專利名稱：體內(nèi)腫瘤血管系統(tǒng)成像的制作方法
體內(nèi)腫瘤血管系統(tǒng)成像本發(fā)明涉及對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像的非侵入性方法和用途，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。在又一方面，本發(fā)明涉及在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效的非侵入性方法和用途，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。另外，提供了在本發(fā)明的方法中使用的試劑盒，其包含經(jīng)熒光標(biāo)記的抗⑶31抗體和用于近紅外熒光成像以檢測(cè)受試者中的該抗體的手段。血管形成經(jīng)由血管生成(vasculogenesis)和血管發(fā)生(angiogenesis)過程發(fā)生。血管生成是胚胎發(fā)育期間血管內(nèi)皮細(xì)胞自前體細(xì)胞(稱為成血管細(xì)胞)的重新分化。此過程與血管發(fā)生過程不同，血管發(fā)生過程是一種以自先前存在的血管萌發(fā)新血管為特征的重塑過程(Folkman 和 D，Amore，Cell 1996 ；第 87 卷1153-1155 ；Risau,Nature 1997;第386卷671-674)。始終廣泛認(rèn)為，血管生成僅在早期胚胎發(fā)生期間發(fā)生。最近的研究揭示了內(nèi)皮祖干細(xì)胞的存在，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些骨髓衍生細(xì)胞摻入成人中的新血管病灶(包括受損傷的角膜、缺血性下肢和腫瘤血管系統(tǒng))中，提示血管生成可以在成人中發(fā)生 (Asahara 等，Science 1997 ；第 275 卷964_967 ；Shi 等，Blood 1998 ；第 92 卷362_367)。然而，血管發(fā)生在胚胎發(fā)生期間，并且以有限的程度在成人中，例如在女性生殖系統(tǒng)中、在生理性傷口愈合中及在病理性疾病過程諸如癌癥中發(fā)生(Klagsbrun和Moses， Chemistry&Biology 1999 ；第 6 卷217_224)。血管發(fā)生是由各種生長(zhǎng)因子諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)刺激的。對(duì)血管發(fā)生刺激因子的早期應(yīng)答是蛋白酶諸如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族成員對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞基底膜的降解。MMP降解膠原和其它胞外基質(zhì)組分(見

圖1)。破壞基底膜屏障讓內(nèi)皮細(xì)胞自先前存在的血管向血管生成刺激遷移并增殖(Marsh，Stem Cells 1997 ；第15卷180-189)。血管細(xì)胞粘著分子通過介導(dǎo)細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用來促成內(nèi)皮細(xì)胞遷移。主要的介導(dǎo)物之一是整聯(lián)蛋白α νβ3，即蛋白質(zhì)諸如纖連蛋白的一種受體。整聯(lián)蛋白α νβ3的拮抗劑抑制新血管的生長(zhǎng)，提示細(xì)胞粘著是血管發(fā)生中的一個(gè)至關(guān)重要的步驟(Brooks等，Cell 1994 ；第79卷1157_1164)。在遷移和增殖后，內(nèi)皮細(xì)胞裝配成具有開放腔的管。生成成熟血管中的一個(gè)重要步驟是間充質(zhì)細(xì)胞的募集及其隨后分化成平滑肌細(xì)胞樣周細(xì)胞，認(rèn)為所述平滑肌細(xì)胞樣周細(xì)胞穩(wěn)定化新形成的血管系統(tǒng)。這些周細(xì)胞逐漸被內(nèi)皮叢吸引，導(dǎo)致血管樹的進(jìn)行性覆蓋(Benjamin等，Development 1998 ；第125卷 1591-1598)。在此期間，未覆蓋的毛細(xì)管發(fā)生消退，這在獲得周細(xì)胞包被后停止。因此，血管形成的此較晚期階段以重塑步驟為特征，其中切除不受保護(hù)的血管，并且經(jīng)周細(xì)胞覆蓋的血管變得穩(wěn)定，而且不太易于脫穩(wěn)定化和消退。大概自內(nèi)皮細(xì)胞來源衍生的血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)募集周細(xì)胞以與內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合，從而提高血管穩(wěn)定性(Lindahl等，Science 1997 ；第277卷242-245)。圖1中也顯示了上文所描述的血管發(fā)生中的過程。血管生成和血管發(fā)生，特別是新血管發(fā)生是不僅在正常的發(fā)育中，而且在異常發(fā)育中諸如在腫瘤形成中發(fā)生的過程。也就是說，腫瘤細(xì)胞的增殖和存活依賴于生長(zhǎng)因子的足夠供應(yīng)和毒性分子的除去。在實(shí)體組織中，例如氧可以自毛細(xì)管放射狀擴(kuò)散僅150至 200 μ HIo
在距離超過這點(diǎn)時(shí)，繼之以細(xì)胞死亡(Vincent等，CANCER-Principles&Practice of Oncology，第5版；Lippincott-Raven)。如此，腫瘤塊的擴(kuò)大超出直徑為2mm依賴于足夠血供的形成。許多出版物描述了腫瘤血管發(fā)生的現(xiàn)象?？梢詫⒛[瘤植入無血管區(qū)，諸如角膜中，或者在特征性血管化表面，諸如雞尿囊絨膜上植入，及在每種情況中形成新毛細(xì)管向內(nèi)生長(zhǎng)的觀察結(jié)果提示了腫瘤釋放血管發(fā)生的擴(kuò)散性活化劑，其可以向靜止的血管系統(tǒng)發(fā)信號(hào)以開始毛細(xì)管萌發(fā)(Hanahan和Folkman，Cell 1996 ；第86卷353_364)。在過去數(shù)年中，已經(jīng)通過使用許多體外和體內(nèi)生物測(cè)定法，諸如增殖測(cè)定法和趨化性測(cè)定法來鑒定血管發(fā)生的許多誘導(dǎo)物和抑制劑。增殖測(cè)定法使用培養(yǎng)的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞，并測(cè)量增加的細(xì)胞數(shù)目或經(jīng)放射性標(biāo)記的或經(jīng)修飾的核苷的摻入以檢測(cè)S期的細(xì)胞。相反，趨化性測(cè)定法通過多孔膜盤來分開內(nèi)皮細(xì)胞和測(cè)試溶液，使得內(nèi)皮細(xì)胞遷移穿過屏障指示測(cè)試溶液中存在的化學(xué)引誘物(Hanahan和Folkman，Cell 1996 ；第86卷 353-364)。通過使用體內(nèi)測(cè)定法，諸如角膜中的植入物，可以補(bǔ)充體外測(cè)定法。已經(jīng)使用這些測(cè)定法來鑒定血管發(fā)生的數(shù)種誘導(dǎo)物和抑制劑。要檢測(cè)的第一種是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子， 并且?guī)缀跬瑫r(shí)，通過其引發(fā)血管通透性的能力鑒定一種分泌性蛋白質(zhì)，稱作血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或血管通透性因子(VEGF) (Simpson-Haidaris和Rybarczyk，Annals of the New York Academy of Sciences2001 ；第 936 卷406_425)。已經(jīng)顯示了這兩種蛋白質(zhì)(VEGF，F(xiàn)GF)都能夠增強(qiáng)毛細(xì)管生長(zhǎng)，并且如此，是血管發(fā)生的有力誘導(dǎo)物。最近，已經(jīng)鑒定出兩種相關(guān)生長(zhǎng)因子VEGF-B和VEGF-C，并且所有三種VEGF基因及FGF在小鼠和人的正常成年器官中廣泛表達(dá)，提示在組織穩(wěn)態(tài)及血管發(fā)生中的作用。FGF 和VEGF結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，其是跨膜酪氨酸激酶，并且如此經(jīng)由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)與細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)偶聯(lián)(Brown等，EXS1997 ；第79卷:233_269)。FGF和VEGF通常在極其多種人和動(dòng)物癌癥中表達(dá)，并且它們已經(jīng)在顯著分?jǐn)?shù)的攜帶腫瘤的患者的尿液和血清中以升高的水平檢出(Simpson-Haidaris和Rybarczyk， Annals of the New York Academy of Sciences2001 ；第 936 卷406_425)。在過去數(shù)十年期間，已經(jīng)鑒定出數(shù)目日益增加的血管生成誘導(dǎo)物，而且還已經(jīng)呈現(xiàn)了內(nèi)源血管發(fā)生抑制劑的第一項(xiàng)證據(jù)。例如，研究人員分別使用基于體外趨化性的測(cè)定法和角膜袋體內(nèi)測(cè)定法觀察到α干擾素和血小板因子_4可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞趨化性和增殖(Brouty-BoyS和 Zetter, Science 1980 ；第 208 卷516_518)。上述段落匯總了如下的證據(jù)，即血管發(fā)生可以受到內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的誘導(dǎo)物和抑制劑兩者調(diào)節(jié)。目前，存在著提示抑制劑和誘導(dǎo)物的平衡決定血管生成開關(guān)的線索。數(shù)個(gè)線索為此假設(shè)提供了基礎(chǔ)。第一個(gè)線索來自體外生物測(cè)定法。如提及的，使用增殖和趨化性測(cè)定法，F(xiàn)GF和VEGF可以引發(fā)來自毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的正響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明了，量增加的抑制劑諸如血小板反應(yīng)蛋白-I(TSP-I)阻斷血管發(fā)生，提示足夠量的抑制劑壓倒正活化劑的信號(hào)，將血管生成開關(guān)保持關(guān)閉(Dameron等，Science 1994 ；第265卷1582-1584)。第二個(gè)線索來自人癌細(xì)胞的研究，其中P53腫瘤阻抑物功能的恢復(fù)導(dǎo)致TSP-I的上調(diào)，壓倒細(xì)胞自身合成的血管發(fā)生誘導(dǎo)物及添加的FGF兩者(Dameron等，Science 1994 ；第265卷 1582-1584)。這些和其它線索提示了正和負(fù)信號(hào)平衡的變化介導(dǎo)“血管生成開關(guān)”(見圖2)。已知血管生成和血管發(fā)生，特別是新血管發(fā)生是腫瘤形成中的關(guān)鍵因素，研究人員對(duì)以最終殺死腫瘤為目的干擾這些過程感興趣。因而，在超過30年前，研究人員假設(shè)為了存活和生長(zhǎng)，腫瘤需要血管，并且通過切斷血供，可以將癌癥饑餓成消退。這種針對(duì)癌癥的革命性方法已經(jīng)發(fā)展成目前科學(xué)調(diào)查的最令人興奮的領(lǐng)域之一。 在過去數(shù)十年中，研究人員已經(jīng)分離出調(diào)節(jié)血管發(fā)生的蛋白質(zhì)并解開調(diào)節(jié)血管發(fā)生的過程 (Ribatti,Angiogenesis 2008 ；第11卷3_10)。在理論上，血管生成級(jí)聯(lián)的每個(gè)步驟是癌癥療法的一個(gè)潛在靶物。已經(jīng)分離并表征了內(nèi)皮增殖和血管發(fā)生的許多特異性和非特異性抑制劑。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute,NCI)協(xié)調(diào)臨床試驗(yàn)中的19種潛在的血管發(fā)生抑制劑，而它們中的5種現(xiàn)在處于臨床3期(NCI，國(guó)家癌癥研究所的官方網(wǎng)站)。兩種相當(dāng)有希望的抑制劑血管他丁(angiostatin)和內(nèi)皮他丁(endostatin)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。沒有招致周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身的增殖。血管他丁在前列腺癌異種移植物中顯示99%腫瘤抑制，而內(nèi)皮他丁在數(shù)種鼠腫瘤模型，諸如路易士(Lewis)肺癌和B16F10黑素瘤中揭示腫瘤消退(O'Reilly等，Cell 1994 ；第79卷:315_328 ；O'Reilly 等，Cell 1997;第88卷277-285)?，F(xiàn)今，主要的制藥公司已經(jīng)認(rèn)識(shí)到該有希望的主題，并且致力于開發(fā)抑制血管發(fā)生活化劑諸如VEGF、FGF或血管生成素的新抗體。已經(jīng)開發(fā)并測(cè)試數(shù)種抗體，獲得或大或小的成功。例如，安維汀(Avastin)(即一種為抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子而設(shè)計(jì)的抗體)因其在乳腺癌和結(jié)腸癌患者中的抑制效果獲得很大成功而馳名。發(fā)表了第一項(xiàng)研究，其中在惡性腫瘤的基因療法中使用血管發(fā)生抑制劑。除了那點(diǎn)之外，在用特異性血管生成抑制劑的動(dòng)物研究中，迄今為止尚未報(bào)告副作用(NCI，國(guó)家癌癥研究所的官方網(wǎng)站)。已經(jīng)對(duì)TNP-470僅部分報(bào)告了血管發(fā)生抑制劑也可以抑制重要的生理學(xué)功能，諸如傷口愈合的評(píng)價(jià)。已經(jīng)顯示了傷口愈合在小鼠中延遲 (0，Reilly等，Science 1999 ；第285卷1926-1928)。其它抑制劑如內(nèi)皮他丁或血管他丁對(duì)小鼠中的傷口愈合或其它生理學(xué)功能沒有顯示負(fù)影響?？傊呀?jīng)完成了許多努力來研究血管發(fā)生。研究人員已經(jīng)分離出調(diào)節(jié)血管發(fā)生的蛋白質(zhì)。已經(jīng)實(shí)施了數(shù)項(xiàng)體外研究以研究?jī)?nèi)皮血管形成。在過去數(shù)十年中，研究人員認(rèn)識(shí)到血管發(fā)生在腫瘤形成中確實(shí)也發(fā)揮主要的作用。使用動(dòng)物中的植入物的早期研究報(bào)告了由腫瘤組織誘導(dǎo)的血管生成應(yīng)答，即血管形成比由正常組織誘導(dǎo)的或傷口后的血管生成應(yīng)答更實(shí)質(zhì)性且更早。因?yàn)橐呀?jīng)顯示了腫瘤生長(zhǎng)是血管發(fā)生依賴性的，所以各公司聚焦于開發(fā)針對(duì)血管生成生長(zhǎng)因子的新藥物以使腫瘤饑餓成消退。為了監(jiān)測(cè)腫瘤血管發(fā)生，特別是在用抗血管生成藥物的治療期間，研究人員嘗試并應(yīng)用不同成像技術(shù)、不同血管靶物和染料。然而，迄今為止應(yīng)用的成像技術(shù)不容許實(shí)時(shí)條件下的體內(nèi)成像。例如，計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層攝影術(shù)(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些經(jīng)典的非侵入性成像技術(shù)(見表1)?；诮馄蕦W(xué)、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)變化，這些技術(shù)容許診斷疾病，諸如癌癥。然而，大多數(shù)這些建立的技術(shù)缺乏靈敏性，降低特異性靶向，而且不能展現(xiàn)出以分子為基礎(chǔ)的功能變化，并且如此不是基礎(chǔ)研究、臨床前和轉(zhuǎn)化應(yīng)用中的合適工具。因此，僅可以在晚期、形態(tài)學(xué)可見的時(shí)間點(diǎn)時(shí)診斷出疾病。其它成像技術(shù)遭受不得不自受試者獲得包括血管系統(tǒng)的腫瘤材料的缺陷。
腫瘤內(nèi)的血管系統(tǒng)一般經(jīng)歷活躍的血管發(fā)生，導(dǎo)致新血管的連續(xù)形成以支持生長(zhǎng)中的腫瘤。此類血管生成血管與成熟的血管系統(tǒng)的可區(qū)別之處在于血管生成血管系統(tǒng)表達(dá)獨(dú)特的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物，包括ανβ3整聯(lián)蛋白(Brooks等，Cell 1994，第79 卷1157-1164 ；WO 95/14714)和血管生成生長(zhǎng)因子受體(Mustonen 和 Alitalo, J. Cell Biol. 1995，第 129 卷895_898 ；Lappi, Semin. Cancer Biol. 1995，第 6 卷279_288)。此夕卜，腫瘤血管系統(tǒng)與一般的血管在組織學(xué)上的可區(qū)別之處在于腫瘤血管系統(tǒng)是有孔的 (Folkman, Nature Med. 1995，第 1 卷:27_31 ；Rak 等，Anticancer Drugs 1995，第 6 卷 3-18。如此，血管生成血管系統(tǒng)是一種用于靶向腫瘤歸巢分子的特別有吸引力的靶物。因而，α νβ 3整聯(lián)蛋白、血管生成生長(zhǎng)因子諸如VEGF及其受體是用于對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)成像的有吸引力的靶物。US 6，958，140提示了肝配蛋白(印hrin)-Β2為用于成像，特別地對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)成像的血管靶物。US 6，051，230提示了 FGF為用于成像的靶物。EP 627 940 提示了 ELAM-1-1、VCAM-I、ICAM-I、LAM-I 或MHC II 類抗原。Citrin 等，Mol Cancer Ther. 2004，第 4 卷481-8 提示了內(nèi)皮他丁。Bix 等，J Natl Cancer Inst. 2006，第 98 卷: 1634-1646提示了 Endor印ellin。其他作者提示了使用MPI造影劑，即釓(Saban等，BMC Cancer2007，第 7 卷:219_238)。此外，迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)成像技術(shù)、血管標(biāo)志物和染料間的合適相互作用，其容許腫瘤血管系統(tǒng)的非侵入性體內(nèi)成像或在受試者中在實(shí)時(shí)條件下監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效。因而，研究人員停留于用于對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)成像的已知技術(shù)，并且如此對(duì)腫瘤的冷凍切片應(yīng)用免疫化學(xué)技術(shù)(參見Ninomiya等，J.Surg. Res. 2009，第154卷196-262)。一些研究人員通過使用⑶31抗體來應(yīng)用對(duì)補(bǔ)充有Matrigel并植入小鼠中的HUVEC的命運(yùn)的體內(nèi)成像(Bogdanov 等，Pharm. Res. 2007，第 24 卷:1186_1192)。這些作者提示了使用 CD31 抗體來對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠中的過繼轉(zhuǎn)移體內(nèi)成像及出于生物工程目的在確定人細(xì)胞在小鼠模型中的命運(yùn)中以及在藥物開發(fā)中使用⑶31抗體。具體地，這些作者想要追蹤人細(xì)胞在小鼠中的命運(yùn)，并且如此測(cè)定抗CD31抗體對(duì)小鼠中人內(nèi)皮細(xì)胞的特異性。然而，這些作者沒有通過使用經(jīng)標(biāo)記的CD31抗體使用小鼠腫瘤模型來顯現(xiàn)腫瘤的血管形成。另外，這些作者提示了非侵入性成像可以充當(dāng)一種重要的輔助以監(jiān)測(cè)細(xì)胞過繼及最后體內(nèi)接受的命運(yùn)。因而，他們進(jìn)一步提示了如此，抗⑶31抗體可以是一種用于對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠中過繼轉(zhuǎn)移成像的潛在成像劑，以及這些抗體可以出于生物工程目的幫助確定人細(xì)胞命運(yùn)及幫助藥物開發(fā)。然而，這些作者沒有提示使用抗⑶31抗體來在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效。Mitra和Foster，Neoplasia 2008，第10卷429_438應(yīng)用體內(nèi)共焦熒光成像來顯現(xiàn)光敏劑單-L-天冬氨酰二氫卟酚_e6(NPe6)的攝取和腫瘤內(nèi)分布。光敏劑在光動(dòng)力療法中使用。光動(dòng)力療法是一種第三水平的癌癥治療，其牽涉三種關(guān)鍵的組分光敏劑、光和組織氧。因而，Mitra和Foster調(diào)查NPe6光敏劑的分布及其動(dòng)力學(xué)。出于所述目的，他們經(jīng)由尾靜脈對(duì)小鼠EMT6腫瘤模型系統(tǒng)性施用NPe6，并且通過使用綴合有Alexa Fluor 647的抗小鼠⑶31抗體就血管系統(tǒng)而言顯現(xiàn)NPe6。然而，Mitra和Foster沒有使用經(jīng)標(biāo)記的抗 CD31抗體來顯現(xiàn)腫瘤血管系統(tǒng)。他們應(yīng)用此類抗體來顯現(xiàn)NPe6光敏劑的分布。Runnels等，Mol. Imaging 2006，第5卷31_40在小鼠中應(yīng)用體內(nèi)成像來顯現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的典型粘著分子的分子表達(dá)。因而，Runnels等施用針對(duì)例如⑶31 (PECAM-I)、E-選擇蛋白、P-選擇蛋白和VCAM-I的單克隆抗體，并調(diào)查這些蛋白質(zhì)的時(shí)間和空間表達(dá)。 然而，Runnels等沒有顯現(xiàn)腫瘤血管系統(tǒng)，因?yàn)樗麄儧]有使用腫瘤模型，并且對(duì)顯現(xiàn)血管系統(tǒng)根本不感興趣，而是對(duì)顯現(xiàn)例如CD31的表達(dá)感興趣。TP 2009126864披露了一種血管成像劑，其能夠顯現(xiàn)膜中的血管，并目.其是一種與靶物定向基團(tuán)和檢測(cè)基團(tuán)組合的聚合物?？傊?，盡管有可用于監(jiān)測(cè)血管發(fā)生，特別地腫瘤血管發(fā)生的各種成像技術(shù)、各種血管靶物和許多染料的知識(shí)，據(jù)我們所知，仍需要尋找用于顯現(xiàn)腫瘤血管發(fā)生和/對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像，特別地在用治療性抗血管生成藥物治療期間和/或之后的合適手段和方法。更具體地，仍需要提供用于對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像及用于對(duì)受試者中的抗血管生成劑的治療功效成像的非侵入性手段和應(yīng)用這些手段的方法。因此，本發(fā)明的技術(shù)問題遵照上文所描述的需要。本發(fā)明解決此需要，并且如此作為技術(shù)問題的解決辦法提供關(guān)注通過檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體來對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像及在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效的手段，例如工具和試劑盒及應(yīng)用這些手段的方法和用途的實(shí)施方案。這些實(shí)施方案在本文中表征并描述，在實(shí)施例中例示，并在權(quán)利要求書中反映。本申請(qǐng)的發(fā)明人以非侵入性研究腫瘤血管發(fā)生，優(yōu)選地在實(shí)時(shí)條件下，特別地在用治療性抗血管生成劑治療期間和/或之后非侵入性研究腫瘤血管發(fā)生為目的應(yīng)用不同成像技術(shù)、血管標(biāo)志物、用于結(jié)合這些血管標(biāo)志物的手段和便于顯現(xiàn)所述手段結(jié)合這些血管標(biāo)志物的染料。他們還以尋找對(duì)顯現(xiàn)腫瘤血管最合適的成像劑、染料和成像技術(shù)為目的檢查各種成像參數(shù)，由此對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)成像。他們可以實(shí)現(xiàn)其目的及用于非侵入性顯現(xiàn)并量化腫瘤血管發(fā)生的已建立的且評(píng)估的手段和方法。具體地，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在已經(jīng)嘗試的不同成像技術(shù)、血管標(biāo)志物、用于結(jié)合這些血管標(biāo)志物的手段和便于顯現(xiàn)所述手段結(jié)合這些血管標(biāo)志物的染料中，應(yīng)用抗 CD31抗體的基于熒光的監(jiān)測(cè)方法對(duì)于通過檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)非侵入性成像和/或在受試者中監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效是最合適的。本發(fā)明人驚訝的是，CD31是一種特別適合于腫瘤形成期間的血管發(fā)生的標(biāo)志物，因?yàn)橐呀?jīng)可以預(yù)期腫瘤特異性血管發(fā)生標(biāo)志物更合適。此外，通常在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞和庫普弗(Kupffer)細(xì)胞、粒細(xì)胞、T/NK 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、破骨細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞上找到⑶31。⑶31還在某些腫瘤，包括上皮樣血管內(nèi)皮瘤、上皮樣肉瘤樣血管內(nèi)皮瘤、其它血管腫瘤、組織細(xì)胞性惡性腫瘤、和漿細(xì)胞瘤中表達(dá)。還可以在嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、未成熟的淋巴樣細(xì)胞、髓樣造血細(xì)胞和來自白血病和淋巴瘤患者的細(xì)胞的膜中以及在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞膜中找到CD31。如此，已經(jīng)可以預(yù)期抗⑶31抗體會(huì)非特異性結(jié)合許多細(xì)胞/組織，由此產(chǎn)生太多的背景信號(hào)。然而，本發(fā)明人令人驚訝地觀察到相反的事情?？傊_發(fā)的方法對(duì)于以高的信號(hào)-比-背景比率特異性監(jiān)測(cè)腫瘤血管發(fā)生是可行的。它容許比較腫瘤血管系統(tǒng)，并且能夠監(jiān)測(cè)抗血管生成劑抑制腫瘤血管形成和/或?qū)δ[瘤血管施加異化影響的能力和/或功效。因而，在第一方面，本發(fā)明涉及對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像的非侵入性方法，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。本文中所描述的方法和用途容許實(shí)時(shí)成像，即直接顯現(xiàn)血管系統(tǒng)，特別是腫瘤血管系統(tǒng)，使得不需要顯現(xiàn)照片等的延遲。因而，可以直接 (在線)顯現(xiàn)血管系統(tǒng)，特別地腫瘤血管系統(tǒng)的任何變化。實(shí)時(shí)成像的優(yōu)點(diǎn)在于可以在施用例如抗血管生成劑后不久監(jiān)測(cè)此類藥劑的效果。術(shù)語“對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像”還包括對(duì)腫瘤形成期間發(fā)生的血管發(fā)生體內(nèi)成像或體內(nèi)監(jiān)測(cè)。它還包括對(duì)血管，特別地腫瘤血管體內(nèi)成像或體內(nèi)監(jiān)測(cè)。具體地，所應(yīng)用的方法基于經(jīng)熒光標(biāo)記的抗⑶31抗體，其已經(jīng)證明為靶物特異性的，并且適當(dāng)?shù)仫@現(xiàn)血管。如本發(fā)明人已經(jīng)證明的，⑶31是一種用于顯現(xiàn)腫瘤血管系統(tǒng)的特別有用的標(biāo)志物，因?yàn)棰?1是一種在血管發(fā)生期間，特別地腫瘤形成中的血管發(fā)生期間表達(dá)的標(biāo)志物。更具體地，對(duì)不同靶向劑、基于抗體的或非肽的分子檢查對(duì)血管生長(zhǎng)和分布成像。 所有藥劑在血管發(fā)生中具有關(guān)鍵的作用，并且是藥物開發(fā)的重要靶物。它們比體外試劑面臨更嚴(yán)格的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。基本的根本性困難是以高的靶物比背景比率設(shè)計(jì)它們。例如， 應(yīng)當(dāng)存在有最小的非特異性組織外滲、被巨噬細(xì)胞內(nèi)在化、或腎或肝消除，但是應(yīng)當(dāng)在感興趣的區(qū)域產(chǎn)生高的局部濃度。出于這些原因，單抗3-aleXa647、抗CD31-aleXa610和單抗7-aleXa700服從特定標(biāo)記設(shè)計(jì)，盡管對(duì)單一抗體使用多拷貝alexa標(biāo)記物(比率為約 1/3)。第四種成像劑IntegriSense 680是一種靶向性熒光成像劑，其包含一種有力的、選擇性非肽的小分子整聯(lián)蛋白α νβ3拮抗劑和NIR熒光染料。已經(jīng)對(duì)它進(jìn)行開發(fā)以顯現(xiàn)整聯(lián)蛋白α νβ 3表達(dá)，即一種通過在新血管系統(tǒng)中及在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)細(xì)胞_胞外基質(zhì)相互作用來促成內(nèi)皮細(xì)胞遷移的細(xì)胞粘著分子。用單抗3-aleXa647的成像結(jié)果揭示了一種強(qiáng)烈的且腫瘤濃縮的信號(hào)，然而，Nuance成像研究指示抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，但是不可檢出血管 (見圖16A)。已經(jīng)顯示了單抗3生長(zhǎng)因子復(fù)合物被猴視網(wǎng)膜切片中的腫瘤摻入。相反，抗 ⑶31-aleXa610成像在整個(gè)小鼠身體中展現(xiàn)出規(guī)則的抗體分布。這可以通過所使用的單克隆抗體(抗小鼠⑶31)和小鼠⑶31的最小程度表達(dá)解釋。組織學(xué)檢查顯示血管毛細(xì)管的充分限定的輪廓(見圖16B)。第三種成像劑單抗7-aleXa700及其血管生成生長(zhǎng)因子靶物似乎經(jīng)由整個(gè)血液系統(tǒng)循環(huán)，在肺和肝中結(jié)束。Nuance成像僅可以在鼠間質(zhì)中檢出弱的信號(hào)強(qiáng)度和少量的抗體。血管不可見(見圖16C)。IntegriSenSe680(即認(rèn)為能夠顯現(xiàn)新血管系統(tǒng)的非肽小分子)不是適合于監(jiān)測(cè)所使用的異種移植物中的血管發(fā)生的成像劑。在體內(nèi)，它以低的靶物比背景比率給出強(qiáng)烈的信號(hào)。然而，通過靶向腫瘤細(xì)胞，而不是期望的血管來產(chǎn)生此信號(hào)(見圖16D)。為此，本發(fā)明人觀察到，僅抗⑶31抗體以高的信號(hào)-比-背景比率特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。可以在本發(fā)明的試劑盒、方法和用途中應(yīng)用容許檢測(cè)經(jīng)熒光或近紅外熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)，例如器官或腫瘤的任何合適的成像系統(tǒng)。一種優(yōu)選的成像系統(tǒng)是本文中所描述的MAESTRO系統(tǒng)(見圖5)，其容許靶物特異性體內(nèi)活體成像以檢查腫瘤血管系統(tǒng)，包括腫瘤中的血管發(fā)生。除了這點(diǎn)外，有可能同時(shí)在僅一只小鼠中測(cè)定靶物特異性信號(hào)。該程序能夠分開兩個(gè)發(fā)射光譜，并以不同顏色顯現(xiàn)這兩種試劑。此外，可以比較信號(hào)強(qiáng)度，并且容許關(guān)于靶物濃度和分布的結(jié)論。用aleXa700標(biāo)記赫賽汀(Herceptin)(即一種人源化的單克隆抗體，其結(jié)合HER2受體)，并將其以相等濃度與抗⑶31-aleXa610 —起注射以檢查不同表達(dá)樣式和成像系統(tǒng)的靈敏性(見圖17)?？梢苑珠_熒光信號(hào)，并且信號(hào)強(qiáng)度的比較揭示了⑶-31信號(hào)比赫賽汀-aleXa700的信號(hào)弱百倍(見圖17E-F)。通過離體Nuance圖像確認(rèn)這些結(jié)果，如本文中所描述的。腫瘤細(xì)胞表面上濃縮的赫賽汀比代表血管毛細(xì)管的小鼠⑶31+內(nèi)皮細(xì)胞多得多地存在。對(duì)于理想的成像條件，期望高的靶物-比-背景比率。劑量減少的循環(huán)成像試劑和微少的非特異性結(jié)合是最好的成像結(jié)果必需的。相反，腫瘤內(nèi)的靶物特異性濃度應(yīng)當(dāng)為最大值。IntegriSenseeSO的成像結(jié)果表明背景信號(hào)隨時(shí)間逐漸降低。試劑注射后2小時(shí)和5小時(shí)的成像圖揭示由循環(huán)的熒光劑或非特異性結(jié)合引起的高背景信號(hào)(見圖18)。后來的時(shí)間，可以將這些探針代謝，隨后消除。MAESTRO成像系統(tǒng)是一種平面熒光反射成像系統(tǒng)，并且因此近紅外放射的組織滲透是有限的。熒光信號(hào)強(qiáng)度取決于其在小鼠組織中的位置(深度)。因此，成像劑在器官如肝、脾、腎和肺中的信號(hào)相對(duì)于在上部組織切片，如皮下腫瘤中的信號(hào)不能精確量化。腫瘤和排泄器官中自體內(nèi)活體成像獲得的單抗3-aleXa647信號(hào)強(qiáng)度與用Nuance系統(tǒng)的離體研究中的信號(hào)分布不相關(guān)聯(lián)。雖然體內(nèi)研究展現(xiàn)出腫瘤中的最高藥劑濃度，但是對(duì)外植器官的熒光檢查揭示在肝、腎和脾中更高的，或者至少相似的濃度(見圖19)。這些結(jié)果與信號(hào)強(qiáng)度高度依賴于成像劑的組織深度的理論一致?？傊?，已經(jīng)評(píng)估了對(duì)血管生成劑特異性的數(shù)種成像劑以在體內(nèi)監(jiān)測(cè)腫瘤血管發(fā)生并且非侵入性使用體內(nèi)熒光成像，優(yōu)選地近紅外成像?？梢杂肕AESTRO系統(tǒng)在體內(nèi)評(píng)估成像探針，并且任選地，以離體方式在經(jīng)福爾馬林固定的經(jīng)石蠟包埋的腫瘤切片中評(píng)估以測(cè)試這些標(biāo)志物的靈敏性和特異性。內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定和腫瘤的血管分布是隨后研究的先決條件。僅抗⑶31標(biāo)志物以高的信號(hào)-比-背景比率特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞(見圖28)。它還容許單一血管的離體顯現(xiàn)作為量化方法的起始點(diǎn)。本發(fā)明還涵蓋，在如本文中所描述的對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像或者在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效外，可以通過用本文中所描述的任何成像技術(shù)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的抗體來對(duì)受試者中經(jīng)標(biāo)記的抗⑶31抗體的位置監(jiān)測(cè)/成像。此別的方面提供了關(guān)于抗體位置的概述。例如，關(guān)于抗體是否也在血液中，特別地在血清中，在腎、膀胱等中，可以對(duì)其監(jiān)測(cè)。因而，也可以根據(jù)抗體的特異性、半衰期、分布等來判斷。在所要求保護(hù)的方法和用途中，對(duì)受試者胃腸外，優(yōu)選地靜脈內(nèi)施用抗體，優(yōu)選地在治療期間的不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)，并通過熒光成像系統(tǒng)，優(yōu)選地通過近紅外熒光成像系統(tǒng)諸如熒光反射成像(FRI)系統(tǒng)或通過熒光介導(dǎo)的斷層攝影術(shù)(FMT)系統(tǒng)對(duì)其體內(nèi)成像?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的NIR熒光測(cè)量的成像系統(tǒng)通常包含三種基本構(gòu)件(1)近紅外光源，(2)用于分開或區(qū)分熒光發(fā)射與用于熒光染料激發(fā)的光的手段，和(3)檢測(cè)系統(tǒng)。光源提供單色(或基本上單色)近紅外光。光源可以是適當(dāng)過濾的白光， 艮口，來自寬帶來源的帶通光。例如，可以將來自150瓦特鹵素?zé)舻墓馔ㄟ^可購(gòu)自O(shè)mega OpticaKBrattleboro, VT)的合適帶通濾光器。在一些實(shí)施方案中，光源是激光。參見例如 Boas，D. Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994，第 91 卷4887_4891 ；Ntziachristos, V.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000，第 97 卷2767_2772 ；Alexander, W.，J. Clin. Laser Med. Surg. 1991，第 9 卷416_418。
可以使用高通濾光器(700nm)來分開熒光發(fā)射與激發(fā)光。合適的高通濾光器可購(gòu)自 Omega Optical。一般地，可以認(rèn)為光檢測(cè)系統(tǒng)包括光聚集/圖像形成構(gòu)件和光檢測(cè)/圖像記錄構(gòu)件。雖然光檢測(cè)系統(tǒng)可以是并入這兩種構(gòu)件的單一集成裝置，但是光聚集/圖像形成構(gòu)件和光檢測(cè)/圖像記錄構(gòu)件可以是分開的?？梢栽诒景l(fā)明中使用任何合適的光檢測(cè)/圖像記錄構(gòu)件，例如電荷耦合裝置 (CCD)系統(tǒng)或照相膠片。光檢測(cè)/圖像記錄的選擇會(huì)取決于包括所使用的光聚集/圖像形成構(gòu)件的類型的因素。選擇合適的構(gòu)件、將它們裝配成近紅外成像系統(tǒng)、及操作所述系統(tǒng)在本領(lǐng)域的普通技術(shù)內(nèi)。在本發(fā)明中應(yīng)用的體內(nèi)成像技術(shù)還包括FMT技術(shù)(熒光分子斷層攝影術(shù))、基于激光的三維成像系統(tǒng)，其提供小動(dòng)物模型中的非侵入性、全身、深組織成像，而且產(chǎn)生熒光源的3D重建和/或容許測(cè)量由于本發(fā)明中應(yīng)用的經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體結(jié)合所致的經(jīng)熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的熒光濃度。該系統(tǒng)容許測(cè)定成像探針的實(shí)際分布。平面二維成像(見圖 29A)揭示了腫瘤區(qū)內(nèi)的最高抗體濃度，而用FMT系統(tǒng)的3D成像研究容許小鼠身體中的抗體分布的評(píng)估改善(見圖29B-D和圖31)。因此，可以在更實(shí)際的方法中分析熒光信號(hào)強(qiáng)度的量化。在實(shí)施本發(fā)明的方法和用途時(shí)，優(yōu)選的是，要對(duì)受試者施用經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31 抗體，之后檢測(cè)抗體，即來自經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體的信號(hào)。如上文提及的，然后涵蓋的是，要在相同位置處和/或在與第一位置不同的位置處為了控制、排除另一個(gè)腫瘤的復(fù)發(fā)在治療期間及任選地在治療后的不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)施用抗體。還有，為了在治療前顯現(xiàn)腫瘤血管系統(tǒng)和/或?yàn)榱嗽诒O(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效前顯現(xiàn)腫瘤以便然后評(píng)估抗血管生成劑是否治療有效，可以在治療前施用抗體。近紅外熒光成像系統(tǒng)的例子是所附實(shí)施例中所描述的MAESTRO系統(tǒng)。因而， MAESTRO系統(tǒng)是一種優(yōu)選的系統(tǒng)，其可以在本發(fā)明的試劑盒、方法和用途中應(yīng)用。MAESTRO系統(tǒng)是一種平面熒光反射成像系統(tǒng)，其容許非侵入性體內(nèi)熒光測(cè)量。在此多光譜分析中，在特定波長(zhǎng)捕獲一系列圖像。捕獲的波長(zhǎng)范圍應(yīng)當(dāng)覆蓋存在于標(biāo)本中的標(biāo)記物的預(yù)期光譜發(fā)射范圍。結(jié)果會(huì)是一系列稱作“圖像立方體(image cube)”的圖像，并且它是用于限定自身熒光和特定標(biāo)記物兩者的個(gè)別光譜的此一系列圖像內(nèi)的數(shù)據(jù)。生物學(xué)感興趣的許多標(biāo)記物具有相似的發(fā)射光譜，使得使用昂貴的窄帶濾光器分離是困難或不可能的。用單一長(zhǎng)通發(fā)射濾光器替換大量發(fā)射濾光器。在皮膚、毛皮、皮脂腺的天然自身熒光夕卜，還存在著來自共棲生物體(真菌、螨等)和攝取食物(葉綠素)的獨(dú)特自身熒光。多光譜分析經(jīng)由發(fā)射熒光的線性信號(hào)混合物的數(shù)學(xué)解開(分解)能夠分開來自應(yīng)用于標(biāo)本的特定標(biāo)記物的所有這些信號(hào)，只要期望信號(hào)和自身熒光的發(fā)射光譜是已知的。用MAESTRO系統(tǒng)的測(cè)量如下運(yùn)轉(zhuǎn)給照明模塊裝備激發(fā)白光的氙氣燈(Cermax)。 經(jīng)由下游連接的激發(fā)濾光器(由實(shí)驗(yàn)者選擇)，將光限定于(對(duì)于該實(shí)驗(yàn))期望的波長(zhǎng)范圍，并經(jīng)由光纖引導(dǎo)入成像模塊中。在這里，將受限制的光劃分入照亮麻醉的測(cè)試動(dòng)物的四根光纖中。MAESTRO系統(tǒng)自動(dòng)選擇最佳的暴露時(shí)間，從而沒有過度暴露的風(fēng)險(xiǎn)。用發(fā)射濾光器選擇激活的熒光探針的發(fā)射熒光光(見表1)，并經(jīng)由液晶(LC)引導(dǎo)至高靈敏性、冷卻型 CCD照相機(jī)。液晶使照相機(jī)能夠進(jìn)行特定波長(zhǎng)的選擇性照片記錄。波長(zhǎng)測(cè)量范圍取決于選定的濾光器組(藍(lán)色、綠色、黃色、紅色、深紅色、NIR)，并且以IOnm為梯級(jí)記錄照片。在一個(gè)稱作“圖像立方體”的“照片包”中組合每個(gè)單一照片的光譜信息。表1 :Maestro 濾光器組。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像的非侵入性方法，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。
2.一種在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效的非侵入性方法，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗⑶31抗體。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中要在檢測(cè)所述抗體前對(duì)所述受試者施用所述經(jīng)熒光標(biāo)記的抗⑶31抗體。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者患有癌癥。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者具有實(shí)體瘤。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述受試者的實(shí)體瘤是異種移植物，優(yōu)選地人異種移植物。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中要用抗血管生成劑治療所述受試者。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中通過近紅外熒光成像(NIRE)來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中近紅外熒光成像包括熒光反射成像(FRI)或熒光介導(dǎo)的斷層攝影術(shù)(FMT)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗血管生成劑是VEGF-A、VEGF-B,VEGF-C, VEGF-D, VEGFRU VEGFR2或血管生成素的抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制劑是抗體、siRNA或小分子。
12.在前述權(quán)利要求中限定的任何方法中使用的經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。
13.在前述權(quán)利要求中限定的任何方法中使用的試劑盒，其包含經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31 抗體和用于近紅外熒光成像以檢測(cè)受試者中的所述抗體的手段。
14.經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體用于制備用于對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像的診斷組合物的用途。
15.經(jīng)熒光標(biāo)記的抗⑶31抗體用于制備用于在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效的診斷組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)受試者中的腫瘤血管系統(tǒng)體內(nèi)成像的非侵入性方法和用途，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。在又一方面，本發(fā)明涉及在受試者中體內(nèi)監(jiān)測(cè)抗血管生成劑的治療功效的非侵入性方法和用途，包括檢測(cè)經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體。另外，提供了在本發(fā)明的方法中使用的試劑盒，其包含經(jīng)熒光標(biāo)記的抗CD31抗體和用于近紅外熒光成像以檢測(cè)受試者中的該抗體的手段。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102481380SQ201080039490
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者C.克萊恩, J.薩姆, M.多伯茲, W.舒爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司