專利名稱：變異LovD多肽及其用途的制作方法
變異LovD多肽及其用途1.相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2009年9月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/247，253號(hào)和61/247，274 號(hào)的權(quán)益，其所有內(nèi)容通過弓I用以整體并入本文。2.序列表引用將根據(jù)37CFR § 1. 821以計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)經(jīng)由EFS-Web同時(shí)遞交的文件名為CX2-022. txt的序列表通過引用并入本文。序列表的電子拷貝于2010年9月M日生成， 其文件大小為51字節(jié)。3.背景辛伐他汀(simvastatin)是可以從土曲霉(Aspergillus terreus)的發(fā)酵液分離的自然真菌聚酮(polyketide)洛伐他汀(lovastatin)的半合成類似物。辛伐他汀和洛伐他汀作為減少心臟病風(fēng)險(xiǎn)的降膽固醇藥物辛伐他汀作為ZOCOR 而洛伐他汀作為 MEVACOR ,均由Merck公司銷售。洛伐他汀(在

圖1中說(shuō)明)是膽固醇生物合成途徑中的限速酶羥甲基戊二酸輔酶A還原酶的強(qiáng)效抑制劑(Xie等人，2006，Chemistry & Biologyl3 :1161-1169)。其類似物辛伐他汀(也在圖1中說(shuō)明)在高膽固醇血癥治療中更有效(Manzoni和Rollini， 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 58 :555-564 ；Istan 禾口 Diesenhofer,2001, Science 四2 :1160-1164)。用辛伐他汀中發(fā)現(xiàn)的α-二甲基丁酸側(cè)鏈取代洛伐他汀的α-甲基丁酸側(cè)鏈在降低不期望的副作用的同時(shí)顯著地增加其抑制性質(zhì)(Klotz，Ulrich,2003, Arzneimittel-Forschung 53 :605-611)。因?yàn)樾练ニ〉呐R床重要性，從洛伐他汀起始的不同的多步驟合成已經(jīng)被描述 (見，如WO 2005/066150 ；美國(guó)申請(qǐng)2005/0080275號(hào)；美國(guó)申請(qǐng)2004/0068123號(hào)；美國(guó)專利 6，833，461 號(hào)；WO 2005/040107 ；Hoffman 等人，1986，J. Med. Chem. 29 :849-852 ；Schimmel 等人，1997，Appl. Environ. Microbiol. 63 :1307-1311)。用于洛伐他汀生物合成的基因簇之前已經(jīng)被描述(見，如美國(guó)專利6，391，583 號(hào)；Kennedy 等人，1999，Science 284 1368—1372 ；Hutchinson 等人，2000，Antonie Van Leeuwenhoek 78 :287-295)。在該基因簇中編碼46kD酶LovD，其催化洛伐他汀生物合成的
最后一步。簡(jiǎn)言之，模擬洛伐他汀化合物的部分的十氫化萘核部分與HMG-CoA部分通過洛伐他汀九酮合酶(LNKS)和三種輔助酶體內(nèi)合成。洛伐他汀的2-甲基丁酸側(cè)鏈通過洛伐他汀二酮合酶(LDKQ體內(nèi)合成，并經(jīng)由硫酯鍵共價(jià)連接到LovF的酰基載體域。?；D(zhuǎn)移酶LovD 繼而能夠在單個(gè)步驟中使2-甲基丁酸基團(tuán)從LDKS向莫納可林jOiionacolin J)的C8羥基基團(tuán)選擇性地轉(zhuǎn)移以生產(chǎn)洛伐他汀(Xie等人，2006，Chemistry & Biologyl3 :1161-1169)。最近已發(fā)現(xiàn)LovD?；D(zhuǎn)移酶對(duì)?；d體、?；孜锖褪畾浠刘；荏w具有廣泛的底物特異性(Xie等人，2006，Chem. Biol. 13 :1161-1169)。例如，LovD可以有效地催化酰基從CoA硫酯或N-乙酰基半胱胺(“SNAC” )硫酯向莫納可林J轉(zhuǎn)移(同上)。顯著地是，在α - 二甲基丁酰-SNAC被用作酰基供體時(shí)，LovD能夠使莫納可林J和6_羥基_6_去甲基莫納可林J分別轉(zhuǎn)化為辛伐他汀和huvastatin (同上)。使用被工程化以過表達(dá)LovD 的大腸桿菌(E. coli)菌株作為全細(xì)胞生物催化劑，制備量的辛伐他汀在單個(gè)發(fā)酵步驟(同上)中合成。以上研究證明LovD?；D(zhuǎn)移酶是用于諸如辛伐他汀的藥學(xué)上重要的降低膽固醇藥物的生物合成的有吸引力的酶。然而，在使用分離的LovD酶進(jìn)行的隨后的實(shí)驗(yàn)中， 穩(wěn)定性和反應(yīng)速率被證實(shí)是有問題的(Xie和Tang, 2007Appl. Environ. Microbiol. 73 2054-2060)。具體來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)LovD在高蛋白濃度( 100 μ Μ)容易(以小時(shí)計(jì))沉淀，而在較低濃度( 10 μ Μ)緩慢(以天計(jì))沉淀(同上)。此外，發(fā)現(xiàn)非常期待的產(chǎn)物辛伐他汀競(jìng)爭(zhēng)LovD酶，顯著地阻礙酰化的總凈速率(同上)。LovD酶在大腸桿菌中過表達(dá)時(shí)也高度傾向于錯(cuò)誤折疊和聚集，使得對(duì)于商品化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)即使是全細(xì)胞生物催化系統(tǒng)也不太理想(Xie等人，2009，Biotech. Bio Eng. 102 20-28)。在試圖增加LovD的溶解性而不損失催化活性的努力中，野生型土曲霉LovD的突變體已被研究。用丙氨酸殘基替換位置40和60的半胱氨酸殘基(Cys40和Cys60)造成酶的溶解度和全細(xì)胞生物催化活性的改進(jìn)(同上)。使這兩個(gè)殘基向小的或極性的氨基酸轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步的誘變實(shí)驗(yàn)顯示Cys40 — Ala( “C40A”)和Cys60 — Asn( “C60N”)突變最有益，分別造成全細(xì)胞生物催化活性27%和的增加(同上)。在組合時(shí)，這些突變證明是加性的，其中C40A/C60N雙突變體表現(xiàn)出溶解度和全細(xì)胞生物催化活性近50%的增長(zhǎng)。除了其改進(jìn)的性質(zhì)，這些LovD突變體并不適于在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中大規(guī)模生產(chǎn)辛伐他汀。與野生型和/或已知突變體相比，表現(xiàn)出改進(jìn)的性質(zhì)的野生型土曲霉LovD酶的額外變異體或突變體會(huì)是期待的。4.概述如以上討論的，土曲霉的LovD基因編碼?；D(zhuǎn)移酶(在下文中稱為“LovD多肽”、 "LovD酶”、“LOvD酰基轉(zhuǎn)移酶”或“LovD” )，該酰基轉(zhuǎn)移酶能夠使天然產(chǎn)物洛伐他汀的水解產(chǎn)物莫納可林J轉(zhuǎn)化為辛伐他汀。本公開內(nèi)容的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包括在一定位置的突變的 LovD多肽與土曲霉產(chǎn)生的野生型LovD多肽(SEQ ID NO 2)相比表現(xiàn)出改進(jìn)的性質(zhì)。相應(yīng)地，在一方面本公開內(nèi)容提供變異LovD多肽，其與來(lái)自土曲霉的野生型LovD 多肽(SEQ ID NO 2)相比具有一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，LovD變異體包括在選定位置的一個(gè)或多個(gè)突變，其與一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)，諸如增加的催化活性、增加的熱穩(wěn)定性、減少的聚集和/或增加的對(duì)細(xì)胞裂解條件的穩(wěn)定性相關(guān)。變異LovD多肽可以包括一種或多種來(lái)自單一種類的突變(例如，增加催化活性的一種或多種突變)，或者來(lái)自兩種或多種不同種類的突變。通過選定與具體性質(zhì)相關(guān)的突變，適合于在特定條件下使用的變異 LovD多肽可以被容易地獲得。已被發(fā)現(xiàn)與一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)諸如增加的催化活性相關(guān)的突變所在的野生型LovD多肽序列SEQ ID NO 2中的位置包括但不限于A123、M157、S164、S172、L174、A178、 N191、L192、A247、R250、S256、A261、G275、Q297、L361、V370 和 N391。已被發(fā)現(xiàn)與一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)諸如熱穩(wěn)定性相關(guān)的突變所在的額外的位置包括但不限于QM1、A26U Q295 和Q412。已被發(fā)現(xiàn)與一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)諸如減少的聚集相關(guān)的突變所在的又另一些位置包括但不限于N43、D96和H404。已被發(fā)現(xiàn)與一種或多種改進(jìn)的性質(zhì)諸如增加的穩(wěn)定性相關(guān)的突變所在的位置包括但不限于C40、C60和D2M。不具有不利作用的突變所在的(或者改進(jìn)LovD酶性質(zhì)的突變所在的)野生型 LovD多肽序列SEQ ID NO 2中的位置被發(fā)現(xiàn)包括但不限于I4、A9、K26、R28、I35、C40、S41、 N43、C60、S109、S142、A184V、N191S、A261、L292、Q297、L335、A377、A383、N391 和 H404。具有改進(jìn)的性質(zhì)的特別的實(shí)施方案可以包括但不限于具有在位置L174和A178的突變以及任選地零至約30個(gè)額外突變的LovD多肽。在一種具體的實(shí)施方案中，額外突變處在選自以上鑒定的位置的位置。在一些實(shí)施方案中，具有改進(jìn)的性質(zhì)的LovD多肽包括在位置A123、 L174、A178、N19UA247和L361的突變，以及零向上至約沈個(gè)額外突變。在一種具體的實(shí)施方案中，額外突變處在選自以上鑒定的位置的位置。與增加催化活性相關(guān)的SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽的具體示例性的突變包括但不限于 A123P、M157V、S164G、S172N、L174F、A178L、N191G、L192I、A247S、R250K、S256T、 A261H、G275S、Q297G、L361M、V370I 和 N391S。與增加熱穩(wěn)定性相關(guān)的SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽的具體示例性的突變包括但不限于 Q241M、A261H、Q295R 和 Q412R。與減少聚集相關(guān)的SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽的具體示例性的突變包括但不限于 N43R、D96R 和 H404K。與增加穩(wěn)定性相關(guān)的SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽的具體示例性的突變包括但不限于C40R、C60R和D2ME。除了以上公開的具體的、示例性的突變，已發(fā)現(xiàn)LovD多肽能夠耐受沒有不利作用的在其它位置的一定范圍的額外的特定的突變。確實(shí)，在一些實(shí)例中，額外突變也賦予LovD 多肽有益的或改進(jìn)的性質(zhì)。這些額外突變包括但不限于以下特定的和示例性的突變I4N、 A9V、K26E、R28K、R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、C60N、C60H、S109C、 S142N、A184T、A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L335M、A377V、A383V、N391D 和H404R。變異LovD多肽可以包括在這些額外位置的一個(gè)或多個(gè)突變。在一些實(shí)施方案中，本文描述的變異LovD多肽包括以下兩個(gè)突變L174F和 A178L，以及任選地零至約30個(gè)額外突變。在一種具體的實(shí)施方案中，任選的額外突變選自以上鑒定的不同的突變。在一些實(shí)施方案中。本文描述的變異LovD多肽將至少包括以下突變A123P、 1^174 、41781^、附91(5或6)、4對(duì)75和L361M，以及零到約沈個(gè)選自以上鑒定的多種不同突變的額外突變。一般而言，包括更大突變數(shù)的變異LovD多肽表現(xiàn)出更大的催化活性。例如，包括在兩個(gè)殘基位置(L174F和A178L)的突變的特定的變異體比野生型LovD表現(xiàn)出大近兩倍的活性，包括在六個(gè)殘基位置(SEQ IDNO 120)的突變的特定的變異體比野生型LovD表現(xiàn)出大近12倍的催化活性，一種包括28個(gè)突變的特定的變異體(SEQ ID NO :114)，一種包括四個(gè)突變的特定的變異體(SEQ ID NO :116)和一種包括32個(gè)突變的特定的變異體(SEQ ID NO: 118)，各自比野生型Lo vD表現(xiàn)出大近1550倍的催化活性。表1公開了多種比SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽表現(xiàn)出大約10至約1550倍的活性的變異LovD多肽。使用這些示例性的特定的變異LovD多肽，具有比SEQ ID NO 2的野生型LovD多肽大約10、20、 30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700倍或者甚至更大的活性的額外LovD變異多肽可以容易地被獲得。表1的特定的變異LovD多肽也可以被用于容易地獲得具有改進(jìn)性質(zhì)的特定組合的變異LovD多肽。除以上描述的突變之外本文描述的不同的變異LovD多肽還可以任選地包括一種或多種保守突變。通常，這種任選的保守突變將構(gòu)成總序列的不多于約20 %、15 %、10 %、 8%、5^^3^^2%或1%。不打算被任何特殊的操作理論約束，相信在位置76的氨基酸可能涉及催化。在該殘基位置的突變應(yīng)優(yōu)選地被避免。也相信在位置79、148、188和/或363 的氨基酸可能有助于催化。在一些實(shí)施方案中，包括任選的保守突變的變異LovD多肽將包含從1至20個(gè)這種突變。在又一些實(shí)施方案中，變異LovD多肽包括截短的多肽，其中1至 15個(gè)氨基酸可以從N末端刪去且1至6個(gè)氨基酸可以從C末端刪去。在另一方面，本公開內(nèi)容提供編碼本文描述的變異LovD多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該編碼多核苷酸是表達(dá)載體的一部分，該表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)適合于在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)的控制序列。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體適合于在諸如但不限于大腸桿菌的細(xì)菌中表達(dá)變異LovD多肽，并且包括可操作地連接到編碼序列的啟動(dòng)子序列，諸如Iac啟動(dòng)子序列。在這種多核苷酸中，編碼序列的密碼子可以被優(yōu)化以用于在感興趣的特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在又另一方面，本公開內(nèi)容提供包括編碼變異LovD的多核苷酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是細(xì)菌，諸如但不限于大腸桿菌。宿主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)特定的變異LovD多肽的粗制備物或純化制備物，或者可選地，宿主細(xì)胞可以被用作本文描述的方法中的全細(xì)胞制備物來(lái)生產(chǎn)辛伐他汀和huvastatin。本文描述的變異LovD多肽使莫納可林J的C8羥基基團(tuán)在α -二甲基丁酰硫酯輔助底物存在條件下酯化以生產(chǎn)辛伐他汀。相應(yīng)地，在另一方面，本公開內(nèi)容提供了利用本文描述的變異LovD多肽生產(chǎn)辛伐他汀的方法。該方法大體包括在產(chǎn)生辛伐他汀的條件下使莫納可林J與變異LovD多肽在α-二甲基丁酰硫酯輔助底物的存在下接觸。在一些實(shí)施方案中，莫納可林J的類似物可以被用作形成諸如但不限于huvastatin的其它他汀類的前體底物。本文描述的變異LovD多肽識(shí)別多種不同的α - 二甲基丁酰硫酯輔助底物，包括作為實(shí)例且不受限的α-二甲基丁酰-S-N-乙?；腚装?“DMB-S-NAC”)、α-二甲基丁酰-S-甲硫乙酸酯(a-dimethylbutyryl-S-methylthioglycolate) ( “ DMB-S-MTG ”)、 α _二甲基丁酉先_S_疏基丙酸甲酉旨(a -dimethylbutyry 1-S-methyl mercaptopropionate) ("DMB-S-MMP")、α - 二甲基丁酰-S-巰基丙酸乙酯(α -dimethylbutyryl-S-ethyl mercaptoproprionate) ( “DMB-S-EMP“), α - 二甲基丁酰-S-巰基丁酸甲酯 (α -dimethylbutyryl-S-methyl mercaptobutyrate) ( “DMB-S-MMB“)禾口 α - 二甲基丁酰-S-巰基丙酸(“DMB-S-MPA”)。這些硫酯輔助底物中任一種或這樣的硫酯輔助底物的混合物能夠在本文描述的方法中使用。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)用分離的變異LovD多肽在體外進(jìn)行，該分離的變異 LovD多肽在使用前可以被純化或不純化。在一些實(shí)施方案中，酶標(biāo)簽可以被添加到LovD 多肽的任一末端以使其能夠結(jié)合到固體載體。在一些具體的實(shí)施方案中，變異LovD多肽在
7使用前被分離和純化。在其它具體的實(shí)施方案中，變異LovD多肽作為被工程化以表達(dá)變異 LovD多肽的宿主細(xì)胞的粗裂解產(chǎn)物供給，且需要或并不需要從細(xì)胞裂解產(chǎn)物去除細(xì)胞碎片。莫納可林J底物能夠以純化的形式被包括在反應(yīng)混合物中，或者可選地它可以通過洛伐他汀的水解原位產(chǎn)生。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)在作為從洛伐他汀起始的兩步處理在單鍋(pot)中進(jìn)行。該方法可以在多種條件下進(jìn)行，取決于所使用的特定的變異LovD多肽的活性和其它因素。典型的反應(yīng)包括約1至250g/L、也可以是25至200g/L、并且經(jīng)常是1至200g/L 的莫納可林J底物或其類似物，過量的硫酯輔助底物(例如，從約1. O至10. O當(dāng)量、也可以是1. O至5. O當(dāng)量、并且經(jīng)常是1. O至4. O當(dāng)量)以及約0. 1至10g/L的LovD變異多肽。 在一些實(shí)施方案中，典型的反應(yīng)可以包括20至200g/L、50至200g/L、或50至150g/L的莫納可林J底物或其類似物。在一些實(shí)施方案中，典型的反應(yīng)可以包括從1. O至2. O、從1. O 至1. 5、或從1. 1至1. 3當(dāng)量的硫酯輔助底物。在一些實(shí)施方案中，可以使用0. 2至10g/L、 0.5 M 10g/L、0. 5 至 5g/L、0. 75 至 2. 5g/L、或 0. 75 至 1. 5g/L 的 LovD 變異多肽。反應(yīng)混合物的PH、反應(yīng)進(jìn)行的溫度和反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間將取決于所使用的特定的LovD變異多肽和其它因素。大多數(shù)反應(yīng)能夠在PH 7. 5至pH 10. 5、也可以是pH 8. O至ρΗΙΟ. O、并且經(jīng)常是pH 8至pH 9. 5的范圍中的pH，和在約20至50°C、也可以是20至30°C、并且經(jīng)常是20至40°C 的范圍中的溫度，持續(xù)近2至M小時(shí)、5至48小時(shí)或10至48小時(shí)來(lái)進(jìn)行。用包括與熱穩(wěn)定性增加相關(guān)的突變的變異LovD多肽進(jìn)行的反應(yīng)可以在更高溫度進(jìn)行，該溫度通常在約 30至40°C的范圍中，取決于所使用的特定的變異體。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的硫醇副產(chǎn)物可以抑制LovD多肽。相應(yīng)地，在反應(yīng)混合物中包括一種或多種清除劑是可取的，該清除劑可能通過去除或清除這些硫醇副產(chǎn)物來(lái)改進(jìn)反應(yīng)速率和/或產(chǎn)量。清除包括但不限于諸如通過氧化對(duì)硫醇副產(chǎn)物的化學(xué)修飾。適合的清除劑可以包括但不限于與硫醇副產(chǎn)物反應(yīng)的化合物和能夠螯合、吸附、吸收或去除硫醇副產(chǎn)物的試劑。在使用清除劑的一些實(shí)施方案中，清除劑可以是活性炭。在使用時(shí)，活性炭可以按從 1至30g/L、2至20g/L、和5至15g/L范圍的量被包括在反應(yīng)混合物中。莫納可林J底物可以是鹽的形式，諸如銨鹽或鈉鹽。莫納可林J底物諸如莫納可林J的鈉鹽或銨鹽的反應(yīng)，可以任選地在諸如活性炭的清除劑的存在下運(yùn)行。莫納可林J 也可以是銨鹽的形式。在莫納可林J的銨鹽被轉(zhuǎn)化為辛伐他汀的銨鹽時(shí)，辛伐他汀的銨鹽可以從反應(yīng)介質(zhì)例如從水沉淀。根據(jù)以下詳細(xì)的描述本公開內(nèi)容的其它方面和優(yōu)勢(shì)將是明顯的。5.附圖簡(jiǎn)述圖1提供了說(shuō)明從洛伐他汀或莫納可林J合成辛伐他汀的途徑的圖；圖2提供了已被進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于在大腸桿菌中表達(dá)的編碼來(lái)自土曲霉的野生型LovD酶的多核苷酸序列(SEQ ID NO=D ；并且圖3提供了由圖2的序列編碼的多肽序列(SEQ ID NO :2)。6.詳細(xì)描述在某些方面，本公開內(nèi)容提供了如下LovD變異多肽其能夠?qū)?lái)自某些硫酯輔助底物的酰基基團(tuán)向莫納可林J及其類似物或衍生物轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生治療上重要的他汀類化合物(statin compound)，諸如但不限于辛伐他汀和huvastatin。LovD變異體與可從土曲霉獲得的野生型LovD酰基轉(zhuǎn)移酶(SEQ ID NO : 相比具有改進(jìn)的性質(zhì)，并且能夠在基于細(xì)胞或者無(wú)細(xì)胞的系統(tǒng)中使用以高效地并且經(jīng)濟(jì)有效地從容易得到的起始材料諸如洛伐他汀和莫納可林J生產(chǎn)他汀類諸如辛伐他汀。6. 1 縮寫出于本文描述的目的，遺傳編碼的氨基酸所使用的縮寫是常規(guī)的并且如下
權(quán)利要求
1.一種變異LovD多肽，所述變異LovD多肽具有比SEQ ID NO :2的野生型土曲霉 (A. terreus)酰基轉(zhuǎn)移酶大至少兩倍的催化活性。
2.如權(quán)利要求1所述的變異LovD多肽，所述變異LovD多肽包括包含下列的SEQID NO 2的氨基酸序列以下兩種突變L174F和A178L，以及任選地約1至30個(gè)額外的突變和任選地約1至20個(gè)額外的保守突變。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的變異LovD多肽，所述變異LovD多肽具有比SEQ ID NO 2的野生型土曲霉?；D(zhuǎn)移酶大至少10倍的催化活性。
4.如權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的變異LovD多肽，所述變異LovD多肽包括包含一個(gè)或多個(gè)以下特征并且任選地含有約1至20個(gè)額外的保守突變的SEQ ID NO 2的氨基酸序列(i)與催化活性增加相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)突變；( )與增加的熱穩(wěn)定性相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)突變；(iii)與減少的聚集相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)突變；(iv)與增加的酶穩(wěn)定性相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)突變；以及(ν)選自由 I4N、A9V、K26E、R28K、R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、 C60N、C60H、S109C、S142N、A184T、A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L335M、 A377V、A383V、N391D和H404R組成的組的一個(gè)或多個(gè)突變。
5.如權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)所述的變異LovD多肽，所述變異LovD多肽包括包含一個(gè)或多個(gè)以下特點(diǎn)以及任選地約1至20個(gè)額外的保守突變的SEQ ID NO 2的氨基酸序列⑴選自由 A123P、M157V、S164G、S172N、L174F、A178L、N191G、L192I、A247S、R250K、 S256T、A261H、G275S、Q297G、L361M、V370I 和 N391S 組成的組的至少一個(gè)突變；(ii)選自由Q241M、A261H、Q295R和Q412R組成的組的至少一個(gè)突變；(iii)選自由N43R、D96R和H404K組成的組的至少一個(gè)突變；(iv)選自由C40R、C60R和DM5E組成的組的至少一個(gè)突變；以及(ν)選自由 I4N、A9V、K26E、R28K、R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、 C60N、C60H、S109C、S142N、A184T、A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L335M、 A377V、A383V、N391D和H404R組成的組的至少一個(gè)突變。
6.一種變異LovD多肽，所述變異LovD多肽包括對(duì)應(yīng)于包括下列的SEQ ID NO 2的氨基酸序列以下突變A123P、L174F、A178L、N191 (S或G) ,A247S和L361M，零至約洸個(gè)選自由 Q241M、A261H、Q295R、Q412R、N43R、D96R、H404K、C40R、C60R、D254E、I4N、A9V、K26E、R28K、 R28S、I35L、C40A、C40V、C40F、S41R、N43Y、C60F、C60Y、C60N、C60H、S109C、S142N、A184T、 A184V、N191S、A261T、A261E、A261V、L292R、Q297E、L335M、A377V、A383V、N391D 和 H404R 組成的組的額外的突變，以及任選地約1至20個(gè)額外的保守突變。
7.一種變異LovD多肽，所述變異LovD多肽包括選自表1的氨基酸序列。
8.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的變異LovD多肽。
9.如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，所述多核苷酸是適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述變異 LovD多肽的表達(dá)載體。
10.如權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的多核苷酸，在所述多核苷酸中編碼序列利用為在宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。
11.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的變異 LovD多肽的多核苷酸。
12.—種生產(chǎn)變異LovD多肽的方法，包括在所述變異LovD多肽被表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，并且任選地回收所述變異LovD多肽。
13.—種生產(chǎn)辛伐他汀的方法，包括在α-二甲基丁酰硫酯輔助底物的存在下并在使莫納可林J轉(zhuǎn)化為辛伐他汀的條件下使所述莫納可林J底物與根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的變異LovD多肽接觸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述莫納可林J是鈉鹽。
15.如權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的方法，其中所述莫納可林J是鈉鹽并且加入活性炭。
16.如權(quán)利要求13-15的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述莫納可林J是銨鹽。
17.如權(quán)利要求13-16的任一項(xiàng)所述的方法，其中加入用于沉淀辛伐他汀的試劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述試劑是氫氧化銨。
19.一種生產(chǎn)辛伐他汀的方法，包括在α-二甲基丁酰硫酯輔助底物的存在下并在使洛伐他汀底物轉(zhuǎn)化為辛伐他汀的條件下使所述洛伐他汀底物與根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的變異LovD多肽接觸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述洛伐他汀底物、所述變異LovD多肽、和所述硫酯在實(shí)質(zhì)相同的時(shí)間被裝載到容器中。
21.如權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的方法，其中所述洛伐他汀底物和所述變異 LovD多肽首先被裝載到容器中并且繼而所述硫酯被裝載到所述容器中。
22.如權(quán)利要求19-21的任一項(xiàng)所述的方法，其中加入用于沉淀辛伐他汀的試劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑是氫氧化銨。
全文摘要
本公開內(nèi)容提供了用于合成治療上重要的他汀類化合物的?；D(zhuǎn)移酶。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102574896SQ201080043600
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者喬利·蘇庫(kù)瑪蘭, 史蒂文·詹姆斯·科利爾, 奧斯卡·阿爾維索, 張易玲, 徐俊業(yè), 楊萬(wàn)林, 林恩·吉爾森, 羅伯特·約翰·威爾遜 申請(qǐng)人:科德克希思公司