專利名稱：在ffpe材料中用于檢測整聯(lián)蛋白復(fù)合體的抗體的制作方法
在FFPE材料中用于檢測整聯(lián)蛋白復(fù)合體的抗體本發(fā)明涉及能夠與整聯(lián)蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體。本發(fā)明的另ー個目的涉及所述抗體在檔案福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFP^組織中檢測整聯(lián)蛋白的用途。本發(fā)明也涉及用于制備單克隆兔抗體的方法(其中免疫原是來自昆蟲表達(dá)培養(yǎng)物的重組細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域)，以及篩選抗整聯(lián)蛋白抗體的方法，所述方法區(qū)分最近的整聯(lián)蛋白同源物并且特別適合于在FFPE材料中的免疫組織化學(xué)。整聯(lián)蛋白是由兩個非共價結(jié)合鏈組成的細(xì)胞黏著分子的家族。整聯(lián)蛋白的復(fù)合多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)對微小的調(diào)節(jié)敏感。在許多水平調(diào)控整聯(lián)蛋白，包括翻譯和轉(zhuǎn)錄、翻譯后糖基化、細(xì)胞表面遞送、通過細(xì)胞內(nèi)提示的細(xì)胞表面活化和通過細(xì)胞外提示的細(xì)胞表面活化。α 和β鏈都是I類跨膜蛋白，所述跨膜蛋白橫跨膜并且使細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)區(qū)室整合，因此為信號提供途徑，所述信號最終導(dǎo)致控制黏著、増殖、存活、遷移和侵入。在許多人病理學(xué)中整聯(lián)蛋白是治療靶。例如，在癌中，α-v系列整聯(lián)蛋白 (ανβ1、ανβ3、ανβ5、ανβ6禾ロ ανβ8)不同地涉及血管發(fā)生、保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療和放療、腫瘤存活和局部免疫抑制。α 5 β 1和α 4 β 1也涉及血管發(fā)生，而α2β1和α6β4 涉及腫瘤増殖。α νβ 3過量表達(dá)與人黑色素瘤的侵入階段相關(guān)，并且在腫瘤侵入性的內(nèi)皮中ανβ3和α νβ 5都特異性地被増量調(diào)節(jié)，在該處它們似乎調(diào)節(jié)血管發(fā)生生長因子在內(nèi)皮表面的功能。在給定的腫瘤類之間和之中整聯(lián)蛋白的準(zhǔn)確的表達(dá)圖式是高度可變的并且反映了功能生物學(xué)。因此它們也是腫瘤狀態(tài)的生物標(biāo)志物，并且表達(dá)圖式對于結(jié)果是有預(yù)兆的并且能夠明確治療機(jī)會。針對α ν-整聯(lián)蛋白鏈和西侖吉肽(cilengitide)的單克隆抗體DI-17E6處于臨床開發(fā)中，所述西侖吉肽是含有環(huán)狀RGD的，抑制整聯(lián)蛋白ανβ3和ανβ5的五肽。然而， 靶向整聯(lián)蛋白的治療尚未達(dá)到全部治療潛力，部分因為在病理學(xué)病況中整聯(lián)蛋白表達(dá)圖式的圖顯著地不完整。整聯(lián)蛋白分布的病理學(xué)表征依賴于在新鮮冷凍組織上的研究。良好地建立了活細(xì)胞到冷凍染色的聯(lián)系，并且冷凍組織是整聯(lián)蛋白染色的極好的底物，但是它們的保藏和超微結(jié)構(gòu)保真性的水平比FFPE材料中常規(guī)的水平低很多。這能夠嚴(yán)重地影響復(fù)雜組織中染色的解釋。此外，常規(guī)的臨床實踐，和一般地及可商購的組織庫，提供FFPE材料獲取冷凍臨床材料是后勤且通常是臨床培養(yǎng)的難題，或當(dāng)涉及某些腫瘤和稀有的和珍貴的臨床樣品時是根本不可能的。由于經(jīng)典的組織學(xué)和整聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)的沖突性的需要阻礙現(xiàn)有技術(shù)在FFPE材料中明確的整合蛋白的檢測。組織學(xué)需要極好的和穩(wěn)健的組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)保存，涉及通過疏水不溶性試劑(例如甲醛溶液、分級醇和石蠟)任選地與熱作用一起的軟的親水組織的廣泛的交聯(lián)、浸潤和穩(wěn)定化。已知固定和包埋，特別地如在臨床組織學(xué)實驗室中實踐的，能夠隱藏或甚至毀壞表位。非天然條件使得整聯(lián)蛋白沒有被提取或被降解，而主要被封閉。有構(gòu)象活性的專性整聯(lián)蛋白異源ニ聚體對此類構(gòu)象變化是敏感的，并且不能夠容易地從發(fā)生在FFPE過程中的堵塞恢復(fù)它們。由于在組織固定和包埋中涉及的化學(xué)嚴(yán)重影響整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)，在FFPE處理后本領(lǐng)域人員使用的確定的可獲得的單克隆抗體不能可靠地識別整聯(lián)蛋白。識別整聯(lián)蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的抗體被必然地限制于單整聯(lián)蛋白鏈，導(dǎo)致在FFPE材料中模糊的染色圖式，這是因為它們不報告完整的整聯(lián)蛋白異源ニ聚體的分布。此外，針對短肽表位的此類抗體，傾向于構(gòu)象獨立，這導(dǎo)致檢測單鏈或降解產(chǎn)物的檢測，以及比檢測完整的整聯(lián)蛋白復(fù)合體的抗體低的特異性和親和力。若干小鼠單克隆抗體，例如小鼠單克隆抗整聯(lián)蛋白av β 3抗體LM609，使用FACS或冷凍組織檢測ανβ3和α νβ 5，然而，在FFPE材料中它們沒有顯示它們的表位的顯著的或可復(fù)制的標(biāo)記。鼠單克隆抗體在它們的受限制的表位識別和低親和カ中的缺陷是廣為承認(rèn)的。當(dāng)在FFPE材料上使用此類抗體時所見的分布圖式與在新鮮冷凍的冷凍切片的材料中所觀察到的圖式是不同的；而這些后者的表達(dá)譜緊密匹配從此類組織分離的那些活的細(xì)胞。必須把用此類抗體的FFPE染色視為具有可疑出處的，并且必須進(jìn)行抗原提取的技術(shù)以從FFPE材料恢復(fù)此類決定子。目前沒有在FFPE組織中穩(wěn)健地識別α ν β 3或α ν β 5胞外表位，允許在FFPE患者腫瘤組織中表征整聯(lián)蛋白的單克隆抗體。此情況的最終結(jié)果是不能分析數(shù)十年的病理學(xué)標(biāo)本的整聯(lián)蛋白表達(dá)譜，所述整聯(lián)蛋白表達(dá)譜可能掲示能夠從靶向整聯(lián)蛋白的治療獲益的患者群體。在新型的治療前景中，此類缺陷能夠意味著有效的療法可能悲劇地永遠(yuǎn)無法達(dá)到有需要的患者。因此，形成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題是提供抗體，所述抗體允許在FFPE材料中，特別地在常規(guī)的FFPE腫瘤活組織標(biāo)本中可靠的和明確的檢測整聯(lián)蛋白復(fù)合體。另ー個問題是提供篩選抗整聯(lián)蛋白抗體的方法，所述抗體在FFPE材料中在免疫組織化學(xué)期間顯示有效地區(qū)分整聯(lián)蛋白同源物的行為。本發(fā)明通過提供下述抗體解決第一個問題，所述抗體包含一或多條輕鏈和/或重鏈，每條鏈包含一個或多個兔源的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)并且任選地在輕和/或重(Vh)鏈的可變區(qū)中包含框架區(qū)(FR)，其中抗體具有結(jié)合整聯(lián)蛋白胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的能力。換言之，抗體包含至少ー個輕鏈可變區(qū)(V和/或至少ー個重鏈可變區(qū)(Vh)，毎一區(qū)包含至少一個兔源的互補(bǔ)決定區(qū)和任選地包含一個或多個框架區(qū)(FR)，其中抗體具有結(jié)合整聯(lián)蛋白胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的能力。更詳細(xì)地，本發(fā)明通過提供下述抗體解決第一個問題，所述抗體為針對具有來自昆蟲的糖基化模式的整聯(lián)蛋白和具有任何其他真核生物糖基化模式的整聯(lián)蛋白的單克隆兔抗體，或其片段，其中抗體或其片段至少包含輕鏈可變區(qū)(yL)和重鏈可變區(qū)(Vh)，其中抗體對胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域、胞外整聯(lián)蛋白鏈結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)整聯(lián)蛋白鏈結(jié)構(gòu)域的非封閉表位具有抗原結(jié)合特異性，并且其中抗體能夠在福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFP^材料中與完整的整聯(lián)蛋白異源ニ聚體結(jié)合，并且與在ELISA中分離的形式和/或在活細(xì)胞上天然的狀態(tài)具有基本相同的特異性。本發(fā)明人令人驚訝地說明通過在兔中使用整聯(lián)蛋白的胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或整聯(lián)蛋白鏈作為免疫原能夠容易地生成具有FFPE能力的抗體。用完整的結(jié)構(gòu)域獲得最好的結(jié)果，所述完整的結(jié)構(gòu)域能夠被有利地重組表達(dá)。特別地，已經(jīng)證明如果在昆蟲細(xì)胞中制備， 胞外異源ニ聚整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域是有效的免疫原。根據(jù)本發(fā)明提供的截短的整聯(lián)蛋白免疫原顯著地增強(qiáng)了表位的可及性并且導(dǎo)致對抗原有精確的敏感性和特異性的抗體。單克隆兔抗體選擇性地，但是獨立于糖基化模式與抗原結(jié)合。盡管針對來自昆蟲的重組蛋白產(chǎn)生本發(fā)明的有活性的抗體，它們在抗原的糖基化模式方面是多功能的，并且因此認(rèn)為它們是合適識別來自昆蟲的重組抗原的，但是并不限于這種模式。本發(fā)明的抗體良好地適合識別任何真核生物的糖基化模式的特定的整聯(lián)蛋白或其部分的胞外結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解糖基化模式不是混合的，而是分別地來自不同的真核細(xì)胞或生物的。這樣做吋，生成的抗體特別地能夠識別在復(fù)雜的FFPE基質(zhì)中的靶結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人已經(jīng)顯示了在FFPE組織中這些抗體用于整聯(lián)蛋白檢測的意想不到的適用性。就獲得的抗體對FFPE材料有強(qiáng)烈特異性和活性說明適用性。通過本發(fā)明的抗體能夠容易地檢測在FFPE材料中的整聯(lián)蛋白復(fù)合體是壓倒性的效應(yīng)。 盡管在FFPE材料中經(jīng)典的單克隆抗體不工作，在FFPE材料中本發(fā)明的抗體顯著地與它們的抗原結(jié)合并且在活細(xì)胞上具有相同的特異性；不限于以活細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)(例如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)，簡略為FACS)證明后者。本發(fā)明的抗體也能夠在FFPE材料中顯著地與它們的抗原結(jié)合，并且與在ELISA中以分離的形式具有相同特異性；在如在本說明書過程中描述的和在實施例3. 3中詳述的標(biāo)準(zhǔn)的ELISA不受限地證明后者。因此達(dá)到的在FFPE組織中的染色圖式比從現(xiàn)有技術(shù)的抗體必然地獲得的模糊的結(jié)果具有明顯的優(yōu)勢。迄今，已經(jīng)描述了至少M(fèi)個整聯(lián)蛋白復(fù)合體的組成。整聯(lián)蛋白是由兩個非共價結(jié)合鏈組成的細(xì)胞黏著分子的家族。阿爾法(α)和貝塔(β)亞基都橫跨膜并且使細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)區(qū)室整合，以遞送控制細(xì)胞黏著、増殖、遷移和侵入的那些細(xì)胞外信號?；诟髯缘慕M成，指定并且已知細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域并且通過常規(guī)方法能夠制備它們。從生物樣品分離天然來源的結(jié)構(gòu)域或重組表達(dá)并其后純化結(jié)構(gòu)域。特別地，從哺乳動物體內(nèi)(in-vivo)獲取樣品以用于分析整聯(lián)蛋白分布模式。樣品提取應(yīng)當(dāng)遵照優(yōu)質(zhì)醫(yī)學(xué)規(guī)范(good medical practice) 0可從具有目標(biāo)整聯(lián)蛋白的任何種類的生物物種獲取生物樣品，但是特別地樣品取自實驗室動物或人，更優(yōu)選地大鼠、小鼠、兔或人。通過任何本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行整聯(lián)蛋白的下游加工過程，隨后為結(jié)構(gòu)域分裂和分離細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。能夠在合適的、公知的裂解緩沖液中實施細(xì)胞裂解，所述緩沖液可引起滲透沖擊并且使細(xì)胞膜穿孔。也能夠通過機(jī)械カ(例如球磨機(jī)、弗氏壓碎器、超聲波等)，分別地通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜酶促降解，和/或通過表面活性劑(tenside)的作用破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？蛇M(jìn)ー步純化整聯(lián)蛋白以移除干擾物質(zhì)，或者在樣品中能夠濃縮整聯(lián)蛋白。優(yōu)選地通過沉淀、 透析、凝膠過濾、凝膠洗脫或色譜(例如HPLC或離子交換色譜)的方法實施下游加工過程和/或濃縮。為了更好的產(chǎn)率推薦組合若干種方法。優(yōu)選地，重組表達(dá)并純化細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域。能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)獲得、擴(kuò)增、任選地改變或合成編碼蛋白質(zhì)序列的DNA。能夠把DNA引入載體中并且在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。能夠把結(jié)構(gòu)域與用于親和層析的標(biāo)簽(例如Strep標(biāo)簽、His標(biāo)簽、GST 標(biāo)簽、Arg標(biāo)簽或鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白)融合，或使用建立的抗體親和純化技術(shù)純化結(jié)構(gòu)域。 用蛋白質(zhì)懸液加載柱并且所有缺乏標(biāo)簽的組分被立刻洗脫。在通過洗滌步驟移除非特異性結(jié)合物后，從柱移除融合標(biāo)簽的構(gòu)建體。如果標(biāo)簽影響抗體的誘導(dǎo)，在免疫之前把它切除。若干表達(dá)系統(tǒng)為本領(lǐng)域現(xiàn)有技木。令人感興趣地，如果使用來自昆蟲的重組整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，能夠有益地提高對免疫原的蛋白質(zhì)元件的效價。來自昆蟲的、重組的哺乳動物糖蛋白不完全地被糖基化，并且缺乏末端糖加工和延伸，這意味著與非重組蛋白或常規(guī)的真核表達(dá)的重組蛋白相比較蛋白質(zhì)表位高度暴露。因此具有來自昆蟲的糖基化模式的免疫原性的整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的。此外，當(dāng)把抗原依附到大的載體(例如蛋白質(zhì)或多糖)吋，能夠影響引起，更確切地說增加免疫應(yīng)答的抗原性質(zhì)；載體可為通過它本身并不引起免疫應(yīng)答的載體。整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域具有人的一級結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的實施方案，所述人的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列與匹配的數(shù)據(jù)庫中的人條目(例如序列數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot的登錄號)比對。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉此類分子生物學(xué)的數(shù)據(jù)庫以提取序列應(yīng)用在本文中。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案中，細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域具有人的一級結(jié)構(gòu)和昆蟲的糖基化模式。發(fā)明的抗體指由免疫球蛋白基因或其部分編碼的多肽。抗體包含至少一條輕鏈和 /或至少一條重鏈，優(yōu)選地至少一條輕鏈和至少一條重鏈，更優(yōu)選地兩條輕鏈和兩條重鏈， 它們中的每ー個如以下定義。意思是，輕鏈在所述輕鏈的可變區(qū)中包含至少ー個CDR， 特別地是兔源的CDR，并且任選地在所述輕鏈的可變區(qū)(VJ中包含至少ー個FR，優(yōu)選地輕鏈包含至少所述CDR和至少所述FR。重鏈在所述重鏈的可變區(qū)(Vh)中包含至少ー個CDR， 特別地是兔源的CDR，和/或在所述重鏈的可變區(qū)(Vh)中包含至少ー個FR，優(yōu)選地重鏈包含至少所述CDR和至少所述FR。在抗體的抗原結(jié)合部分中，CDR直接與抗原的表位相互作用而FR維持互補(bǔ)位的三級結(jié)構(gòu)。在免疫球蛋白的輕鏈和重鏈中，均有3到4個分別由三個互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R-I到⑶R-3)分離開的框架區(qū)(FR-1到FR-4)。⑶R或高變區(qū)，特別地⑶R-3 區(qū)，更特別地重鏈⑶R-3，很大程度上負(fù)責(zé)抗體親和性和特異性。在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的實施方案中，輕鏈可變區(qū)(VJ包含2個⑶R，更優(yōu)選地3 個⑶R，最優(yōu)選地與FR數(shù)目相同或甚至比FR再多ー個。仍然在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的實施方案中，重鏈可變區(qū)(Vh)包含2個CDR，更優(yōu)選地3個CDR，最優(yōu)選地與FR數(shù)目相同或甚至比FR再多ー個。在另ー個更優(yōu)選地實施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)，每一區(qū)包含2個⑶R，最優(yōu)選地3個⑶R，非常優(yōu)選地與FR數(shù)目相同或甚至比FR再多ー個。換言之，本發(fā)明的抗體將至少包含分別來自單鏈可變區(qū)的最小支架，其賦予分別對任何整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或特別是胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明，抗體也能夠作為免疫球蛋白的許多其他良好表征的片段或甚至作為完整的免疫球蛋白來存在，條件是給定前述的最小支架。優(yōu)選地片段選自重鏈(H)、輕鏈(L)、可變區(qū)(V)、單鏈可變片段(scFv)、由共價結(jié)合的抗體輕鏈和抗體重鏈的一部分(Fd)組成的Fab片段，等?？贵w的輕鏈能夠額外地包含輕鏈恒定區(qū)(Q)。相似地，抗體的重鏈能夠額外地包含重鏈恒定區(qū)(Ch)或其部分，其中部分特別地指Fd區(qū)內(nèi)的恒定區(qū)。Fd片段是抗體特異性的主要決定子并且單獨保持表位結(jié)合能力。本發(fā)明的抗體也能夠由F。片段作為補(bǔ)體級聯(lián)的效應(yīng)子完成，所述補(bǔ)體級聯(lián)不涉及抗體結(jié)合。能夠通過使用多種肽酶切割生產(chǎn)片段，例如Fab 和F。片段。此外，能夠工程化并重組表達(dá)抗體，優(yōu)選地scFv。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，抗體能夠為多克隆或單克隆源的。當(dāng)由抗原引發(fā)免疫應(yīng)答吋，通常在哺乳動物生物體中生產(chǎn)多克隆抗體，所述抗原對生物體是陌生的并具有超過 3.000g/mol的分子重量。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。單克隆抗體的巨大優(yōu)勢包括永生的試劑源、穩(wěn)定的抗體性質(zhì)和精確的特異性。生產(chǎn)單克隆抗體的流行的技木，例如雜交瘤技木，也為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。用于多克隆和/或單克隆抗體生產(chǎn)的有利的宿主物種包含大鼠、山羊、兔和小鼠， 更優(yōu)選地兔。兔抗體，更優(yōu)選地兔單克隆抗體(RabMab)，顯示了比小鼠單克隆更高的親和性
7和更寬范圍的表位識別，而由于免疫系統(tǒng)的趨異性，和擴(kuò)大的CDR，與鼠應(yīng)答相比較，能夠生產(chǎn)對表位，優(yōu)選地人表位的更強(qiáng)的應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)理解能夠遺傳工程化嵌合抗體，其CDR、FR和 /或恒定區(qū)來自不同的哺乳動物源，只要ー個或多個⑶R具有兔源。相應(yīng)地，能夠通過不僅置換CDR而且置換非兔源輕和重鏈的整個可變區(qū)獲得嵌合抗體。通過在可變區(qū)內(nèi)一些氨基酸的選擇性交換能夠備選地影響抗原結(jié)合位點的親和性。用于制備單克隆兔抗體的基本原理如用于鼠單克隆的。在兔免疫后，從生產(chǎn)多克隆血清的兔取得脾臟。用兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系融合免疫的兔的分離的兔B細(xì)胞以生產(chǎn)穩(wěn)定的雜交瘤。就抗體分泌測試雜交瘤細(xì)胞，所述抗體是免疫原特異性的，并且它們隨后能夠被克隆。由 Spieker-Polet 等人，PNAS USA 1995,92(20) :9348-9352 描述了兔雜交瘤融合伴侶細(xì)胞系的初始建立。在US7，429，487 B2中公開了融合伴侶細(xì)胞系的進(jìn)ー步發(fā)展。在美國申請編號 10/705，109 ； 10/266, 387 ；10/313，881 ；10/350，841 和 11/476，277 中還公開了其他的方法。編碼抗體的插入片段的cDNA被優(yōu)選地克隆、測序并被插入到表達(dá)載體中以允許完全定義的抗體的生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于抗體重組生產(chǎn)的合適的技木，例如根據(jù) Pham等人，Biotech Bioeng2003,84(3) :332-342在EBNA細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中。在本發(fā)明公開內(nèi)容中整體引用所述出版物作為參考?？贵w或其片段特別地針對整聯(lián)蛋白ανβ3、ανβ5、ανβ6·ανβ8的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的特別的實施方案中，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白 α νβ 3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在Vl中合適的CDR包含SEQ ID NO :81 (CDR-l-Vf α ν β 3)、 SEQ ID NO :82(CDR-2-VL-a νβ 3)禾ロ/或 SEQ ID NO 83 (CDR-3-VL-a ν β 3)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的CDR包含SEQ ID NO 84 (CDR-I-Vh- α ν β 3)、 SEQ ID NO 85 (CDR-2-VH-a ν β 3)禾ロ/或 SEQ ID NO :86 (CDR-3_VH-a v β 3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在\中的CDR包含SEQ ID NO 81 (CDR-l-Vf α ν β 3)、 SEQ ID NO :82(CDR-2-VL-a νβ 3)和 SEQ ID NO 83 (CDR-3-VL- a ν β 3)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 84 (CDR-I-Vh- α ν β 3), SEQ ID NO
85(CDR-2-VH-α ν β 3)禾ロ SEQ ID NO :86 (CDR-3_VH-α ν β 3)的氨基酸序列。更優(yōu)選地， 在 Vl 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 81 (CDR-I-Vl- α ν β 3)、SEQ ID NO :82 (CDR-2_VL- a ν β 3) 和SEQ ID NO 83 (CDR-3_Vl_ α ν β 3)的氨基酸序列，并且在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 84 (CDR-I-Vh- α ν β 3) , SEQ ID NO :85 (CDR-2_Vh-α ν β 3)禾ロ SEQ ID NO:
86(CDR-3_Vh- α νβ3)的氨基酸序列。而涉及抗a V β 3抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO
87(FR-I-Vl- α ν β 3) , SEQ ID NO 88 (FR-2_Vl-α ν β 3)禾ロ/或 SEQ ID NO: 89 (FR-3-Vl- α ν β ；3)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO
91(FR-I-Vh- α ν β 3)、SEQ ID NO :92 (FR-2_VH- a v β 3)、SEQ ID NO :93 (FR-3_VH- a v β 3)禾ロ /或SEQ ID NO 94 (FR-4-V a ν β 3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的FR包含SEQ ID NO 87 (FR-I-Vl- α ν β 3)、SEQ ID NO :88 (FR-2_VL- α ν β 3)禾ロ SEQ ID NO :89 (FR-3_VL- a ν β 3) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 91 (FR-I-Vh-α ν β 3), SEQ ID NO:
92(FR-2-VH- α ν β 3)、SEQ ID NO :93 (FR-3_VH- a ν β 3)禾ロ SEQ ID NO :94 (FR-4-V a ν β 3) 的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在Vl中的FR包含SEQ ID NO 87 (FR-I-Vl-α ν β 3), SEQ IDNO 88 (FR-2-Vl- α ν β 3)禾ロ SEQ ID NO :89 (FR-3_VL- α ν β 3)的氨基酸序列，并且在 Vh 中的 FR 包含 SEQ ID NO 91 (FR-トVh- α ν β 3)、SEQ ID NO :92 (FR-2-V α ν β 3)、SEQ ID NO 93 (FR-3-VH- α ν β 3)和 SEQ ID NO :94 (FR-4-V α ν β 3)的氨基酸序列。作為抗α νβ3抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在\中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 81 (CDR-I-Vl- α ν β 3), SEQ ID NO 82 (CDR-2-Vl-α ν β 3) 和/或SEQ ID NO :83(CDR-3-VL_a νβ ；3)的氨基酸序列，并且在Vl中合適的 FR 包含 SEQ ID NO :87(FR-ト VL-a νβ 3)、SEQ ID NO 88 (FR-2-VL-a ν β 3)禾ロ / 或SEQ ID NO :89(FR-3-VL-a νβ3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含 SEQ ID NO :81 (CDR-トVl-α ν β 3)、SEQ ID NO 82 (CDR-2-VL- a ν β 3)禾ロ SEQ ID NO 83 (CDR-3-Vl- α ν β 3)的氨基酸序列，并且在VL中的FR包含SEQ ID NO 87 (FR-I-Vl- α ν β 3)、SEQ ID NO :88 (FR-2_VL- α ν β 3)禾ロ SEQ ID NO :89 (FR-3_VL- a ν β 3) 的氨基酸序列。還是作為抗ανβ3抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 84 (CDR-I-Vh- α ν β 3)、SEQ ID NO :85 (CDR-2-V α ν β 3) 和/或SEQ ID NO 86 (CDR-3_VH_ a ν β 3)的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含 SEQ ID NO :91 (FR-ト Vh-α ν β 3)、SEQ ID NO 92 (FR-2-VH- a ν β 3) , SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-α ν β 3)禾ロ/或 SEQ ID NO :94 (FR-4_VH_ a v β ；3)的氨基酸序列。優(yōu)選地， 在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 84 (CDR-I-Vh-α ν β 3)、SEQ ID NO :85 (CDR-2_VH-a v β 3) 和SEQ ID NO 86 (CDR-3-V a ν β 3)的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 91 (FR-I-Vh- α ν β 3)、SEQ ID NO :92 (FR-2_VH- a v β 3)、SEQ ID NO :93 (FR-3_VH- a v β 3)禾ロ SEQ ID NO :94(FR-4-VH-a νβ 3)的氨基酸序列。在另ー個抗α ν β 3抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，ん包含SEQ ID NO 95(Vl_ci νβ;3)的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO :96 (VH_ α ν β幻的氨基酸序列， 更優(yōu)選地VL由SEQ ID NO:95(VL_av0;3)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO 96 (Vh- ανβ3)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗α ν β 3scFv0通過輕鏈的恒定區(qū)(Cl)和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗ανβ3抗體。 優(yōu)選地，Cl包含SEQ ID NO 97 (Cl- α ν β 3)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO
98(Ch- α ν β 3)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗α νβ 3抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO
99(L- α ν β 3)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO 100 (H-α ν β 3)的氨基酸序列。 最優(yōu)選地，輕鏈由SEQ ID NO :99(L-a νβ3)的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID NO 100(Η-ανβ3)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID Ν0 99 (L- α ν β 3)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID NO 100 (H- α ν β 3)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的特別的實施方案中，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白α νβ 5 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在Vl中合適的CDR包含SEQ ID NO 1 (CDR-I-Vl-α ν β 5)、SEQ ID NO: 2 (CDR-2-Vf α ν β 幻和/或 SEQ ID NO :3 (CDR_3_Vf a ν β 5)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 4 (CDR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO :5 (CDR-2-V α ν β 5)和/ 或SEQ ID NO 6 (CDR-3-V a ν β 5)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含SEQ ID NO 1(CDR-I-Vl- α ν β 5)、SEQ ID NO :2 (CDR-2_VL- α ν β 5)禾ロ SEQ ID NO 3 (CDR-3_VL- α ν β 5) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中的CDR包含SEQ ID NO :4 (CDR-I-Vh-α ν β幻、SEQ ID NO 5 (CDR-2-V α ν β 5)和 SEQ ID NO :6 (CDR-3-V α v β 幻的氨基酸序列。更優(yōu)選地， 在 Vl 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 1 (CDR-I-Vl- α ν β 5)、SEQ ID NO :2 (CDR-2_VL- α ν β 5) 和SEQ ID NO 3 (CDR-3-Vl- α ν β 5)的氨基酸序列，并且在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 4 (CDR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO :5 (CDR-2_VH- α ν β 5)和 SEQ ID NO 6 (CDR-3_VH- α ν β 5) 的氨基酸序列。而涉及抗α V β 5抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO 7 (FR-I-Vl- α ν β 5)、SEQ ID NO :8 (FR-2_VL- α ν β 5)禾ロ/或 SEQ ID NO :9 (FR-3_VL- α ν β 5) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO 11 (FR-I-Vh- α ν β 5)、 SEQ ID NO :12(FR-2-VH-a νβ 5)、SEQ ID NO 13 (FR-3-VH-a ν β 5)禾ロ/或 SEQ ID NO :14(FR-4-VH-a νβ5)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的FR包含SEQ ID NO 7 (FR-トVl-α ν β 5)、SEQ ID NO 8 (FR-2-VL-a ν β 5)禾ロ SEQ ID NO 9 (FR-3-VL-a ν β 5) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 11 (FR-トVh- α ν β 5)、SEQ ID NO
12(FR-2-VH- α ν β 5)、SEQ ID NO :13 (FR-3_VH- a ν β 5)禾ロ SEQ ID NO 14 (FR-4-V a ν β 5) 的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在\中的FR包含SEQ ID NO 7 (FR-I-Vl-α ν β 5), SEQ ID NO 8 (FR-2-Vl- α ν β 5)和 SEQ ID NO :9 (FR-3_VL- a ν β 5)的氨基酸序列，并且在 Vh 中的 FR 包含 SEQ ID NO 11 (FR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO 12 (FR-2-V α ν β 5)、SEQ ID NO
13(FR-3-Vh- α ν β 5)和 SEQ ID NO 14 (FR-4-V α ν β 5)的氨基酸序列。作為抗α νβ 5抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在\中合適的⑶R 包含 SEQ ID NO 1 (CDR-I-Vl- α ν β 5), SEQ ID NO 2 (CDR-2-Vl-α ν β 5)和/或 SEQ ID NO 3 (CDR-3-VL- α ν β幻的氨基酸序列，并且在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO 7 (FR-I-Vl- α ν β 5)、SEQ ID NO :8 (FR-2_VL- α ν β 5)禾ロ/或 SEQ ID NO :9 (FR-3_VL- a ν β 5) 的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含SEQ ID NO 1 (CDR-I-Vl- α ν β 5)、SEQ ID NO
2(CDR-2-\- α ν β幻和SEQ ID NO 3 (CDR-3-\- a ν β 5)的氨基酸序列，并且在^中的 FR 包含 SEQ ID NO 7 (FR-I-Vl-α ν β 5), SEQ ID NO :8 (FR-2_VL-α ν β 5)禾ロ SEQ ID NO: 9 (FR-3-Vl- α νβ5)的氨基酸序列。還作為抗ανβ5抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 4 (CDR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO :5 (CDR-2-V α ν β 5)禾ロ/或 SEQ ID NO 6 (CDR-3-Vh- a ν β 5)的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO
11(FR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO :12 (FR-2_VH- α ν β 5)、SEQ ID NO :13 (FR-3-V a v β 5)禾ロ /或SEQ ID N0:14(FR-4-VH-a νβ。的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 4 (CDR-I-Vh- α ν β 5)、SEQ ID NO :5 (CDR-2_VH- α ν β 5)和 SEQ ID NO :6 (CDR-3_VH- a ν β 5) 的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 11 (FR-I-Vh-α ν β 5), SEQ ID NO:
12(FR-2-VH- α ν β 5)、SEQ ID NO :13 (FR-3_VH- a ν β 5)禾ロ SEQ ID NO 14 (FR-4-V a ν β 5) 的氨基酸序列。在另ー個抗α ν β 5抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，ん包含SEQ ID NO 15(Vl_Q νβ5)的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO 16 (VH-α ν β 5)的氨基酸序列， 更優(yōu)選地\由SEQ ID NO 15 (Vl- α ν β 5)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO 16 (Vh- ανβδ)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗α ν β 5scFv0通過輕鏈的恒定區(qū)(Cl)和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗ανβ5抗體。 優(yōu)選地，Cl包含SEQ ID NO :17(CL-a νβ5)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO:
18(Ch- α ν β 5)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗α ν β 5抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO
19(L- α ν β 5)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO 20 (H- α ν β 5)的氨基酸序列。最優(yōu)選地，輕鏈由SEQ ID NO:19(L-avi3。的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID NO: 20(Η-ανβ5)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID NO 19(L-a νβ5)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID NO :20(Η-α νβ5)的氨基酸序列組成。還在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的特別的實施方案中，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白 α νβ 6的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在Vl中合適的CDR包含SEQ ID NO 121 (CDR-I-Vl-α ν β 6)、 SEQ ID NO :122(CDR-2-VL-a ν β 6)禾ロ/或 SEQ ID NO 123 (CDR-3-VL-a ν β 6)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的CDR包含SEQ ID NO 1 (CDR-I-Vh-α ν β 6)、 SEQ ID NO :125(CDR-2-VH-a ν β 6)禾ロ/或 SEQ ID NO 126 (CDR-3-VH-a ν β 6)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在^中的CDR包含SEQ ID NO :121 (CDR-I-V^ α ν β 6)、 SEQ ID NO :122(CDR-2-VL-a νβ 6)禾ロ SEQ ID NO 123 (CDR-3-VL-a ν β 6)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO :124 (CDR-I-Vh- α ν β 6)、SEQ ID NO
125(CDR-2-Vh- α ν β 6)和 SEQ ID NO :126 (CDR-3_VH- a ν β 6)的氨基酸序列。更優(yōu)選地， 在 Vl 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 121 (CDR-トVl-α ν β 6)、SEQ ID NO 122 (CDR-2-VL-a ν β 6) 和SEQ ID NO :123 (CDR-3_Vl_ α ν β 6)的氨基酸序列，并且在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 124 (CDR-I-Vh- α ν β 6) , SEQ ID NO 125 (CDR-2-Vh-α ν β 6)禾ロ SEQ ID NO:
126(CDR-3_Vh- α ν β 6)的氨基酸片列。而涉及抗a V β 6抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO
127(FR-I-Vl- α ν β 6) , SEQ ID NO 128 (FR-2-Vl-α ν β 6)禾ロ/或 SEQ ID NO: 129 (FR-3-Vl- α ν β 6)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO 13 l(FR-l-VH-a ν β 6), SEQ ID NO 132 (FR-2_VH-α ν β 6)、SEQ ID NO :133 (FR-3_VH-a v β 6) 和/或SEQ ID NO :134(FR-4-VH-a νβ6)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的FR包含 SEQ ID NO 127 (FR-I-Vl-α ν β 6) , SEQ ID NO 128 (FR-2-VL-a ν β 6)禾ロ SEQ ID NO :129 (FR-3-Vl- α ν β 6)的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 131 (FR-l-VH-a ν β 6), SEQ ID NO 132 (FR-2_VH-α ν β 6)、SEQ ID NO :133 (FR-3_VH-a v β 6) 和SEQ ID NO :134(FR-4-VH-a νβ6)的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在Vl中的FR包含 SEQ ID NO :127 (FR-トVl-α ν β 6)、SEQ ID NO 128 (FR-2_VL-α ν β 6)禾ロ SEQ ID NO :129 (FR-3-Vl- a ν β 6)的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 131 (FR-l-VH-a ν β 6), SEQ ID NO 132 (FR-2_VH-α ν β 6)、SEQ ID NO :133 (FR-3_VH-a v β 6) 和 SEQ ID NO :134(FR-4-VH-a νβ6)的氨基酸序列。作為抗α νβ6抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在ん中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 121 (CDR-I-Vl-α ν β 6), SEQ ID NO 122 (CDR-2-VL-a ν β 6) 和/或SEQ ID NO :123 (CDR-3-Vl_ α ν β 6)的氨基酸序列，并且在VL中合適的FR包含 SEQ ID NO 127 (FR-I-Vl- α ν β 6) , SEQ ID NO 128 (FR-2-Vl-α ν β 6)禾ロ / 或SEQ ID NO :129(FR-3-VL-a νβ6)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含 SEQ ID NO 121 (CDR-I-Vl- α ν β 6) , SEQ ID NO 122 (CDR-2-Vl-a ν β 6)禾ロ SEQ ID NO :123(CDR-3-VL-a νβ6)的氨基酸序列，并且在Vl中的FR包含SEQ ID NO 127 (FR-I-Vl- α ν β 6) , SEQ ID NO 128 (FR-2-Vl-a ν β 6)禾ロ SEQ ID NO: 129 (FR-3-Vl- α ν β 6)的氨基酸序列。還作為抗ανβ6抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 124 (CDR-I-Vh- α ν β 6), SEQ ID NO 125 (CDR-2-Vh-α ν β 6) 和/或SEQ ID NO 126 (CDR-3_VH_ a ν β 6)的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含 SEQ ID NO 131 (FR-l-VH-a νβ 6), SEQ ID NO 132 (FR-2-VH- α ν β 6), SEQ ID NO 133 (FR-3-Vh- α ν β 6)禾ロ/或 SEQ ID NO 134 (FR-4-V α ν β 6)的氨基酸序列。優(yōu)選地， 在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 124 (CDR-I-Vh- α ν β 6)、SEQ ID NO 125 (CDR-2-V α ν β 6) 和SEQ ID NO 126 (CDR-3-V a ν β 6)的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 131 (FR-l-VH-a ν β 6), SEQ ID NO 132 (FR-2_VH-α ν β 6)、SEQ ID NO :133 (FR-3_VH-a v β 6) 和 SEQ ID NO :134(FR-4-VH-a νβ6)的氨基酸序列。在另ー個抗α ν β 6抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，ん包含SEQ ID NO 135(VL-a νβ6)的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO 136 (VH-α ν β 6)的氨基酸序列， 更優(yōu)選地\由SEQ ID NO 135 (Vl- α ν β 6)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO 136 (Vh- α ν β 6)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗α ν β BscFv0通過輕鏈的恒定區(qū)(Cl)和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗ανβ6抗體。 優(yōu)選地，Cl包含SEQ ID N0:137(CL-av^6)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO 138(0Η-ανβ6)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗α ν β 6抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO 139 (L- α ν β 6)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO 140 (H- α ν β 6)的氨基酸序列。 最優(yōu)選地，輕鏈由SEQ ID NO :139 (L- α ν β 6)的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID NO 140(Η-ανβ6)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID Ν0 139 (L- α ν β 6)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID NO :140 (H- α ν β 6)的氨基酸序列組成。還在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的特別的實施方案中，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白 α νβ 8的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在Vl中合適的CDR包含SEQ ID NO 161 (CDR-I-Vl-α ν β 8), SEQ ID NO :162(CDR-2-VL-a ν β 8)禾ロ/或 SEQ ID NO 163 (CDR-3-VL-a ν β 8)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的CDR包含SEQ ID NO 164 (CDR-I-Vh-α ν β 8)、 SEQ ID NO :165(CDR-2-VH-a ν β 8)禾ロ/或 SEQ ID NO 166 (CDR-3-VH-a ν β 8)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在^中的CDR包含SEQ ID NO :161 (CDR-1-Vf α ν β 8)、 SEQ ID NO :162(CDR-2-VL-a νβ 8)禾ロ SEQ ID NO 163 (CDR-3-VL-a ν β 8)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 164 (CDR-I-Vh-α ν β 8)、SEQ ID NO 165 (CDR-2-Vh- α ν β 8)和 SEQ ID NO :166 (CDR-3_VH- a ν β 8)的氨基酸序列。更優(yōu)選地， 在 Vl 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 161 (CDR-I-Vl- α ν β 8)、SEQ ID NO 162 (CDR-2_VL- α ν β 8) 和SEQ ID NO 163 (CDR_3-Vl_ α ν β 8)的氨基酸序列，并且在Vh中的CDR包含SEQID NO 164 (CDR-I-Vh- α ν β 8) , SEQ ID NO 165 (CDR-2-Vh-α ν β 8)禾ロ SEQ ID NO:
166(CDR-3_Vh- α ν β 8)的氨基酸序列。而涉及抗α V β 8抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO
167(FR-I-Vl- α ν β 8) , SEQ ID NO 168 (FR-2-Vl-α ν β 8)禾ロ/或 SEQ ID NO: 169 (FR-3-Vl- α ν β 8)的氨基酸序列，并且/或在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO 17 l(FR-l-VH-a ν β 8), SEQ ID NO 172 (FR-2_VH-α ν β 8)、SEQ ID NO :173 (FR-3_VH-α v β 8) 和/或SEQ ID NO :174(FR-4-VH-a νβ8)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的FR包含 SEQ ID NO 167 (FR-I-Vl- α ν β 8) , SEQ ID NO 168 (FR-2-Vl-a ν β 8)禾ロ SEQ ID NO 169 (FR-3-Vl- α ν β 8)的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 171 (FR-l-VH-a ν β 8), SEQ ID NO 172 (FR-2_VH-α ν β 8)、SEQ ID NO :173 (FR-3_VH-a v β 8) 和SEQ ID NO :174(FR-4-VH-a νβ8)的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在Vl中的FR包含 SEQ ID NO :167 (FR-トVl-α ν β 8)、SEQ ID NO 168 (FR-2_VL-α ν β 8)禾ロ SEQ ID NO :169 (FR-3-Vl- a ν β 8)的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 171 (FR-l-VH-a ν β 8), SEQ ID NO 172 (FR-2_VH-α ν β 8)、SEQ ID NO :173 (FR-3_VH-a v β 8) 和 SEQ ID NO :174(FR-4-VH-a νβ8)的氨基酸序列。作為抗α νβ8抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在\中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 161 (CDR-I-Vl-α ν β 8), SEQ ID NO 162 (CDR-2-VL-a ν β 8) 和/或SEQ ID NO :163 (CDR_3-Vl_ α ν β 8)的氨基酸序列，并且在VL中合適的FR 包含 SEQ ID NO 167 (FR-I-Vl- α ν β 8) , SEQ ID NO 168 (FR-2-Vl-a ν β 8)禾ロ / 或SEQ ID NO :169(FR-3-VL-a νβ8)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含 SEQ ID NO 161 (CDR-I-Vl- α ν β 8) , SEQ ID NO 162 (CDR-2-Vl-a ν β 8)禾ロ SEQ ID NO :163(CDR-3-VL_a νβ 8)的氨基酸序列，并且在Vl中的FR包含SEQ ID NO 167 (FR-I-Vl- α ν β 8) , SEQ ID NO 168 (FR-2-Vl-a ν β 8)禾ロ SEQ ID NO: 169 (FR-3-Vl- α ν β 8)的氨基酸序列。還作為抗ανβ8抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 164 (CDR-I-Vh- α ν β 8), SEQ ID NO 165 (CDR-2-Vh-α ν β 8) 和/或SEQ ID NO 166 (CDR-3_VH_ a ν β 8)的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含 SEQ ID NO 171 (FR-l-VH-a νβ 8), SEQ ID NO 172 (FR-2-VH- α ν β 8), SEQ ID NO 173 (FR-3-Vh- α ν β 8)禾ロ/或 SEQ ID NO 174 (FR-4-V α ν β 8)的氨基酸序列。優(yōu)選地， 在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 164 (CDR-I-Vh- α ν β 8)、SEQ ID NO 165 (CDR-2-V α ν β 8) 和SEQ ID NO 166 (CDR-3-V a ν β 8)的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO 171 (FR-l-VH-a ν β 8), SEQ ID NO 172 (FR-2_VH-α ν β 8)、SEQ ID NO :173 (FR-3_VH-a v β 8) 和 SEQ ID NO :174(FR-4-VH-a νβ8)的氨基酸序列。在另ー個抗α ν β 8抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，ん包含SEQ ID NO 175(VL-a νβ8)的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO 176 (VH-α ν β 8)的氨基酸序列， 更優(yōu)選地\由SEQ ID NO 175 (Vl- α ν β 8)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO 176 (Vh- ανβ8)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗α ν β SscFv0通過輕鏈的恒定區(qū)(Cl)和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗ανβ8抗體。 優(yōu)選地，Cl包含SEQ ID N0:177(CL-av^8)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO 178(0Η-ανβ8)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗α ν β 8抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO 179 (L- α ν β 8)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO 180 (H- α ν β 8)的氨基酸序列。 最優(yōu)選地，輕鏈由SEQ ID NO :179 (L- α ν β 8)的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID NO 180(Η-ανβ8)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID NO 179 (L- α ν β 8)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID NO :180 (H- α ν β 8)的氨基酸序列組成。還在本發(fā)明的另ー個優(yōu)選的特別的實施方案中，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白αν 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在Vl中合適的CDR包含SEQ ID NO :201 (CDR-I-Vl- α v)、SEQ ID NO
202(CDR-2-Vl- α ν)和/或 SEQ ID NO :203 (CDR-3_VL- α v)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO :204 (CDR-I-Vh- α v)、SEQ ID NO :205 (CDR-2-V α v)禾ロ/或 SEQ ID NO 206 (CDR-3_VH- α v)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含SEQ ID NO 201 (CDR-I-Vl- α v)、SEQ ID NO :202 (CDR-2_VL- α v)禾ロ SEQ ID NO :203 (CDR-3_VL- α ν) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中的CDR包含SEQ ID NO :204 (CDR-I-Vh-α v)、SEQ ID NO: 205 (CDR-2-Vh- α v)和 SEQ ID NO :206 (CDR-3-V α v)的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在 Vl 中的 CDR 包含 SEQ ID NO :201 (CDR-I-Vl- α v)、SEQ ID NO :202 (CDR-2-VL- α v)和 SEQ ID NO
203(CDR-3-Vl-α ν)的氨基酸序列，并且在Vh 中的CDR包含 SEQ ID NO :204 (CDR-I-Vh-α ν)、 SEQ ID NO :205(CDR-2-VH-a v)和 SEQ ID NO :206 (CDR-3_VH-a v)的氨基酸序列。而涉及抗a V抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO :207 (FR-I-Vl- α ν)、 SEQ ID NO 208 (FR-2-VL- a v)和/或 SEQ ID NO :209 (FR-3-VL- a v)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中合適的 FR 包含 SEQ ID NO :211 (FR-I-Vh- a v)、SEQ ID NO :212 (FR-2_VH- a v)、 SEQ ID NO :213(FR-3-VH-a v)和/或 SEQ ID NO :214 (FR-4_VH-a v)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在 Vl 中的 FR 包含 SEQ ID NO :207 (FR-I-Vl- a v)、SEQ ID NO :208 (FR-2_VL- a v) 和SEQ ID NO :209 (FR-3-VL- a v)的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 211 (FR-l-VH-a ν) , SEQ ID NO 212 (FR-2-VH-a v), SEQ ID NO 213 (FR-3-VH-a v)禾ロ SEQ ID NO :214(FR-4-VH-a v)的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在Vl中的FR包含SEQ ID Ν0: 207 (FR-I-Vl- a ν)、SEQ ID NO :208 (FR-2_VL- a v)禾ロ SEQ ID NO :209 (FR-3_VL- a v) 的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO :211 (FR-I-Vh- a v)、SEQ ID NO 212(FR-2-VH-a ν)、SEQ ID NO :213 (FR-3_VH-a v)和 SEQ ID NO :214 (FR-4_VH-a v)的氨基酸序列。作為抗α ν抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在ん中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO :201 (CDR-ト Vl-α ν)、SEQ ID NO 202 (CDR-2-VL-a ν)禾ロ/或 SEQ ID NO :203(CDR-3-VL_a ν)的氨基酸序列，并且在Vl中合適的FR包含SEQ ID N0: 207 (FR-I-Vl- a ν)、SEQ ID NO :208 (FR-2_VL- a v)禾ロ/或 SEQ ID NO :209 (FR-3_VL- a v) 的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含SEQ ID NO 201 (CDR-I-Vl-a v), SEQ ID NO 202 (CDR-2-Vl- a v)和 SEQ ID NO :203 (CDR-3_VL- a v)的氨基酸序列，并且在^中的 FR 包含 SEQ ID NO :207 (FR-I-Vl- a v)、SEQ ID NO :208 (FR-2-VL- a v)和 SEQ ID NO 209 (FR-3-Vl- a v)的氨基酸序列。還作為抗α ν抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的
14CDR 包含 SEQ ID NO 204 (CDR-I-Vh-α v), SEQ ID NO :205 (CDR-2_VH-α v)禾ロ/或 SEQ ID NO :206 (CDR-3-Vh- α v)的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO 211 (FR-I-Vh- α v)、SEQ ID NO :212 (FR-2-V α ν)、SEQ ID NO :213 (FR-3-V α v)禾ロ/或 SEQ ID NO :214(FR-4-VH-a v)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 204(CDR4-VH-av)、SEQ ID NO 205 (CDR-2-VH-a ν)禾ロ SEQ ID NO :206 (CDR-3_VH-a v) 的氨基酸序列，并且在Vh中的FR包含SEQ ID NO :211 (FR-I-Vh- a v)、SEQ ID NO 212(FR-2-VH-a ν)、SEQ ID NO :213 (FR-3_VH-a v)和 SEQ ID NO :214 (FR-4_VH-a v)的氨基酸序列。在另ー個抗α ν抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，\包含SEQ ID NO :215 (VL- α ν) 的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO 216 (VH- a ν)的氨基酸序列，更優(yōu)選地\由SEQ ID NO 215 (VL- a ν)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO :216 (VH- a ν)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗avscFv。通過輕鏈的恒定區(qū)(CJ和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗α ν抗體。優(yōu)選地， Cl包含SEQ ID NO 217 (CL-α ν)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO :218 (C0-a ν)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗αν抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID NO 219 (L-α ν)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO :220 (H_ a v)的氨基酸序列。最優(yōu)選地，輕鏈由SEQ ID NO 219 (L- a ν)的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID NO :220 (H- a ν) 的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID NO 219 (L-α ν)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID NO 220 (H-α ν)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另ー個實施方案中，把整聯(lián)蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域用作初級免疫原。所述細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也被稱為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。它們被特別地表示為N端融合蛋白質(zhì)。融合伴侶可以是不同的(例如GST、MBP、KLH等)以允許以下描述的差示篩選，或能夠排除初級和次級篩選，直接進(jìn)入在細(xì)胞系陣列上的三級篩選。細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象不如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象確定，并且它相對地獨立于成對的鏈，即針對如β 3的抗體將識別與ανβ3禾ロ與 a iib β 3關(guān)聯(lián)的β 3。這有效地降低了抗體對DTM- α ν β 3復(fù)合體的特異性，能夠篩選所述 DTM- α ν β 3復(fù)合體以獲得僅當(dāng)β 3與α ν相關(guān)聯(lián)時才識別β 3的抗體。相似的考慮應(yīng)用于針對α νβ 5生成的抗體。然而，優(yōu)勢是整聯(lián)蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域在哺乳動物中完全地保守并因此，能夠產(chǎn)生寬的跨物種反應(yīng)性。特別地，抗體或其片段針對整聯(lián)蛋白β 3鏈的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。下述是此類抗β 3 抗體的特殊的實施方案，即在Vl中合適的⑶R包含SEQ ID NO :41(⑶R-I-Vf β 3)、SEQ ID NO 42 (CDR-2-Vl- β 幻和/或 SEQ ID NO 43 (CDR-3_VL- β 3)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中合適的 CDR 包含 SEQ ID NO 44 (CDR-I-Vh- β 3)、SEQ ID NO :45 (CDR-2-V β 3)和 /或SEQ ID NO :46(CDR-3-Vh-0;3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vl中的CDR包含SEQ ID NO 41 (CDR-I-Vl- β 3)、SEQ ID NO :42 (CDR-2_VL- β 3)禾ロ SEQ ID NO :43 (CDR-3_VL- β 3) 的氨基酸序列，并且/或在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 44 (CDR-I-Vh- β 3)、SEQ ID NO 45 (CDR-2-V β 3)和SEQ ID NO :46 (CDR-3_VH-β幻的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在ん中的 CDR 包含 SEQ ID NO :41 (CDR-I-Vl-β 3)、SEQ ID NO 42 (CDR-2-VL-β 3)和 SEQ ID NO 43 (CDR-3-Vl- β 3)的氨基酸序列，并且在 Vh 中的 CDR 包含 SEQ ID NO 44 (CDR-I-Vh- β 3)、SEQ ID NO :45(CDR-2-VH-^ 3)和 SEQ ID NO 46 (CDR-3-VH-β 3)的氨基酸序列。而涉及抗β 3抗體的背景，在Vl中合適的FR包含SEQ ID NO 47 (FR-I-Vl- β 3)、 SEQ ID NO 48 (FR-2_VL- β 3)和/或 SEQ ID NO :49 (FR-3_VL- β 3)的氨基酸序列，并且 / 或在 Vh 中合適的 FR 包含 SEQ ID NO 51 (FR-トVh- β 3)、SEQ ID NO :52 (FR-2-V β 3)、SEQ ID NO :53(FR-3-VH-3 3)禾ロ/或 SEQ ID NO :54(FR-4_VH-β 3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在 Vl 中的 FR 包含 SEQ ID NO 47 (FR-I-Vl- β 3)、SEQ ID NO :48 (FR-2_VL- β 3)和 SEQ ID NO 49 (FR-3-Vl- β 3)的氨基酸序列，并且/或在Vh中的FR包含SEQ ID NO 51 (FR-トVh- β 3)、 SEQ ID NO :52(FR-2-VH-3 3)、SEQ ID NO :53 (FR-3_VH-β 3)和 SEQ ID NO :54 (FR-4_VH-β 3) 的氨基酸序列。更優(yōu)選地，在\中的FR包含SEQ ID NO 47 (FR-I-Vl- β 3)、SEQ ID NO 48 (FR-2-Vl- β 3)和 SEQ ID NO :49 (FR-3_VL- β 3)的氨基酸序列，并且在 Vh 中的 FR 包含 SEQ ID NO 51 (FR-I-Vh- β 3)、SEQ ID NO :52 (FR-2_VH- β 3)、SEQ ID NO :53 (FR-3_VH- β 3)和 SEQ ID N0:54(FR-4-Vh-^3)的氨基酸序列。作為抗β 3抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在\中合適的⑶R包含 SEQ ID NO :41 (CDR-I-Vl-β 3)、SEQ ID NO 42 (CDR-2-VL-β 3)禾ロ/或 SEQ ID Ν0: 43 (CDR-3-Vf β幻的氨基酸序列，并且在\中合適的FR包含SEQ ID NO 47 (FR-I-Vl-β 3), SEQ ID NO :48(FR-2-VL-3 3)和/或 SEQ ID NO :49 (FR-3_VL-β 3)的氨基酸序列。優(yōu)選地， 在 Vl 中的 CDR包含 SEQ ID NO :41 (CDR-I-Vl-β 3)、SEQ ID NO 42 (CDR-2-VL-β 3)和 SEQ ID NO :43(CDR-3-VL-3 3)的氨基酸序列，并且在 \ 中的 FR包含 SEQ ID NO 47 (FR-I-Vl-β 3)、 SEQ ID NO 48 (FR-2-VL-^ 3)和 SEQ ID NO 49 (FR-3-VL-^ 3)的氨基酸序列。還作為抗β 3抗體的背景中另ー個組合的實施方案，其中在Vh中合適的⑶R 包含 SEQ ID NO :44(CDR-PVh-3 3)、SEQ ID NO :45 (CDR-2_VH-β 3)和/或 SEQ ID NO 46 (CDR-3-VH-β幻的氨基酸序列，并且在Vh中合適的FR包含SEQ ID NO :51 (FR-I-Vh-β 3)、 SEQ ID NO :52(FR-2-VH-3 3)、SEQ ID NO 53 (FR-3-VH-β 3)禾ロ/或 SEQ ID NO: 54(FR-4-Vh-β 3)的氨基酸序列。優(yōu)選地，在Vh中的CDR包含SEQ ID NO 44(CDR-I-Vh-β 3)、 SEQ ID NO :45(CDR-2-VH-3 3)和 SEQ ID NO :46 (CDR-3-V 旦 3)的氨基酸序列，并且在 Vh 中的 FR 包含 SEQ ID NO :51 (FR-ト Vh-β 3)、SEQ ID NO :52 (FR-2_VH-β 3)、SEQ ID NO: 53 (FR-3-Vh- β 3)和 SEQ ID NO :54 (FR-4_VH-β 3)的氨基酸序列。在另ー個抗β 3抗體背景的優(yōu)選的實施方案中，ん包含SEQ ID NO :55(Vf β 3)的氨基酸序列并且/或Vh包含SEQ ID NO 56 (Vh- β 3)的氨基酸序列，更優(yōu)選地\由SEQ ID NO 55 (Vl- β 3)的氨基酸序列組成并且/或Vh由SEQ ID NO 56 (Vh- β 3)的氨基酸序列組成，最優(yōu)選地抗體被塑造成抗i3 3scFv。通過輕鏈的恒定區(qū)(CJ和/或重鏈的恒定區(qū)(Ch)能夠完成抗β 3抗體。優(yōu)選地， Cl包含SEQ ID Ν0 57 (Cl-β 3)的氨基酸序列和/或Ch包含SEQ ID NO :58(0Η-β3)的氨基酸序列。相應(yīng)地，更優(yōu)選地抗β3抗體包含輕和/或重鏈，其中輕鏈包含SEQ ID Ν0: 59 (L- β 3)的氨基酸序列和/或重鏈包含SEQ ID NO 60 (H- β 3)的氨基酸序列。最優(yōu)選地， 輕鏈由SEQ ID NO :59(L-^3)的氨基酸序列組成和/或重鏈由SEQ ID Ν0:60(Η-β3)的氨基酸序列組成。在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方案中，輕鏈由SEQ ID NO 59 (L-β 3)的氨基酸序列組成并且重鏈由SEQ ID Ν060 (H-β 3)的氨基酸序列組成。
應(yīng)當(dāng)理解⑶^ド！？^し^ぃじし和/或H的組合并非被下文詳述而窮盡，而是所述組分能夠以任何其他方式組合。只要獲得的抗體或其片段識別整聯(lián)蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，就應(yīng)當(dāng)把每ー組合視為在本發(fā)明范圍內(nèi)理解。也應(yīng)當(dāng)理解所述氨基酸序列的變體、突變體、部分或具有相同功能的同源序列包括在定義以及保護(hù)的范圍內(nèi)。特別地在FFPE材料中，原始序列和它的衍生物之間的變更程度受到結(jié)構(gòu)背景內(nèi)的抗原識別的要求不可避免地限制。通過很大程度地實現(xiàn)本發(fā)明益處來生成等價肽和蛋白質(zhì)的ー些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，所述等價肽和蛋白質(zhì)即與發(fā)明教導(dǎo)的那些在功能上類似的氨基酸序列。因此，本發(fā)明也含有如此處所列出的變更。構(gòu)成本發(fā)明抗體的基礎(chǔ)的氨基酸序列的變體能夠來自修飾(例如，至少單個氨基酸的烷基化、 芳基化或乙?；?、對映異構(gòu)體的摻入、至少單個氨基酸的添加或與另ー個肽或蛋白質(zhì)的融合?？赡艿耐蛔儼笔А⒉迦?、取代、易位和/或倒置。氨基酸序列和抗體的部分分別地涉及對那些區(qū)的限制，所述區(qū)對特定功能的表達(dá)是足夠的。根據(jù)互補(bǔ)位的表征，抗體的部分能夠為非常小的，所述互補(bǔ)位如與細(xì)胞外的整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)合一樣也與抗原結(jié)合。在本發(fā)明的含義中，明確地區(qū)分了任何大小的部分和同源序列；后者的同源性涉及整個序列。 優(yōu)選地，原始序列和具有相同特征的它的衍生物之間的同源性達(dá)至少80%，更優(yōu)選地至少 95%，最優(yōu)選地至少98%。相似地，如果前述的任何大小的部分變更為變體或突變體，將考慮同源性。如果解決本發(fā)明的問題，本教導(dǎo)覆蓋全部肽衍生物，所述肽衍生物是通過此類方法在本成分的基礎(chǔ)上開發(fā)。此外，在現(xiàn)有技術(shù)中描述了生成具有相同功能的非同源肽的若干技木。此處非同源肽指與上文優(yōu)選的量的同源性相比具有較少同源性的氨基酸序列。例如，置換一個氨基酸或多個氨基酸而不不利地影響關(guān)于達(dá)到本發(fā)明目的的活性是可能的。對于此類氨基酸的置換，參考生物化學(xué)和遺傳學(xué)的適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)教科書。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，一些氨基酸具有類似的物理化學(xué)性質(zhì)并且因此，這些氨基酸能夠有利地被互相置換。這些包括氨基酸組(a)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(b)絲氨酸和蘇氨酸，(c)天冬酰胺和谷氨酰胺，(d)天門冬氨酸和谷氨酸，(e)賴氨酸和精氨酸，和(f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在(a)到(f) ー個和相同組內(nèi)的氨基酸能夠之間互相置換。根據(jù)描述了生成功能類似的氨基酸序列的ー種方法的 Schneider 等人，PNAS 1998,95 :12179-12184 ；WO 1999/62933 和/或WO 2002/38592的教導(dǎo)，其他的變更是可能的。在本發(fā)明的公開內(nèi)容中以此引入?yún)⒖?。通過使用弓I用的方法設(shè)計和起始自本發(fā)明任何氨基酸序列的全部氨基酸序列，包含序列的序列部分或結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是本發(fā)明內(nèi)含的序列，并且他們應(yīng)當(dāng)被包括在根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)，只要它們達(dá)到了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的目的也是編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的多核苷酸或其片段。術(shù)語“多核苷酸” 指天然的或合成的單或雙鏈DNA或RNA的多聚物，備選地包括合成的、非天然的或修飾的核苷酸，所述核苷酸能夠被摻入到DNA或RNA多聚物中。每ー核苷酸由糖部分、磷酸鹽部分， 以及嘌呤或嘧啶殘基組成。能夠把核酸任選地修飾為硫代磷酸DNA、鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或spiegelmer。術(shù)語“多核苷酸編碼的”指編碼蛋白質(zhì)、多肽或其部分的基因的部分。排除控制轉(zhuǎn)錄起始或終止的調(diào)節(jié)性序列和/或元件。通常能夠在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)編碼序列和/或調(diào)節(jié)性序列，在這種情況下它被指作自體的或內(nèi)生的，或不能夠把它定位在細(xì)胞中， 這種情況下它被指作異源的。術(shù)語“基因”指編碼特定蛋白質(zhì)的DNA序列和控制所述DNA序列表達(dá)的調(diào)節(jié)性元件。異源基因也可由以在轉(zhuǎn)入基因的細(xì)胞中通常沒有的順序和/或方向排列的自體的元件組成。異源基因能夠完全地或部分地來自本領(lǐng)域所知的任何來源，包括細(xì)菌或病毒的基因組或附加體、真核生物細(xì)胞核或質(zhì)粒DNA、cDNA，或化學(xué)合成的DNA。結(jié)構(gòu)基因可形成連續(xù)的編碼區(qū)，或它可包含由合適的剪接點分界的ー個或多個內(nèi)含子。結(jié)構(gòu)基因能夠由來自不同的天然發(fā)生的或合成的來源的區(qū)段組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸包含一個或多個核酸序列，所述核酸序列選自SEQ ID NO :21至四和31至40、SEQ ID NO :61至69和71 至 80、SEQ ID NO :101 至 109 和 111 至 120、SEQ ID NO :141 至 149 和 151 至 160、SEQ ID NO :181至189和191至200、以及SEQ ID NO :221至2 和231至M0。如果適宜，認(rèn)為涉及抗體和其特定的氨基酸的本說明書的在前教導(dǎo)是有效的和可用的，不限于多核苷酸和特定的核酸序列。本發(fā)明的另ー個目的涉及包含根據(jù)本發(fā)明如上所述的編碼抗體的多核苷酸的載體。術(shù)語“載體”指重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體可為質(zhì)粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體，或核苷酸序列，所述核苷酸序列是線性的或環(huán)狀的，由單或雙鏈DNA或RNA組成，其中許多核苷酸序列被連接或重組以形成獨特的構(gòu)建體，并且所述構(gòu)建體能夠以有義或反義的方向把啟動子片段和選擇的基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的非翻譯3'序列引入細(xì)胞。優(yōu)選地，質(zhì)粒包含本發(fā)明的編碼抗體的多核苷酸，特別地以克隆和表達(dá)發(fā)明的抗體或其片段的重組基因。在本發(fā)明的含義中，質(zhì)粒是穩(wěn)定遺傳的并且不是它們的宿主細(xì)胞染色體的部分的遺傳元件。它們可包含DNA或RNA，并且它們能夠為線性的或環(huán)狀的。質(zhì)粒編碼在細(xì)胞復(fù)制期間保證它們的復(fù)制和穩(wěn)定遺傳的分子。在本說明書中公開的起始質(zhì)粒是可商購的、公眾可獲得的，或通過常規(guī)使用公知的、出版的方法能夠從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。根據(jù)本發(fā)明能夠使用的許多質(zhì)粒和其他克隆和表達(dá)載體為公知的并且對技術(shù)人員是容易獲得的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地構(gòu)建任何數(shù)量的適合本發(fā)明使用的其他質(zhì)粒。載體對于引入宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是合適的。相應(yīng)地，包含帶有編碼抗體的多核苷酸的載體的宿主細(xì)胞仍是本發(fā)明的另ー個目標(biāo)。本發(fā)明優(yōu)選地涉及分離的原核或真核細(xì)胞，但它也應(yīng)當(dāng)覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、器官等，甚至生物體，所述生物體包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞， 包括以上描述的載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”指通過轉(zhuǎn)移嵌合的、異源的或自體的核酸序列或仍包括所述序列的其衍生物被遺傳修飾的細(xì)胞。這些細(xì)胞也被稱作轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)移自體核酸序列吋，在宿主細(xì)胞中這個序列的拷貝數(shù)比天然發(fā)生的序列的拷貝數(shù)高。本發(fā)明也涉及重組免疫原，所述免疫原由具有來自昆蟲的糖基化模式的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。優(yōu)選地把細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域聯(lián)合作為δ跨膜(DTM)形式。如果將本發(fā)明的免疫原自身注射到選擇的哺乳動物物種，包括兔中，所述免疫原能夠刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答。 更優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原具有SEQ ID NO :10、90、130、170或210的氨基酸序列，或氨基酸序列的變體、突變體、部分或具有相同功能的至少95%同源序列。本發(fā)明的目標(biāo)也是編碼本發(fā)明的所述免疫原的多核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼免疫原的多核苷酸具有 SEQ ID NO :30、110、150、190或230的核苷酸序列，或核苷酸序列的變體、突變體、部分或具有相同功能的至少95%同源序列。本發(fā)明的另ー個目標(biāo)涉及包含根據(jù)本發(fā)明的編碼免疫原的多核苷酸的載體。另ー個目標(biāo)是包含具有根據(jù)本發(fā)明的編碼免疫原的多核苷酸的載體的宿主細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明宿主物種包括在本保護(hù)的范圍內(nèi)。涉及抗體，或序列或其同源序列的變體、突變體、部分，編碼抗體的多核苷酸，或載體、宿主細(xì)胞等的本說明書的現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的，如果適宜不限于用于產(chǎn)生所述或其他抗體的免疫原。本發(fā)明也涉及用于制備兔抗體的方法，所述方法包括步驟為(a)在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段；(b)純化表達(dá)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；(C)用純化的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域免疫兔；(d)從兔取含有多克隆抗體的多克隆抗血清；和任選地(e)制備單克隆抗體。優(yōu)選地，用于制備單克隆抗體的方法包括以下步驟(a)在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域；(b)純化表達(dá)的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域；(c)用純化的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域免疫兔；(d)從兔取含有多克隆抗體的多克隆抗血清；和(e)制備單克隆抗體。 更優(yōu)選地，如以上詳述，方法涉及本發(fā)明所述單克隆抗體的制備。步驟(a)的蛋白質(zhì)表達(dá)對于可以獲得若干適當(dāng)?shù)睦ハx細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染它們的方法的本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。例如，在桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中用重組桿狀病毒感染的BTI-Tn5Bl-4(High Five)昆蟲細(xì)胞系獲得了廣泛的使用，因為與來自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的細(xì)胞系(如Sf9)相比，以高很多的速度生產(chǎn)許多分泌的重組蛋白質(zhì)。為了優(yōu)化來自桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)率，用High Five細(xì)胞的懸浮適應(yīng)培養(yǎng)能夠容易地實施實驗，以在感染和用養(yǎng)分和氧氣補(bǔ)充培養(yǎng)基時研究宿主細(xì)胞狀態(tài)、感染復(fù)數(shù)、細(xì)胞密度的作用。此類流程是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)并且由例如 Vallazza&Petri，Cytotechnologyl999，29 :85_92，或 Mehta 等人，Biochem J 1998， 330 :861-869 公開。如果有利地，認(rèn)為涉及抗體或免疫原改變的本領(lǐng)域現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的， 不限于步驟(a)的改變的免疫原。如對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明解釋為限于整聯(lián)蛋白的全長細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的生理或人工片段、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的次級修飾、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的物種依賴性的變化以及等位變體。就此而言，“等位變體”理解為代表能夠在遺傳的單一基因座存在的兩個或更多不同形式的基因或DNA序列中的ー個的基因產(chǎn)物。優(yōu)選地人工片段包含合成或由重組技術(shù)生產(chǎn)的肽，所述肽至少包含目的診斷的表位。根據(jù)步驟(e)，如果在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域具有缺陷的防粘糖基化模式，所述糖基化模式與成熟哺乳動物細(xì)胞上的糖基化模式不同。由于整聯(lián)蛋白被廣泛地糖基化，即以重量計多于10%，這意味著昆蟲蛋白質(zhì)比在哺乳動物系統(tǒng)中生產(chǎn)的兔天然整聯(lián)蛋白更趨異。來自昆蟲的免疫原導(dǎo)致大大增強(qiáng)的免疫原性和對所述免疫原的蛋白質(zhì)元件更強(qiáng)的抗體應(yīng)答。步驟(b)到(d)的蛋白質(zhì)純化、哺乳動物免疫和血清提取遵循公知技術(shù)和優(yōu)質(zhì)實驗室規(guī)范，例如在說明書和實施例過程中描述的。隨后就多克隆的存在測試步驟(d)的血清，并且就抗原識別篩選檢測的抗體。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員合適的測試和篩選是可獲得的。任選地，把抗體制備延續(xù)至単一特異性、相同的抗體種類，即步驟(e)的單克隆抗體。一般地通過使骨髄瘤細(xì)胞與來自根據(jù)步驟(c)已經(jīng)被免疫的哺乳動物的脾細(xì)胞融合制備單克隆抗體。特別地，使用含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的選擇性HAT培養(yǎng)基，在所述 HAT培養(yǎng)基中僅融合的細(xì)胞能夠生長。然后稀釋所謂的雜交瘤并且在微量滴定孔上自單個親代細(xì)胞生長克隆。就它們結(jié)合細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的抗原的能力測試由不同克隆分泌的抗體。相應(yīng)地，特別地通過下述方法制備本發(fā)明的抗體。不言而喻，通過使用細(xì)胞內(nèi)整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，通過本發(fā)明的所述方法可類似地制備抗體。方法應(yīng)當(dāng)加以必要的變通。本發(fā)明的目標(biāo)也是通過用在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)的整聯(lián)蛋白的細(xì)胞外或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域免疫兔獲得的抗體。由于本發(fā)明的免疫原能夠用于產(chǎn)生抗體，本發(fā)明特別地涉及通過用免疫原和/或多核苷酸免疫兔獲得的單克隆抗體，各自根據(jù)本發(fā)明，取得具有多克隆抗體的多克隆抗血清并且制備單克隆抗體。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為涉及免疫原和用于制備兔抗體的方法的本發(fā)明說明書的現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的，適當(dāng)時，不限于通過此方法生產(chǎn)的抗體產(chǎn)物。盡管在培養(yǎng)基中最多產(chǎn)和穩(wěn)定的克隆能夠大量生長，優(yōu)選地以重組的方式表達(dá)選擇的單克隆。其需要編碼抗體的插入片段的cDNA克隆，測序并插入表達(dá)載體中以允許完全確定的抗體的生產(chǎn)。隨后，本發(fā)明也涉及用于制備重組單克隆抗體或其片段的方法，所述方法包括步驟為(a)把一個或多個載體引入宿主細(xì)胞，所述載體包含ー個或多個核酸序列 SEQ ID NO 21 至Ij 29 禾ロ 31 至Ij 40、SEQ ID NO 61 至Ij 69 禾ロ 71 至Ij 80、SEQ ID NO 101 至Ij 109 和 111 到 120、SEQ ID NO :141 到 149 和 151 到 160、SEQ ID NO :181 到 189 和 191 到 200、 和/或SEQ ID NO 221到2 和231到M0，(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而表達(dá)編碼的抗體或其片段，和(c)純化表達(dá)的抗體或其片段。能夠通過本領(lǐng)域任何方法引入載體，例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。應(yīng)當(dāng)理解特別地轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，包括細(xì)菌和古細(xì)菌，例如埃希氏菌屬Escherichia)種或芽孢桿菌屬 (Bacillus)種，然而特別地轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，例如CH0、Hela等。也能夠通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)三域系統(tǒng)。載體能夠包含編碼單克隆抗體或其片段的ー個或多個核酸序列。仍在步驟(a)的另ー個優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列 SEQ ID NO 115 (Vl- α ν β 3)禾ロ/或 SEQ ID NO 116 (Vh- α ν β 3)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID N0:119(L-av^3)和/或 SEQ ID NO :120(Η-α νβ 3)。在步驟(a)的優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID Ν0:35(\-ανβ5)禾ロ/或SEQ ID NO :36 (Vh-α ν β 5)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID N0:39(L-av^5)和/或SEQ ID NO 40 (H- α ν β 5)。在步驟(a)的優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO 155 (Vl- α ν β 6)禾ロ/或SEQ ID NO 156 (Vh- α ν β 6)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO :159(L-a νβ6)和/或SEQ ID NO
160 (H- α ν β 6) ο在步驟(a)的優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO 195 (Vl- α ν β 8)禾ロ/或SEQ ID NO 196 (Vh- α ν β 8)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO :199(L-a νβ8)和/或SEQ ID NO
200 (H- α ν β 8) ο在步驟(a)的優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ IDNO 235 (Vl-α ν)和/或SEQ ID NO :236 (Vh-α v)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO :239 (L-α ν)和/或SEQ ID NO :240 (H-α ν)。在步驟(a)的另一個優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO :75(Vl-^3)和/或SEQ ID NO :76(νΗ-β 3)。在步驟(a)的更優(yōu)選的實施方案中，待引入的一個或多個載體包含核酸序列SEQ ID NO:79(L-i3 3)和/或SEQ ID NO80(H-β 3)。在優(yōu)選的方面本發(fā)明涉及用于制備包含輕鏈可變區(qū)(VJ和重鏈可變區(qū)(Vh)的重組單克隆抗體的方法，所述方法具有步驟(a)把一個或多個載體引入宿主細(xì)胞，所述載體包含(i) SEQ ID NO :115(VL-a νβ 3)禾口 SEQ ID NO :116 (VH-α ν β 3)、(ii)SEQ ID NO:35 (VL- α ν β 5)禾口 SEQ ID NO :36 (VH- a v β 5)、(iii) SEQ ID NO :155 (VL- a ν β 6)禾口 SEQ IDNO :156 (VH- α ν β 6)、(iv) SEQ ID NO 195 (VL- a v β 8)禾口 SEQ ID NO 196 (VH- a v β 8)，或(v)SEQ ID NO :235 (VL-a v)和SEQ ID NO :236 (VH-a v)的核酸序列，(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而表達(dá)編碼的抗體，和(c)純化表達(dá)的抗體。應(yīng)當(dāng)理解由于僅具有以上所述SEQ IDNO的單一序列，若干載體有利地不同。在步驟(a)中引入兩個載體是優(yōu)選的，所述載體每一具有以上所述SEQ ID NO的一個序列。此外，如果適宜，認(rèn)為涉及抗體、氨基酸序列和其改變、編碼其的多核苷酸以及兔抗體的制備的本說明書的現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的，不限于重組單克隆抗體的生產(chǎn)。使用本發(fā)明的抗體或其片段用于在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)材料中檢測整聯(lián)蛋白也是另一個目標(biāo)。迄今，沒有針對整聯(lián)蛋白的并且特異性地和可靠地與FFPE材料中的復(fù)合體反應(yīng)的經(jīng)典的單克隆抗體。僅本發(fā)明的抗體，特別地兔單克隆抗體，具有如此高親和性和特異性，允許整聯(lián)蛋白的非閉塞表位的檢測。本文可交換使用的術(shù)語“非閉塞的”和“暴露的”意指抗原的分子確認(rèn)，其中表位能夠被抗體識別。因此，如果對比對FFPE材料的本發(fā)明的抗體和對冷凍材料的鼠單克隆抗體，觀測到相同的染色模式。此外，如果對比本發(fā)明的抗體在FFPE材料上和在ELISA中的分離的整聯(lián)蛋白形式和/或在活細(xì)胞上的天然整聯(lián)蛋白狀態(tài)，優(yōu)選地如果對比本發(fā)明的抗體在FFPE材料上和在活細(xì)胞上，觀測到基本相同的染色模式。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)FPE材料是組織。FFPE組織是一片組織，所述組織首先通過解剖或者活組織檢查從動物標(biāo)本被分離。然后，固定這一組織以防止其腐敗或變性并且在顯微鏡下明確地檢查它，用于組織學(xué)、病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)研究。固定是為了染色和在顯微鏡下觀察它的目的把組織固定、殺死并且保存的過程。固定后加工使得組織對于染色試劑是可透過的并且交聯(lián)它的大分子從而使得它們被穩(wěn)定和鎖定在位置上。許多固定劑用于此目的，例如，Bouine溶液、福爾馬林或液氮。然后把此固定的組織包埋在石蠟中以允許其被切割成薄切片并且用蘇木精和伊紅染劑染色。此后，通過切割細(xì)切片完成切片以在顯微鏡下研究用抗體染色。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)FPE組織是腫瘤組織，最優(yōu)選地人腫瘤組織。特別地腫瘤選自鱗狀上皮、膀胱、胃、腎、頭、頸、食管、宮頸、甲狀腺、腸、肝、腦、前列腺、泌尿生殖道、淋巴系統(tǒng)、胃、喉和/或肺的腫瘤。特別地，腫瘤還選自肺腺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌和乳腺癌。此外，優(yōu)選血和免疫系統(tǒng)的腫瘤，更特別地選自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病和/或慢性淋巴性白血病的腫瘤。在本發(fā)明意指中，此類腫瘤也被稱為癌。為檢測整聯(lián)蛋白，用FFPE材料孵育本發(fā)明的抗體。術(shù)語“孵育”指用本發(fā)明的抗體接觸FFPE材料不同的時間，所述時間取決于材料、抗體和/或抗原的種類。孵育過程也取決于多種其他參數(shù)，例如，檢測的敏感性，其優(yōu)化遵循本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法。添加化學(xué)溶液和/或應(yīng)用物理方法(例如熱沖擊)能夠改善樣品中目標(biāo)結(jié)構(gòu)的可及性。孵育的結(jié)果是形成特定的孵育產(chǎn)物。用于檢測形成的抗體/抗原復(fù)合體的合適的測試為本領(lǐng)域人員所知或作為常規(guī)能夠容易地設(shè)計。許多不同類型的測定法是已知的，其實例如下所示。盡管根據(jù)本發(fā)明測定法可為適合于檢測和/或定量整聯(lián)蛋白表達(dá)的任何測定法，優(yōu)選地后者由與本發(fā)明的第一抗體特異地相互作用的物質(zhì)測定。術(shù)語“特異性的物質(zhì)”如本文所用包含對本發(fā)明的抗整聯(lián)蛋白抗體具有高親和性的分子，以保證可靠的結(jié)合。優(yōu)選地此物質(zhì)對抗體的部分(例如恒定區(qū)，特別地兔恒定區(qū)，更特別地F。片段，若有的話)具有特異性。有許多針對兔抗體的特異性抗體存在。部分代表對下述區(qū)的限制，所述區(qū)對于特定功能的表達(dá)是足夠的，即提供用于識別的結(jié)構(gòu)決定子。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“識別”涉及但不限于特異性物質(zhì)和靶抗體之間的任何類型的相互作用，特別地共價或非共價結(jié)合或聯(lián)合，例如共價鍵、疏水/親水相互作用、范德華力、離子對、氫鍵、配體-受體相互作用、表位和抗體結(jié)合位點的相互作用、核苷酸堿基配對等。此類聯(lián)合也可包括其他分子(例如肽、蛋白質(zhì)或其他核苷酸序列)的存在。特異性的物質(zhì)由生物和/或化學(xué)的結(jié)構(gòu)組成，所述結(jié)構(gòu)能夠以如此方式與靶分子相互作用，所述方式使得識別、結(jié)合和相互作用是可能的。特別地，物質(zhì)選自具有分子量在50和IOOODa之間的蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、多聚物和小分子，優(yōu)選地蛋白質(zhì)和核酸。特異性的物質(zhì)表達(dá)足夠的敏感性和特異性以保證可靠的檢測。特異性的物質(zhì)對抗整聯(lián)蛋白抗體具有至少10_7M的親和性。優(yōu)選地特異性的物質(zhì)對其靶分子具有10_%或甚至更優(yōu)選地KT9M的親和性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，術(shù)語特異性的用于表明在樣品中存在的其他生物分子不與對抗整聯(lián)蛋白抗體特異性的物質(zhì)顯著地結(jié)合。優(yōu)選地，與非靶分子的生物分子結(jié)合的水平造成僅為靶分子親和性的10%，更優(yōu)選地僅5%或更少的結(jié)合親和性。最優(yōu)選地，物質(zhì)為單一特異性以保證與選擇的本發(fā)明的第一抗整聯(lián)蛋白抗體的專一的和直接的相互作用。高度優(yōu)選的特異性的物質(zhì)將滿足親和性以及特異性的上述最小標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選地蛋白質(zhì)或肽選自抗體、細(xì)胞因子、脂籠蛋白、受體、凝集素、抗生物素蛋白、脂蛋白、糖蛋白、寡肽、肽配體和肽激素。更優(yōu)選地，抗體被用作特異性的物質(zhì)。優(yōu)選地核酸為單或雙鏈DNA或RNA、引物、反義寡核苷酸、核糖核酸酶、DNA酶、適配體和/或siRNA，或其部分。更優(yōu)選的核酸探針為適配體，最優(yōu)選地RNA適配體，因為在RNA中可用的2’羥基促進(jìn)幾個分子內(nèi)和分子間接觸。使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)合成適配體。此外，通過體外轉(zhuǎn)錄，能夠有利地合成大量的具有多于大約30個核苷酸的RNA適配體。適配體的選擇、合成和純化為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。能夠標(biāo)記特異性的物質(zhì)；這樣做時標(biāo)記取決于待監(jiān)測的特異性物質(zhì)和特異性孵育產(chǎn)物的固有特征，以及應(yīng)用的方法，即要求的敏感性、接合的容易性、穩(wěn)定性要求，和可得的儀器操作以及處理規(guī)定。只要容易地檢測標(biāo)簽，標(biāo)記方法不特別地受限制?！皹?biāo)記的特異性的物質(zhì)”是下述物質(zhì)，所述物質(zhì)或通過接頭或化學(xué)鍵共價地，或通過離子、范德華力、靜電、疏水作用或氫鍵非共價地與標(biāo)簽結(jié)合，以此使得本發(fā)明的抗整聯(lián)蛋白抗體的存在可由檢測標(biāo)簽的存在檢測。能夠直接或間接地檢測抗體對蛋白質(zhì)的特異性的免疫學(xué)結(jié)合。在下文，應(yīng)當(dāng)理解抗體-蛋白質(zhì)對包括針對整聯(lián)蛋白的本發(fā)明的第一抗體或針對第一抗整聯(lián)蛋白抗體的第二抗體。根據(jù)本發(fā)明合適的檢測方法的優(yōu)選的實例為發(fā)光，特別地?zé)晒?，此外VIS著色和/或放射性發(fā)射。發(fā)光涉及作為化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或光致發(fā)光的結(jié)果的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光涉及作為化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的可見光的發(fā)射，而生物發(fā)光需要螢光素酶的活性。當(dāng)前優(yōu)選地光致發(fā)光，也被稱為熒光激發(fā)，是由優(yōu)選由放射提供的光子的吸收引起的，所述光子作為具有波長在30到50nm變化并且周期在約10_8秒內(nèi)的光子被再次釋放。用于熒光檢測的儀器包括但不限于典型的臺式熒光計、熒光多孔板閱讀儀、光纖熒光計、熒光顯微鏡和與熒光檢測偶聯(lián)的微芯片/微流體系統(tǒng)。VIS著色指任何非染色物質(zhì)的可視化，使得對于肉眼是可視的。優(yōu)選地，由光度計測量著色的強(qiáng)度。通過閃爍測量同位素的放射性輻射。液體閃爍的方法涉及通過捕捉在稱為閃爍混合物的有機(jī)溶劑和溶質(zhì)的系統(tǒng)中的β發(fā)射在樣品中檢測β衰變。在樣品中由放射性同位素例如3H、14C、32P、33P和mS發(fā)射的β衰變電子激發(fā)溶劑分子，所述溶劑分子反過來把能量轉(zhuǎn)移給溶質(zhì)。通過在閃爍計數(shù)器內(nèi)的光電倍增管將溶質(zhì)的能量發(fā)射(可見光光子)轉(zhuǎn)化為電信號?；旌衔镆脖仨氉鳛樵鋈軇┳饔?，所述增溶劑保持樣品均勻懸浮。作為其他衰變過程(鏈?zhǔn)剿プ?的結(jié)果Y射線光子通常出現(xiàn)以消除新形成的多余能量的核。它們沒有質(zhì)量并且產(chǎn)生(即使有)極少的沿著它們路徑的直接的碰撞電離。為了檢測和量子化，通過三種機(jī)制中的一或多種吸收Y光子，所述三種機(jī)制為康普頓效應(yīng)、光電效應(yīng)和電子偶的產(chǎn)生。本發(fā)明的有利的Y衰變同位素是1251。直接標(biāo)簽包括與抗體連接的熒光或發(fā)光標(biāo)簽、金屬、染料、放射性核素等。能夠使用用碘-125 (125Ι)標(biāo)記的抗體。使用蛋白質(zhì)特異性的化學(xué)發(fā)光抗體的化學(xué)發(fā)光測定法對于靈敏的、非放射性的蛋白質(zhì)水平的檢測是合適的。用熒光染料標(biāo)記的抗體也是合適的。熒光染料的實例包括但不局限于DAPI、熒光素、Hoechst 33258、R-藻藍(lán)蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、羅丹明、德克薩斯紅和麗絲胺。間接標(biāo)簽包括本領(lǐng)域公知的多種酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶、脲酶等。可通過不同的方法實施抗整聯(lián)蛋白抗體與酶的共價連接，例如與戊二醛的偶聯(lián)。酶和抗體都與戊二醛通過游離氨基互連，并且移除網(wǎng)聯(lián)的酶和抗體的副產(chǎn)物。在另一種方法中，如果它是糖蛋白，例如過氧化物酶，則酶通過糖殘基與抗體偶聯(lián)。酶被高碘酸鈉氧化并且與抗體的氨基直接互連。含有碳水化合物的其他酶也能夠以此方式與抗體偶聯(lián)。也可通過使用異雙功能的接頭(例如琥珀酰亞胺6-(N-馬來酰亞胺)己酸酯)互連抗體的氨基和酶(例如β半乳糖苷酶)的游離的巰基實施酶偶聯(lián)。能夠使用辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)，例如用生色底物四甲基聯(lián)苯氨(TMB)，所述四甲基聯(lián)苯氨在過氧化氫存在時產(chǎn)生在450nm可檢測的可溶性產(chǎn)物。例如，能夠使用堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)，用生色底物磷酸對硝基苯酯，所述磷酸對硝基苯酯產(chǎn)生在405nm可容易地檢測的可溶性產(chǎn)物。類似地，能夠使用β半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)，用生色底物鄰-硝基苯-β -D-galactopyranoxide^NPG)，
23所述鄰-硝基苯-β -D-galactopyranoxide產(chǎn)生在410nm可檢測的可溶性產(chǎn)物。能夠使用脲酶檢測系統(tǒng)，用底物例如脲-溴甲酚紅紫。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，用可檢測的部分標(biāo)記抗體，所述部分包括但不限于放射性核素、熒光染料，(例如熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、0regOn Green 、羅丹明、德克薩斯紅、四若丹明異硫氰酸鹽(TRITC，tetrarhodimine isothiocynate)、Cy3、Cy5 等)、熒光標(biāo)志物(例如綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶激活的自淬滅熒光化合物、酶(例如螢光素酶、HRP、AP等)、納米顆粒、生物素、地高辛配基等。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，用地高辛配基、生物素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光染料、磁珠、金屬珠、膠體顆粒、電子密度試劑、酶(它們都是本領(lǐng)域公知的)或放射性同位素標(biāo)記核酸。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，用于標(biāo)記核酸的優(yōu)選的同位素為咕、14(、邛、3芐、％或1251，更優(yōu)選的 32P、33P 或 125L能夠使用多種免疫測定技術(shù)，包括競爭性和非競爭性免疫測定。術(shù)語“免疫測定”包括下述技術(shù)，所述技術(shù)包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、FACS、酶免疫測定(EIA)，例如酶多種免疫測定技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、IgM抗體捕捉ELISA (MAC ELISA)和微粒子酶免疫測定(MEIA)，此外毛細(xì)管電泳免疫測定(CEIA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)、熒光偏振免疫測定(FPIA)和化學(xué)發(fā)光測定(CL)。如果需要，此類免疫測定能夠為自動化的。免疫測定也能夠與激光誘導(dǎo)的熒光聯(lián)合使用。脂質(zhì)體免疫測定(例如流動注射脂質(zhì)體免疫測定和脂質(zhì)體免疫傳感器)也適用于本發(fā)明。此外，比濁測定是適合用在本發(fā)明的方法中的，其中蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合體的形成導(dǎo)致增加的光散射，所述光散射被轉(zhuǎn)化為作為標(biāo)志物濃度的函數(shù)的峰比率信號。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，通過ELISA、RIA、熒光免疫測定(FIA)或可溶性顆粒免疫測定(SPIA)檢測孵育產(chǎn)物。ELISA的組分是與免疫學(xué)反應(yīng)中的一個伴侶結(jié)合的酶。在競爭性ELISA中使用單一捕捉抗體(本文以下稱為第一)優(yōu)選地標(biāo)記整聯(lián)蛋白的示蹤抗原(分析物的衍生物)，而在非競爭性ELISA中優(yōu)選地標(biāo)記抗體，優(yōu)選地包含通過第二抗體(本文以下稱為第二)的抗原-抗體復(fù)合體的沉淀。由抗原和兩個抗體組成的復(fù)合體也被稱為夾心復(fù)合體。檢測包含隨后的底物到產(chǎn)物，優(yōu)選地著色產(chǎn)物的酶促轉(zhuǎn)換，所述產(chǎn)物由視覺顯色、生物發(fā)光、熒光或電信號(酶電極)的測量識別。在本發(fā)明中用于標(biāo)記的有利的酶為本領(lǐng)域人員所知，例如過氧化物酶(例如HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶和AP。其他優(yōu)選的為使用放射性同位素的放射性免疫測定，所述放射性同位素或在合成過程中被摻入免疫試劑中或隨后與測定法的免疫試劑，優(yōu)選地與抗體偶聯(lián)。在FIA中使用以熒光團(tuán)有利地標(biāo)記的抗體。SPIA使用凝集反應(yīng)導(dǎo)致的銀顆粒的顏色變化。既不需要第二抗體也不需要指示物反應(yīng)就使得它在本發(fā)明的范圍內(nèi)特別地有用。類似地有利地是使用抗體的乳膠凝集測試，所述抗體結(jié)合于著色的乳膠顆粒。然而，它需要整聯(lián)蛋白的強(qiáng)的固定以在先前的洗滌步驟中移除未結(jié)合和/或非特異性地結(jié)合的抗原。—般地，用于檢測的所用方法包括加強(qiáng)的洗滌步驟以從整聯(lián)蛋白/抗體復(fù)合體分離未結(jié)合的抗體。此外，任何檢測方法的實驗流程為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，使用分光光度計以檢測來自生色底物的顏色，使用放射計數(shù)器以檢測放射(例如用于檢測125I的Y計數(shù)器)，或使用熒光計以在某波長的光存在時檢測熒光，能夠分析來自直接或間接的標(biāo)記的信號。對于酶聯(lián)抗體的檢測，根據(jù)生產(chǎn)商的指示使用分光光度計(例如 EMAX Microplate Reader (Molecular Devices ；Menlo Park, CA))能夠進(jìn)行定量分析。如果需要，本發(fā)明的測定法能夠為自動化的或由機(jī)器人實施，并且能夠同時檢測來自多個樣品的信號。例如通過把圖像數(shù)字化并且在電腦上存儲和分析圖像，在任何本文實施方案中可任選地進(jìn)一步處理由攝像機(jī)或其他記錄裝置(例如光電二極管和數(shù)據(jù)存儲裝置)觀察的和任選地記錄的光學(xué)圖像。用于數(shù)字化、存儲和分析數(shù)字化的錄像或數(shù)字化的光學(xué)圖像的多種可商購的外周儀器和軟件是可獲得的。本領(lǐng)域中常用的，一種常規(guī)的系統(tǒng)把光從樣品視野輸送到冷電荷耦合裝置(CXD)攝像機(jī)。CXD攝像機(jī)包括圖片元素(象素)的陣列。來自樣品的光在CCD上成像。取樣對應(yīng)于樣品區(qū)域的特別象素以獲得對于每一位置的光強(qiáng)度讀數(shù)。平行地處理多象素以提高速度。例如通過熒光或暗視野顯微鏡技術(shù)，本發(fā)明的設(shè)備和方法容易地用于觀察任何樣品。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，針對SEQ ID NO 90的DTM-α ν β 3生成的由氨基酸序列SEQ ID NO 99 (L- α ν β 3)和SEQ ID NO :100 (H- α ν β 3)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與α νβ 3選擇性地結(jié)合。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，針對 SEQ ID NO 10 的 DTM- α νβ 5 生成的由氨基酸序列 SEQ ID NO :19 (L- α ν β 5)禾口 SEQID NO 20 (H- α ν β 5)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與α ν β 5選擇性地結(jié)合。仍然在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，針對SEQ ID Ν0:130的DTM-avi3 6生成的由氨基酸序列SEQ ID N0:139(L-av3 6)禾口SEQ ID NO 140 (H-α ν β 6)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與ανβ6選擇性地結(jié)合。仍然在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，針對SEQ ID N0:170的DTM-avβ8生成的由氨基酸序列SEQ ID NO:179(L-av0 8)和SEQ ID NO :180 (H-α ν β 8)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與ανβ8選擇性地結(jié)合。仍然在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，針對SEQ IDNO :210 的 DTM-α ν 生成的由氨基酸序列 SEQ ID NO :219 (L_ a v)和 SEQ ID NO :220 (H-a v)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與α ν選擇性地結(jié)合。仍然在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，針對SEQ ID Ν0:50的β 3免疫原生成的由氨基酸序列SEQID NO 59 (L-β 3)和SEQ ID NO :60(Η-β3)組成的兔雜交瘤克隆生產(chǎn)適于FFPE組織的抗體。它們與β 3選擇性地結(jié)合。然而應(yīng)當(dāng)理解，如在本發(fā)明說明書中所描述的任何備選的序列或其組合可被應(yīng)用于發(fā)明的用途。如果適宜，認(rèn)為涉及抗體和其氨基序列的本發(fā)明說明書的現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的并且不受限于該用途。此外，本發(fā)明可作為試劑盒實施，所述試劑盒包含抗體、多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞，它們每一均根據(jù)本發(fā)明，以實施在FFPE材料中檢測整聯(lián)蛋白的發(fā)明的用途。特別地，能夠把抗體摻入診斷檢測試劑盒中用于表征整聯(lián)蛋白譜(例如腫瘤或其他人病理的α ν整聯(lián)蛋白或其他整聯(lián)蛋白表達(dá)譜)并且特別地在檔案FFPE材料中表征整聯(lián)蛋白譜。本發(fā)明的試劑盒可包括下述物品，所述物品包含書面說明或就如何實施本發(fā)明的方法把書面說明指示給使用者。在實施方案中，試劑盒還包含報告部分或報告裝置。如果適宜，認(rèn)為涉及試劑盒的成分及其用途的本發(fā)明的說明書的現(xiàn)有教導(dǎo)是有效的和可用的并且不限于該試劑盒。通過教導(dǎo)用于篩選抗整聯(lián)蛋白抗體的方法本發(fā)明解決第二個問題，所述抗體能夠區(qū)分整聯(lián)蛋白α亞基和/或β亞基的各自的最接近的同源物并且適合于在FFPE材料中的免疫組織化學(xué)，所述方法包括步驟為(a)提供能夠與選擇的整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體的樣品；(b)比對整聯(lián)蛋白序列以鑒定選擇的整聯(lián)蛋白的α亞基和/或β亞基的最接近的同源物；(C)用抗體樣品對選擇的整聯(lián)蛋白和其最接近的一個或多個同源物的天然的形式實施差示ELISA，從而積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(初級篩選)；(d)用步驟c)積累的抗體對選擇的整聯(lián)蛋白和另一種整聯(lián)蛋白的天然形式實施另一差示ELISA，從而進(jìn)一步積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(次級篩選)；(e)用步驟d)積累的抗體實施FFPE細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)，其中至少一個細(xì)胞系能夠表達(dá)選擇的整聯(lián)蛋白并且任選地另一個細(xì)胞系不能夠表達(dá)選擇的整聯(lián)蛋白，從而進(jìn)一步積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第三級篩選)；(f)用步驟e)積累的抗體實施步驟e)的FFPE細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)，其中細(xì)胞系在哺乳動物中作為異種移植腫瘤生長，從而進(jìn)一步積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第四級篩選)；和(g)用步驟f)積累的抗體實施檔案FFPE腫瘤的免疫組織化學(xué)，從而進(jìn)一步積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第五級篩選)。通過對免疫原的天然的、有生物活性的、未變性的形式的差示ELISA實施初級篩選(Mehta等人，1998，Biochem J 330 :861-86)。例如，如果靶免疫原是α νβ 3，初級篩選為ανβ3對ανβ5。這意味著初級篩選對具有與初級靶最接近的序列同源性的整聯(lián)蛋白使用反-篩選(counter-screen)。與β 3鏈最接近的同源物是β 5，而α ν在兩個復(fù)合體中都相同。以這種方式能夠獲取最有判別性的抗體。相似地，能夠?qū)Ζ力挺?篩選ανβ5。對α鏈特異性的抗體的篩選能夠按照相同的流程，即α νβ 1能夠用作用于α 5νβ 1特異性抗體的反篩選。次級篩選著眼于在ELISA中更寬泛組的重組整聯(lián)蛋白以進(jìn)一步確認(rèn)特異性，例如，能夠使用α iib β 3以確認(rèn)對于α ν復(fù)合體，而非α ν β 3抗體(優(yōu)選地α ν β 3單克隆抗體)的單獨β 3鏈的特異性。在步驟(d)中用步驟(c)積累的抗體對選擇的整聯(lián)蛋白和另一個緊密相關(guān)的整聯(lián)蛋白的天然形式實施差示篩選是優(yōu)選的。第三級篩選著眼于FFPE細(xì)胞系的IHC中染色的抗體，所述細(xì)胞系以它們的整聯(lián)蛋白表達(dá)譜被生物化學(xué)地表征。第四級篩選對在裸鼠中作為異種移植腫瘤生長的相同的細(xì)胞系使用FFPE-IHC。第五級篩選著眼于檔案FFPE人腫瘤。例如，對M21、U87MG和MM黑色素瘤進(jìn)行第三級和第四級篩選作為陽性篩選靶。全部這些系是從內(nèi)部和文獻(xiàn)分析已知表達(dá)ανβ3的，而A549 NSCLC、Raji和為陰性篩選靶。全部這些系是從內(nèi)部和文獻(xiàn)分析已知不表達(dá)α νβ 3的。優(yōu)選地對惡性黑色素瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤進(jìn)行第五級篩選作為α ν β 3陽性，并且NSCLC和CRC作為α νβ 3陰性人腫瘤。在篩選方法的實施方案中，步驟(C)到(g)的任何步驟包含檢測積累的抗體的判別能力和/或特異性的進(jìn)一步的步驟。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，第一次提供了抗體，所述抗體允許在FFPE檔案患者材料(例如腫瘤活組織檢查)中整聯(lián)蛋白的有效的檢測，所述檢測并且也通過活細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)(FACS)。在FACS中的染色模式對應(yīng)于用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的相關(guān)的單克隆抗體獲得的模式(例如LM609對于α ν β 3 ；P1F6對于α ν β 5)。顯示了本發(fā)明的抗體不僅在FFPE材料中，也在活細(xì)胞上的它們的天然狀態(tài)中檢測各自的整聯(lián)蛋白。整聯(lián)蛋白，特別地ανβ3、ανβ5、ανβ6或ανβ8為主要的治療靶，所述治療靶在提交本申請之前不能在常規(guī)FFPE活組織檢查材料中可靠地可視化。本發(fā)明的穩(wěn)健的抗體具有在檔案FFPE材料中以下述染色模式識別它們的整聯(lián)蛋白靶的潛力，所述染色模式與在冷凍保存的材料上由已知的ανβ3_、ανβ5_或α νβ 6-特異性的單克隆抗體的所見的分布相同，但具有公知的比冷凍組織學(xué)材料高得多的空間分辨率和FFPE的典型的形態(tài)學(xué)保存的質(zhì)量。非常合適的抗體為兔單克隆抗體，所述兔單克隆抗體并非簡單地來源于另一個物種，而是這些RabMab被有利地證明具有特異性、可再生性和永恒性(即永遠(yuǎn)的相同的試劑和相同的特異性)。通過使用ανβ3或α νβ 5克隆生成的RabMab以與用經(jīng)典的抗α ν β 3抗體LM609或抗ανβ5抗體PIF6染色的冷凍固定的材料相同的染色模式在人腫瘤識別檔案α νβ3或α νβ5。通過使用β 3細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域生成的RabMab以對應(yīng)于靶細(xì)胞的已知的α ν β 3表達(dá)譜的模式對異種移植物陣列染色。盡管生產(chǎn)的，和通過下文顯示的方法篩選而任選地選擇的抗體主要對FFPE整聯(lián)蛋白起作用，它們也能夠在ELISA中對分離的整聯(lián)蛋白使用，也能夠用于對活細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)，或甚至具有其他標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)應(yīng)用?？贵w提供了觀測的人病理和受體的生物化學(xué)之間的非同尋常的并且有價值的確認(rèn)橋梁。本發(fā)明教導(dǎo)通過使用純化的整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，特別地純化的整聯(lián)蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，更特別地人源的，來生成抗整聯(lián)蛋白抗體。本發(fā)明的免疫原在免疫的短時間內(nèi)引起高效價的抗體。通過血清的高度稀釋反映高度抗體效價，所述血清在免疫之后獲取并且在測定中使用。同時，由于它們被稀釋的存在，可能由其他血清成分引起的不利效果被大量降低。通過生產(chǎn)昆蟲重組免疫原還能夠有利地增加效價，所述昆蟲重組免疫原生成來自內(nèi)源和高度同源的兔整聯(lián)蛋白的糖基化的趨異?？贵w及其衍生物由工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模、低制備成本和方便的操作的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中的高特異性穩(wěn)定性和表達(dá)表征。這些特征形成可再生的作用和與它們匹配的整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)的可靠的和安全的相互作用的基礎(chǔ)，所述可再生的作用中包括缺少交叉反應(yīng)性和不利效果。由于抗體能夠被克隆進(jìn)入表達(dá)載體，它們提供用于基礎(chǔ)研究和診斷的材料的絕對穩(wěn)定和可再生源。此外，成本效益高地生產(chǎn)適當(dāng)?shù)脑噭┖小Ｋ性诖艘玫膮⒖嘉墨I(xiàn)以本發(fā)明的公開內(nèi)容方式引入作為參考。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于本文描述的特定的抗體、特別的方法、用途和試劑盒，由于此類物質(zhì)可當(dāng)然地變化。也應(yīng)當(dāng)理解本文使用的術(shù)語僅是為了描述特別的實施方案的目的并不旨在限制本發(fā)明的范圍，所述本發(fā)明的范圍僅被附加的權(quán)利要求限定。如本文包括附加的權(quán)利要求所用，詞的單數(shù)形式例如“a”、“an”和“the”包括它們對應(yīng)的復(fù)數(shù)指示物除非上下文另有明確地指示。因此，例如，提到“抗體”包括單一或若干不同的抗體，然而應(yīng)當(dāng)加上必要的變更以適用于提到“復(fù)數(shù)形式的抗體”，并且提到“方法”包括涉及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的等價步驟或方法，等等。除非另有定義，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語具有如由本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在說明書中詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的必要的技術(shù)。并未以細(xì)節(jié)描述的其他技術(shù)對應(yīng)于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的已知的標(biāo)準(zhǔn)的方法，或在引用的參考、專利申請或標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中以更多細(xì)節(jié)描述技術(shù)。在本申請中未提及的其他微生物、細(xì)胞系、質(zhì)粒、啟動子、抗性標(biāo)志物、復(fù)制起點等是可商購的。如果在本申請中沒有給出其他的提示，則它們僅作為實例使用，根據(jù)本發(fā)明它們不被認(rèn)為是必要的，但是它們能夠由其他合適的工具和生物材料替代。盡管能夠在本發(fā)明的實施或測試中使用與那些本文描述的相似的或等價的方法和材料，以下描述了合適的實施例。以說明而非限制的方式提供下面的實施例。在實施例中，使用沒有污染活性的標(biāo)準(zhǔn)試劑和緩沖液(只要是實際的)。如果解決本發(fā)明的技術(shù)問題，特別地理解實施例使得它們不限于明確地說明的特征組合，而可無限制地再次組合示例的特征。

圖1顯示用針對α νβ 3的外部結(jié)構(gòu)域生成的亞克隆Ε3528_2_12的上清液的FFPE癌細(xì)胞系(左側(cè))和異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖2顯示在異種移植物中用純化的抗ανβ3整聯(lián)蛋白抗體克隆Ε3528-2-7的Μ21細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖3顯示用純化的抗α νβ 3整聯(lián)蛋白抗體Ε3528-2-7、Ε3528-2-11 *Ε3528-2-12的癌細(xì)胞系Μ21 (左側(cè))和Μ21異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖4顯示在用Spotfire的圖像分析(Ariol SL-50)和圖解表示法幫助下用抗α ν β 3抗體Ε3528-2-7、Ε3528-2-11和Ε3528-2-12的免疫組織化學(xué)染色的分析。圖5顯示在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下用抗體α ν β 3_Ε!35^-2-7和小鼠單克隆抗體20Η9的免疫組織化學(xué)染色的分析?？寺?0Η9針對β 3整聯(lián)蛋白鏈。把“表達(dá)(％最大值)”對Μ21的表達(dá)歸一化。圖6顯示在異種移植物中用純化的抗αvβ3整聯(lián)蛋白抗體E3531-227-3和Ε3531-229-3的Μ21細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖 7 顯示用多克隆 227(Ε;3531-227-3、Ε3531-227-3 和 Ε!3531-227-6)的純化的抗ανβ3整聯(lián)蛋白抗體的癌細(xì)胞系Μ21 (左側(cè))和Μ21異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖8顯示用克隆Ε3531-227的抗ανβ3抗體的免疫組織化學(xué)染色的分析(上側(cè))和與小鼠單克隆抗日3抗體20!19的比較(下側(cè))，計算為在1121細(xì)胞中表達(dá)的(％。在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下分析表達(dá)。圖9顯示用針對α νβ 5的外部結(jié)構(gòu)域生成的亞克隆Ε3536_99_3的上清液的FFPE癌細(xì)胞系(左側(cè))和異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖10顯示針對整聯(lián)蛋白α νβ 3和α νβ 5的重組人細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和全長純化的血小板gpiibiiia的純化的單克隆雜交瘤抗體E3531-227-3、E3531-229-3和E3536-99-2的ELISA譜。圖11顯示在異種移植物中用純化的抗α νβ 5整聯(lián)蛋白抗體克隆Ε3536_99_3的Α431和HCTl 16細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖12顯示用純化的抗α ν β 5整聯(lián)蛋白抗體E!3536-99-l、Ε3536-99-2和Ε3536-99-3的癌細(xì)胞系U87MG (左側(cè))和U87MG和Α431異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖13顯示在用Spotfire的圖像分析(Ariol SL-50)和圖解表示法幫助下用抗α ν β 5抗體Ε;3536-99-1、Ε3536-99-2和Ε!3536-99-3的免疫組織化學(xué)染色的分析。圖14顯示用亞克隆Ε3866-52-1的上清液的FFPE癌細(xì)胞系(左側(cè))和異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖15顯示用亞克隆Ε3866-52-1的純化的抗體的FFPE癌細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)染色。圖16顯示用重組抗α ν β 6整聯(lián)蛋白抗體的癌細(xì)胞系和異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖17顯示在異種移植物中用重組抗α νβ 6整聯(lián)蛋白抗體的前列腺癌細(xì)胞(上側(cè))和HD9結(jié)腸癌細(xì)胞的質(zhì)膜染色。
圖18顯示在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下用抗α ν β 6抗體的免疫組織化學(xué)染色(循環(huán)(rim) 3421)的分析。圖19顯示用抗α νβ 6重組抗體的載玻片到載玻片和循環(huán)到循環(huán)的復(fù)現(xiàn)性。圖20顯示用抗α νβ 8亞克隆133_9的上清液的FFPE癌細(xì)胞系和異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖21顯示用抗α νβ8亞克隆Ε3875-133-9的純化的抗體的FFPE癌細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)染色。圖22顯示用重組抗αvβ8整聯(lián)蛋白抗體EM13309的癌細(xì)胞系和異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖23顯示用重組抗α νβ 8整聯(lián)蛋白抗體ΕΜ13309的人組織的免疫組織化學(xué)染色。圖M顯示在異種移植物中用重組抗α νβ 8整聯(lián)蛋白抗體的前列腺癌細(xì)胞(上側(cè))和Η1975肺癌細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖25顯示在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下用抗α ν β 8抗體EM13309的免疫組織化學(xué)染色(循環(huán)3422)的分析。圖沈顯示用抗α ν β 8重組抗體ΕΜ13309的載玻片到載玻片和循環(huán)到循環(huán)的復(fù)現(xiàn)性。圖27顯示用抗α ν亞克隆Ε3875_13_9的上清液的FFPE癌細(xì)胞系和異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖28顯示用亞克隆Ε3875-13-9的純化的抗α ν抗體的FFPE癌細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)染色。圖四顯示用重組抗α ν抗體EM01309的癌細(xì)胞系和異種移植物的免疫組織化學(xué)染色。圖30顯示在異種移植物中用重組抗α ν抗體EM01309的DU-145 (上側(cè))和Η ^9細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖31顯示在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下用重組抗α ν抗體ΕΜ01309的免疫組織化學(xué)染色的分析。圖32顯示用抗α ν重組抗體ΕΜ01309的載玻片到載玻片和循環(huán)到循環(huán)的復(fù)現(xiàn)性。圖33顯示在異種移植物中用純化的抗β 3整聯(lián)蛋白抗體克隆Ε3592-2-12的Μ21細(xì)胞的質(zhì)膜染色。圖；34顯示用純化的抗β 3整聯(lián)蛋白抗體Ε3592-2-4、Ε3592-2-10和Ε3592-2-12的癌細(xì)胞系Μ21 (左側(cè))和Μ21異種移植物(右側(cè))的免疫組織化學(xué)染色。圖35顯示在用Spotfire的圖像分析(Ariol SL-50)和圖解表示法幫助下用抗β 3抗體Ε3592-2-4、Ε3592-2-10和Ε3592-2-12的免疫組織化學(xué)染色的分析。圖36顯示在圖像分析(Ariol SL-50)幫助下用抗體β 3_Ε3592_2_12和小鼠單克隆抗體20Η9的免疫組織化學(xué)染色的分析?？寺?0Η9針對β 3整聯(lián)蛋白鏈。把“表達(dá)(％最大值)”對Μ21的表達(dá)歸一化。圖37顯示針對重組人α ν整聯(lián)蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和全長純化的血小板gpiibiiia的，來自兔抗整聯(lián)蛋白的純化的單克隆雜交瘤抗體E3875-133-9、E3866-052-1和E3875-013-9的ELISA譜，所述抗體。圖38顯示針對重組人α ν整聯(lián)蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和全長純化的血小板gpiibiiia的的，^NA-重組兔抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體EM22703、EM09902、EM00212、EM05201、EM13309和 EMO1309 的 ELISA 譜。圖39顯示使用生物素玻連蛋白作為配體的RabMab抗體EM22703、EM09902、EM00212的受體抑制測定。圖40顯示在M21上的EM022703的FACS滴定。圖41顯示在AM9上的EM009902的FACS滴定。圖42顯示在Η ^9上的ΕΜ05202的FACS滴定。圖43顯示在MM-met細(xì)胞上的EM13309的FACS滴定。實施例1 免疫原的生成實施例1. 1細(xì)胞夕卜結(jié)構(gòu)域av3 3、av3 5、av36fPav3 8v的生成在昆蟲細(xì)胞系(Hive Five)中使用桿狀病毒感染產(chǎn)生重組人整聯(lián)蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，0￥旦3、(!^^5、(1^^6禾口(1^^8。昆蟲系作為陰性對照的用途是適當(dāng)?shù)?。在發(fā)酵后，下游加工包含下列元素在<Mab 14D9>Toyopearl親和柱上的層析、用Spectra/POR透析管的透析(6-8kDa 對于 DTM- α ν β 3 禾口 DTM- α νβ 5 ； 25kDa 對于 DTM- α ν β 8)、用具有截止 30kDa的 Millipore TFF Labscale 的濃縮(僅 DTM-α ν β 5 禾口 DTM-α ν β 8)、用具有截止 30kDa 的Amicon Ultra-15離心過濾單元的濃縮和用Millex GV的0. 2 μ m過濾(僅DTM-α ν β 3、DTM-α νβ 6、DTM_a νβ 8)。在50mM Na (CH3COO)、0· 2mM MnCl2、pH 7. 4 的緩沖液中溶解 22mg DTM- α νβ 3 以給出2. Omg/ml的蛋白質(zhì)濃度。隨后把儲液等分為500 μ 1的22小瓶。在50mM Na(CH3COO)、0. 2mM MnCl2, pH 7. 4的緩沖液中溶解10. 6mg DTM- α ν β 5以給出2. 36mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。隨后把儲液等分為500 μ 1的9小瓶。在50mM Na(CH3COO)、0· 2mM MnCl2, pH 7. 4的緩沖液中溶解15mg DTM- α ν β 6以給出2. 36mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。在50mM Na(CH3COO)、0· 2mMMnCl2, pH 7. 4的緩沖液中溶解16. 6mgDTM_ α ν β 8以給出2. 78mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。在液氮中冷凍等份并在-80°C儲存。按照常規(guī)實驗行為，用Coomassie染色或western印跡通過BCA測定和SDS PAGE實施分析。由western印跡使用以下抗體用于DTM-α νβ3 的檢測第一 Mab ΑΡ3 EMD330515/CH000, 5 μ g/ml, 2h RT，以及第二山羊抗小鼠IgG (H+L)x AP, Dianova, 115-055-062,1 1000，Ih RT，隨后為 Precision Step Tractinχ AP，BioRad，161-0382，1 5000。由 western 印跡使用以下抗體用于 DTM-α v β 5 的檢測第一 Mab<llDl>-CH004，2. 5μ g/ml，lh RT，以及第二山羊抗小鼠 IgG(H+L)χ AP,Dianova, 115-055-062，1 1000，Ih RT，隨后為 Precision Step Tractin χ AP, BioRad,161-0382,1 5000。由western印跡使用以下抗體用于DTM-α v β 6的檢測第一 Mab442-5C4 χ Biotin<hu-整聯(lián)蛋白 β 6>330510/CH001，2 μ g/ml，2h RT，以及第二抗 Biotinχ AP, Sigma A-7064，1 2500，2h RT，隨后為 Precision Step Tractin χ AP, BioRad,161-0380，1 5000。由western印跡使用以下抗體用于DTM- α νβ 8的檢測第一 Mab LM142 χ Biotin Pool A 269A07H1. G01, 5 μ g/ml, 2h RT，以及第二山羊抗小鼠 IgG (H+L) χ AP,Dianova, 115-055-062，1 1000，Ih RT，隨后為 Precision Step Tractin χ AP, BioRad,161-0382,1 5000，Ih RT。
30
通過它們的與它們的關(guān)聯(lián)底物(例如玻連蛋白(ανβ3和ανβδ)和纖連蛋白(ανβ3))結(jié)合的能力，免疫原被表征為有生物學(xué)活性的和特異性的。認(rèn)可這些制備物為整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)保真性的金標(biāo)準(zhǔn)(Mehta等人，Biochem J 1998，330 =861-869 ；Xiong等人，Science 2001，294 :339-345)。重組人整聯(lián)蛋白細(xì)胞夕卜結(jié)構(gòu)域 DTM-α ν β 3、DTM-α ν β 5、DTM- α ν β 6禾口 DTM- α ν β 8被用作免疫原。實施例1. 2 細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域β 3的生成在大腸桿菌BL21中生產(chǎn)與GST融合的人β 3整聯(lián)蛋白細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并且純化為作為免疫原的重組融合蛋白質(zhì)。在發(fā)酵后，下游加工包含以下元素細(xì)胞裂解、French壓碎、包含體的制備、通過透析和濃縮的重折疊。在0. IM碳酸鈉、5mM DTT、pH 9. 5的緩沖液中溶解55mg蛋白質(zhì)以給出1. 27mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。隨后把儲液等分為IOml的2小瓶，5ml的4小瓶和Iml的4小瓶。過濾(0. 2 μ m)、在液氮中冷凍并在_80°C儲存等分試樣。按照常規(guī)實驗行為，用Coomassie染色或western印跡通過Bradford測定和SDS PAGE實施分析。由western印跡使用以下抗體用于β 3的檢測第一山羊-抗-GST，Amersham,No. 27-4577-01，1 5000，Ih RT，和第二F(ab，)2片段兔-抗-山羊IgG(H+L)x AP,Dianova,305-056-045,1 1000，Ih RT，隨后為 Precision Strep Tactin-AP Conjugate，BioRad，Nr.161-0382,1 5000。實施例1. 3gpiibiiia的生成如先前詳述地(Mitjans等人，J Cell Sci 1995,108 (Pt 8) =2825-38)使用辛烷基葡糖苷從過時的人血小板提取全長人gpiibiiia。實施例2:抗體的生成兔單克隆抗體的生成依照4步流程(A)兔的免疫和多克隆血清的篩選，(B)生成雜交瘤細(xì)胞的融合和多克隆上清液的篩選，(c)亞克隆和亞克隆上清液的篩選，以及(D)編碼抗體的插入片段的cDNA克隆，測序并插入EBNA表達(dá)載體中以允許完全確定的抗體的生產(chǎn)。依照標(biāo)準(zhǔn)的流程針對固定的純化的免疫原用ELISA分析兔出血、雜交瘤上清液和純化的抗體。交付時通過針對ανβ3、ανβ5、ανβ6和ανβ8的重組細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的差示篩選再測試陽性克隆以確認(rèn)特異性和活性。在步驟(A)中，每個免疫源免疫幾只兔并且監(jiān)控抗血清的效價。在FFPE材料上甚至在低稀釋(1 50)時全部兔的前出血(prebleed)沒有給出任何信號，而在融合前的首次出血(primary bleed)(多克隆血清)已經(jīng)給出清晰和明確的信號，有力說明對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的特異性。遞交每一兔的三次出血，并且在8到12周后就融合每個免疫原選擇單一只陽性兔。在步驟(B)中，分離來自血清陽性的兔的B細(xì)胞，并且把兔融合伴侶細(xì)胞系MOE-W與分離的兔B細(xì)胞融合以創(chuàng)造兔雜交瘤細(xì)胞。通過ELISA就融合篩選96孔板。遞交10到100個陽性克隆的上清液，并且在5到6周后每個免疫原選擇3個多克隆。在步驟(C)中，克隆并且篩選雜交瘤以選擇分泌具有合適的特異性抗原識別的抗體的克隆，并且使用多種方法(western印跡、IHC、ICC、流式細(xì)胞術(shù)，等)表征抗體。特別地用ELISA就特異性抗原識別篩選亞克隆的上清液。冷凍并且在_80°C儲存陽性的檢測的亞克隆的上清液直到使用。隨后，以實施例3的兩步方法篩選亞克隆上清液，首先在癌細(xì)胞系陣列上篩選并且第二步中在異種移植物組織上篩選，所述第二步具有平行的癌細(xì)胞系陣列，以驗證第一步篩選。在步驟(D)中，把選擇的抗體克隆的DNA序列切除、克隆入EBNA表達(dá)載體，并且通過自動的cDNA Sanger染料測序進(jìn)行測序。根據(jù)Wiam等人，Biotech Bioeng 2003，84(3) :332-342,在EBNA細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組抗體，但有較小的修改，所述修改為使用HEK293-6E細(xì)胞和用于瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的pTT5載體。通過ELISA和IHC驗證抗體生產(chǎn)。根據(jù)生產(chǎn)商的建議使用TuboCapture Kit(Qiagen)分離來自雜交瘤細(xì)胞的mRNA，并然后用寡-dT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用專有引物0YZ64-2和0YZvh3PCR擴(kuò)增重鏈的可變區(qū)(Vh)。使用專有引物0YZ62和0YZ71 PCR擴(kuò)增整條輕鏈(L)。使用限制酶HindIII和Kpnl消化PCR片段的Vh區(qū)。使用HindIII和NotI消化L PCR片段。使用Qiagen PCR清理試劑盒純化全部的消化的產(chǎn)物。純化后，把Vh或L片段連接入對應(yīng)的重或輕鏈的專有表達(dá)載體并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5 α (MC Lab)。挑取轉(zhuǎn)化的菌落并且使用對應(yīng)的限制酶確認(rèn)插入片段(通過預(yù)期的大小大約是對于VH440bp并且對于L 740bp)。使用TT5為引物對具有預(yù)期大小的插入片段的質(zhì)粒測序。用HindIII和NotI從對應(yīng)的載體切除并且隨后使用QiagenPCR清理試劑盒純化整條輕鏈或重鏈片段。存儲約50到IOOng cDNA插入片段。實施例3 篩選和表征抗體的方法實施例3.1:陣列組成將27株癌細(xì)胞系和1株昆蟲細(xì)胞系在磷酸緩沖的4%多聚甲醛，pH 7中在室溫下固定16到M小時，包埋在石蠟中并且安放入28株細(xì)胞系石蠟塊(CAX05)內(nèi)。通過流式細(xì)胞術(shù)，使用分別地針對ανβ3和α νβ 5整聯(lián)蛋白復(fù)合體的確定的小鼠單克隆抗體(例如LM609(Cheresh&Spiro, JBC1987,262 :17703-17712)和 P1F6((Varner&Cheresh，ImportantAdv Oncol 1996,87 :69))，先前表征了在陣列中使用的若干細(xì)胞系的整聯(lián)蛋白細(xì)胞表面表達(dá)譜(Mitjans 等人，J Cell Sci 1995，108 (Pt 8) :2825-38) CAX05
A431squams cancer oes
A549肺癌
A2780ADR卵巢癌
C8161黑色素瘤
Calu6月市腺癌(lung adeno)
Colo205結(jié)腸癌
DU145前列腺癌
HCTl16結(jié)腸癌
HT29結(jié)腸癌
Igrovl卵巢癌
Kyse30鱗狀癌
Lox黑色素瘤
M21黑色素瘤
M24-met黑色素瘤
MCF7乳腺癌
MDA-MB23乳腺癌
MDA-MB468乳腺癌
MiaPaCa2胰腺癌
NCI-H460LC肺癌
0vcar-3卵巢癌
PC3前列腺癌
RajiBuBVLtt 淋巴
Sf9昆蟲細(xì)胞
SK0V3卵巢癌
Suit7胰腺癌
SW707結(jié)腸癌
U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤
WM164黑色素瘤通過使用來自載體處理的小鼠的異種移植物組成在不同實驗研究外的陣列(Xeno-08-A ；Xeno-08-Mul)。Xeno-08-A M21小鼠U87MG小鼠HCTl 16CDlnu/nu 小鼠A549 (人肺癌)CDlnu/nu 小鼠Calu6CDlnu/nu 小鼠Xeno-08-Mul A549、HCTl 16, U87MG、M21、Calu6、A431、BT474、Colo205、H1975、MDA MB-231、Mes-Sa/Dx5、PC3、SW707, A2780, A2780ADR把癌細(xì)胞系整列和異種移植物陣列的3 μ m的切片設(shè)置在帶正電荷的SuperFr0St PlllS載玻片上(Menzel-Glaeser，Braunsctiweig，德國)并且?guī)Ц稍飫﹥Υ嬖?80"C。實施例3. 2: IHC流程用染色儀器Discovery 或Discovery XT (Ventana Medical Systems, Inc.，Tucson，美國)完成以切片的去石蠟化開始的免疫組織化學(xué)染色流程。在去石蠟化之后加熱切片用于在Tris-EDTA緩沖液pH8中的表位補(bǔ)救或?qū)⑶衅?7°C用蛋白酶孵育8分鐘(蛋白酶1)或12分鐘(蛋白酶幻。通過在3%過氧化氫(OmniMap 或UltraMap 試劑盒的部分，Ventana Medical Systems)中的孵育封閉內(nèi)源過氧化物酶。在第一次免疫組織化學(xué)循環(huán)(rim)的當(dāng)天在室溫溫?zé)嵘锨逡褐?，添加疊氮化鈉至最終濃度0.01% (w/v)，并且在4°C儲存上清液?？偸怯孟嗤膬x器對一系列上清液染色。用多克隆或亞克隆的上清液，或重組表達(dá)的抗體(2-10μ g/ml ；每個載玻片100 μ 1)孵育切片，并隨后在37°C用合適的第二抗體(如OmniMap或UltraMap試劑盒的HRP綴合多聚物)孵育切片16分鐘。辣根過氧化酶(HRP)催化3，3’_ 二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸化物(DAB)/ 反應(yīng)以生產(chǎn)可視的不能溶解的黑棕色沉淀。用蘇木精復(fù)染切片。用自來水洗、脫水，并在永久封固培養(yǎng)基Entellan Neu(VWR，德國)中用玻璃蓋玻片封固載玻片。在室溫儲存載玻片，并且在6°C儲存石蠟塊。
免疫組織化學(xué)染色流程圖A.預(yù)處理-去石蠟化(溫度75°C8分鐘，然后75°C 8分鐘EZ Prep緩沖液)-細(xì)胞條件處理(TrisEDTA緩沖液pH 8，時間48分鐘；溫度95°C )或-蛋白酶條件處理(蛋白酶1:0.5U/ml，或蛋白酶2 :0. lU/ml ；時間8或12分鐘；溫度37°C )B.檢測-第一抗體(體積100μ 1 ；時間32分鐘；溫度:37°C )-第二抗體(與HRP綴合的OmniMap或UltraMap；體積:100 μ 1 ；時間16分鐘；溫度37°C )-檢測(ChromoMapDAB)-復(fù)染色(蘇木精I(xiàn)I；時間8分鐘)-后復(fù)染色(Bluing試劑)-載玻片清潔用自動顯微鏡Ariol SL_50at X20掃描細(xì)胞系陣列(x/y比例1象素=0. 38x0.38μπι2)。在每一組織點中設(shè)定0.1mm2的環(huán)狀區(qū)(輸入?yún)^(qū))。通過設(shè)定“顏色”、“色調(diào)”，和“飽和度”的閾值在Ariol SL-50的圖像分析軟件的幫助下定量陽性的免疫組織化學(xué)標(biāo)記的棕色顏色。在輸入?yún)^(qū)中的陽性區(qū)是棕色標(biāo)記的組織的分?jǐn)?shù)。陽性區(qū)的強(qiáng)度是在3張黑色的和白色的圖像中測量的棕色顏色的平均灰色值，所述圖像是用紅色、藍(lán)色和綠色過濾器拍照的?；疑翟趶腛 (黑色)到白色055)范圍內(nèi)。根據(jù)陽性區(qū)分?jǐn)?shù)* (255-強(qiáng)度)計算表達(dá)。用Spotflre DecisionSiteTM (9.ο版本，Spotfire he.)展示數(shù)據(jù)。實施例3. 3 =ELISA流程通過從包被緩沖液(150mMNaCl ； ImM CaCl2 ； ImM MgCl2 ； 10 μ MMnCl2 ；50mMTris-Cl ；pH 7.5)吸收； 16h)在微量滴定板上包被重組整聯(lián)蛋白(1 μ g/ml)。將平板洗滌(洗滌緩沖液0. 5% BSA ；PBS ψ 0. 05% Tween20)、封閉(lh ；4°C;PBS 中 5% BSA)，并且用在洗滌緩沖液中被系列稀釋的第一抗體孵育(lh;37°C)。洗滌后，加入第二檢測抗體(山羊-抗兔HRP ;1 5000) (lh ;37°C)，隨后使用在檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 5. 0)中的四甲基聯(lián)苯胺(100μ g/ml)洗滌和檢測，用硫酸顯色，并且對比在450nm試劑空白的進(jìn)行讀數(shù)。減去空白值后表示結(jié)果，所述空白值一般地<陽性對照值的5%。實施例3. 4 =FACS分析使用胰蛋白酶(0. 5 μ g/ml)/EDTA(0. 2 μ g/ml)收獲對數(shù)生長的細(xì)胞，將所述細(xì)胞在FACS緩沖液(PBS加0. 9mM CaCl2 ；0. 5mM MgCl2 ；0. 5% w/v BSA)中洗滌，并用抗整聯(lián)蛋白抗體孵育(60min ；4°C;10 μ g/ml，在FACS緩沖液中)。洗滌后，將細(xì)胞用Alexa-488標(biāo)記的抗兔 IgG(Invitrogen)、或山羊抗小鼠 IgG FITC(Becton-Dikinson)染色(30min ；4°C )，洗滌并在FACS緩沖液中重懸(500μ 1管)。在FACScan (Becton-Dickinson)上分析細(xì)胞并且將平均強(qiáng)度熒光(MIF)對陰性對照(用PI和第二標(biāo)記的抗體，而沒有第一抗體染色的細(xì)胞)的MIF歸一化。實施例3. 5 評估和統(tǒng)計學(xué)通過圖形軟件包Graphpad Prism(第 5. O 版，GrapUad Software, Inc. LaJollaCa)中的非線性曲線擬合從三重數(shù)據(jù)點測定在ELISA中抗體結(jié)合的IC5tl。使用BD Facs-scan程序(CellQuest MacOS 8.6)分析流式細(xì)胞術(shù)。實施例4 抗α ν β 3克隆和抗α ν β 3抗體的表征實施例4. 1 :Ε3528-2-7、Ε3528-2-11 和 Ε3528-2-12 的表征在癌細(xì)胞系CAX05的FFPE細(xì)胞系陣列上未稀釋地篩選來自M個亞克隆的上清液，所述亞克隆獲取自兔的多克隆2和63。作為非整聯(lián)蛋白特異性，排除了沒有清晰的膜譜的細(xì)胞質(zhì)信號。多克隆2的亞克隆顯示質(zhì)膜染色(圖1)。將關(guān)于某些細(xì)胞類型的亞克隆的選擇性與小鼠單克隆IgG，克隆20H9對比。克隆20H9是抗β 3鏈抗體(Mitjans等人，J Cell Sci 1995，108 (Pt 8) :2825-38)，所述抗體在FFPE中交叉反應(yīng)，但是是以低的結(jié)合親和力。在異種移植物陣列Xeno-08-A上的第二循環(huán)中測試陽性亞克隆以確認(rèn)在腫瘤組織上的交叉反應(yīng)性(表1)。表1 對細(xì)胞外ανβ3結(jié)構(gòu)域的克隆。把染色強(qiáng)度從_(陰性)到+++(強(qiáng))分級。
權(quán)利要求
1.針對具有來自昆蟲的糖基化模式的整聯(lián)蛋白和具有另ー種真核生物糖基化模式的整聯(lián)蛋白的單克隆兔抗體，或其片段，所述抗體或其片段各自至少包含輕鏈可變區(qū)(VJ和重鏈可變區(qū)(Vh)，其中抗體具有對細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞外整聯(lián)蛋白鏈結(jié)構(gòu)域的非封閉表位的抗原結(jié)合特異性，并且其中抗體能夠以基本相同的特異性與在福爾馬林固定石蠟包埋(FFP^的材料中和在活細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白的完整的異源ニ聚體結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中抗體與整聯(lián)蛋白ανβ 3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且優(yōu)選地，Vl包含SEQ ID NO 95的氨基酸序列(Vf α ν β 3)并且Vh包含SEQ ID NO :96的氨基酸序列(Vh- α ν β 3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中抗體與整聯(lián)蛋白ανβ 5的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且優(yōu)選地，八包含SEQ ID Ν0:15的氨基酸序列(Vf α ν β幻并且Vh包含SEQ ID NO 16的氨基酸序列(Vh- α ν β 5)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中抗體與整聯(lián)蛋白ανβ 6的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且優(yōu)選地，八包含SEQ ID NO :135的氨基酸序列(Vf α ν β 6)并且Vh包含SEQ ID NO :136的氨基酸序列(Vh- α ν β 6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中抗體與整聯(lián)蛋白ανβ 8的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且優(yōu)選地，八包含SEQ ID NO :175的氨基酸序列(Vf α ν β 8)并且Vh包含SEQ ID NO :176的氨基酸序列(Vh- α ν β 8)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中抗體與整聯(lián)蛋白鏈αν的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且優(yōu)選地，Vl包含SEQ ID NO 215的氨基酸序列(Vf α ν)并且Vh包含SEQ ID NO :216的氨基酸序列(Vh- α ν)。
7.編碼權(quán)利要求1到6的任ー項的抗體或其片段的多核苷酸。
8.由具有來自昆蟲的糖基化模式的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域組成的重組免疫原，任選地作為δ跨膜形式偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求9的免疫原，其具有SEQID NO :10、90、130、170或210的氨基酸序列， 或氨基酸序列的變體、突變體、部分或具有相同功能的至少95%同源序列。
10.編碼權(quán)利要求9的免疫原的多核苷酸。
11.單克隆抗體，其通過以根據(jù)權(quán)利要求8或9的免疫原和/或根據(jù)權(quán)利要求10的多核苷酸免疫兔，獲取具有多克隆抗體的多克隆抗血清并且制備單克隆抗體獲得。
12.用于制備單克隆兔抗體的方法，所述方法包括步驟(a)在昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，(b)純化表達(dá)的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域，(c)用純化的細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域免疫兔，(d)從兔中獲取包含多克隆抗體的多克隆抗血清，和(e)制備單克隆抗體。
13.具有下述步驟的用于制備包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)的重組單克隆抗體的方法(a)將至少一個載體引入宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼抗體的下述核酸序列(i)SEQID NO :115(VL-a νβ 3)和 SEQ ID NO 116 (VH-a ν β 3)，(ii)SEQ ID NO :35 (VL- a ν β 5)和 SEQ ID NO :36 (VH- a v β 5)，(iii)SEQID NO 155 (VL-α ν β 6)和 SEQ ID NO 156 (VH-α ν β 6)，(iv)SEQ ID NO : 195 (VL- α ν β 8)和 SEQ ID NO 196 (VH- α v β 8)，或(ν) SEQ ID NO 235 (VL- α v)和 SEQ ID NO :236 (VH- α v)，(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而表達(dá)編碼的抗體，和(c)純化表達(dá)的抗體。
14.權(quán)利要求1到6或11的任ー項的抗體或其片段的用途，其用于在福爾馬林固定石蠟包埋(FFP^的材料中檢測整聯(lián)蛋白。
15.篩選抗整聯(lián)蛋白抗體的方法，所述抗體能夠區(qū)分整聯(lián)蛋白α亞基和/或β亞基各自的最接近的同源物并且適合于在福爾馬林固定石蠟包埋(FFP^的材料中的免疫組織化學(xué)，所述方法包括步驟(a)提供能夠與選擇的整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體的樣品，(b)比對整聯(lián)蛋白序列以鑒定選擇的整聯(lián)蛋白的α亞基和/或β亞基的最接近的同源物，(c)用抗體樣品對選擇的整聯(lián)蛋白和其最接近的ー個或多個同源物的天然的形式實施差示ELISA，從而積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(初級篩選)；(d)用步驟(c)積累的抗體對選擇的整聯(lián)蛋白和另ー種整聯(lián)蛋白的天然形式實施另一差示ELISA，從而進(jìn)一歩積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(次級篩選)；(e)用步驟(d)積累的抗體實施FFPE細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)，其中至少ー個細(xì)胞系能夠表達(dá)選擇的整聯(lián)蛋白并且任選地另一個細(xì)胞系不能夠表達(dá)選擇的整聯(lián)蛋白，從而進(jìn)一歩積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第三級篩選)；(f)用步驟(e)積累的抗體實施步驟(e)的FFPE細(xì)胞系的免疫組織化學(xué)，其中細(xì)胞系在哺乳動物中作為異種移植腫瘤生長，從而進(jìn)一歩積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第四級篩選)；和(g)用步驟(f)積累的抗體實施檔案FFPE腫瘤的免疫組織化學(xué)，從而進(jìn)ー步積累針對選擇的整聯(lián)蛋白的抗體(第五級篩選)。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠與整聯(lián)蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體。本發(fā)明的另一個目的涉及所述抗體用于檢測在檔案福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織中的整聯(lián)蛋白的用途。本發(fā)明也涉及用于制備單克隆兔抗體的方法(其中免疫原是來自昆蟲表達(dá)培養(yǎng)物的重組細(xì)胞外整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域)，和另一個用于篩選抗整聯(lián)蛋白抗體的方法，所述抗體區(qū)分最接近的整聯(lián)蛋白同源物并且特別地適合于在FFPE材料中的免疫組織化學(xué)。
文檔編號C07K16/28GK102597001SQ201080036609
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者C·威爾姆, F·米蒂亞斯, S·戈德曼 申請人:默克專利有限公司