDRs，如含SEQ ID NOs 8 (對于VL CDR1)、9 或四(對于VL CDR2)，或10、30、43、56、69或82(對于VL CDR3)，或與前面一個或多個這些序列大體上同源的序列(如每個上述CDR1、CDR2和CDR3或者與其大體上同源的序列中的一個)。本發(fā)明中更加特別優(yōu)選的實施例提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括VH結(jié)構(gòu)域，包含3個重鏈⑶Rs，該重鏈⑶Rs含有SEQ ID NOs :5、6和7，以及VL結(jié)構(gòu)域，包含3個輕鏈⑶Rs。在優(yōu)選實施例中，一個、兩個或三個輕鏈⑶Rs由SEQ ID NOs :8、9和10來限定。 大體上與之同源的序列也同樣包括在內(nèi)。在替代的VL結(jié)構(gòu)域中，一個、兩個或三個輕鏈CDRs由SEQ ID NOs :8、四和30 ；8、 29和43 ；8、四和56 ；8,29和69 ；以及8、四和82而限定。大體上與之同源的序列也同樣包括在內(nèi)。本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例中提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包含有如SEQ ID NO :3的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列的VH結(jié)構(gòu)域，和/或含有如SEQ ID NOs 4、27、40、53、66或者79的氨基酸序列，或一個與其大體上同源的序列的VL結(jié)構(gòu)域。進一步優(yōu)選的實施例提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包含有如SEQ ID NO 3的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，還包含有3個輕鏈CDRs的VL結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述VL結(jié)構(gòu)域含有如SEQ ID NOs :4、27、40、53、66或79的氨基酸序列。本發(fā)明的其他實施例提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，包括一個VL結(jié)構(gòu)域，包括3個輕鏈CDRs，該輕鏈CDRs含有SEQ ID NOs :8、9和10，還包括一個VH結(jié)構(gòu)域，含有3個重鏈⑶Rs。在優(yōu)選實施例中，一個、兩個或三個重鏈CDRs由SEQ ID NOs :5、6和7來確定。進一步優(yōu)選的實施例提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，所包含的VL結(jié)構(gòu)域含有如 SEQ ID NOs :4、27、40、53、66或79的氨基酸序列，還包含VH結(jié)構(gòu)域，含有3個重鏈CDRs。 優(yōu)選地，所述VH結(jié)構(gòu)域含有如SEQ ID NO 3的氨基酸序列。在另一個進一步實施例中，本發(fā)明提供了一種與EpCAM結(jié)合的抗體，含有如SEQ ID NO 21的氨基酸序列(所述抗體在此處同樣稱為3-171 kFv)，或含有與EpCAM結(jié)合的其片段，或一個與其大體上同源的序列。本發(fā)明的其他抗體含有如SEQ ID NO :36 (所述抗體在此處同樣稱為7_F17SCFv)、 SEQ ID NO :49(所述抗體在此處同樣稱為12-C15scFv)、SEQ ID NO :62 (所述抗體在此處同樣稱為16-G5scFv)、SEQ ID NO :75 (所述抗體在此處同樣稱為17_C20scFv)和SEQ ID NO 88 (所述抗體在此處同樣稱為M-G6scFV)所列的氨基酸序列，或含有與EpCAM結(jié)合的片段， 或一個與其大體上同源的序列。本發(fā)明采用單克隆抗體3-171作為例證，其單鏈形式如

圖1 (SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 20)所示，其全長IgG形式如例1和表1所描述。所述3-171抗體包括一個含SEQ ID NO 3的VH結(jié)構(gòu)域和含SEQ ID NO 4的VL結(jié)構(gòu)域。3-171抗體的CDR結(jié)構(gòu)域、VH和VL 結(jié)構(gòu)域由表1和圖1示出。包含這些⑶R結(jié)構(gòu)域或者VH和VL結(jié)構(gòu)域(或大體上與其同源的序列)的抗體作為本發(fā)明的優(yōu)選方面。本發(fā)明其他作為例證的抗體有7-F17、12-C15、16-G5、17-C20以及M-G6。7-F17 抗體包含如SEQ ID NO :3的VH結(jié)構(gòu)域，以及如SEQ ID NO :27的VL結(jié)構(gòu)域。12-C15抗體包含如SEQ ID NO 3的VH結(jié)構(gòu)域，以及如SEQ ID NO 40的VL結(jié)構(gòu)域。16-G5抗體包含如 SEQ ID NO 3的VH結(jié)構(gòu)域，以及如SEQ ID NO 53的VL結(jié)構(gòu)域。17-C20抗體包含如SEQ ID NO :3的VH結(jié)構(gòu)域，以及如SEQ ID NO :66的VL結(jié)構(gòu)域。M-G6抗體包含如SEQ ID NO 3 的VH結(jié)構(gòu)域，以及如SEQ ID NO :79的VL結(jié)構(gòu)域。因此，這些抗體含有與3-171相同的重鏈，但其輕鏈不同，其序列分別在表2、3、4、5和6中示出。包含這些⑶R結(jié)構(gòu)域或者VH和 VL結(jié)構(gòu)域(或大體上與其同源的序列)的抗體作為本發(fā)明的優(yōu)選方面。本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例為SEQ ID NO :21(氨基酸)示出的3-171抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO :20(核酸)進行編碼。本發(fā)明另一個實施例為SEQ ID NO :36(氨基酸)示出的7-F17抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO :35 (核酸)進行編碼。本發(fā)明另一個實施例為SEQ ID NO :49(氨基酸)示出的12-C15抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO :48(核酸)進行編碼。本發(fā)明另一個實施例為SEQ ID NO :62(氨基酸)示出的16-G5抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO :61(核酸)進行編碼。本發(fā)明另一個實施例為SEQ ID NO 75(氨基酸)示出的17-C20抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO 74(核酸)進行編碼。本發(fā)明另一個實施例為SEQ ID NO :88(氨基酸)示出的M-G6抗體的scFv形式，其優(yōu)選通過SEQ ID NO 87(核酸)進行編碼。
本發(fā)明另一種優(yōu)選實施例為3-171抗體的全長IgG形式，其重鏈由SEQ ID NO 24(氨基酸)示出，優(yōu)選地由SEQ ID NO :22(核酸)進行編碼；其輕鏈由SEQ ID NO :25(氨基酸)示出，優(yōu)選地由SEQ ID NO :23(核酸)進行編碼。7-F17、12-C15、16-G5、17-C20以及M-G6抗體的全長IgG形式也是優(yōu)選的實施例。因此，本發(fā)明優(yōu)選的抗體包含3-171的VH和VL結(jié)構(gòu)域，即包含SEQ ID NO 3和 SEQID NO :4或大體上與之同源的序列。其他優(yōu)選的抗體包括7-F17、12-C15、16-G5、17-C20 和M-G6的VH和VL結(jié)構(gòu)域，或大體上與之同源的序列。在此處描述的所有本發(fā)明的實施例中，VL⑶R2結(jié)構(gòu)域具有或者包括如G A S T X5 A X7(SEQ ID NO 37)的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，其中&和X7可以是任一種氨基酸。在這些實施例中)(5可以是R或T，優(yōu)選為T。X7可以是T或S，優(yōu)選為S。因此，一種優(yōu)選的VL CDR2具有或包括一種如G A S T R/T A T/S (SEQ ID NO 38)的氨基酸序列?？赏瑯訁⒁姳?。在此處描述的所有本發(fā)明的實施例中，VL⑶R3結(jié)構(gòu)域具有或者包括如Q X2 Y N X5 w P P X9 X10 T(SEQ ID NO 89)的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，其中)(2、X5、 乂9和)(1(1可以是任一種氨基酸。在這些實施例中&可以是Q或H或K，優(yōu)選為Q。&可以是 N或D，優(yōu)選為N。X9可以是G或T或S或M或A，優(yōu)選為A。Xltl可以是F或W或Y，優(yōu)選為 Y。因此，一種優(yōu)選的VL CDR3具有或包括一種如Q Q/H/K Y N N/D W P P G/T/S/M/AF/W/ Y T(SEQ ID NO 90)的氨基酸序列?？赏瑯訁⒁姳?。某些大體上同源的序列的例子為與所披露的氨基酸序列至少具有70% —致性的序列。在某些實施例中，本發(fā)明的與EpCAM結(jié)合的抗體至少包括一個輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包括一個氨基酸序列域，與SEQ ID NOs :4、27、40、53、66或79的氨基酸序列至少約70%或75%，更加優(yōu)選的至少約80%，更加優(yōu)選的至少約85%，更加優(yōu)選的至少約90% 或95%和最優(yōu)選的至少約97^^98%或者99%的一致性；和/或至少包括一個重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括一個氨基酸序列域，與SEQ ID NO :3的氨基酸序列至少約70%或 75 %，更加優(yōu)選的至少約80 %，更加優(yōu)選的至少約85 %，更加優(yōu)選的至少約90 %或95 %和最優(yōu)選的至少約97^^98%或者99%的一致性。其他優(yōu)選的大體上同源的序列的例子為含有對披露的氨基酸序列替換保守氨基酸的序列。其他優(yōu)選的大體上同源的序列的例子為在一個或多個披露的CDR結(jié)構(gòu)域中含有 1、2或3個，優(yōu)選為1或2個改變的氨基酸的序列。這種變更可以是保守或非保守氨基酸的替換，或者是它的結(jié)合。在所有這些實施例中，優(yōu)選的變更為保守氨基酸的替換。在所有實施例中，含有大體上同源的序列的抗體保留了與EpCAM結(jié)合的能力，優(yōu)選保留此處所描述的一個或多個其他特性，如至少與人源EpCAM結(jié)合的能力，優(yōu)選能與人源和猴源EpCAM結(jié)合的能力。本發(fā)明的其他實施例提供了與EpCAM結(jié)合的結(jié)合蛋白，包括本發(fā)明的一種抗體， 本發(fā)明的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或者本發(fā)明的一個或多個CDRs。在一個優(yōu)選實施例中，這種結(jié)合蛋白為抗體。對于VH、VL和CDR結(jié)構(gòu)域在應(yīng)用到此類結(jié)合蛋白上的優(yōu)選結(jié)合方式會在本說明書的其他地方談及。本發(fā)明優(yōu)選的抗體最少包括一個含三個⑶Rs的重鏈可變區(qū)，以及最少包括含三個⑶Rs的輕鏈可變區(qū)。這些⑶Rs的示范和優(yōu)選的序列會在此描述到。正如本說明書中所使用的，簡潔術(shù)語“EpCAM”，除非另外特別聲明或者與科學(xué)術(shù)語區(qū)分開，指的是上皮細胞粘附分子。EpCAM也可被稱之為EGP-2，、17-1A、HEA125、MK-U GA733-2、EGP34、KSA、TR0P-1、ESA、TACSTD1 或者 KS1/4?！癊pCAM”也指EpCAM的任一形式，特別是指EpCAM在哺乳動物物種中的保守類型 (Trzpis等，2008，Transgenic Res 17 =229-238) 本發(fā)明的抗體或抗體片段可因此與例如人類、猴(如食蟹猴)、奶牛(牛)、小鼠、大鼠、倉鼠、雪貂、豚鼠和/或兔的EpCAM結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或抗體片段至少能與人源EpCAM結(jié)合。在某些優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的抗體或抗體片段至少能與人源和猴源(如食蟹猴)EpCAM結(jié)合。在其他的優(yōu)選實施例中本發(fā)明的抗體或抗體片段至少能與人源和鼠源EpCAM結(jié)合。在其他的優(yōu)選實施例中本發(fā)明的抗體或抗體片段至少能與人源、猴源和鼠源EpCAM結(jié)合。EpCAM可以是游離EpCAM，如重組或純化的EpCAM，或者也可以天然形式，如在細胞表面的形式呈現(xiàn)。本發(fā)明的抗體或者結(jié)合蛋白也可與EpCAM的片段，特別是包含或組成部分為細胞外結(jié)構(gòu)域的片段結(jié)合，或者能與包含EpCAM或EpCAM片段的實體相結(jié)合。實際上，本發(fā)明的抗體的表位位于EpCAM的細胞外結(jié)構(gòu)域上。正如本說明書中所使用的，在本發(fā)明的抗體或抗體片段背景下的術(shù)語“與EpCAM 結(jié)合的”或者“抗-EpCAM”，指的是抗體或抗體片段，能夠?qū)崿F(xiàn)如下中的一個或多個；優(yōu)選的，能夠?qū)崿F(xiàn)如下中的多于一個；最優(yōu)選的，能夠?qū)崿F(xiàn)如下中的所有(a)在固相載體上結(jié)合至游離EpCAM ；比如重組表達的EpCAM，例如由ELISA試驗或BIAcore試驗所驗證的；(b)結(jié)合至構(gòu)象依賴的(如非線性的)EpCAM表位，如在非還原狀態(tài)下通過蛋白質(zhì)印跡與EpCAM結(jié)合來進行檢測；(c)結(jié)合至表達在細胞表面的EpCAM，如經(jīng)流式細胞術(shù)或免疫組織化學(xué)檢測的；(d)至少與人源EpCAM結(jié)合，更加優(yōu)選的與人源和猴源EpCAM或者人源和鼠源 EpCAM結(jié)合，最優(yōu)選的和人源、猴源和鼠源EpCAM結(jié)合；(e)以IOnM或更小水平，優(yōu)選為5nM或更小，更加優(yōu)選的為3nM或者更少或者2nM 或更少，最優(yōu)選的為InM或更少的結(jié)合親和力(Kd)與人源EpCAM結(jié)合，這些會在本說明書的其他地方提及；(f)比如Kd為IOnM或更少，優(yōu)選的為5nM或更少，更加優(yōu)選的為3nM或更少或2nM 或更少，比如InM或更少以相似的親和力與人源和猴源EpCAM或者與人源和鼠源EpCAM結(jié)合，這些會在本說明書的其他地方提及。本發(fā)明優(yōu)選的抗體或者抗體片段同樣能夠完成一個或多個以下功能特性；優(yōu)選的，能夠完成多于一個的以下功能特性；最優(yōu)選的，完成所有下述功能特性(g)向有腫瘤的動物施用后能夠集中在腫瘤區(qū)域；(h)如本說明書中其他地方所描述的那樣誘導(dǎo)腫瘤細胞的ADCC ；(i)如本說明書中其他地方所描述的那樣誘導(dǎo)腫瘤細胞的CDC ；(j)在體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。
關(guān)于這些優(yōu)選的性質(zhì)的進一步信息會在本說明書的其他地方描述。其他優(yōu)選的性質(zhì)包括在施用本發(fā)明的抗體后不會出現(xiàn)嚴重的體內(nèi)毒性，也不會出現(xiàn)嚴重的其他體內(nèi)副作用，比如胰腺炎，或?qū)τ谄渌笶pCAM抗體比如會觀察到的對于正常組織帶來的其他附帶損傷等副作用。本發(fā)明的抗體也有可能抑制或顯著地降低EpCAM的作用或者防止或減少 EpCAM與其天然配體的相互作用。本發(fā)明抗體的另一種優(yōu)選的性質(zhì)(但不是必需的)為具有一種能力，能夠以單特異性的形式，如只有一種抗體特異性的形式而發(fā)揮治療效果。因此，根據(jù)本發(fā)明，一系列抗-EpCAM抗體可以被制造并應(yīng)用于多種方案中，包括治療癌癥的方案中。在整個申請文件中貫穿使用的詞語“a”及“an”，它們所表達的意思為“最少一個”，“至少第一個”，“一種或多種”或者“多種”其指代的成份或步驟，除了在一些情況下，其上限由后面所具體聲明。因此，一個“抗體”，正如本說明書所采用的，意味著“至少第一種抗體”。組合物可行的范圍和參數(shù)，同任何單一試劑的量一樣，由于本發(fā)明所披露的內(nèi)容而為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。本發(fā)明優(yōu)選的實施例是至少包含一種本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，或者其抗原結(jié)合片段的組合物。包含編碼由本說明書所限定的本發(fā)明中的抗體或其部分或片段的核苷酸序列的核酸分子，或者大體上與其同源的核酸分子，還構(gòu)成了本發(fā)明的進一步方面。優(yōu)選的核酸分子包括編碼由SEQ ID NO :21列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID N0:20進行編碼)。 其他優(yōu)選的核酸分子包括編碼由SEQ ID NO :36所列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO 35進行編碼)，或者編碼由SEQ ID NO 49所列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO 48進行編碼)，或者編碼由SEQ ID NO 62所列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID N0:61進行編碼)，或者編碼由SEQ ID NO :75所列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO 74進行編碼)，或者編碼由SEQ ID NO 88所列出的氨基酸序列的序列(優(yōu)選由SEQ ID N0:87進行編碼)。其他優(yōu)選的核酸分子包括編碼具有由SEQ ID NO : 所列出的氨基酸序列的重鏈的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO 22進行編碼)，和/或包括編碼具有由SEQ ID NO :25所列出的氨基酸的輕鏈的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO :23進行編碼)，或者編碼具有由 SEQ ID NO :51所列出的氨基酸序列的輕鏈的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO :50進行編碼)，或者編碼具有由SEQ ID NO :64所列出的氨基酸序列的輕鏈的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO :63進行編碼)，或者編碼具有由SEQ ID NO :77所列出的氨基酸序列的輕鏈的序列(優(yōu)選由SEQ ID NO 76進行編碼)。其他優(yōu)選的核酸分子包括編碼本發(fā)明中IgG形式的抗體的序列，例如在例1中所描述的那些，或者鼠源的嵌合形式。如上面所述，本發(fā)明所包含的其他核酸分子為編碼本發(fā)明中人源抗體的部分或者片段，例如，為編碼抗體的重鏈的核酸分子(比如，編碼SEQ ID NO 24的核酸分子，如SEQ ID NO :22)，或者編碼抗體的輕鏈的核酸分子(比如，編碼SEQ ID NO :25的核酸分子，如SEQ ID NO 23)。其他優(yōu)選的核酸分子為編碼本發(fā)明中抗體的VH區(qū)(如，編碼SEQ ID NO 3的核酸分子，比如SEQ ID NO :1)。其他優(yōu)選的核酸分子可以編碼本發(fā)明中抗體的VL區(qū)(比如，編碼SEQ ID NO :4的核酸分子，如SEQ ID NO :2，編碼SEQ ID NO :27的核酸分子，如SEQ ID N0:26，編碼SEQ ID NO :40的核酸分子，如SEQ ID N0:39，編碼SEQ ID N0:53的核酸分子，如SEQ ID N0:52，編碼SEQ ID NO :66的核酸分子，如SEQ ID NO :65，或者編碼SEQ ID NO 79的核酸分子，如SEQ ID NO 78)。因此，在本說明書中限定的本發(fā)明抗體的片段，或者大體上與之同源的序列，或包含編碼這些片段的序列的核酸分子，構(gòu)成了本發(fā)明的進一步方面。這里有一個總體的考慮，即高親和力的抗-EpCAM抗體會有無法承受的毒性范圍， 因為它們無法區(qū)分惡性的及正常的組織。因此，只有對低親和力的抗體，如edrecolomab 和MT201，才存在治療窗。另一方面，低親和力的抗體在消除腫瘤方面效力較低。例如，根據(jù)Mircromet網(wǎng)站的信息，在治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和前列腺癌的II期臨床試驗中， Adecatumumab (MT201)未達到作為單一試劑的主要終點(比如，在第M周時取得25%的臨床療效)。本發(fā)明的抗體，當呈IgG形式時，在EpCAM結(jié)合的親和力方面具有獨特的性質(zhì)。雖然計算的平衡親和力(Kd)看上去比較高(約InM)，其動力學(xué)成分(結(jié)合率和解離率)對親和力起不同的作用。本發(fā)明的抗體具有非常高的結(jié)合率(約為IO7M-1S-1),使其能與靶細胞快速地識別并結(jié)合，以及，同時，相對較高的解離率(KT2-KT3iT1)，使抗體能快速解離，在細胞表面的半衰期為3-4分鐘。這種獨特的結(jié)合屬性有可能會帶來較高的抗腫瘤效力及較低的毒性范圍的綜合結(jié)果。這種動力學(xué)特點，與現(xiàn)有技術(shù)的有明顯不同，當將該抗體應(yīng)用于體內(nèi)時，有可能帶來不同的(可能是更好的)藥代動力學(xué)結(jié)果。任何適于檢測結(jié)合率和尤其是解離率的方法均可應(yīng)用。然而，優(yōu)選的測定動力學(xué)常數(shù)的方法在于，使用商業(yè)化結(jié)合模型軟件，如BIAcore TlOO模型中的1 1結(jié)合模型(如 Langmuir結(jié)合模型)，在體外測定不同濃度下受試抗體與固定濃度的固定抗原(EpCAM)的反應(yīng)。為了進行說明，在例3中描述了一種合適的試驗方法。該常數(shù)優(yōu)選采用位于固相載體，比如BIAcore芯片上的固定抗原(EpCAM)，并檢測抗體與抗原的結(jié)合能力的方法進行測定。該結(jié)合親和力優(yōu)選在37°C (比如體溫)下進行測定，雖然它也可在其他溫度下，比如室溫下，如25°C測定?？蛇x地，在EpCAM陽性的細胞表面上抗體的解離率和半衰期可以通過細胞表面保留試驗而測定(Adams 等，1998，Br J Cancer 77 :1405-12 ；Le Gall 等，1999，F(xiàn)EBS Lett 453 :164-8)。后面的方法使得能夠更好地模擬患者處于治療狀態(tài)下的真正狀況。本發(fā)明的抗體處于IgG形式時，對EpCAM具有相對較高的結(jié)合親和力，例如，其Kd 位于ΙχΙΟΛ 或者IxKTi3M內(nèi)或者更少的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的抗體處于IgG形式時，其與EpCAM(優(yōu)選為人源EpCAM)的結(jié)合親和力相當于低于20ηΜ、15ηΜ或者IOnM的Kd，更加優(yōu)選的低于 10、9· 5、9、8· 5、8、7· 5、7、6· 5、6、5· 5、5、4· 5、4、3· 5、3、2· 5、2、1· 5、1、0· 9、0· 8、0· 7、 0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或者0. InM,然而，具有更高Kd值的抗體也同樣可以應(yīng)用于本發(fā)明中，只要它們具有如本說明書其他部分所述的適當功能特性。任何合適的測定Kd值的方法均可應(yīng)用。然而，優(yōu)選的測定Kd的方法在于，在體外測定不同濃度下受試抗體與多種濃度下的固定抗原(EpCAM)的反應(yīng)，以建立飽和曲線，例如采用Lineweaver-Burk法，或者優(yōu)選采用商業(yè)化結(jié)合模型軟件，如BIAcore TlOO模型中的1 1結(jié)合模型(如Langmuir結(jié)合模型)。因此，BIAcore測定法優(yōu)選用于測定Kd，為了進行說明，在例3中描述了一個合適的測定方法。Kd優(yōu)選通過在固相載體，如BIAcore芯片上固定抗原(EpCAM)，優(yōu)選游離抗原，如游離EpCAM或者一種包含EpCAM細胞外結(jié)構(gòu)域的分子，并測定抗體與抗原的結(jié)合力而得出。結(jié)合親和力優(yōu)選在37°C (如，體溫)下測定，雖然也可在其他溫度下，比如室溫，比如25°C測定。優(yōu)選采用抗體的IgG形式測定結(jié)合親和力。如本說明書其他部分所討論的，本發(fā)明優(yōu)選的抗體與人源和猴源EpCAM結(jié)合。這種物種間，特別是在人類和常用于臨床前動物模型的物種之間的交叉反應(yīng)性是一種重要的優(yōu)勢，它可以更有效地將臨床前的研究反映到臨床應(yīng)用上。例如，具有與使用的某種動物模型中存在的天然EpCAM交叉反應(yīng)的抗體，意味著在這種模型中所得到的結(jié)果更有可能反映出患者的狀況，從而可以更精確地評估出如劑量的選擇，同樣意味著提高了發(fā)現(xiàn)任何潛在的與之相關(guān)的或不確定的副作用的可能。如果抗體對猴源和人源的EpCAM具有相似的親和性則尤其如此。例如，本發(fā)明的抗體與人源EpCAM和猴源EpCAM結(jié)合的能力意味著這種抗體可用于臨床前毒性研究，以評估治療所導(dǎo)致的不利的副作用，尋找合適的可承受劑量。另外，同時與人源EpCAM和鼠源EpCAM結(jié)合的能力，意味著本發(fā)明的這種抗體在小鼠模型，如在采用免疫活性小鼠的小鼠同源模型中所示的結(jié)果，更有可能代表著該抗體在人類使用對象中所表現(xiàn)出的活性。如果抗體對鼠源的和人源的EpCAM具有相似的親和性則尤其如此。其理由在于，與人源EpCAM能夠結(jié)合但不能與鼠源EpCAM結(jié)合的抗體，能夠與在小鼠模型中生長的人源腫瘤細胞上表達的EpCAM結(jié)合，但無法與內(nèi)源性的小鼠EpCAM結(jié)合。 這當然與患者的狀況不同，在患者中，由腫瘤表達的EpCAM以及內(nèi)源性EpCAM同時存在。這種情況的一個潛在的不利之處在于，一種抗體可以與人源EpCAM結(jié)合，但是不能與鼠源EpCAM結(jié)合，或者親和力顯著降低，有可能在免疫缺陷的小鼠(如裸鼠或SCID小鼠)的人源腫瘤移植模型中表現(xiàn)良好，但可能在含有更多EpCAM表達的人類系統(tǒng)中無法表現(xiàn)出類似的性能。換句話說，在小鼠移植系統(tǒng)中，能與人源EpCAM結(jié)合，但無法與鼠源EpCAM 結(jié)合的抗體所表現(xiàn)出來的抗腫瘤作用，有可能比實際臨床效果看上去更好。與之相對的，當使用既可與人源，又可以與鼠源EpCAM結(jié)合的抗體后，它便可以與小鼠模型系統(tǒng)中存在的所有形式的EpCAM結(jié)合，更有可能更好的反映出將該種抗體應(yīng)用到人體時的情況。如果抗體對鼠源的和人源的EpCAM具有相似的親和性則尤其如此。本發(fā)明的3-171抗體(以及本發(fā)明其他優(yōu)選的抗體)對猴源和人源EpCAM相似的親和力，與現(xiàn)有技術(shù)抗體M0C31 (其對猴源EpCAM結(jié)合的親和力明顯低于對人源EpCAM的親和力)相比具有明顯優(yōu)勢，對MT201抗體這種與猴源EpCAM沒有檢測到親和力的抗體同樣具有優(yōu)勢。因此，本發(fā)明優(yōu)選的抗體與人源和猴源EpCAM結(jié)合，或者以相似的親和力、相似的結(jié)合率或相似的解離率，如本說明書其他部分所描述的那樣與人源和鼠源EpCAM結(jié)合。通過“相似的親和力”，“相似的結(jié)合率”或者“相似的解離率”同樣意味著抗體對人源EpCAM以及對于一個或多個其他合適的物種(如猴或鼠)的抗體的結(jié)合的親和力、結(jié)合率或者解離率，視情況而定，是可以相比的，例如，為不超過20倍。更加優(yōu)選的，結(jié)合親和力之間的差異少于15倍，更加優(yōu)選的少于10倍，最優(yōu)選的少于5、4、3或2倍?？梢韵嘈牛景l(fā)明的抗體可以結(jié)合在與已經(jīng)被鑒定出的已知抗-EpCAM抗體不同的表位處。當然，該表位看上去與M0C31抗體的表位不同，因為在EpCAM處于還原狀態(tài)后， 位于人源EpCAM上的M0C31表位仍然存在，而本發(fā)明的優(yōu)選抗體，3-171的表位處于這種狀態(tài)下明顯已經(jīng)被破壞掉了(見例幻。另外，由本發(fā)明的抗體，如3-171所識別的表位看來可能與被MT201抗體識別的抗原表位不同。結(jié)果顯示，3-171抗體(以及本發(fā)明的其他抗體) 與人源和猴源EpCAM均可結(jié)合，而MT201抗體只與人源EpCAM結(jié)合，這些結(jié)果可作為對此的間接證據(jù)。因此，本發(fā)明的一個進一步實施例提供了一種抗體，優(yōu)選為一種分離抗體，更加優(yōu)選為人源抗體，與EpCAM細胞外結(jié)構(gòu)域的一個抗原表位結(jié)合，并且具有與本說明書所述的 3-171抗體(比如，一種含有如SEQ ID NO 4的VL和如SEQ ID NO 3的VH的抗體)競爭的能力，或者具有與和3-171含有相同CDRs的抗體競爭結(jié)合到EpCAM上的能力，所述具有與和3-171含有相同CDRs的抗體也就是一種包含如SEQ ID NOs :8、9和10的VL CDR序列和如 SEQ ID N0s:5、6 和 7 的 VH CDR 序列的抗體。與 7-F17、12-C15、16-G5、17-C20 或者 24-G6抗體競爭結(jié)合EpCAM的抗體也同樣作為優(yōu)選。與相同的抗原表位/抗原結(jié)合可以輕易地通過本領(lǐng)域已知的并已被描述過的方法進行檢測，如，采用結(jié)合分析法，如競爭性抑制分析法。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白， 結(jié)合分析法可用于鑒別與本發(fā)明的抗體和抗體片段具有相同結(jié)合特性的其他抗體和抗體片段。如下面所述，競爭性結(jié)合分析法可用于發(fā)現(xiàn)這種類型的其他抗體。下面所描述的方法僅僅是合適的競爭性分析法的一個例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道其他合適的方法和變形。在用流式細胞儀進行競爭性分析之前，一定量的受試抗體需要通過如生物素化進行標記。生物素化的樣品的功能(細胞結(jié)合特性的保留程度)，以及本發(fā)明的生物素化的抗體(Abl)在與固定數(shù)量的腫瘤細胞，比如乳腺癌細胞實現(xiàn)亞-最大化結(jié)合時的最小濃度，便得以測定。從呈指數(shù)增長的培養(yǎng)物中收集了總量為IO6個細胞，并在4°C下與不同濃度的抗體孵育1小時。細胞洗滌后，在4°C下與合適的檢測抗體另外孵育1個小時。洗滌以后，細胞用流式細胞儀進行分析。對于每一個受試抗體，通過描繪針對抗體濃度的中位熒光強度 (MFI)，生成了一個飽和曲線。對于競爭性分析法，腫瘤細胞，如乳腺癌細胞，按照上面所述的方法準備，用固定濃度的標記(生物素化)抗體(bio-Abl)與濃度逐漸增加的非標記競爭性抗體的混合物進行處理一式兩份。所采用的固定濃度是指相對于如上面所測定的固定數(shù)量的腫瘤細胞，能產(chǎn)生合適的熒光信號的抗體的最小濃度。比較理想的是，這種nM級的固定濃度應(yīng)該低于平衡狀態(tài)下處理的抗體的親和力(Kd)。這種情況下，所描述的方法可用于估計競爭性抗體的親和力(Schodin 和 Kranz，1993，J Biol Chem 268:25722-7)?？贵w混合物與靶細胞在 4°C 下孵育1小時。洗滌細胞，通過與FITC-標記的鏈霉親和素孵育，與生物素化的抗體結(jié)合的細胞便可被顯示出來。將每個測試樣品(bio-Abl+AM)讀出的中位熒光信號減去背景熒光信號(PBS-5%FCS)后，對于每個仙2濃度“c”，其抑制百分數(shù)可按照如下的公式進行計算得出抑制％= (I-MFIbi。-Abl+Ab2’’c7MFIbi。-Abl)x 100.計算得出。抑制百分率與空白值相比，如果抑制百分率與對照組抑制百分率相比具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，則意味著受試抗體能夠與相同的表位/抗原結(jié)合。該統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異優(yōu)選為概率值<0. 05。適合于檢測統(tǒng)計學(xué)上顯著性的方法在本領(lǐng)域中廣為人知并有記錄，它們中的任何一種均可被應(yīng)用。優(yōu)選的，受試抗體至少能夠?qū)⒈景l(fā)明的抗體與EpCAM結(jié)合的量降低約95%。優(yōu)選的，這種抗體具有一個或多個如本說明書其他部分所限定的其他結(jié)合及功能特性，比如在上面的(a)到(j)中所述。本發(fā)明的抗體能與EpCAM結(jié)合。因此本發(fā)明的抗體或者結(jié)合蛋白可用于檢測體內(nèi)或體外的EpCAM。由于EpCAM在腫瘤細胞中過表達，本發(fā)明的抗體或者結(jié)合蛋白可用于檢測體內(nèi)或體外的腫瘤細胞。另外，所述抗體集中于腫瘤細胞上的能力意味著本發(fā)明的抗體能夠以存在腫瘤細胞的身體部位作為靶點，因此抗體能夠作用于靶點處。例如，抗體，也就是裸抗體，其本身可誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，比如通過激活或者誘導(dǎo)ADCC或者CDC來實現(xiàn)。這種以裸抗體起作用的能力非常具有優(yōu)勢?？蛇x擇的，或者另外，憑借與附加的治療性分子，如本說明書中所述的毒素或其它抗腫瘤分子相結(jié)合，這種抗體可誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有誘導(dǎo)體外腫瘤細胞，如表達EpCAM的腫瘤細胞，如乳腺癌細胞或胃癌細胞等的ADCC的能力。在例4中描述了一種適于在體外檢測ADCC的試驗。因此，本發(fā)明的抗體在比如存在人源PBMCs的時候，可以對體外的腫瘤細胞帶來如至少30%、 40^^50%,60^^70^^80%或90%的殺傷。可用于此類測定或分析的合適的腫瘤細胞， 其例子在例4中給出，但一般來說，任何表達EpCAM的腫瘤細胞均可應(yīng)用。例如，本發(fā)明的3-171抗體已經(jīng)表現(xiàn)出當存在人源PBMCs時，對體外的乳腺癌細胞株BT-474帶來至少 30^^40%,50%或者60%殺傷的能力；表現(xiàn)出當存在人源PBMCs時，對體外乳腺癌細胞株 MDA-MB-453帶來至少30 %、40 %、50 %、60 %或70 %殺傷的能力以及當存在人源PBMCs時， 對體外乳腺癌細胞株MDA-MB-231帶來至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %殺傷的能力。這種水平的殺傷是本發(fā)明的抗體所優(yōu)選的。這種水平的殺傷明顯高于當前正在做臨床試驗的最好的抗-EpCAM抗體(也就是MT201)所表現(xiàn)出來的殺傷水平，參見例4。本發(fā)明的抗體在達到這種ADCC水平所需要的抗體的低濃度下優(yōu)選為也同樣表現(xiàn)的特別有效。此外，例4中描述了一種合適的體外試驗。因此，對于腫瘤細胞，如乳腺癌細胞，達到半數(shù)最大細胞裂解(EC5tl)所需的抗體濃度體外試驗中優(yōu)選低于30ng/ml、25ng/ml、 20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 或 0. 25ng/ml 或 0. 20ng/ml 或0. 15ng/ml。例如，本發(fā)明的3-171抗體所表現(xiàn)出的EC5tl，對于MDA-MB-453細胞來說低至 0. 08ng/ml，對于B7474細胞來說低至0. 12ng/ml以及對于MDA-MB-231細胞來說低至15ng/ ml，所有的這些EC5tl顯著低于MT201在平行試驗中所測定的EC5tl值。此外，與現(xiàn)有技術(shù)抗體的MT201相比，這些結(jié)果顯示出本發(fā)明的優(yōu)選抗體具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有誘導(dǎo)體外腫瘤細胞，如表達EpCAM的腫瘤細胞，如乳腺癌細胞或胃癌細胞等的CDC的能力。在例4中描述了一種適于在體外檢測CDC的試驗。因此， 本發(fā)明的抗體當存在人類血清時，對于體外的腫瘤細胞可以至少帶來如70^^80^^90%, 95%或甚至達到100%的殺傷?？捎糜诖祟悳y定或分析的合適的腫瘤細胞的例子在例4中給出，但一般來說，任何表達EpCAM的腫瘤細胞均可應(yīng)用。例如，本發(fā)明的3-171抗體當存在人類血清時，對體外的乳腺癌細胞株MT-3已經(jīng)表現(xiàn)出帶來至少70%、80%、90%或95% 殺傷的能力，實際上表現(xiàn)出了大約100%的殺傷；當存在人類血清時，對體外的胃癌細胞株 KATO III已經(jīng)表現(xiàn)出帶來至少70%、80%、90%或者95%殺傷的能力，實際上表現(xiàn)出了大約100%的殺傷。這種水平的殺傷對于本發(fā)明的抗體來說是優(yōu)選的，并且與當前正在做臨床試驗的最好的抗-EpCAM抗體(也就是MT201)所表現(xiàn)出來的殺傷水平相當，參見例4。
本發(fā)明的抗體在達到這種CDC水平所需要的抗體的低濃度下優(yōu)選為也同樣表現(xiàn)的特別有效。此外，例4中描述了一種合適的體外試驗。因此，對于腫瘤細胞，如表達EpCAM 的腫瘤細胞，如乳腺癌細胞或胃癌細胞等，達到半數(shù)最大細胞裂解(EC5tl)所需的抗體濃度在體外優(yōu)選低于 60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、IOng/ ml、5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 75ng/ml、0. 5ng/ml、0. 4ng/ml 或 0. 3ng/ml。例如,本發(fā)明的 3-171抗體所表現(xiàn)出的EC5tl，對于KATO III細胞來說低至0. ^ng/ml，對于MT-3細胞來說低至0. 38ng/ml，所有的這些EC5tl顯著低于MT201在平行試驗中所測定的EC5tl值。此外，與現(xiàn)有技術(shù)抗體的MT201相比，這些結(jié)果顯示出本發(fā)明的優(yōu)選抗體具有明顯的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明的抗體至少與在先技術(shù)的抗體MT201相比，表現(xiàn)出提高的ATCC和⑶C 活性，而MT201被認為是在這一方面特別有效。這種作用說明本發(fā)明的抗體可用于發(fā)動患者的免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞戰(zhàn)斗(即無需其他活性成分就可對治療有用)。將ATCC誘導(dǎo)到如此高的水平以及如此高的效能的能力很顯然是一個很有利的特性。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的抗體具有誘導(dǎo)ADCC和/或⑶C的能力。ADCC和/或⑶C的活性可在體內(nèi)或體外進行測定。因此，本發(fā)明的優(yōu)選的抗體表現(xiàn)出抗腫瘤的活性。這種抗腫瘤活性可在體外或體內(nèi)進行測定。本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有抑制腫瘤細胞，如乳腺癌細胞生長的能力。所述抑制能力可由體外或體內(nèi)來證明。優(yōu)選的，上面所述的能力和性能與合適的對照組水平相比，處于可測到的水平或顯著性水平，更加優(yōu)選的處于有統(tǒng)計學(xué)意義的水平。合適的顯著性水平會在本說明書的其他部分提及。更加優(yōu)選的，一種或多種上面所述的能力和性能其檢測到的水平，當與現(xiàn)有技術(shù)的抗體所觀察到的能力相比時，可以測定的程度有所改善，或更加優(yōu)選的，顯著改善。有些抗體能夠進入到與其結(jié)合的細胞內(nèi)部。因此，在本發(fā)明的幾個實施例中，所述抗體能夠被內(nèi)在化。這種特性在應(yīng)用免疫偶聯(lián)物的時候具有特別的優(yōu)勢，因為與抗體分子結(jié)合的任何其他制劑都會隨抗體分子而被內(nèi)在化。在其他實施例中并未見到顯著的內(nèi)在化。在下面說明書中的組合物、免疫偶聯(lián)物、藥物、組合、復(fù)合物、試劑盒、第一和第二醫(yī)學(xué)用途以及本發(fā)明中所有的方法中，術(shù)語“抗體”和“免疫偶聯(lián)物”，或者它的抗原結(jié)合區(qū)域或片段，除非另行特別說明或解釋清楚該科學(xué)術(shù)語，都涉及一系列的抗-EpCAM抗體，也指具體的 3-17I、7-F17、12-C15、16-G5、17-C20 或 24-G6 抗體。本說明書中使用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”，較寬泛的指代任何包含人類抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫結(jié)合試劑或分子，包括多克隆和單克隆抗體。由于重鏈中的恒定區(qū)的類型不同，所有抗體均屬于五種主要類型中的一種IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，本發(fā)明的抗體可屬于這些類型中的任一種。這些中的幾種進一步分成亞型或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4等等。所述重鏈的與不同類型的免疫球蛋白相對的恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y和 μ。不同類型的免疫球蛋白的亞型結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型均已眾所周知。一般地，在本發(fā)明所使用的全部抗體，而非抗原結(jié)合域中，IgG和/或IgM是優(yōu)選的，因為它們是生理狀況下最常見的抗體，還因為它們最容易在實驗室環(huán)境中制備。然而在有些實施例中，IgA抗體是優(yōu)選的。
哺乳動物抗體的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列以及其可變區(qū)的骨架區(qū)的某些氨基酸，屬于兩種明顯不同的類型kappa( κ)以及IambdaU )中的一種。本發(fā)明的抗體使用κ或λ輕鏈恒定區(qū)在本質(zhì)上沒有傾向性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，由術(shù)語“抗體”所指代的免疫結(jié)合試劑會擴展到所有人源抗體及其抗原結(jié)合片段，包括整個抗體、二聚體、三聚體及多聚體的抗體；雙特異性抗體；嵌合抗體；重組體和改造抗體，及其片段。術(shù)語“抗體”因此用于指代任何具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣的分子，該術(shù)語包括抗體片段，所述抗體片段包含抗原結(jié)合域如Fab'、Fab、F(ab' )2、單域抗體(DABs)、TandAbS 二聚體、Fv、scFv (單鏈Fv)、dsFv、ds_scFv、FcU線性抗體、微抗體、雙功能抗體(diabodies)、 雙特異性抗體片段、雙體(bibody)、三體(tribody)(分別為scFv-Fab融合體、雙特異性或三特異性)；so-雙功能抗體；κ ( λ )體(scFv-CL融合體)；BiTE (雙特異性T細胞結(jié)合子， scFv-scFv相連以吸引T細胞)；DVD-Ig (雙可變區(qū)抗體，雙特異性型)；SIP (小免疫蛋白， 一種微抗體)；SMIP( “小型模塊化免疫藥學(xué)” scFv-Fc 二聚體；DART( 二硫鍵穩(wěn)定的雙鏈抗體“雙親和再靶向”)；包含一個或多個CDRs等的小抗體模擬物。用于制備和使用多種基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知(參見Kabat等，1991，在說明書中被特別用來做參考)。特別是雙鏈抗體，在EP 404，097和 W093/11161中被進一步描述；而線性抗體在Zapata等(1995)中被進一步描述。抗體能夠通過常規(guī)技術(shù)打成片段。例如，F(xiàn)(ab' )2片段可通過用胃蛋白酶處理抗體而制得。產(chǎn)生的F(ab' )2片段可以進行處理，以減少二硫鍵而制得Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可促使Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab' )2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、 TandAbs, ds-scFv、二聚體、微抗體、雙功能抗體、雙特異性抗體片段及其他片段可同樣通過重組技術(shù)進行合成或能通過化學(xué)合成。用于制備抗體片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知并有描述。例如，Beckman 等，2006 ；Holliger & Hudson，2005 ；Le Gall 等，2004 ；Reff & Heard， 2001 ；Reiter等，1996 ；和^ung等，1995中的每一篇文獻進一步描述并使得能夠制備有效抗體片段?？贵w或者抗體片段可通過天然產(chǎn)生或能夠完全或部分合成制備。因此所述抗體可通過任何適當?shù)膩碓传@得，例如重組體來源和/或通過轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物而生產(chǎn)， 或在采用IgY技術(shù)的蛋中生產(chǎn)。因此，所述抗體分子可通過體外或體內(nèi)方法制備得到。優(yōu)選的，所述抗體或抗體片段包括一個含有三個CDR結(jié)構(gòu)域的抗體輕鏈可變區(qū) (\)，以及一個含有三個CDR結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)(Vh)。所述VL和VH大體構(gòu)成了抗原結(jié)合位點。“Fv”片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小的抗體片段。此區(qū)域含有一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)，通過緊密而非共價的方式聯(lián)合成二聚體。在這種構(gòu)型中，每個可變區(qū)的三個高變區(qū)(CDRs)相互作用，從而在二聚體的表面限定出抗原結(jié)合位點。共同地， 6個高變區(qū)(CDRs)使抗體具有抗原結(jié)合特異性。然而，本領(lǐng)域中的文獻充分表明，對于一個抗體來說，其輕鏈可變區(qū)的三個CDRs 以及重鏈可變區(qū)的三個CDRs的存在對抗原結(jié)合并非是必要的。因此，比上述典型的抗體片段小的構(gòu)型被認為是有效的。例如，駱駝抗體(Hamers-Casterman等，1993 ；Arbabi Ghahroudi 等，1997)含
23有除輕鏈外的廣泛的抗原結(jié)合所有需要的組成部分。同樣的，只含有VH結(jié)構(gòu)域的單域抗體(Ward等，1989 ；Davies和Riechmann, 1995)或只含有VL結(jié)構(gòu)域的單域抗體(van den Beucken等，2001)的結(jié)果表明，這些結(jié)構(gòu)域能以可接受的高親和力與抗原結(jié)合。因此，三個 ⑶Rs能夠有效地結(jié)合抗原。同樣所知的是，單CDR或者兩個CDRs，能夠有效地結(jié)合抗原。作為第一個例子，單 ⑶R能夠插入到異種蛋白中，使異種蛋白具有抗原結(jié)合的能力，可以通過將VH⑶R3區(qū)插入一種異種蛋白，如GFP中，使該異種蛋白具有抗原結(jié)合的能力(Kiss等，2006 ；Nicaise等， 2004)而作為例證。進一步為人所知的是，兩個CDRs能夠有效地結(jié)合抗原，甚至能夠表現(xiàn)出比母抗體更好的特性。例如，有文獻表明Oliu等，2007)，母抗體中的兩個⑶Rs (—個VH⑶Rl和一個VL⑶R3結(jié)構(gòu)域)保留了母分子的抗原識別特性，但具有更強的穿透腫瘤的能力。將這些 ⑶R結(jié)構(gòu)域用合適的連接子序列(如，來自VH FR2)連接，以與天然母抗體相似的方式定位所述CDRs，甚至可以帶來更好的抗原識別。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的是，通過適當?shù)墓羌軈^(qū)維持母抗體上的構(gòu)型，有可能構(gòu)造出包含兩個CDR結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選的，一個來自于VH結(jié)構(gòu)域，一個來自于VL結(jié)構(gòu)域，更加優(yōu)選的，這兩個CDR結(jié)構(gòu)域中有一個為CDR3結(jié)構(gòu)域)定位的抗原結(jié)合的抗體模擬物。因此，雖然本發(fā)明優(yōu)選的抗體可能包含6個⑶R區(qū)(三個來自于輕鏈，三個來自于重鏈)，但是含有少于6個⑶R區(qū)以及少至含有一個或兩個⑶R結(jié)構(gòu)域的抗體也同樣包括在本發(fā)明中。另外，含有只有重鏈或輕鏈的CDRs的抗體也同樣處于可預(yù)期之中。本發(fā)明中與EpCAM結(jié)合的優(yōu)選的抗體至少包括包含三個⑶Rs的重鏈可變區(qū)，并且至少包括包含三個⑶Rs的輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)包括(C)VH⑶R3，含有如SEQ ID NO :7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列；或者(a)可變重鏈(VH)⑶R1，含有如SEQ ID NO 5的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，(b)VH⑶R2，含有如SEQ ID NO :6的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列，以及(C)VH⑶R3，含有如SEQ ID NO 7的氨基酸序列或一個與其大體上同源的序列。本說明書中例示了6 種抗體克隆:3-17I、7-F17、12-C15、16-G5、17-C20 和 24-G6， 所有這些均可與EpCAM結(jié)合，所有這些具有相同的重鏈⑶R結(jié)構(gòu)域(a)，(b)和(C)。也已鑒定了 7種具有相同的重鏈CDR結(jié)構(gòu)域并與EpCAM結(jié)合的其他的抗體克隆。因此，這些重鏈CDR結(jié)構(gòu)域被認為對于結(jié)合EpCAM是重要的。由于抗體的CDR3結(jié)構(gòu)域在抗原特異性方面經(jīng)常非常重要，因此本發(fā)明特別優(yōu)選具有基于SEQ ID NO 7的VH⑶R3結(jié)構(gòu)域的抗體。用于與特定重鏈CDR結(jié)構(gòu)域結(jié)合的優(yōu)選的輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域在本說明書的其他地方描述，然而，其他包含用于與本發(fā)明的重鏈可變區(qū)結(jié)合的3個CDRs的輕鏈可變區(qū)也同樣處于可預(yù)期之中。可用于與本發(fā)明的重鏈可變區(qū)聯(lián)合的合適的輕鏈可變區(qū)，以及引起與EpCAM 結(jié)合的抗體的合適的輕鏈可變區(qū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易地進行鑒定。例如，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)能夠與單一輕鏈可變區(qū)，或者輕鏈可變區(qū)的所有成分， 以及與生成的用于結(jié)合EpCAM的抗體相結(jié)合。CN 102549017 A如果需要的話，類似的方法可用于鑒別與本發(fā)明優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)聯(lián)合使用的可選的重鏈可變區(qū)。在某些實施例中，抗體或抗體片段包含一個重鏈恒定區(qū)，如一個IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgAU IgA2、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)的全部或者一部分。優(yōu)選的，重鏈恒定區(qū)是一個 IgGl重鏈恒定區(qū)，或者是其一部分。此外，抗體或抗體片段能夠包含全部的或者一部分的 κ輕鏈恒定區(qū)或者λ輕鏈恒定區(qū)，或者其一部分。這種恒定區(qū)的全部或部分可以是天然產(chǎn)生的，或者可以是全部或部分合成的。對于這些恒定區(qū)的合適的序列在本領(lǐng)域中眾所周知并有記錄。當重鏈和輕鏈中恒定區(qū)的所有部分包括在本發(fā)明的抗體中，本說明書的這些抗體代表性地指代“全長”抗體或“全部”抗體。含有Fc區(qū)的抗體對于特定的用途，特別是體內(nèi)治療用途是優(yōu)選的，其中Fc區(qū)介導(dǎo)如ADCC和⑶C的效應(yīng)子功能。在本說明書中，術(shù)語“大體上同源”用于與一個氨基酸或核酸序列相連，該氨基酸或核酸序列含有與說明書中披露的氨基酸或核酸序列至少70%或75%，優(yōu)選的至少80%， 以及更加優(yōu)選的至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或者99%的序列一致性。本發(fā)明的大體上同源的序列因此包括與本發(fā)明的序列的單個或多個堿基或者氨基酸改變(添加，替換，插入或者缺失)。在氨基酸水平，在一個或多個骨架區(qū)中和/或一個或多個構(gòu)成本發(fā)明的序列的⑶Rs中，優(yōu)選的大體上同源的序列包含最多5個，如只有1、2、3、4或5個，優(yōu)選的，1、2或3個，更加優(yōu)選的1或2個改變的氨基酸。所述改變的可以為保守或者非保守氨基酸。優(yōu)選的，所述改變?yōu)楸Ｊ匕被岬奶鎿Q。在本發(fā)明的有些實施例中，某些殘基被規(guī)定為X，然后，在大體上同源的序列所指代處，大體上同源的序列的氨基酸替換可以在除X殘基外的其他殘基上，如在除X殘基外的1，2或3個殘基上，或者替換可以在X殘基處，如在 1，2，或3個X殘基處。大體上同源的核酸序列同樣包括與披露的核酸序列(或者它們的互補序列)雜交的核苷酸序列，如，在至少中等嚴格條件下，與編碼一個或多個本發(fā)明的輕鏈或重鏈CDRs， 本發(fā)明的輕鏈或重鏈可變區(qū)，或者本發(fā)明的抗體的核苷酸序列雜交(或者與它們的互補序列雜交)。術(shù)語“大體上同源”同樣包括以大體上相同的方法，執(zhí)行與本發(fā)明的蛋白或核酸分子大體上相同的功能的本發(fā)明的氨基酸和核苷酸序列的修飾物或化學(xué)等同物。例如，任何大體上同源的抗體(或編碼它的大體上同源的核酸)應(yīng)該保留如上面所述的結(jié)合EpCAM的能力。優(yōu)選的，任何大體上同源的抗體應(yīng)該保留抗體的功能性能力，如本說明書中其他地方所明確的，例如至少與人源和猴源EpCAM結(jié)合的能力。優(yōu)選的，任何大體上同源的抗體，應(yīng)該保留特異性結(jié)合到與所述的抗體能識別的EpCAM相同的表位的能力，例如，與本說明書中所描述的，被本發(fā)明的CDR結(jié)構(gòu)域所識別的或被本發(fā)明的VH和VL結(jié)構(gòu)域所識別的相同的表位。與相同的表位/抗原結(jié)合可以輕易地通過本領(lǐng)域已知的并已被描述過的方法進行檢測，如，采用結(jié)合分析法，如，競爭性分析法。保留其他功能特性也能夠輕易地通過本領(lǐng)域已知的并已被描述過的方法進行檢測。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，結(jié)合分析法能用于測試“大體上同源”的抗體是否與本發(fā)明的抗體和抗體片段具有相同的結(jié)合特異性，如，結(jié)合分析法如ELISA分析法或BIAcore分析法能夠很容易地明確這種“大體上同源”的抗體是否能夠與EpCAM結(jié)合。如下面所述，競爭性結(jié)合分析法可用于檢測“大體上同源”的抗體是否保留了特異性結(jié)合到與本發(fā)明的抗體所識別的EpCAM大體上相同的表位上的能力，或者是否具有與本發(fā)明的各種抗體中的一種或多種(如3-171)競爭的能力。下面所描述的方法僅僅是合適的競爭性分析法的一個例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道其他合適的方法和變形。一個示例性的競爭性分析法包括在受試抗體(如，大體上同源的抗體)處于不同濃度下，評估本發(fā)明的一種抗體在多種有效濃度下與EpCAM的結(jié)合能力。由受試抗體誘導(dǎo)的結(jié)合抑制量就可被測算出。受試抗體在逐漸增加的濃度下表現(xiàn)出與本發(fā)明的抗體增加的競爭性(如，受試抗體濃度增加導(dǎo)致本發(fā)明的抗體與EpCAM結(jié)合的量相應(yīng)減少)，則可作為結(jié)合到大體上相同的表位的證據(jù)。優(yōu)選的，受試抗體顯著地降低了本發(fā)明的抗體與EpCAM 結(jié)合的量。優(yōu)選的，受試抗體至少能夠?qū)⑴cEpCAM結(jié)合的本發(fā)明的抗體的量降低約95%。 ELISA和流式細胞分析法比較適合用于分析在這種競爭性試驗中的結(jié)合抑制情況，但是其他合適的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員也是熟知的。本發(fā)明的蛋白大體上同源的序列包括，但不僅限于，保守氨基酸的替換，或者比如不影響抗體的VH、VL或CDR結(jié)構(gòu)域的改變，如，包括使用了不同連接子序列的scFv抗體， 或者增加了不影響與抗原結(jié)合的標簽序列或其他組分的抗體，或者將一類或一種形式的抗體分子或片段轉(zhuǎn)換成另一種類型或形式的抗體分子或片段的改變(如，從Fab到scFv的轉(zhuǎn)換，或者反過來也一樣)，或者一個抗體分子向抗體分子的一個特定類型或亞型的轉(zhuǎn)換 (如，一種抗體分子向IgG或其亞型，如IgGl或者IgG3的轉(zhuǎn)換)。如本說明書中所使用的，“保守氨基酸的替換”，指的是用具有相似側(cè)鏈的另一個氨基酸殘基替換一個氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)被確定，包括堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸、精氨酸、組胺酸)，酸性側(cè)鏈(如，天冬氨酸、谷氨酸)，無電荷極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(如，酪氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、組胺酸)。同源性可以用任何方便的方法進行測定。然而，為了測定序列之間同源性的程度，用于計算序列匹配排列程度的計算機程序可以得到應(yīng)用，如Clustal W(Thompson等， 1994)。如果需要的話，Clustal W算法可以與BLOSUM 62得分矩陣(Henikoff和Henikoff， 1992)和10的空位開放罰分和0. 1的空位擴展罰分合并應(yīng)用，這樣可以獲得兩個序列之間最高的順序匹配度，其中，一個序列總長的至少50%會在校正時涉及到。其他可以用于定位序列的方法為Needleman和1Wunsch (1970)的定位法，并由Smith和Waterman (1981)進行了修正，從而可以獲得兩個序列間最高的順序匹配度，并且兩個序列之間的相同氨基酸的數(shù)量也可得到測定。其他用于計算兩個氨基酸序列之間一致性百分率的方法一般為本領(lǐng)域所公認，包括，例如，由Carillo和Lipton(1988)所描述的方法和由Computational Molecular Biology, Lesk,e. d. Oxford University Press,New York,1988,Biocomputing Informatics and Genomics Projects 所描述的方法。一般地，計算機程序會被用于進行這些計算。用于比較和排列序列對的程序，如 ALIGN (Myers 和 Miller，1988)、FASTA (Pearson 禾口 Lipman，1988 ；Pearson, 1990)禾口空位的 BLAST (Altschul 等，1997)，BLASTP, BLASTN 或者 GCG (Devereux 等，1984)也可用于這個目的。此外，歐洲生物信息學(xué)研究中心的Dali服務(wù)器提供基于結(jié)構(gòu)的蛋白序列排列服務(wù) (Holm, 1993 ；1995 ； 1998)。通過提供一個參考點，按照本發(fā)明的序列含有70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 96^^97^^98%或者99%的同源性，序列一致性等可采用默認參數(shù)的ALIGN程序進行測定 (例如在法國蒙彼利埃IGH的GENESTREAM網(wǎng)絡(luò)服務(wù)商網(wǎng)上有提供)?！白钌僦械葒栏耠s交條件”意味著，需要選定條件以促進溶液中兩個互補的核酸分子之間的選擇性雜交。對于全部或者部分核酸序列分子均有可能發(fā)生雜交。雜交的部分典型為最少15(如，20、25、30、40或50)個核苷酸長度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該清楚，核酸雙螺旋或雜交體的穩(wěn)定性，由Tm決定，在含有鈉的緩沖液中，Tm值與鈉離子濃度和溫度有關(guān)(Tm =81. 5°C -16. 6 (LoglO [Na+]) +0. 41 (% (G+C) -600/1)，或者類似的等式)。相應(yīng)地，洗滌條件下決定雜交體穩(wěn)定性的參數(shù)為鈉離子濃度和溫度。為了識別與已知核酸分子相似但不相同的分子，的錯配率可認為能夠帶來Tm 1°C的降低。例如，如果核酸分子被認為具有> 95%的一致性，最終洗滌溫度會下降約5°C?；谶@些考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地選擇合適的雜交條件。在優(yōu)選實施例中，選擇嚴格的雜交條件。通過示例的方法，下面的條件可用來實現(xiàn)精確的雜交在5 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5 X Denhardt溶液/1.0% SDS， 根據(jù)上述公式算得Tm為-5°C時進行雜交，然后在60°C下用0. 2 X SSC/0. 1 % SDS進行洗滌。 適當嚴格的雜交條件包括在42°C下用3XSSC進行洗滌的步驟。通過進一步示例，“雜交” 的序列為在非嚴格條件下(如，6XSSC，50%甲酰胺，室溫下)結(jié)合，在低嚴格條件下洗滌 (如，2父55(，室溫下，更加優(yōu)選的為2\55(，42°0或者在更高嚴格的條件下(如，2XSSC， 650C )(其中 SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M 檸檬酸鈉，pH 7.2)的序列。然而，需要理解的是，也可通過使用可替換的緩沖液、鹽及溫度來達到相等的嚴格性。關(guān)于雜交條件的其他指示可以參見Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N. Y. , 1989,6. 3. 1-6. 3. 6及Sambrook等，Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3。一般來說，優(yōu)選采用在高嚴格性條件下雜交的序列，因為除了簡并密碼以外，其他序列都會在高嚴格性條件下雜交。在其他優(yōu)選實施例中，與原抗-EpCAM抗體，如3_17I、7_F17、12-C15、16-G5、 17-C20或者M-G6相比，提供了具有增強的或更出色的性能的二代抗體。例如，二代抗體可能具有不同的結(jié)合親和力或者良好的動力學(xué)常數(shù)(如結(jié)合率和/或解離率)、良好的交叉反應(yīng)性譜、與腫瘤細胞良好的靶向能力，如誘導(dǎo)ADCC或CDC的改進的能力，或?qū)w內(nèi)腫瘤改進的治療效果，或更高的生產(chǎn)水平。鑒別有效的二代抗體的比較很容易進行和量化，如，使用一種或多種本說明書所詳細描述的或在本領(lǐng)域中的各種測定方法。在二代抗體中，那些具有增強的生物學(xué)性質(zhì)，或者與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體相比，其活性至少為約2倍、5倍、10倍、20倍，優(yōu)選的，至少為約50倍的二代抗體，正如3-171抗體(或者7-F17、12-C15、16-G5、17-C20或24-G6抗體) 所示例的，也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明中的抗體、結(jié)合蛋白和核酸分子一般為“分離的”或“純化的”分子，因為它們與原位存在于人類或動物機體或源自人類或動物機體的組織樣品的任何這類成分都不同。然而，這些序列可以與在人類或動物機體上發(fā)現(xiàn)的序列相對應(yīng)或大體上同源。因此，對于本說明書中所使用的關(guān)于核酸分子或序列和蛋白或多肽，如，抗體，術(shù)語“分離”或“純化”指的是從它們的天然環(huán)境中分離，或純化得到，或大體上擺脫了它們的天然環(huán)境的這類分子，如，從人類或動物機體中分離或純化而得(如果確實能自然發(fā)生的話)，或者指的是通過一個技術(shù)過程制備的這類分子，也就是，包括重組和合成而制備的分子。因此，當用于核酸分子上時，這些術(shù)語可以指代大體上不含有與其天然地聯(lián)系在一起的物質(zhì)的核酸，這類物質(zhì)如其他核酸/基因或多肽。這些術(shù)語也可指代一類核酸分子， 該類核酸分子大體上不含有與通過重組DNA技術(shù)制備時的細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或大體上不含有通過化學(xué)合成時的化學(xué)前驅(qū)物，或其他化學(xué)物質(zhì)。分離或純化的核酸也可大體上不含有與核酸所起源于的核酸的天然側(cè)部序列(也就是，位于核酸5'和3'端的序列)，或者不含有通過，例如，基因工程的方法制作而成核酸側(cè)部的序列(如，標簽序列或其他沒有治療作用的序列)。因此，當用于本發(fā)明的蛋白或多肽分子，如輕鏈⑶Rs 1、2和3，重鏈⑶Rs 1、2和 3，輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)和結(jié)合蛋白或者抗體上，包括全長抗體上時，術(shù)語“分離”或“純化”代表性地指代的是大體上不含與細胞物質(zhì)或其他從中衍生出來的蛋白的蛋白。在有些實施例中，特別是在對人類或動物施用蛋白的實施例中，這些分離或純化的蛋白大體上不含用重組技術(shù)制備時的培養(yǎng)基，或者用化學(xué)合成時的化學(xué)前驅(qū)物或其他化學(xué)物質(zhì)。這些分離或純化的蛋白也可與如上面所述的分離的核酸分子的側(cè)部序列無關(guān)。本說明書中使用的術(shù)語“核酸序列”或“核酸分子”指的是由天然存在堿基，糖和糖間(骨架)連接組成的核苷或核苷單體的序列。該術(shù)語同樣包括包含非天然存在單體或其一部分的修飾的或替換的序列。本發(fā)明的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列(DNA)或者核糖核酸序列(RNA)，還可包括含腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的天然存在堿基。所述序列也可包含修飾的堿基。這種修飾堿基的例子包括氮和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黃嘌呤和次黃嘌呤。核酸分子可以是雙鏈或單鏈。核酸分子可以是完全或部分合成或重組的。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的抗體為人源抗體，更優(yōu)選為完全人源的抗體。在這一點上，人源抗體在用于人類治療時，總體上最少具有三個潛在優(yōu)勢。首先，人類免疫系統(tǒng)不會將抗體識別為異物。第二，在人類循環(huán)中的半衰期會與天然存在的人類抗體相似，使得可以使用更小的劑量，施用的次數(shù)不那么頻繁。第三，由于效應(yīng)部分為人源，它會與人類免疫系統(tǒng)的其他部分有更好的相互作用，比如，通過補體依賴的細胞毒效應(yīng)(CDC)或抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)(ADCC)而更有效地摧毀靶細胞。然而，雖然人源抗體一般被認為會表現(xiàn)出這些優(yōu)勢，但是眾所周知的是，開發(fā)具有足夠高親和力和適當?shù)墓δ芴匦缘娜嗽纯贵w，使其能夠用于成功的人類治療中，這絕不是簡單的事情。本領(lǐng)域因此仍然缺乏可安全有效地治療人類的抗-EpCAM，開發(fā)這種試劑也是一種挑戰(zhàn)。本說明書中使用的術(shù)語“人源”與抗體分子和結(jié)合蛋白有關(guān)，首先指代的是一類抗體和結(jié)合蛋白，該類抗體和結(jié)合蛋白具有可變區(qū)(如，VH、\、CDR或FR區(qū))以及，可選的，恒定抗體區(qū)，分離于或來源于人體組成部分中或者來源于人體中，如，在人類生殖細胞或體細胞中發(fā)現(xiàn)的序列或與之相對應(yīng)。3-171抗體(以及7-F17，12-C15，16-G5，17-C20或24-G6 抗體)是這種人源抗體分子的一個例子，其中可變區(qū)區(qū)已經(jīng)從人源譜系中分離出來。
本發(fā)明的“人源”抗體和結(jié)合蛋白進一步包括不由人源序列編碼的氨基酸殘基， 如，隨機引入的突變或體外的位置定向突變，例如由體外克隆或PCR而引入的突變。這種突變的特別示例為涉及保守替換的突變，或抗體或結(jié)合蛋白較小數(shù)目殘基的其他突變，如，最多5個，如在抗體或結(jié)合蛋白中的5、4、3、2或1個殘基，優(yōu)選的如，直到5個，如組成抗體或結(jié)合蛋白的一個或多個⑶Rs的殘基中的5、4、3、2或1個。某些這種“人源”抗體的示例包括已經(jīng)采用標準修飾技術(shù)，以減少潛在的能產(chǎn)生免疫性的位點的總量的一些抗體和可變區(qū)。因此，本發(fā)明的“人源”抗體包括來源于人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的序列并與之有關(guān)的序列，但可能不會天然存在于體內(nèi)的人源抗體生殖細胞組成部分內(nèi)。此外，本發(fā)明的人源抗體和結(jié)合蛋白包括含有自人源序列中鑒定的人源共有序列，或與人源序列大體上同源的序列。此外，本發(fā)明的人源抗體和結(jié)合蛋白并不限于VH、\、⑶R或FR區(qū)構(gòu)成的組合，Vh, VpCDR或FR區(qū)本身即發(fā)現(xiàn)于人源抗體分子中的組合。因此，本發(fā)明的人源抗體和結(jié)合蛋白能夠包括這些不必要天然存在于人體中的區(qū)的組合，或者能與之相對應(yīng)。在優(yōu)選實施例中，人源抗體為完全人源的抗體。如本說明書所使用的“完全人源” 的抗體，是指包含如上面所述的“人源”可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDRs的抗體，沒有大體上非人源抗體序列或沒有任何非人源的抗體序列。例如，包含人源可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDRs “沒有大體上非人源抗體序列”的抗體指的是抗體、結(jié)構(gòu)域和/或CDRs，其中最多5個，如只有約5、4、3、2或1個氨基酸為不是由人源抗體序列編碼的氨基酸。因此，“完全人源”的抗體不同于“人源化”的抗體，“人源化”的抗體基于的是大體上非人源的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，如，小鼠可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，其中有些氨基酸被加以改變，以更好地與在人源抗體上典型存在的氨基酸相對應(yīng)。本發(fā)明中“完全人源”的抗體可以是人源可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDRs，沒有任何其他大體上的抗體序列，如單鏈抗體。可選的，本發(fā)明的“完全人源”的抗體可以是整合在或有效附著于一個或多個人源抗體恒定區(qū)上的人源可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDRs。一些優(yōu)選的完全人源的抗體為具有IgG恒定區(qū)的所有部分的IgG抗體。在其他實施例中，本發(fā)明的“人源”抗體可以是部分人源的嵌合抗體。本說明書中所使用的“部分人源的嵌合”抗體，指的是一類抗體，包含有效附著在，或移植到全部或部分非人類物種，如大鼠或小鼠的恒定區(qū)上的“人源”可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和/或CDRs。這種部分人源的嵌合抗體可用于，比如，臨床前研究中，其中優(yōu)選使用與在臨床前測試中使用的動物相同物種的恒定區(qū)。這些部分人源的嵌合抗體也可用于，比如說，在體(ex vivo)診斷中，其中非人源物種的恒定區(qū)可以提供抗體檢測方面另外的選擇。本說明書中使用的術(shù)語“片段”指的是生物學(xué)相關(guān)的片段，比如，幫助抗原結(jié)合的片段，比如，構(gòu)成抗原結(jié)合位點的一部分，和/或幫助抑制或減少EpCAM抗原的作用。有些優(yōu)選的片段包括本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)(Vh結(jié)構(gòu)域)和/或輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域)。其他優(yōu)選的片段包括一個或多個本發(fā)明抗體的重鏈CDRs (或一個或多個本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域)， 或一個或多個本發(fā)明抗體的輕鏈CDRs (或一個或多個本發(fā)明的\結(jié)構(gòu)域)。有些優(yōu)選的片段至少有5個氨基酸的長度，最少包括一個CDR區(qū)，優(yōu)選為CDR3區(qū)，更加優(yōu)選為重鏈CDR3 區(qū)。在有些實施例中，本發(fā)明的抗體包括一個任意所限定序列的片段(比如包含如SEQ ID NOs :21、36、49、62、75或者88的片段)，如，含有本發(fā)明的V1^P/或Vl結(jié)構(gòu)域的抗體，或含有本發(fā)明的一個或多個CDRs的抗體或結(jié)合蛋白，然后這些區(qū)/結(jié)構(gòu)域一般在抗體或結(jié)合蛋白內(nèi)分離，這樣每個區(qū)/結(jié)構(gòu)域便可發(fā)揮它的生物學(xué)功能，如此促進抗原結(jié)合的能力便得以保留。因此，Vh和\結(jié)構(gòu)域優(yōu)選通過合適的支架序列/連接子序列而被分開， CDRs優(yōu)選通過合適的骨架區(qū)，如在天然存在的抗體和/或有效的工程抗體中發(fā)現(xiàn)的骨架區(qū)而被分開。因此，本發(fā)明的VH、Vl和單個CDR的序列優(yōu)選通過合適的骨架或支架提供，或合并在其中，以使抗原結(jié)合。這些骨架序列或區(qū)可對應(yīng)于天然存在的骨架區(qū)，F(xiàn)R1、FR2、FR3和 /或FR4，以形成相應(yīng)的合適的支架，或者可對應(yīng)于一致的骨架區(qū)，例如可通過比較各種天然存在的骨架區(qū)而進行鑒定?；蛘?，非抗體支架或骨架，如T細胞受體骨架也可被應(yīng)用。能夠用于骨架區(qū)的合適的序列在本領(lǐng)域中已為人所熟知并有記錄，這些中的任一種均可應(yīng)用。用于骨架區(qū)的優(yōu)選的序列為組成本發(fā)明的Vh和/或\結(jié)構(gòu)域的一個或多個 (如一個、兩個、三個或四個)骨架區(qū)，即，一個或多個在SEQ ID NOs :21、36、49、62、75或者 88中所披露的骨架區(qū)，或者在表1-6中披露的骨架區(qū)，或者與其大體上同源的骨架區(qū)，特別是能夠維持抗原特異性的骨架區(qū)，例如能產(chǎn)生與抗體大體上相同或相同的3D結(jié)構(gòu)的骨架區(qū)。在有些優(yōu)選實施例中，所有的4個可變輕鏈(SEQ ID NOs :15、16、17和18)和/或可變重鏈(SEQ ID NOs 11、12、13和14)，如果適當?shù)脑?，含如SEQ ID NO :21的FR區(qū)(同樣見表1)，或大體上與之同源的FR區(qū)，包括在本發(fā)明的抗體中。其他優(yōu)選的可變輕鏈骨架區(qū)的組合也在表2-6中示出。此外，雖然本發(fā)明的優(yōu)選抗體由本發(fā)明的VH、Vl或者CDRs構(gòu)成，但應(yīng)該注意的是， 本發(fā)明的抗體同樣包含本發(fā)明的VH、Vl或者CDRs的一個或多個與不屬于本發(fā)明的其他VH、 Vl或者CDRs的聯(lián)合，只要在說明書中列出的本發(fā)明的抗體的EpCAM結(jié)合特性或抗-EpCAM 特性依然存在即可。本說明書中使用的術(shù)語“重鏈互補決定區(qū)”(“重鏈⑶R”)指的是抗體分子中重鏈可變區(qū)(Vh結(jié)構(gòu)域)內(nèi)的超變量區(qū)。重鏈可變區(qū)有三個CDRs，從氨基末端到羧基末端分別稱為重鏈CDR1，重鏈CDR2和重鏈CDR3。重鏈可變區(qū)同樣具有四個骨架區(qū)(從氨基末端到羧基末端分別為FR1、FR2、FR3和FR4)。這些骨架區(qū)將⑶Rs分開。本說明書中使用的術(shù)語“重鏈可變區(qū)”(Vh結(jié)構(gòu)域)指的是抗體分子重鏈的可變區(qū)。本說明書中使用的術(shù)語“輕鏈互補決定區(qū)”(“輕鏈CDR”)指的是抗體分子中輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域)內(nèi)的超變量區(qū)。輕鏈可變區(qū)有三個CDRs，從氨基終點到羧基終點分別稱為輕鏈CDR1，輕鏈CDR2和輕鏈CDR3。輕鏈可變區(qū)同樣具有四個骨架區(qū)(從氨基終點到羧基終點分別為FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4)。這些骨架區(qū)將⑶Rs分開。本說明書中使用的術(shù)語“輕鏈可變區(qū)”結(jié)構(gòu)域)指的是抗體分子輕鏈的可變區(qū)。應(yīng)該注意的是，本說明書在必要的地方，為了明確⑶Rs的定位，遵照了 Kabat命名法(Kabat等，1991，被本說明書特別用于作為參考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，本發(fā)明的蛋白和多肽，例如輕鏈和重鏈CDRs、輕鏈和重鏈可變區(qū)、抗體、抗體片段以及免疫偶聯(lián)物，可以用本領(lǐng)域中熟知并被描述過的幾種方法中的任一種進行制備，但是最優(yōu)選采用重組的方法進行制備。編碼本發(fā)明抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸片段可以通過任何合適的方法，比如，通過克隆或合成的方法得到或制備。這種序列可以，比如說，采用在本領(lǐng)域中熟知并被
30描述過的方法，通過從，比如，人源生殖細胞系的基因中克隆合適的序列，然后對生殖細胞系的序列進行任何必要地修飾，以獲得本發(fā)明的序列而制得。另外一種更有效的方法為將合適的輕鏈或重鏈可變區(qū)序列合成為重疊引物，并使用引物延伸法獲得全序列。這種全序列然后可由PCR法進行擴增，其引物含有合適的限定位點，以進一步克隆和處理，比如，將其克隆到合適的表達載體中。每個可變區(qū)含有5-7個重疊引物通常就已足夠，從而使這種技術(shù)非常高效和精確。當編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸片段已經(jīng)得到之后，這些片段可通過標準重組DNA技術(shù)進一步處理，例如將可變區(qū)片段轉(zhuǎn)變成含有合適的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的全長抗體分子，或轉(zhuǎn)變成本說明書其他地方提及的抗體片段的特殊類型，如，F(xiàn)ab片段，scFv 片段，等等。典型的，或作為這種進一步處理程序的一部分，編碼本發(fā)明的抗體分子的核酸片段一般會被并入一個合適的表達載體，以利于本發(fā)明的抗體的生產(chǎn)?？赡艿谋磉_載體包括但不僅限于粘粒、質(zhì)粒或修飾病毒(如，復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，前提是載體能與使用的宿主細胞共存。表達載體“適合于宿主細胞的轉(zhuǎn)化”，意味著表達載體包含本發(fā)明的核酸分子和基于表達所使用的宿主細胞而選擇的調(diào)控序列，該調(diào)控序列有效地連接到核酸分子上。有效地連接意味著核酸分子與調(diào)控序列連接的方式使得核酸能夠表達。本發(fā)明因此還包括一個含有本發(fā)明的核酸分子的重組表達載體，或其片段，以及用于轉(zhuǎn)錄和翻譯本發(fā)明的核酸分子所編碼的蛋白序列的必要的調(diào)控序列。合適的調(diào)控序列可以起源于多種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物或者昆蟲的基因(例如，參見在Goeddel，1990中所描述的調(diào)控序列)。合適的調(diào)控序列的選擇取決于如下面所提及的選擇的宿主細胞，并可輕易地通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)中的一種而實現(xiàn)。 這種調(diào)控序列的示例包括轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結(jié)合序列，一種核醣體結(jié)合序列，包括翻譯起始信號。另外，取決于選擇的宿主細胞和應(yīng)用的載體，其他序列，如復(fù)制起點、附加的DNA限定位點、增強子，以及具有轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)性的序列，都可以包含在表達載體內(nèi)。本發(fā)明的重組表達載體也可包含一個選擇性標記基因，所述選擇性標記基因利于轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染了本發(fā)明的重組分子的宿主細胞的選擇。選擇性標記基因的示例為編碼如新霉素和潮霉素這些對某些藥物表現(xiàn)出抗性的蛋白的基因，編碼半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲螢光素酶或者免疫球蛋白或其一部分，如優(yōu)選為IgG的免疫球蛋白的Fc 部分的基因。選擇性標記基因的轉(zhuǎn)錄通過選擇性標記蛋白的濃度變化進行監(jiān)控，這些選擇性標記蛋白可以為半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或者螢火蟲螢光素酶。如果這種選擇性標記基因編碼具有抗生素抗性，如新霉素抗性的蛋白，那么轉(zhuǎn)化株細胞可以用G418進行篩選。含有選擇性標記基因的細胞能夠存活下來，而其他細胞則會死掉。這使得能夠?qū)Ρ景l(fā)明的重組表達載體的表達情況進行描繪和測定，特別是能夠測定在表達和表現(xiàn)型中一個突變所帶來的影響。應(yīng)該領(lǐng)會的是，選擇性標記物可被引入與目標核酸分開的載體上。重組表達載體也可包含編碼融合部分的基因，其中融合部分可以使重組蛋白表達增加；使重組蛋白溶解性增加；通過在親和純化中作為配基，從而幫助靶重組蛋白純化(例如可存在能夠純化和/或鑒別合適的“標簽”，如，His標簽或myc標簽)。例如，可以在靶重組蛋白中加入蛋白水解位點，使得重組蛋白可以從融合部分中分離下來，然后對融合蛋白進行純化。典型的融合表達載體包括pGEX (Amrad Corp.，Melbourne，澳大利亞)，pMal (NewEngland Biolabs, Beverly, ΜΑ)和 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)，其分別與谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或者蛋白質(zhì)A融合進入重組蛋白中。重組表達載體可被引入到宿主細胞中，生成轉(zhuǎn)化的宿主細胞。術(shù)語“由...轉(zhuǎn)化”， “由...轉(zhuǎn)染”，“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”其意思是包括了通過本領(lǐng)域中已知的多種可能的技術(shù)中的一種，將核酸(比如，載體)引入到細胞中的過程。本說明書中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的宿主細胞”也指的是包括了已經(jīng)用本發(fā)明的重組表達載體轉(zhuǎn)化的能夠糖基化的細胞。原核細胞能通過，例如，電穿孔或氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而由核酸進行轉(zhuǎn)化。例如，核酸可以通過常規(guī)技術(shù)如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，電穿孔或顯微注射等方法被引入到哺乳動物細胞中。對于宿主細胞進行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適的方法可以在Sambrook 等，1989，以及其他實驗教科書找到。合適的宿主細胞包括很多種真核宿主細胞和原核細胞。例如，本發(fā)明的蛋白可以在酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。其他合適的宿主細胞可以參見GOeddel，1990。此外， 本發(fā)明的蛋白可以在原核細胞，如大腸桿菌(aiang等，2004)中表達。適合于開展本發(fā)明的酵母和真菌宿主細胞包括，但不限于釀酒酵母、畢赤酵母屬或克魯維酵母菌屬和多種曲霉屬的物種。在釀酒酵母中表達載體的示例包括 pYepSecl (Baldari.等，1987)、pMFa (Kurjan 和 Herskowitz，1982)、pJRY88 (Schultz 等， 1987)以及 pYES2anvitrogen Corporation, San Diego, CA) 酵母和真菌的轉(zhuǎn)化方案已經(jīng)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知(參見Hinnen等，1978 ；Ito等，1983，以及Cullen等1987)。適合于開展本發(fā)明的哺乳動物細胞包括，除其他外COS(如，ATCC No. CRL 1650 或 1651)、BHK(如，ATCC No. CRL 6281) ,CHO(ATCC No. CCL 61)、HeLa(如，ATCC No. CCL2)、 293 (ATCC No. 1573) ,NS-I 細胞、NS0(ATCC CRL-11177)、HEK493 (人源腎細胞，ATCCnumber CRL-11268)以及 Per. C6 (Crucel 1，Leiden，Netherlands)。用于引導(dǎo)哺乳動物細胞表達的合適的表達載體一般包括一個啟動子(如，來源于病毒物質(zhì)，如多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40)，以及其他的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達載體的示例包括 pCDM8 (Seed, B.，1987)和 pMT2PC (Kaufman 等，1987)。考慮到本說明書所提供的知識，啟動子、終止子，以及將合適類型的表達載體轉(zhuǎn)運進入植物、鳥類和昆蟲細胞中的方法也都能夠很容易地實現(xiàn)。例如，在一個實施例中，本發(fā)明的蛋白可以在植物細胞中表達(參見Sinkar等，1987，這篇文章對毛根農(nóng)桿菌載體的使用進行了綜述；也可參見Zambryski等，1984，這篇文章對于植物細胞中的表達載體的使用進行了描述，其中包括，PAPS2022、PAPS2023 和 PAPS20;34 等)。適合于開展本發(fā)明的昆蟲細胞包括家蠶屬(Bombyx)、Trichoplusia或者 Spodotera等物種的細胞和細胞系?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(SF 9細胞)中表達蛋白的桿狀病毒載體包括PAc系列(Smith等，1983)以及pVL系列(Luckow和Summers 1989)。有些適合于表達本發(fā)明的重組蛋白的桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)已經(jīng)在PCT/US/0M42中進行了描述。或者，本發(fā)明的蛋白也可在非人源的轉(zhuǎn)基因動物如大鼠、兔、綿羊和豬中表達 (Hammer 等，1985 ；Palmiter 等，1983 ；Brinster 等，1985 ；Palmiter 和 Brinster 1985 以及 U. S. Patent No. 4，736，866)。本發(fā)明的蛋白也可采用蛋白化學(xué)領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如固態(tài)合成(Merrifield (1964) ；Frische 等，1996)或均相溶液合成(Houbenweyl，1987)，通過化學(xué)合成的方法進行制備。含有與其他分子，如蛋白偶聯(lián)的本發(fā)明的抗體和蛋白的N-末端或者C-末端融合蛋白，可通過重組技術(shù)融合制備。生成的融合蛋白包含與本說明書中描述的選擇的蛋白或標識物蛋白，或標簽蛋白融合的本發(fā)明的抗體或蛋白。本發(fā)明的抗體和蛋白也可通過已知技術(shù)與其他蛋白偶聯(lián)。例如，蛋白可以采用如WO 90/10457中所描述的N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代-丙酸酯)或N-琥珀酰亞胺-5硫代乙酸酯等異雙功能含硫醇的連接子進行偶聯(lián)?？捎糜谥苽淙诤系鞍谆蚺悸?lián)物的蛋白示例包括細胞結(jié)合蛋白，如免疫球蛋白、激素、生長因子、凝集素、胰島素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、內(nèi)啡肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鈴蟾肽、脫唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、血細胞凝聚素(HA)以及截短型myc。如果不考慮制備第一個抗-EpCAM抗體核酸片段的方式的話，更合適的抗體核酸片段可以很容易地通過標準分子生物學(xué)技術(shù)制備得到。為了證實任何變異體、突變體或二代抗-EpCAM抗體核酸片段是否適合于用在本發(fā)明中，需要對核酸片段進行測定，以證實根據(jù)本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的表達。優(yōu)選的，變異體、突變體或二代核酸片段也需要進行測定，以驗證標準條件下的雜交水平，更加優(yōu)選的，標準嚴格的雜交條件下的雜交水平?？煞滦У暮线m的雜交條件包括在約50°C下，7%十二烷基硫酸鈉(SDS)，約0. 5M NaPO4，約ImM EDTA進行雜交；并在42°C下用SDS進行洗滌。由于多種抗體可以很容易地制備，本發(fā)明的治療方法可按如下進行向動物或患者提供至少第一個核酸片段或分子，這些核酸片段或分子可在患者體內(nèi)表達出至少是本發(fā)明的第一個抗-EpCAM抗體的治療有效量?！氨磉_抗-EpCAM抗體的核酸片段或分子”其形式一般至少為一個表達構(gòu)建體或載體，其形式也可以為包含在病毒或重組宿主細胞內(nèi)的表達構(gòu)建體或載體。本發(fā)明優(yōu)選的基因治療載體一般為病毒載體，例如包含在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、 單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、巨細胞病毒(CMV)等。另一方面提供了一種包括一個或多個本發(fā)明的核酸片段或分子的表達構(gòu)建體或表達載體。表達構(gòu)建體或載體優(yōu)選為重組體。所述構(gòu)建體或載體優(yōu)選進一步包括用于由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯中必要的調(diào)控序列。另一方面提供了一種包括一個或多個本發(fā)明的表達構(gòu)建體或表達載體的宿主細胞或病毒。同樣提供的還有含有一個或多個本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞或病毒。表達本發(fā)明的抗體的宿主細胞或者病毒形成了另一方面。本發(fā)明的另一方面提供了生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的一種方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞的步驟。優(yōu)選的方法包括以下步驟(i)在適合表達這些編碼的抗體或蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)宿主細胞，該宿主細胞含有一個或多個重組表達載體，或含有一個或多個本發(fā)明的核酸序列；以及有選擇的(ii)從宿主細胞中或從生長培養(yǎng)基/上清中分離或獲得抗體或蛋白。這類制備方法也可能包含對抗體或蛋白產(chǎn)品進行純化的步驟和/或?qū)⒖贵w或產(chǎn)品制作成包括至少一個附加的成分，如在藥學(xué)可接受載體或賦形劑的組成物。在有些實施例中，本發(fā)明的抗體或蛋白由多于一個的多肽鏈組成(比如，某些片段，如Fab片段)，然后所有的多肽優(yōu)選在宿主細胞中表達，可以在相同的也可以在不同的表達載體上，這樣完整的蛋白，如，本發(fā)明的結(jié)合蛋白，便能夠在宿主細胞中組裝并可從中分離或純化。
本發(fā)明的抗體也可用于生產(chǎn)與EpCAM結(jié)合的另外的抗體。這些用途包括比如說在一個母抗體的氨基酸序列中添加、缺失、替換或插入一個或多個氨基酸，以形成一個新的抗體，其中所述母抗體屬于說明書其他部分所限定的本發(fā)明的抗體中的一種，并測定生成的新抗體，以識別出能夠與EpCAM結(jié)合的抗體。這些方法可用于形成多樣化的新抗體，所有這些都能測試它們與EpCAM結(jié)合的能力。優(yōu)選的，所述添加、缺失、替換或插入一個或多個氨基酸發(fā)生在一個或多個CDR結(jié)構(gòu)域中。這種對母抗體的修飾或突變可以使用本領(lǐng)域中熟知并被記錄的技術(shù)以任何合適的方式進行，例如采用隨機或定向突變的方法進行。如果采用的是定向突變，那么識別適于發(fā)生突變的殘基的策略則利用結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物，如，Ab-Ag復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的分辨率，以識別出抗原結(jié)合方面的關(guān)鍵殘基(Davies和Cohen，1996)。隨后，對那些殘基可以進行突變，以提高相互作用。還有一種選擇，一個或多個氨基酸殘基可以簡單的被指定為進行定向突變，然后評估對于與EpCAM結(jié)合的影響。隨機突變在任何合適的方式，如，易錯PCR、鏈更替或增變基因大腸桿菌株中進行。因此，一種或多種本發(fā)明的Vh結(jié)構(gòu)域可以與單個\結(jié)構(gòu)域或者任何合適來源的\ 結(jié)構(gòu)域所有組成成分結(jié)合，生成的新抗體進行測試，以識別對EpCAM有特異性的抗體。相反地，一種或多種本發(fā)明的\結(jié)構(gòu)域可以與單個Vh結(jié)構(gòu)域或者任何合適來源的Vh結(jié)構(gòu)域所有組成成分結(jié)合，生成的新抗體進行測試，以識別結(jié)合EpCAM的抗體。類似地，一種或多種，或者優(yōu)選的所有三個本發(fā)明的Vh和/或\結(jié)構(gòu)域的CDRs， 可以被插入單個Vh和/或\結(jié)構(gòu)域或所有合適的Vh和/或\結(jié)構(gòu)域中，生成的新抗體進行測試，以識別能與EpCAM結(jié)合的抗體。⑶Rs，特別是輕鏈和/或重鏈的⑶R3的靶向突變，已經(jīng)表現(xiàn)為是一種提高抗體親和力的有效的技術(shù)，也是優(yōu)選的。優(yōu)選的，對CDR3或者稱為“熱點”的特殊區(qū)中的3-4個氨
基酸塊可進行靶向突變?！盁狳c”指的是在體內(nèi)發(fā)生體細胞高突變的序列(及其下面Neuberger和 MilStein，19%)。熱點序列可以被規(guī)定為在某些密碼子中共有的核苷序列。共有序列指四核苷酸，RGYW，其中R可以為A或G，Y可以為C或T，W可以為A或T(Neuberger和Milstein， 1995)。此外，由核苷酸AGY編碼的絲氨酸殘基，相對于那些由對應(yīng)于一個潛在的熱點序列的TCN所編碼的絲氨酸殘基，主要出現(xiàn)在可變結(jié)構(gòu)域的CDRs區(qū)中。因此，本發(fā)明的每個抗體的重鏈和輕鏈的CDRs的核苷酸序列可進行掃描，以檢測熱點序列和AGY密碼子的存在。輕鏈和重鏈CDR區(qū)中所識別的熱點便可任選地，使用 International ImMunoGen Tics數(shù)據(jù)庫(IMGT, http //imgt. cines. fr/textes/vquest/), 與重鏈和輕鏈的生發(fā)序列進行比對(Davies等，1990)。如果一個序列與生殖細胞系的相同，則意味著沒有發(fā)生體細胞突變；因此可引入隨機突變，模擬體內(nèi)發(fā)生的體細胞事件，或者也可以，如，在熱點和/或AGY密碼子處采用位置定向突變。與之相對，不同的序列表明已經(jīng)發(fā)生了一些體細胞突變。如果在體內(nèi)體細胞突變是最佳的，則其仍有待決定。優(yōu)選的突變熱點指的是那些編碼暴露的氨基酸的熱點，優(yōu)選指的是編碼構(gòu)成抗原結(jié)合位點部分的氨基酸的熱點。其他優(yōu)選的突變熱點為編碼非保守氨基酸的部分。編碼 CDRs內(nèi)埋藏或保守氨基酸的熱點優(yōu)選不發(fā)生突變。這些殘基一般對于總體結(jié)構(gòu)很關(guān)鍵，由于它們被埋藏在內(nèi)，不太可能與抗原發(fā)生相互作用。
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對于氨基酸和蛋白結(jié)構(gòu)域執(zhí)行上面所描述的處理的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，所述處理可以很便利地通過基因工程的方法在核酸水平開展，其中對編碼合適的結(jié)合蛋白及其結(jié)構(gòu)域的核酸分子進行修飾，使得生成的表達蛋白其氨基酸序列進而能夠以合適的方式得到修飾。由這些方法制造的新抗體優(yōu)選具有改進的功能特性，如比母抗體相比具有更高的或增強的與EpCAM的親和力(至少具有相等的親和力)，并且可以按照與本說明書其他地方描述的本發(fā)明的抗體相同的方式進行處理和應(yīng)用(如，用于治療、診斷、在組合物中等)。 可選地，或者另外，新抗體具有一個或多個如本說明書其他地方描述的改進的功能特性。由這些方法生產(chǎn)，獲得或能夠獲得的新抗體構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面?？梢酝ㄟ^任何合適的方法去測定一個或多個抗體與EpCAM結(jié)合的能力，這些都是本領(lǐng)域已知并被描述過的方法。EpCAM樣品，例如從各種物種中獲得的重組EpCAM，都可以購買到(如從R&D Systems Inc, Minneapolis, MN, USA)或者很容易地通過本領(lǐng)域已知的 EpCAM分子的序列信息而生成(參見示例)，并且這些都可很容易地用于測定結(jié)合性，例如可通過常規(guī)方法，如ELISA、BIAc0re，等，其中例如EpCAM附著于固相載體上，抗體與其結(jié)合的能力可通過標準技術(shù)進行測定?；蛘?，也可通過蛋白質(zhì)印跡測定與EpCAM的結(jié)合情況。包含EpCAM的細胞外結(jié)構(gòu)域的EpCAM樣品特別適合于這些目的?；蛘撸绮捎昧魇郊毎g(shù)或者IHC，能夠表達高水平EpCAM的細胞(如胃癌細胞株如Kato III、乳腺癌細胞株如MT-3、BT474、MDA-MB-453及MDA-MB-231)或者被設(shè)計成表達高水平的EpCAM的細胞，可用于評價抗體的與EpCAM結(jié)合的情況。在示例中描述了合適的ELISA，蛋白質(zhì)印跡以及BIAcore測定法。在任何測定法中，抗體與EpCAM結(jié)合的能力，如與特殊物種的EpCAM結(jié)合的能力，一般指的是與合適的對照，如不與EpCAM結(jié)合的抗體相比，抗體表現(xiàn)出的與EpCAM的可測量的以及優(yōu)選的顯著結(jié)合的能力。對于被認為是不能與EpCAM結(jié)合的抗體，例如不能與某個特殊物種的EpCAM結(jié)合的抗體，然后一般來說這種抗體顯示出不顯著的或檢測不到的或無法測量到的與EpCAM的結(jié)合，例如無法測定或顯著高于或不同于合適的對照，如不與EpCAM結(jié)合的抗體的水平。在本說明書所提及的任何統(tǒng)計分析中，與相對應(yīng)的空白對照相比，其統(tǒng)計上的顯著性差異概率值優(yōu)選要<0. 1，優(yōu)選<0. 05，更加優(yōu)選<0.01。測定統(tǒng)計學(xué)意義的合適的方法在本領(lǐng)域中已為人所熟知并有記錄，這些中的任一種均可應(yīng)用。本發(fā)明進一步提供了包含最少一種本發(fā)明的抗體或抗體片段的組合物，也可以包括稀釋液。這種組合物可以是藥學(xué)可接受的組合物或用于實驗室研究的組合物。對于用于藥物組合物來說，它們優(yōu)選采用非腸道施用方式，如靜脈施用或還可以是皮下施用。本發(fā)明提供了本發(fā)明的人源抗體和抗體片段的多種方法和用途。在所有方法中， 除非特別說明，術(shù)語“一”和“一個”用于指代所列舉的方法的步驟中的“最少一個”，“至少第一個”，“一個或多個”或“多個”。這種指代方式與治療方法中的施用步驟尤其相關(guān)。因此，本發(fā)明不僅可應(yīng)用不同的劑量，還可應(yīng)用不同數(shù)量的劑量，如注射法，直到和包括多重注射?？梢栽诳?EpCAM治療抗體施用前，施用后或施用中應(yīng)用組合治療。本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物由于其具有多種有用的體外方法和用途，使其具有重要的生物學(xué)意義。首先提供的是在結(jié)合EpCAM上的方法和用途，一般包括至少將本發(fā)明第一種抗-EpCAM抗體，或其抗原結(jié)合片段與含有EpCAM (或有可能含EpCAM)的組合物有效地接觸。本發(fā)明的抗體，或其免疫偶聯(lián)物，便因此能夠用于結(jié)合分析中。適當有用的結(jié)合分析法因此包括那些本領(lǐng)域所常用的，如免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡、斑點印跡、RIAs, ELISAs、免疫組織化學(xué)、熒光激活的細胞分類(FACS)、免疫沉淀反應(yīng)、親和層析等。還提供了檢測EpCAM方面的方法和用途，一般包括在能夠有效形成EpCAM/抗體復(fù)合物及檢測形成的復(fù)合物的條件下，用最少含有本發(fā)明第一種抗體或免疫偶聯(lián)物，或其抗原結(jié)合片段與有可能含EpCAM的組合物進行接觸。該檢測方法和用途可用于例如，診斷腫瘤的生物學(xué)樣品上，以及同樣提供的基于此的診斷試劑盒。本發(fā)明的方法和用途特別適用于某些動物和患者，這些動物和患者指的是，具有， 或有可能發(fā)展到的任何與EpCAM有關(guān)，或EpCAM在其中發(fā)揮生物學(xué)作用的疾病或狀況，例如與EpCAM存在或過表達或EpCAM活性異常有關(guān)的疾病，例如抑制EpCAM活性便有可能產(chǎn)生有益效果的疾病。優(yōu)選的示例為癌癥或癌，優(yōu)選為包括在乳腺、結(jié)直腸、前列腺、卵巢、膀胱、 膽囊、胰臟、肺、胃的組織或器官(如胃、食道)、肝臟(如肝細胞癌)、腎臟(如腎細胞癌)、皮膚癌、頭和頸部癌(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、唇、嘴、陰道和子宮頸處的癌癥中的一種或幾種。本說明書中任何提及“腫瘤”之處也同樣指代“癌癥”或“癌”。轉(zhuǎn)移性癌癥也能夠治療，因為可以減少其從原發(fā)腫瘤處的轉(zhuǎn)移。尤其是，殘留在術(shù)后患者體內(nèi)的所謂的微量殘存疾病(MRD)， 也可接受應(yīng)用抗-EpCAM抗體的免疫療法。如果患者的腫瘤處于可檢測到的水平，優(yōu)選為其EpCAM的表達處于可檢測到的高水平，那么這類患者有可能非常適合于采用本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的治療。此外，得有腫瘤的患者，如果其沒有表達出非常高水平的Her-2，因而不適于接受赫賽汀(Here印tin)療法的話，可能特別適合于這種抗-EpCAM的療法?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域中熟知的合適的方法檢測腫瘤的表達水平。本發(fā)明因此進一步提供了在治療上述疾病上的方法和用途，包括向患有這類疾病的動物或患者給予治療有效劑量的本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，或這種抗-EpCAM抗體的抗原結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物。另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體或這類抗體的抗原結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物在制造成組合物或藥劑后，用于治療，成像或診斷上的應(yīng)用。另一方面還提供了本發(fā)明的抗體或這類抗體的抗原結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物在治療，診斷或成像上的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供了一種組合物，包含本發(fā)明的抗體或該類抗體的抗原結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物，還包含一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體、稀釋液、緩沖液或穩(wěn)定劑。本說明書中描述的體內(nèi)的方法一般在哺乳動物中開展。任何哺乳動物都可應(yīng)用， 例如人類和任何家畜、家養(yǎng)或?qū)嶒瀯游?。具體實例包括小鼠、大鼠、豬、貓、狗、綿羊、兔、牛和猴。然而，優(yōu)選的，哺乳動物為人。因此，在本說明書使用的術(shù)語“動物”或“患者”包括任何哺乳動物，例如人類和任何家畜，家養(yǎng)或?qū)嶒瀯游?。具體實例包括小鼠、大鼠、豬、貓、狗、綿羊、兔、牛和猴。然而，優(yōu)選的，動物或患者是一個人類使用對象。本發(fā)明將使用未偶聯(lián)的抗體或裸抗體及其片段的抗癌方法，以及使用含有本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫偶聯(lián)物的癌癥靶向方法相結(jié)合，有效附著在治療試劑或診斷試劑上。對于科學(xué)術(shù)語，除非特別聲明或解釋，本說明書中的術(shù)語“抗體及其片段”，因此指代的是“未偶聯(lián)的或裸”抗體或片段，不與另外的試劑相連，特別是治療或診斷試劑。這些限定不排除對抗體的修飾，例如，僅通過示例的方式，改善抗體的生物半衰期，親和力，親和性或其它特性的修飾，或者對含其它效應(yīng)子的抗體組合物的修飾。本發(fā)明的抗癌治療方法和用途同樣包括了未偶聯(lián)抗體或裸抗體和免疫偶聯(lián)物這兩者的用途。在基于免疫偶聯(lián)物的抗癌治療方法中，本發(fā)明的抗體，或其抗原結(jié)合片段，優(yōu)選可以有效地附著于第二種抗癌試劑上(抗-EpCAM抗體本身為第一種抗癌試劑)。所附著的抗癌試劑可以是具有直接或間接抗癌效果的試劑。前面的治療方法和用途一般涉及到對動物或患者全身如通過皮膚、肌肉、靜脈注射等給予有藥效的組合物。然而，只要能使治療試劑在腫瘤位置處集中，任何施用途徑都是可以接受的。因此，其他合適的施用途徑包括口、鼻或呼吸和局部施用。本說明書中所使用的“施用”，指的是提供或運送抗-EpCAM抗體的治療劑，其量和時間周期能夠有效地達到發(fā)揮治療目的，如抗腫瘤效果的程度。蛋白治療劑的被動施用一般作為優(yōu)選方案，部分由于其單一性和可再現(xiàn)性。然而，術(shù)語“施用，，在本說明書中用于指代將本發(fā)明的抗-EpCAM抗體傳遞給或否則提供給腫瘤的任何及所有的方式?！笆┯谩币虼税ㄒ砸环N有效的方式提供能夠生產(chǎn)本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的細胞，以帶來向腫瘤轉(zhuǎn)運的效果。在這樣的實施例中，可以將細胞制定或包裝在選擇性滲透膜，構(gòu)造或可植入性設(shè)備中，一般能夠去除以停止治療。本發(fā)明的外生的抗-EpCAM抗體一般仍然可作為優(yōu)選，因為這種抗體代表了一種無創(chuàng)性方法，使得劑量可以被精確地監(jiān)測和控制。本發(fā)明的治療方法和用途同樣可擴展到提供編碼本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的核酸上，其方式能夠有效地使它們在腫瘤附近表達，或者使它們能夠集中在腫瘤附近。任何基因治療技術(shù)都可應(yīng)用，如裸DNA遞送、重組基因和載體、基于細胞的遞送，包括患者細胞的體外處理等。本發(fā)明的抗-EpCAM抗體也可用于遞送其他治療或診斷腫瘤的試劑。在這樣的實施例中，其他的治療或診斷試劑一般有效地附著在本發(fā)明的抗-EpCAM抗體上。本說明書使用的術(shù)語“治療”或“處理”包括預(yù)防性治療，可以防止疾病的發(fā)生。術(shù)語“治療”和“處理”包括與疾病斗爭或治療疾病，但同樣包括控制、減少或緩和疾病或一種到多種與此有關(guān)的癥狀。本發(fā)明的抗體也可用于預(yù)報應(yīng)用，如用于預(yù)報EpCAM水平會發(fā)生改變的疾病。因此，本發(fā)明的抗體可用于預(yù)測癌癥。本發(fā)明中使用的“治療有效量”指的是本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，或其免疫偶聯(lián)物達到有效地特異殺滅至少一部分腫瘤細胞時的量；達到有效地特異性誘導(dǎo)至少一部分腫瘤細胞發(fā)生細胞凋亡時的量；達到有效地特異性誘導(dǎo)至少一部分腫瘤壞死時的量；和/或在對動物或患者施用后誘導(dǎo)腫瘤退化或緩解時的量。優(yōu)選在取得這些效果的同時，對于正常的健康組織的細胞，只表現(xiàn)出很弱的結(jié)合或無結(jié)合，或者只表現(xiàn)出微弱的殺傷或無殺傷；對于動物或患者的正常的健康組織，只表現(xiàn)出可忽略的或可控制的副作用效果。本說明書在關(guān)于殺傷或誘導(dǎo)細胞凋亡的部分，或在誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死的部分，或在誘導(dǎo)腫瘤退化或緩解的部分中使用的術(shù)語“優(yōu)先地”和“特異地”，便因此指的是本發(fā)明的抗-EpCAM抗體或其免疫偶聯(lián)物，其功能是實現(xiàn)大體上只限于腫瘤位置處的腫瘤破壞和 /或腫瘤壞死，并不會明顯大體上擴展并導(dǎo)致對于動物或患者的正常、健康組織的破壞和/或組織壞死。健康細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能因此能夠通過本發(fā)明的使用而得以基本不受損傷。本發(fā)明的抗-EpCAM抗體或治療偶合物優(yōu)選連接到一種或多種放射治療試劑、化學(xué)治療試劑、抗血管生成試劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞的或細胞毒試劑、 類固醇、細胞因子、趨化因子、ATP酶抑制劑、其他抗體(如雙特異性抗體或雙抗體)或凝聚劑(凝血因子)。本發(fā)明因此提供了一系列的偶聯(lián)抗體及其片段，其中抗-EpCAM抗體有效地附著在至少一種其他治療或診斷試劑上。術(shù)語“免疫偶聯(lián)物”很寬泛地用于限定抗體與其他有效試劑之間的有效結(jié)合，并不僅僅指代何種形式的有效結(jié)合，特別是不限于化學(xué)“結(jié)合”。特別涉及到重組融合蛋白。只要遞送或靶向試劑能夠與目標結(jié)合，以及這些治療或診斷試劑在遞送時保持足夠的功能，那么這種附著的方式就是合適的。本發(fā)明同樣包括了通過糖類部分將試劑附著在抗體上。既可與0連接又可與N連接的糖基化會自然地發(fā)生在抗體上。如果需要的話，重組抗體可以被修飾，以再創(chuàng)造或創(chuàng)造附加的糖基化位點，這個很容易通過向抗體的一級序列中插入設(shè)計的合適的氨基酸序列 (如 AsnUer、Asn-X-Thr, Ser 或者 Hir，其中 X 不是 Pro)而實現(xiàn)。當前優(yōu)選用于本發(fā)明的抗-EpCAM抗體或者治療偶合物的試劑和相關(guān)的方法及用途為補充或增強抗體的效果和/或被選擇用于特殊的腫瘤類型或患者?！坝糜谘a充或增強抗體效果的治療試劑”包括放射治療試劑、化學(xué)治療試劑、抗血管生成試劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑、 抗微管蛋白藥物、抗細胞的或細胞毒試劑、類固醇、凝聚劑、細胞因子、趨化因子、ATP酶抑制劑、其他抗體(如雙特異性抗體或雙抗體)，此處其中的任何一種或多種在使用上都是優(yōu)選的。當前優(yōu)選的抗血管生成試劑包括血管抑素、內(nèi)皮抑素、任意一種血管生成素、血管抑制素、血管能抑制素和乳腺絲抑蛋白。本說明書中使用的“抗微管蛋白藥”，指的是能夠抑制細胞有絲分裂，優(yōu)選通過直接或間接抑制對細胞有絲分裂必要的微管蛋白活性，優(yōu)選為微管蛋白聚合或者解聚作用的任何試劑、藥物、前藥或其組合物。當前優(yōu)選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙堿、紫杉酚、長春堿、長春新堿、長春地辛(vindescine)以及一種或多種考布他汀類(combretastatins)。將優(yōu)選的試劑與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體附著或結(jié)合生成了“免疫偶聯(lián)物”，其中這種免疫偶聯(lián)物常常具有增強的和甚至是協(xié)同的抗腫瘤特性?？贵w-藥物偶聯(lián)物(ADC)如和auristatins、卡奇霉素、類美坦素或者烷化劑偶聯(lián)后也適用于本發(fā)明。使用抗細胞和細胞毒劑會導(dǎo)致本發(fā)明的抗-EpCAM抗體“免疫毒素”，然而使用凝血因子會導(dǎo)致本發(fā)明的抗-EpCAM抗體“凝固配體(coaguligands)，，。使用最少兩種治療劑也同樣包括在本發(fā)明中，如一種組合物，包含一種或多種放射治療試劑、化學(xué)治療試劑、抗血管生成試劑、細胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞和細胞毒試劑、類固醇、細胞因子、趨化因子、ATP酶抑制劑、其他抗體(如雙特異性抗體或雙抗體)和凝血因子。在有些應(yīng)用中，本發(fā)明的抗-EpCAM抗體治療劑可以與細胞毒類試劑，細胞抑制劑或其他能夠殺滅細胞或抑制細胞生長或細胞分裂的抗細胞類試劑有效結(jié)合。合適的抗細胞
38試劑包括化學(xué)治療試劑，也包括細胞毒素和細胞抑制劑。細胞抑制劑一般能夠擾亂靶細胞的天然細胞周期，優(yōu)選使細胞不處于細胞周期中。示范性的化學(xué)治療試劑包括激素，如類固醇；細胞因子；抗代謝物，如阿糖胞苷、 氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或者氨基蝶呤；蒽環(huán)類；絲裂霉素C ；長春堿類；抗生素；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；以及抗腫瘤烷化劑，如苯丁酸氮芥或者苯丙氨酸氮芥。有些優(yōu)選的抗細胞試劑為DNA合成抑制劑如正定霉素、多柔比星/阿霉素等。總體來說，紫杉酚/紫杉醇、 多烯紫杉醇、順鉬、吉西他濱、考布他汀和多柔比星/阿霉素是目前優(yōu)選的抗癌試劑。在細胞因子和趨化因子中，目前優(yōu)選的試劑為IL-2，IL-12，TNF-ci，干擾素-α (IFN- α )、IFN- β、IFN- γ、GM-CSF和LEC (肝臟表達的趨化因子)。V型ATP酶抑制劑也是目前優(yōu)選的，例如水楊酰胺(salicylihalamide)、伴刀球霉素或巴佛洛霉素，例如蛋白合成抑制齊U，如 psymberin、雞矢素(pederin)、irciniastatin A0在某些治療應(yīng)用中，由于大部分毒素與其他可能的試劑相比具有更強的傳遞細胞殺傷效應(yīng)的能力，毒素部分是優(yōu)選的。因此，對于本發(fā)明的抗-EpCAM抗體構(gòu)建體，有些優(yōu)選的抗細胞試劑為植物，真菌或者細菌來源的毒素。示例性毒素包括表鬼白毒素；細菌內(nèi)毒素或細菌內(nèi)毒素的脂質(zhì)A部分；核糖體失活蛋白，例如皂草素或白樹毒素；八疊球菌；曲霉素；局限曲菌素；核糖核酸酶，例如胎盤核糖核酸酶；白喉毒素和假單胞菌外毒素。當前優(yōu)選的示例為篦麻毒蛋白、白樹毒素、相思豆毒素、白喉、假單胞菌和百日咳毒素。有些優(yōu)選的毒素為A鏈毒素，比如篦麻毒蛋白A鏈。最優(yōu)選的毒素部分經(jīng)常為經(jīng)過處理修飾或除去糖類殘基后的篦麻毒蛋白A鏈，稱之為“脫糖基化A鏈”(dgA)。脫糖基化篦麻毒蛋白A鏈可作為優(yōu)選，因為其具有極高的毒性，較長的半衰期，另外因為生產(chǎn)制造它以達到臨床等級和規(guī)模在經(jīng)濟上比較可行。重組和/或截短的篦麻毒蛋白A鏈也同樣可用。本發(fā)明的抗-EpCAM抗體治療劑可以包括能夠促進凝聚的組分，例如，促凝劑。在這里，靶向抗體可用直接地或間接地，例如，通過另一個抗體，連接到能夠直接或間接地促進凝聚的因子上。用于這種用途的優(yōu)選的凝血因子可以是組織因子(TF)和TF衍生物，比如截短型 TF(tTF)、二聚、三聚、聚合/多聚TF，以及刺激因子VII能力缺陷的突變體TF。其他合適的凝血因子包括維生素K-依賴的凝聚劑，比如因子Il/IIa、因子Vll/VIIa、因子IX/DCa和因子XAa ；缺乏Gla修飾的維生素K依賴的凝血因子；拉塞爾蝰蛇毒素因子X激活劑；血小板激活化合物，比如血栓烷A2和血栓烷A2合酶；以及纖維蛋白裂解抑制劑，比如α 2-抗纖溶酶?？傮w上，截短型組織因子(tTF)在目前是優(yōu)選的。免疫偶聯(lián)物和免疫毒素的制備方法一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如， U. S. Patent No. 4，340，535)。下面的每個專利都被進一步與本說明書組合，以參考其在免疫毒素產(chǎn)生，純化和使用方面的進一步補充本發(fā)明的目的U. S. PatentNo. 6，004, 554 ； 5，855，866 ；5，965，132 ；5，776，427 ；5，863，538 ；5，660，827 和 6，051，230。各種化學(xué)治療和其他藥學(xué)試劑都能夠成功地與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體治療劑相偶聯(lián)。示例性的與抗體偶聯(lián)的抗腫瘤試劑包括多柔比星、道諾霉素、氨甲蝶呤和長春堿。而且，其他試劑比如新抑癌素，巨毛霉素，三亞胺和α-鵝膏菌素的附著方式已經(jīng)被描述(參見 U. S. Patent No. 5，660，827 ；5，855，866 ；和 5，965，132 ；每個都在本說明書中涉及到。)
制備凝固配體也很容易進行。一種或多種凝血因子與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體之間的可行的連接方式可以是直接連接，例如那些已在上面關(guān)于免疫毒素時描述過?；蛘撸尚械倪B接方式可以為間接的附著，比如抗體可以有效附著于第二結(jié)合區(qū)，優(yōu)選有效附著于與凝血因子結(jié)合的抗體或抗體的抗原結(jié)合區(qū)上。凝血因子應(yīng)該與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體在與其功能性凝集位點分開，特別是在使用共價鍵與分子結(jié)合的位點上。雙特異性或三特異性抗體也可用于本發(fā)明的方法中。在這類抗體中，一個臂與 EpCAM結(jié)合，也可作為本發(fā)明的抗體。在有些優(yōu)選的示例中，雙特異性或三特異性抗體的其他臂的特異性為抗-CD3、-CD16、-Q^8、-NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46 或者抗-VEGF，以阻斷腫瘤血管生成。制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并已被描述過。在制備免疫偶聯(lián)物、免疫毒素和凝固配體時，可以應(yīng)用重組表達。編碼所選的本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，以及治療試劑、毒素或者凝聚劑的核酸序列，在框內(nèi)附著在一個表達載體中。重組表達便因此會帶來核酸的翻譯并生產(chǎn)出所需要的免疫偶聯(lián)物。化學(xué)交聯(lián)劑和親和素生物素橋也可將治療劑與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體連接在一起。本發(fā)明的組合物和方法可用于與其他治療劑和診斷劑結(jié)合。在生物學(xué)試劑方面， 優(yōu)選采用診斷或治療試劑用于與依照本發(fā)明的抗-EpCAM抗體“結(jié)合”，術(shù)語“結(jié)合”簡潔地用于涵蓋一系列的實施例。術(shù)語“結(jié)合”，除非另行特別聲明或?qū)υ摽茖W(xué)術(shù)語進行解釋，否則均適用于多種形式的結(jié)合組合物、藥品、復(fù)合物、試劑盒、方法，以及第一和第二醫(yī)學(xué)用途。本發(fā)明“結(jié)合”的實施例因此包括，例如，本發(fā)明的抗-EpCAM抗體是一個裸抗體， 并與沒有有效附著其上的試劑或治療試劑聯(lián)合應(yīng)用。在這種情況下，試劑或治療試劑可以非靶向性或靶向性的形式而得到應(yīng)用。在“非靶向性形式”中，試劑，尤其是治療試劑，一般會按照它們在本領(lǐng)域中的標準用法而得到應(yīng)用。在“靶向性形式”中，試劑一般會有效附著在一個獨特的抗體或能夠?qū)⒃噭┗蛑委熢噭┻f送至血管生成疾病位置或腫瘤處的靶向區(qū)上。這種既可以是診斷劑又可以是治療劑的生物學(xué)試劑，其靶向性形式的應(yīng)用在本領(lǐng)域中也同樣非常標準。在本發(fā)明的其他“組合”的實施例中，本發(fā)明的抗-EpCAM抗體為免疫偶聯(lián)物，其中抗體本身與試劑或治療試劑有效連接或結(jié)合在一起。有效的附著方式包括在本說明書中描述過的以及本領(lǐng)域所知道的所有形式的直接或間接的附著方式。“結(jié)合”的用法，尤其是在將本發(fā)明的抗-EpCAM抗體與治療劑聯(lián)合應(yīng)用這方面，同樣包括了結(jié)合的組合物、藥物、復(fù)合物、試劑盒、方法，以及第一和第二醫(yī)學(xué)用途，其中治療試劑為前藥的形式。在這些實施例中，能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)化成藥物的功能形式的激活成分有可能再次與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體有效地結(jié)合。在有些優(yōu)選實施例中，治療組合物、結(jié)合物、藥物、復(fù)合物、試劑盒、方法，以及第一和第二醫(yī)學(xué)用途可以為“前藥組合物”。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該明白的是，術(shù)語“前藥組合物”，除非另行聲明，均指的是本發(fā)明的抗體有效附著在能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)化成活性藥的成分上，而并非指抗體附著在前藥本身上。然而，并沒有要求本發(fā)明的前藥實施例一定需要用作前藥組合物。因此，前藥能夠以它們在本領(lǐng)域中應(yīng)用的任何方式來應(yīng)用，包括以ADEPT和其他形式。因此，在描述的結(jié)合組合物、藥物、復(fù)合物、試劑盒、方法，以及第一和第二醫(yī)學(xué)用途中，優(yōu)選按照診斷試劑，更加優(yōu)選為治療試劑，組合物包括抗-EpCAM抗體，可以是裸抗體，也可為免疫偶聯(lián)物，其中在本發(fā)明的體內(nèi)實施例中，其操作時會涉及到在之前，同時會隨后給予裸抗體或者免疫偶聯(lián)物和生物、診斷或治療試劑；只要在某些偶聯(lián)或非偶聯(lián)的形式中，對于某種形式的抗體，以及某種形式的生物、診斷或治療試劑，其總體供應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)即可。針對本發(fā)明在腫瘤上的效果，前面的和其他的說明僅僅是為了解釋操作，所附著試劑的類型等的結(jié)合模式。這種描述的方法不應(yīng)該被理解為對本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的有益特性公開不充分或者過于簡化。因此需要理解的是，這類抗體本身具有抗腫瘤活性，這類抗體的免疫偶聯(lián)物會保留這些活性，并將這些特性與所附著的試劑相結(jié)合；進一步，抗體與任何附著試劑的結(jié)合效應(yīng)會明顯被增強和/或放大。本發(fā)明因此提供了組合物、藥物組合物、治療試劑盒和藥用復(fù)合物，含有，可選為至少第一種的組合物或容器中，治療有效量的至少第一種本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，或者這種抗EpCAM抗體的抗原結(jié)合片段或免疫偶聯(lián)物；以及治療有效量的至少第二種生物試劑， 成分或系統(tǒng)?！爸辽俚诙N生物試劑、成分或系統(tǒng)”通常為治療或診斷的試劑，成分或系統(tǒng)，但不必須是。例如，至少第二種生物學(xué)試劑、成分或系統(tǒng)可以包括用于對抗體進行修飾的成分和 /或用于將其他試劑附著在抗體上的成分。某些優(yōu)選的第二種生物試劑、成分或系統(tǒng)為前藥或制造和使用前藥的成分，包括用于制造前藥本身的成分，以及在這類前藥或ADEPT實施例中使本發(fā)明的抗體發(fā)揮作用的成分。在至少第二種生物試劑，、成分或系統(tǒng)包括了治療或診斷試劑的時候，這些治療劑和/或診斷劑的典型代表為與癌癥治療或診斷相關(guān)的試劑。因此，在某些實施例中“至少第二種抗癌試劑”會被包括在治療試劑盒或復(fù)合物中。術(shù)語“至少第二種抗癌試劑”被用于與作為第一種抗癌試劑的本發(fā)明的抗-EpCAM抗體相對應(yīng)。本發(fā)明的抗體可因此與化學(xué)治療試劑、放射治療試劑、細胞因子、抗血管生成試劑、 細胞凋亡誘導(dǎo)劑或者抗癌免疫毒素或者凝固配體相結(jié)合，有些示例在本說明書的其他地方提及。其他示例性的抗癌試劑包括，比如，新霉素、鬼臼毒素、TNF-α、α νβ 3拮抗劑、鈣離子載體、鈣流誘導(dǎo)劑，及其任何衍生物或前藥。當前優(yōu)選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙堿、 紫杉酚、長春堿、長春新堿、長春地辛、考布他汀或其衍生物或前藥。對于本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或藥物，結(jié)合的有效量的治療試劑可含在單個容器或容器工具中，或含在不同的容器或容器工具中。復(fù)合物一般會混合在一起，以聯(lián)合應(yīng)用。用于靜脈注射施用的試劑一般可作為優(yōu)選。成像用的成分也可包括在內(nèi)。試劑盒也可包含使用至少第一種抗體和一種或多種包括在內(nèi)的其他生物試劑的說明書。一般來說，至少第二種抗癌試劑(或者任何其他的第二種試劑)可大體上與本發(fā)明的抗-EpCAM抗體同時向動物或患者施用；比如通過單一的藥物組合物或通過兩種藥物組合物一起施用?；蛘?，至少第二種抗癌試劑(或任何其他第二種試劑)在向動物或患者施用的時候，其施用時間與給予本發(fā)明的抗-EpCAM抗體時間相繼。在本說明書中使用的“時間相繼”，指的是“錯開”，也就是至少第二種抗癌試劑向動物或患者施用的時間與給予本發(fā)明的抗-EpCAM抗體的時間區(qū)分開。一般地，兩種試劑的施用時間有效地分開，以使二者發(fā)揮它們各自的治療效果，比如，它們按照“生物有效的時間間隔”來施用。至少第二種抗癌試劑 (或者其他的第二種試劑)可以在給予本發(fā)明的抗-EpCAM抗體之前隔著一個生物有效期而向動物或患者施用，或者在給予本發(fā)明的抗-EpCAM抗體之后隔著一個生物有效期再施用。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了治療患有腫瘤的動物或患者的方法，包括(a)使動物或患者接受第一步治療，大體上降低腫瘤負擔；然后(b)繼而給予至少第一種本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，或者其抗原結(jié)合片段，或其免疫偶聯(lián)物；可選擇的，其中的抗體或片段可以與第二種治療試劑有效連接。優(yōu)選的，第一步治療包括手術(shù)切除和化學(xué)療法干預(yù)。在某些其他實施例中，本發(fā)明的抗體和免疫偶聯(lián)物可以與一種或多種診斷試劑， 特別是用于診斷癌癥的診斷試劑相結(jié)合。一系列的診斷組合物，試劑盒和方法因此而包括在本發(fā)明中。另一方面為對使用對象的診斷或成像的方法，包括對使用對象給予在本說明書中所限定的合適量的本發(fā)明的抗體或其他蛋白，并在使用對象體內(nèi)檢測本發(fā)明的抗體或其他蛋白是否存在和/或存在的量和/或位置。適合按照上面所述的用途和方法進行成像或診斷的疾病包括在本說明書其他部分描述的任何疾病，優(yōu)選為任何的癌癥。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種方法，用于診斷疾病，如動物中的癌癥，包括以下步驟(a)將從所述動物中取出的待測樣品與本發(fā)明的抗體或其免疫偶聯(lián)物接觸。在進一步的實施例中，本發(fā)明提供了一種方法，用于診斷疾病，如動物中的癌癥， 包括以下步驟(a)將從所述動物中取出的待測樣品與本發(fā)明的抗體或其免疫偶聯(lián)物接觸；(b)在待測樣品中測量或檢測抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或存在量和/或位置； 以及，可選擇的(c)將待測樣品中抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或存在量與對照相比。在上述方法中，所述接觸步驟要在能夠形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定合適的條件。在上面的方法中，任何合適的待測樣品均可使用，比如可能受疾病影響的活檢細胞，組織或器官，或者組織切片。在某些上述方法中，待測樣品中任何量的抗體-抗原復(fù)合物的存在都意味著疾病的存在。優(yōu)選的，為了表明診斷結(jié)果為陽性，與合適的對照樣品中的量相比，待測樣品中抗體-抗原復(fù)合物的量需要變大或增加，優(yōu)選顯著變大或增加。更加優(yōu)選的是，顯著變大或增加的水平具有統(tǒng)計學(xué)意義，優(yōu)選為概率值< 0. 05。測定統(tǒng)計學(xué)意義的合適的方法在本領(lǐng)域中已為人所熟知并有記錄，這些中的任一種均可應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地選擇合適的對照樣品，例如，在診斷一種具體疾病時，合適的對照可以為從未患有這種疾病的使用對象中獲得的樣品。合適的對照“值”也可以很容易地測定，無需在每次測試中均設(shè)定對照“樣品”，例如，可以參考本領(lǐng)域已知的正常使用對象的范圍。為了在診斷或成像的應(yīng)用中使用，本發(fā)明的抗體可以用可檢測的標記物進行標記，比如射線透不過物質(zhì)或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、mI ；放射性發(fā)射源 (如，α，β或Y發(fā)射源)；熒光的(熒光團)或化學(xué)發(fā)光的(發(fā)色團)化合物，比如異硫氰酸熒光素、若丹明或者熒光素；酶類，比如堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或者辣根過氧化物酶；成像試劑；或金屬離子；或化學(xué)部分，比如生物素，可以通過結(jié)合到具體的同源可檢測的部分，如標記的親和素/鏈霉親和素上而被檢測到。將標記物附著到結(jié)合蛋白，如抗體或抗體片段上的方法，對于本領(lǐng)域是已知的。這種可檢測的標記物使得可以在受試樣品中檢測結(jié)合蛋白-抗原復(fù)合物的存在，存在量或其位置。優(yōu)選的用于體內(nèi)的可檢測標記物包括Χ射線可檢測混合物，比如鉍(III)、金 (III)、鑭(III)或者鉛(II)；放射性離子，比如銅67、鎵67、鎵68、銦m、銦113、碘123、碘125、碘 131、汞197、汞203、錸186、錸■、銣97、銣103、锝99m或釔90 ；核磁自旋共振同位素，比如鈷(π)、銅 (II)、鉻(III)、鏑(III)、鉺(III)、軋(III)、鈥(III)、鐵(II)、鐵(III)、錳(II)、釹(III)、 鎳(II)、釤(III)、鋱(III)、釩(II)或者鐿(III)；或者若丹明或熒光素。本發(fā)明同樣包括診斷或成像試劑，包括本發(fā)明的抗體，通過直接或間接的方式附著于一個能產(chǎn)生可檢測信號的標記物上。合適的標記物在本說明書的其他地方提及。癌癥治療也可通過如下方法進行(a)形成腫瘤的影像，其方式在于向患有腫瘤的動物或患者給予診斷量的至少第一種可檢測到的標記的本發(fā)明的抗-EpCAM抗體，包括一個診斷試劑，有效附著于本發(fā)明的抗-EpCAM抗體上，從而形成可檢測到的腫瘤影像；另外(b)隨后向相同的動物或患者給予治療上最優(yōu)劑量的至少第一種的本發(fā)明的抗-EpCAM裸抗體，或者使用這種抗體的治療試劑-抗體構(gòu)建體，從而導(dǎo)致抗腫瘤的效果。本發(fā)明進一步包括了試劑盒，含有一種或多種本發(fā)明的抗體、免疫偶聯(lián)物或者組合物，或一種或多種編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子，或一種或多種含有本發(fā)明的核酸序列的重組表達載體，或一種或多種含有本發(fā)明的重組表達載體或者核酸序列的宿主細胞或病毒。優(yōu)選的，所述試劑盒按照本說明書中描述的方法和用途進行使用，比如，本說明書所描述的治療、診斷或成像的方法，或者按照本說明書中描述的體外分析或方法進行使用。在這種試劑盒中的抗體優(yōu)選為本說明書其他部分描述的抗體偶聯(lián)物，例如，可以與可檢測到的部分偶聯(lián)或可以是免疫偶聯(lián)物。所述試劑盒優(yōu)選包含對試劑盒組分用途，如在診斷方面的說明書。所述試劑盒優(yōu)選按照本說明書其他部分的描述用于診斷或治療疾病，如癌癥，也可以包括使用試劑盒組分診斷或治療這種疾病的說明書。本說明書所限定的本發(fā)明的抗體也可作為分子工具用于體外或體內(nèi)應(yīng)用和分析中。由于抗體具有抗原結(jié)合位點，這些可以作為具體結(jié)合對的成員，這些分子可用于需要具體結(jié)合對成員的任何試驗中。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種試劑，包括本說明書所限定的本發(fā)明的抗體，以及將這種抗體用作分子工具的用途，例如在體外或體內(nèi)分析中的用途。
4權(quán)利要求
1.一種能與EpCAM結(jié)合的抗體，包括至少一個含有三個⑶Rs的重鏈可變區(qū)，以及一個含有三個CDRs的輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)包括(c)一個VH⑶R3，具有如SEQ ID NO :7所列的氨基酸序列，或者與其大體上同源的序列，其中所述大體上同源的序列是指，與所提供的CDR序列相比，含有1個、2個或3個氨基酸替換的序列，或者其中所述大體上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替換的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，一種或多種所述重鏈可變區(qū)CDRs從含有如下結(jié)構(gòu)的組中選出(a)可變重鏈(VH)⑶Rl，含有如SEQID NO :5所列的氨基酸序列或者與其大體上同源的序列，以及(b)VH⑶R2，含有如SEQID NO :6所列的氨基酸序列或者與其大體上同源的序列，其中所述大體上同源的序列是指與所提供的CDR序列相比，含有1個、2個或3個氨基酸的替換的序列，或者其中所述大體上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替換的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，一種或多種所述輕鏈可變區(qū) ⑶Rs從含有如下結(jié)構(gòu)的組中選出(d)可變輕鏈(VL)CDRl，含有如SEQID NO :8所列的氨基酸序列或者與其大體上同源的序列，(e)VL⑶R2，含有GA S T X5 A X7(SEQ ID NO 37)的氨基酸序列，或者與其大體上同源的序列，其中\(zhòng)和X7可以是任意氨基酸，以及(f)VLCDR3，含有Q X2 Y N X5 W P P X9 X10 T (SEQ ID NO 89)的氨基酸序列或者與其大體上同源的序列，其中&、X5、X9和Xltl可以是任意氨基酸，其中所述大體上同源的序列是指與所提供的CDR序列相比，含有1個，2個或3個氨基酸的替換的序列，或者其中所述大體上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替換的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，在(e)的所述VLCDR2中 或者T，優(yōu)選為T和/或X7為T或者S，優(yōu)選為S;和/或其中在(f)的所述VL CDR3中X2為Q或H或K，優(yōu)選為Q ；ASN或者D，優(yōu)選為N;X9為G或T或S或M或A，優(yōu)選為A ；和/或Xltl為F或W或Y，優(yōu)選為Y。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，(e)的所述VLCDR2含有如 SEQ ID NO :9或者SEQ ID NO : 所列的氨基酸序列，或者與其大體上同源的序列，和/或 (f)的所述VL CDR3含有如SEQ ID NO :10、30、43、56、69或82所列的氨基酸序列，或者與其大體上同源的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的抗體，包括重鏈⑶R結(jié)構(gòu)域(a)，(b)，和(c)每一個中的一個和/或輕鏈CDR結(jié)構(gòu)域(d)、(e)和(f)每一個中的一個。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體，其特征在于，所述三個輕鏈可變區(qū)CDRs為 SEQ ID NOs :8、9 和 10，或者 SEQ ID NOs :8、四和 30，或者 SEQ ID NOs :8、四和 43，或者 SEQ ID NOs :8、四和56，或者SEQ ID NOs :8、四和69，或者SEQ ID NOs :8、四和82，或者大體上與其同源的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的抗體，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO: 3所列的氨基酸序列，或者一個與其具有至少70%、80%、90%、95%或者98%的序列一致性的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO :4、27、40、53、66或者79所列的氨基酸序列，或者一個與其具有至少70%、80%、 90%、95%或者98%的序列一致性的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體含有如SEQID NO 21、36、49、62、75或者88所列的氨基酸序列，或者一個與其具有至少70%、80%、90%、95% 或者98%的序列一致性的序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體均能與人源和猴源EpCAM結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的抗體，包含具有如SEQID NO :5所列氨基酸序列的VH CDR1、具有如SEQ ID NO :6所列氨基酸序列的VHCDR2、具有如SEQ ID N0:7所列氨基酸序列的VH CDR3、具有如SEQ ID NO :8所列氨基酸序列的VL CDR1、具有如SEQ ID NO: 9所列氨基酸序列的VL⑶R2以及具有如SEQ ID NO 10所列氨基酸序列的VL⑶R3，或者一個能與所述抗體競爭結(jié)合EpCAM的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體是完全人源的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含抗體重鏈恒定區(qū)和/或抗體輕鏈恒定區(qū)的全部或者一部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體是IgG抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含一個重鏈和一個輕鏈，所述重鏈含有如SEQ ID而對所列的氨基酸序列或者與其具有至少？。1^』。1^、^1^、 95%或者98%序列一致性的序列，所述輕鏈含有如SEQ ID NO :25、51、64或者77所列的氨基酸序列，或者與其具有至少70%,80^^90^^95%或者98%序列一致性的序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體是一個抗體的抗原結(jié)合片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，其特征在于，所述抗體的所述抗原結(jié)合片段為一個 Fab ‘、Fab、F (ab ‘ ) 2、單域抗體、TandAbs 二聚體、Fv> scFv、dsFv、ds-scFv、FcU線性抗體、 微抗體、雙功能抗體、雙特異性抗體片段、雙體、三體、Sc-雙功能抗體、κ (λ)體、BiTE、 DVD-Ig, SIP、SMIP、DART或者含有一個或多個CDRs的小抗體模擬物。
19.一種免疫偶聯(lián)物，含有附著于至少第二種診斷或治療試劑的根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的免疫偶聯(lián)物，其特征在于，所述抗體附著于一個放射治療試劑、化學(xué)治療試劑、抗血管生成試劑，細胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗微管蛋白藥、抗細胞或細胞毒試劑、類固醇、細胞因子、趨化因子、ATP酶抑制劑、另一種抗體或者凝聚劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的免疫偶聯(lián)物，其特征在于，所述抗體附著于另一個抗體上， 并且所述免疫偶聯(lián)物包含一個雙特異性抗體或雙功能抗體。
22.—種結(jié)合蛋白，含有根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項所述抗體。
23.一種組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的至少第一種抗體或其免疫偶聯(lián)物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述組合物為藥學(xué)可接受的組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求M所述的組合物，其特征在于，所述組合物進一步包括至少第二種治療試劑。
26.一種核酸分子，包含編碼權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體的核苷酸序列區(qū)。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列區(qū)包含如SEQID NO :1所列的核苷酸序列，并且可選的，還含有如SEQ ID N0:2、26、39、52、65或者78所列的核苷酸序列，或與其具有至少70 %序列一致性的序列。
28.一種表達載體，含有如權(quán)利要求沈或權(quán)利要求27所述的核酸分子。
29.一種宿主細胞或者病毒，含有如權(quán)利要求沈或權(quán)利要求27所述的核酸分子或者如權(quán)利要求觀所述的表達載體。
30.一種試劑盒，在至少一個容器中包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體；(b)根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項所述的免疫偶聯(lián)物；(c)根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項所述的組合物；(d)根據(jù)權(quán)利要求沈或權(quán)利要求27所述的核酸分子；(e)根據(jù)權(quán)利要求觀所述的表達載體；(f)根據(jù)權(quán)利要求四所述的宿主細胞；或者(g)根據(jù)權(quán)利要求四所述的病毒。
31.一種制造抗體的方法，包括(a)在能夠有效表達編碼抗體的條件下，培養(yǎng)含有如權(quán)利要求沈或者權(quán)利要求27所述核酸分子，或者含有如權(quán)利要求觀所述表達載體的宿主細胞；以及(b)從所述宿主細胞中獲得表達的抗體。
32.一種結(jié)合EpCAM的方法，包括將含有EpCAM的組合物與如權(quán)利要求1_18中任一項所述的抗體，或其免疫偶聯(lián)物相接觸。
33.一種檢測EpCAM的方法，包括在能夠有效形成EpCAM/抗體復(fù)合物的條件下，將可能含有EpCAM的組合物與如權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體，或其免疫偶聯(lián)物相接觸，然后檢測形成的復(fù)合物。
34.一種在動物中診斷癌癥的方法，包括(a)在能夠有效形成EpCAM/抗體復(fù)合物的條件下，將動物或從所述動物體內(nèi)取出的測試樣品與如權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體，或其免疫偶聯(lián)物接觸。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括(b)在待測樣品中測量或檢測抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或存在量和/或位置；以及，可選擇的(C)將待測樣品中抗體-抗原復(fù)合物的存在和/或存在量與對照相比。
36.一種治療癌癥的方法，包括向一種動物施用如權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體，或其免疫偶聯(lián)物，其量能夠達到有效治療所述動物癌癥的水平。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，進一步包括向所述動物施用第二種治療試劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求34-37中任一項所述的方法，其特征在于，所述動物是人類使用對象。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體，或其免疫偶聯(lián)物，用于治療，成像或者診斷。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的抗體或免疫偶聯(lián)物，用于癌癥的治療，成像或者診斷。
41.將如權(quán)利要求1-18中任一項所述的抗體或其免疫偶聯(lián)物，生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物的用途。
42.根據(jù)權(quán)利要求39或者權(quán)利要求40所述的抗體或者免疫偶聯(lián)物，或者根據(jù)權(quán)利要求 36-38中任一項所述的方法，或者根據(jù)權(quán)利要求41所述的用途，其特征在于，所述癌癥源自于一個組，該組包括乳房、結(jié)直腸、前列腺、卵巢、膀胱、膽囊、胰臟、肺、胃組織或器官，優(yōu)選為胃或食道、肝臟，優(yōu)選為肝細胞癌、腎，優(yōu)選為腎細胞癌、皮膚癌、頭和頸，優(yōu)選為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、唇、嘴、陰道和子宮頸的癌癥。
43.根據(jù)權(quán)利要求39或者權(quán)利要求40或者權(quán)利要求42所述的抗體或免疫偶聯(lián)物，或者根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項所述的方法，或者根據(jù)權(quán)利要求41所述的用途，進一步包括第二種治療試劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明披露了能與上皮細胞粘附分子(Ep CAM)結(jié)合的抗體，與已知的結(jié)合Ep CAM的抗體相比，表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，例如，本發(fā)明的抗體表現(xiàn)出良好的親和力，良好的交叉反應(yīng)性譜和出色的ADCC和CDCC活性。本發(fā)明披露了含有特殊重鏈和輕鏈CDRs的抗體。本發(fā)明因此涉及到這些抗體和它們的所有用途，特別是在治療癌癥上的用途。本發(fā)明因此提供了用于治療癌癥的基于新抗體的組合物、方法和結(jié)合方案。本發(fā)明同樣提供了采用新的抗-Ep CAM抗體的優(yōu)選的免疫偶聯(lián)物組合物和方法。
文檔編號C07K16/30GK102549017SQ201080035166
公開日2012年7月4日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月9日
發(fā)明者拉維尼婭·黛安娜·奇科爾塔什·貢納松, 燕妮·瑪加麗塔·卡爾松, 謝爾蓋·米哈伊洛維奇·基普里亞諾夫, 迪德里克·派于斯, 雷姆科·阿爾貝特·格里普 申請人:奧菲技術(shù)科學(xué)研究院