專利名稱：純化gla結構域凝血蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質純化領域，特別涉及純化GLA結構域凝血蛋白的領域。
現有技術一般而言，GLA結構域蛋白形成具有共同結構-GLA結構域-的蛋白質家族，GLA結構域由位于這些蛋白質N末端的區(qū)域組成，并且包含多個谷氨酰胺殘基，它們特別羧化產生羧基谷氨酸或“GLA”殘基。GLA結構域蛋白一般包括被稱為前肽的N端部分，該部分被維生素K依賴性的羧化酶識別。在GLA結構域的谷氨酰胺殘基羧化后，前肽被蛋白水解切割，釋放出成熟和活性的GLA結構域蛋白。根據考慮的蛋白質，GLA結構域由約45個氨基酸組成，其中包括9至12個谷氨酰胺殘基，它們通常被羧化而產生Gla。GLA結構域蛋白由“維生素K依賴性”的蛋白質組成。GLA結構域蛋白涵蓋了凝血因子、骨組織蛋白和芋螺毒素(conopeptides)。GLA結構域凝血因子涵蓋了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、C蛋白和S蛋白。GLA結構域蛋白，包括維生素K依賴性GLA結構域蛋白，在Furie等人(1999，Blood，Vol. 93 :1798-1808)的文章中特別介紹。維生素K依賴性的GLA結構域凝血蛋白由目的治療性蛋白組成。在所述蛋白質中，因子II、因子VII、因子IX和因子X代表具有極大治療性目的的蛋白質，被施用用于預防和治療多種內穩(wěn)態(tài)功能障礙?？梢詮奶烊坏娜梭w液中，一般是從人血漿中純化人GLA結構域凝血蛋白。此外，為了開發(fā)出生產和純化重組人GLA結構域凝血蛋白的方法，已進行了大量研究。例如可提及已作為藥物銷售的重組人因子VII。關于獲得從生物液體中純化的GLA結構域蛋白(其中這些蛋白質是天然生產的或以重組蛋白的形式生產的)，合適的純化方法是現有技術中已知的。這些方法一般包括一系列的選擇性分離步驟，所述選擇性分離是基于蛋白質沉淀和通過層析支持體的步驟，再通過順序洗脫步驟、深層過濾步驟、超濾或者濃縮步驟。用于純化目前用于生產藥物的GLA結構域凝血蛋白的方法不包括親和層析步驟。此類技術選擇的一個原因是存在這樣的缺陷，所述缺陷是由于一部分移植到親和支持體上的配體分子脫落造成的，脫落的配體分子發(fā)現在層析洗脫液體積中與純化的治療性蛋白質相結合。作為示例，可提及產品Mononine ,這是基于純化的人因子IX的藥物組合物，所述人因子IX是通過使用固定了小鼠抗fix單克隆抗體的免疫親和支持體的方法獲得的。然而，Mononine 產品的專題文章明確說明在最終產品中存在微量的小鼠抗人Fix單克隆抗體，所述抗體能夠在治療患者體內導致免疫原性問題，因為患者變得對“可濾去物”(小鼠抗體和抗體片段)免疫。Mononiiie 產品的專題文章明確說明對小鼠蛋白質過敏的患者的禁忌癥。一般現有技術需要改善的或替代的方法，用于純化維生素K依賴性GLA結構域凝血蛋白。這涵蓋了對替代或改善的方法的需求，所述方法用于獲得包括單一的純化蛋白質例如因子VII或因子IX的組合物，以及用于獲得包含GLA結構域蛋白的組合的組合物，例如包括因子II、因子VII、因子IX和因子X的組合的組合物的備選或改進方法。這涵蓋了對備選或改進的方法的需求，所述方法用于純化非重組的GLA結構域蛋白或重組的GLA結構域蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于純化GLA結構域凝血蛋白的方法，包括下列步驟a)使含有一種或多種GLA結構域凝血蛋白的樣品與親和支持體接觸,所述親和支持體上固定了特異性結合GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，以便在(i)所述核酸適配體和Qi)所述GLA結構域凝血蛋白之間形成復合體，b)從步驟a)形成的復合體中釋放GLA結構域凝血蛋白，和c)以純化的形式回收所述生物學GLA結構域凝血蛋白。在上述方法中，所述適配體優(yōu)選是脫氧核糖核酸適配體。在上述方法中，所述GLA結構域蛋白可以是維生素K依賴性的凝血因子，例如選自因子II、因子VII、因子IX、和因子X。在這些方法的某些實施方案中，所述核酸適配體由SEQ ID NO. 4的序列的適配體組成。
附圖簡介圖I是包含通過使用親和支持體層析純化血漿因子IX期間獲得的連續(xù)級分中所含的蛋白質的SDS-PAGE電泳凝膠的圖像。泳道I :起始材料；泳道2 :沒有保留的級分(NR)；泳道3 :洗脫級分(El);泳道4 :再生級分(E2);泳道5 :純化的因子IX參考對照；泳道6 已知分子量的參考蛋白質。圖2顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，(i)在各種組合物中存在的因子VII、因子IX或因子X，分別與(ii)特異性針對固定在支持體上的GLA結構域蛋白的適配體之間的結合曲線。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。I號曲線人重組因子IX的制品(BeneFIX ) ;2號曲線人血漿因子Vll的制品；3號曲線人血漿因子X的制品；4號曲線陰性對照制品。圖3顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，本發(fā)明的多種核酸與固定在支持體上的重組人因子IX的結合曲線。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。曲線“I”:低親和力核酸；曲線“2”中等親和力核酸；曲線“3”高親和力核酸；曲線“4” 非常高親和力核酸。圖4顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，核酸適配體“Mapt-1. 2. -CS”和“Mapt-1. 2. -CS0”與固定在支持體上的重組人因子IX的結合曲線。沿X軸時間，按秒表示；沿y軸共振信號，按任意共振單位表示。I號曲線是用Mapt-L 2. -CS適配體獲得的結合曲線；2號曲線是用Mapt-1. 2. -CSO適配體獲得的結合曲線。圖5顯示了當進行純化人血漿因子IX的方法時獲得的層析圖，所述人血漿因子IX是用固定了抗GLA核酸適配體的親和支持體生產的。沿X軸時間；沿y軸254納米的吸光值(0. D.)。(I):注射人血漿FIX濃縮液的時刻；⑵非滯留級分的消除峰；(3):純化的FIX的洗脫峰；(4):在層析支持體再生步驟的過程中產生的峰。 圖6是包含在人血漿因子IX的純化級分中的蛋白質，在不含還原劑的、具有4%至12%雙丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE電泳凝膠的圖像，所述人血漿因子IX經過在移植了特異性針對GLA結構域蛋白的核酸適配體的親和支持體上層析。用考馬斯藍處理SDS-PAGE凝膠。從左至右泳道1( “SM”)起始組合物，人血漿因子IX濃縮液；泳道2 ( “NR”)包含在不滯留在親和支持體上的級分中的蛋白質；泳道3(“E1”)包含在洗脫級分El中的蛋白質；泳道4( “E2”)包含在親和支持體輸出的、再生緩沖液中的蛋白質；泳道5( “E3”)包含在親和支持體輸出的、再生緩沖液中的蛋白質；泳道6(“T FIX”)人血漿因子IX的純化級分。圖7顯示了當進行純化人血漿因子IX的方法時獲得的層析圖，所述人血漿因子IX是用固定了抗GLA核酸適配體的親和支持體生產的。沿X軸時間；沿y軸254納米的吸光值(O.D.)。(I):非滯留級分；(2):純化的人FIX洗脫峰；(3):層析支持體的再生峰。圖8是包含在人血漿因子IX的純化級分中的蛋白質，在不含還原劑的、具有4% 至12%雙丙烯酰胺梯度的SDS-PAGE電泳凝膠的圖像，所述人血漿因子IX經過在移植了特異性針對GLA結構域蛋白的核酸適配體的親和支持體上的層析。用考馬斯藍處理SDS-PAGE凝膠。從左至右泳道I ( “Start”)起始組合物，人血漿因子IX濃縮液；泳道2 ( “Notretained”)包含在不滯留在親和支持體上的級分中的蛋白質；泳道3( “Eluate”)包含在洗脫級分中的蛋白質。圖9顯示了當進行純化轉基因人血漿因子IX的方法時獲得的層析圖，所述人血漿因子IX是在轉基因母豬的乳汁中生產的，其中純化使用固定了抗GLA核酸適配體的親和支持體。沿X軸:時間；沿7軸254納米的吸光值(O.D.)。(I):注射轉基因FIX的時刻；(2)非滯留級分；(3):洗脫級分。

圖10是包含在重組人因子IX的預純化級分中的蛋白質的SDS-PAGE電泳凝膠圖像，所述重組人因子IX是在轉基因母豬的乳汁中生產的，經過在移植了特異性針對GLA結構域蛋白的核酸適配體的親和支持體上的層析。用考馬斯藍處理SDS-PAGE凝膠。從左至右泳道1( “E5”、“start”)起始組合物，在MEP HyperCel 上預純化的轉基因人因子IX;泳道2( “E6”、“Not retained”)包含在不滯留在親和支持體上的級分中的蛋白質；泳道3( “E7”、“Eluate”):包含在洗脫級分中的蛋白質；泳道4( “E8”、“Regeneration”)包含在再生級分中的蛋白質；泳道5( “T FIX”、“Pure FIX control”)純化的FIX對照。箭頭FIX遷移的位置。圖11顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，本發(fā)明的多種核酸與固定在支持體上的重組人因子IX的結合曲線。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。曲線“I”:低親和力核酸；曲線“2”中等親和力核酸；曲線“3”高親和力核酸；曲線“4” 非常高親和力核酸。圖12顯示了當進行純化轉基因人因子VII的方法時獲得的層析圖，所述人血漿因子IX是用固定了抗GLA核酸適配體的親和支持體生產的。沿X軸時間；沿丫軸254納米的吸光值(0. D.)。(I):注射的時刻；⑵非滯留級分；(3):注射洗脫緩沖液的時刻；⑷洗脫級分。圖13是包含在人血漿因子VII的預純化級分中的蛋白質的SDS-PAGE電泳凝膠圖像，所述人血漿因子VII經過在移植了特異性針對GLA結構域蛋白的核酸適配體的親和支持體上的層析。用考馬斯藍處理SDS-PAGE凝膠。從左至右(I):泳道I (“Start”)起始組合物，人血漿因子VII ; (2):泳道2 (“Eluate”):包含在洗脫級分中的蛋白質；(3) =Des-GlaFVII =FVII的低糖基化形式；(4) =FVII的其他難鑒別的形式。
圖14顯示了當進行純化轉基因人因子VII的方法時獲得的層析圖，所述人血漿因子VII是用固定了抗GLA核酸適配體的親和支持體生產的。沿X軸時間；沿y軸254納米的吸光值(0. D.)。(I):非滯留級分；⑵洗脫級分；(3):再生級分。圖15是包含在人血漿因子VII的預純化級分中的蛋白質的SDS-PAGE電泳凝膠圖像，所述人血漿因子VII經過在移植了特異性針對GLA結構域蛋白的核酸適配體的親和支持體上的層析。用考馬斯藍處理SDS-PAGE凝膠。從左至右(I):泳道I (“Start”)起始組合物，人血漿因子VII ; (2):泳道2(“NR”)非滯留蛋白質的級分；(3):泳道3 (“Eluate”)包含在洗脫級分中的蛋白質；(4) =Des-Gla FVII =FVII的低糖基化形式。圖16顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線分別對應于血漿FVII在使用各種運行緩沖液的過程中的結合動力學，圖16從下至上T3 :緩沖液3 ；T2 :緩沖液2 ；T1 :緩沖液I ;T4 :緩沖液4和T5 :緩沖液5。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。圖從下至上曲線示例了增加親和力的相互作用。圖17顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線使得能夠確定在使用緩沖液I (50mM Tris, 50mMNaCiaOmM CaCl2,4mM MgCl2, pH 7. 5)的過程中血漿FVII的結合動力學參數。沿x軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。圖18顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線對應于在使用緩沖液5 (50mM Tris, IOmM CaCl2,pH 7. 5)的過程中血漿FVII的結合動力學。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。圖19顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線對應于在使用多種洗滌緩沖液的過程中血漿FVII與Mapt-2的結合抗性，所述洗滌緩沖液是(I) =FVI注射液I ; (2):含IM NaClUOmMCaCl2、4mM MgCl2 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ； (3):含 2M NaCl、IOmM CaCl2、4mMMgCl2 的50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5，(4):含 3M NaCl、IOmM CaCl2、4mM MgCl2 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ;和(5):含IOmM EDTA的50mM Tris緩沖液。沿x軸時間，按秒表示；沿y軸共振信號，按任意共振單位表示。圖20顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線對應于在使用多種洗滌緩沖液的過程中血漿FVII與Mapt-2的結合抗性，所述洗滌緩沖液是(I) =FVII注射液；(2):含IOmM CaCl2、4mMMgCl2 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ； (3):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mM Tris緩沖液，pH 7. 5，(4):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,2M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ;和(5):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ;和(6):含 IOmM EDTA的50mM Tris緩沖液。沿x軸時間,按秒表示；沿y軸共振信號，按任意共振單位表示。圖21顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與人血漿因子VII的結合曲線。曲線對應于使用各種洗滌緩沖液時血漿FVII與Mapt-2的結合抗性，所述洗滌緩沖液是(I) :FVII注射液；(2) : 10 %乙醇緩沖液；(3):含IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ； (4):含 IOmM CaCl2、4mM、MgCl2,2M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ； (5):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的50mM Tris緩沖液，pH 7. 5 ;和(6):含IOmM EDTA的50mM Tris緩沖液。沿x軸時間，按
秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。圖22顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-I適配體與重組人因子VII的結合曲線。曲線對應于當使用多種洗滌緩沖液時重組FIX與Mapt-I的結合抗性，所述洗滌緩沖液是(I):重組FVII注射液；(2):含IOmM CaCl2、4mMMgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7.5，； (3):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2、2MNaCl 的50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ； (4):含 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH 7. 5 ;和(5):含IOmM EDTA的50mM Tris緩沖液。沿x軸時間，按秒表示；沿y軸共振信號，按任意共振單位表示。圖23顯示了在根據表面等離振子共振技術的測定中，固定在支持體上的Mapt-2適配體與重組人因子IX的結合曲線。曲線對應于當使用下列洗滌緩沖液時重組FIX與 Mapt-I的結合抗性，所述洗滌緩沖液是50mM TrisUOmM CaCl2、50%丙二醇，pH 7.5。沿X軸時間，按秒表示；沿7軸共振信號，按任意共振單位表示。(I)注射在緩沖液5中的50%丙二醇。發(fā)明詳述申請人:嘗試設計用于純化GLA結構域凝血蛋白的新方法，即，適用于從包括GLA結構域凝血蛋白或多種GLA結構域凝血蛋白的起始樣品中獲得純化的GLA結構域凝血蛋白的新方法。換言之，申請人尋求開發(fā)出(i)對GLA結構域凝血蛋白具有選擇性，和(ii)對特定GLA結構域凝血蛋白非選擇性的富集或純化的方法。為了開發(fā)出這些純化方法，申請人分離并表征了新的配體，所述配體(i)具有特異性結合GLA結構域凝血蛋白的能力和(ii)對具體的一種GLA結構域凝血蛋白不特異。本說明書下文中將詳述這類新配體的特征，所述新配體由核酸組成，也稱為“核酸適配體”，其結合GLA結構域凝血蛋白并且對特定的GLA結構域凝血蛋白不是特異性的。本發(fā)明提供了純化GLA結構域凝血蛋白的方法，其中利用了這些核酸類型的新配體的結合特性。申請人:還嘗試開發(fā)獲得特異性結合GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體的方法，目標是在純化方法中使用所述核酸適配體。根據本發(fā)明，已獲得特異性結合GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體。更具體而言，申請人已獲得并表征了專門結合多種GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，S卩，所述蛋白是具有GLA結構域的多種凝血蛋白，其中GLA結構域的特征性谷氨酰胺殘基可以被Y羧基化。如實施例中所示，本發(fā)明的對GLA結構域凝血蛋白特異性的核酸適配體能夠無差別的結合多種具有保守的共同特征的維生素K依賴性凝血蛋白，所述共同特征是GLA結構域。實施例中特別顯示，對GLA結構域凝血蛋白特異性的適配體能夠結合多種蛋白，例如因子IX、因子VII和因子X。特異且單獨識別GLA結構域凝血蛋白(如因子II、因子VII、因子IX或因子X)的核酸適配體是現有技術已知的，包括結合凝血酶的適配體(Zhao等人,2008, Anal Chem, 80卷(19) :7586-7593)、結合因子 IX/IXa 的適配體(Subash 等人，2006, Thromb Haemost,第95卷:767-771 ；Howard 等人，2007，Atherioscl Thromb Vasc Biol，第 27 卷:722-727 ；PCT申請?zhí)朩O 2002/096926 ;美國專利號US 7312325)、結合因子X/Xa的適配體(PCT申請?zhí)朩O2002/096926 ;美國專利號US 7312325)或者結合人因子VII/VIIa的適配體(Rusconi等人，2000, Thromb Haemost, 84 卷(5) :841-848 ;Layzer 等人，2007, Spring,第 17 卷:1_11)。應說明的是上述適配體無一描述了用于純化其結合的靶蛋白的用途。此外，上述適配體專門結合一種GLA結構域凝血蛋白，不與另一種GLA結構域凝血蛋白交叉結合。此類型適配體對給定的GLA結構域凝血蛋白是特異性的，不具有結合另一種蛋白質的能力，包括另一種GLA結構域凝血蛋白，由例如Layzer等人(2007,Oligonucleotides,第17卷1-11)所述。然而，就申請人所知，現有技術中尚未描述過這樣的核酸適配體，所述核酸適配體的結合特異性是蛋白質的GLA結構域，且具有結合多種不同的GLA結構域凝血蛋白的能力。獲得特異性結合GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體使得能夠開發(fā)出純化這些蛋白質的方法，特別是以獲得可用作藥物活性成分的純化終產物為目標。本發(fā)明涉及純化GLA結構域凝血蛋白的方法，包括下列步驟a)使含有一種或多種GLA結構域凝血蛋白的樣品與親和支持體接觸,所述親和支持體上固定了特異性結合GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，從而在(i)所述核酸適配體和Qi)所述GLA結構域凝血蛋白之間形成復合體，b)從步驟a)形成的復合體中釋放GLA結構域凝血蛋白，和c)以純化的形式回收所述GLA結構域凝血蛋白。本發(fā)明還涉及純化GLA結構域凝血蛋白的方法，包括下列步驟a)使含有一種或多種GLA結構域凝血蛋白的樣品與親和支持體接觸,所述親和支持體上固定了特異性結合多種GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，從而在(i)所述核酸適配體和Qi)所述GLA結構域凝血蛋白之間形成復合體，b)從步驟a)形成的復合體中釋放GLA結構域凝血蛋白，和c)以純化的形式回收所述GLA結構域凝血蛋白。術語“GLA結構域凝血蛋白”涵蓋了任何包含表示為GLA結構域的區(qū)域的凝血蛋白，所述區(qū)域包含多個在蛋白質合成期間被Y羧基化的谷氨酰胺殘基。GLA結構域凝血蛋白涵蓋了具有朝向N末端的GLA結構域的凝血蛋白，所述GLA結構域一般位于前肽的下游，即C端一側，所述前肽在合成過程中被天然的水解。GLA結構域凝血蛋白涵蓋了這樣的凝血蛋白，所述凝血蛋白中的GLA結構域由約45個氨基酸的區(qū)域組成，包括9至12個谷氨酰胺殘基，其中至少一部分在細胞中蛋白質合成過程中被正常的羧基化為給定的GLA殘基。GLA結構域凝血因子由維生素K依賴性的蛋白質組成，涵蓋了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA結構域凝血蛋白涵蓋了從天然來源例如血漿獲得的非重組蛋白，以及可以在體外通過用編碼所述凝血蛋白的DNA轉染或轉化細胞來生產的重組蛋白，或者可以在體內通過已導入編碼所述凝血蛋白的轉基因的動物來生產的重組蛋白。由轉基因動物生產的GLA結構域凝血蛋白在本說明書中也被稱為“轉基因蛋白”。 根據本發(fā)明，術語“核酸適配體”意在表示特異性結合GLA結構域凝血蛋白的單鏈核酸，包括特異性結合多種GLA結構域蛋白的核酸，在本說明書中也可被稱為“抗GLA適配體”。因而本發(fā)明的適配體涵蓋了在使各個核酸和蛋白質配偶體接觸的在先步驟之后，能夠檢測多種給定的GLA結構域凝血蛋白的復合體的適配體。本領域技術人員可以容易的檢測在根據本發(fā)明的抗GLA適配體和GLA結構域凝血蛋白之間形成的復合體，例如，通過執(zhí)行表面等離振子共振檢測技術，包括Biaco re 技術，如實施例中示例的。本領域的技術人員還可以通過ELISA類型的常規(guī)技術，容易的檢測在根據本發(fā)明的抗GLA適配體和GLA結構域凝血蛋白之間復合體的形成，如本領域技術人員已知的。實施例中已顯示，根據本發(fā)明的抗GLA適配體能夠分別結合多種不同的GLA結構域凝血蛋白，特別是結合多種人GLA結構域凝血蛋白。已特別顯示，根據本發(fā)明的給定的抗GLA適配體能夠分別與人因子VII、人因子IX和人因子X結合。在某些實施方案中，上述純化方法的特征是所述GLA結構域凝血蛋白選自維生素K依賴性的凝血因子。在某些實施方案中，上述純化方法的特征是所述GLA結構域凝血蛋白選自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些實施方案中，上述純化方法適合同時純化至少兩種選自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的GLA結構域凝血蛋白。在某些實施方案中，上述純化方法適合同時純化至少三種選自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的GLA結構域凝血蛋白。在某些實施方案中，上述純化方法適合同時純化因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些實施方案中，上述純化方法適合同時純化因子II、因子VII、因子IX、和因
子Xo在某些實施方案中，上述純化方法適合同時純化因子VII、因子IX和因子X。同時純化一種以上的GLA結構域凝血蛋白特別取決于用于執(zhí)行純化方法的起始樣品的類型。特別的，在方法結束時，以純化形式獲得的GLA結構域凝血蛋白的數量和身份，邏輯上受初始存在于起始樣品中的GLA結構域凝血蛋白的數量和身份的限制。一般而言，抗GLA適配體可以由DNA (脫氧核糖核酸)或RNA (核糖核酸)分子組成，并具有結合GLA結構域蛋白的能力，該能力大于結合不包含任何GLA結構域的蛋白的能力。可以通過出于本發(fā)明的需要而特別開發(fā)的方法來獲得抗GLA適配體，所述方法詳細描述在本說明書的下文中。在某些實施方案中，根據本發(fā)明的抗GLA適配體具有多個共同的結構特征，包括這樣的序列，所述序列從5’端至3’端順序包括(i)長度約20個核苷酸的不變的特定核苷酸序列，后續(xù)為(ii)長度約40至50個核苷酸的可變核苷酸序列，后續(xù)為(iii)長度約20個核苷酸的不變的特定核苷酸序列。應說明，可變核苷酸序列(ii)可彼此具有非常強的核苷酸序列同一丨I"生。在本說明書中說明的選擇抗GLA適配體的方法是這樣的類型，其使得能夠獲得抗GLA適配體的家族,所述抗GLA適配體能夠識別多種GLA結構域凝血蛋白，特別是人GLA結構域凝血蛋白。、
從結構的觀點出發(fā)，特異性結合GLA結構域凝血蛋白的能夠根據本發(fā)明獲得的核酸或核酸適配體的家族的每個成員包含至少15個連續(xù)核苷酸的多核苷酸，與下列通式(I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性5，-[SEQ ID NO. I] X-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]y_3’ (I)，其中- “SEQ ID NO. X” 由序列 SEQ ID NO 3 的核酸組成，- “X”是等于0或I的整數，和- “Y”是等于0或I的整數。在某些實施方案中，序列SEQ ID勵.父的核酸具有長度15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在其他實施方案中，序列SEQ ID N0.X的核酸具有長度43、44、45、46、47、48或49個核苷酸。在某些其他優(yōu)選的實施方案中，序列SEQ ID勵]的核酸具有長度43、44或45個核苷酸。如前已述，通式⑴的核酸長度至少是15個核苷酸。在某些實施方案中，通式(I)的核酸長度至少是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81個核苷酸，從而涵蓋了具有所述每個確切長度的核酸。當整數“X”等于0，并且整數“y”等于I時，本發(fā)明的核酸適配體涵蓋了這樣的核酸，所述核酸包含與下列通式(I-I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15個連續(xù)的核苷酸5，-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]_3， (I-I)當整數“x”等于1，并且整數“y”等于0時，本發(fā)明的核酸適配體涵蓋了這樣的核酸，所述核酸包括與下列通式(1-2)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15個連續(xù)的核苷酸5，-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID N0.X]_3， (1-2)當整數“x”等于0，并且整數“y”等于0時，本發(fā)明的核酸適配體涵蓋了這樣的核酸，所述核酸包括與下列通式(1-3)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15個連續(xù)的核苷酸5，-[SEQ ID NO. X]-3， (1-3)因而，上述核酸適配體涵蓋了包括與序列SEQ ID NO. 3的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15個連續(xù)的核苷酸?！愣裕c第二多核苷酸或核酸具有至少40%核苷酸同一丨丨生的第一多核苷酸與所述第二多核苷酸或核酸具有至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、 50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%或100%的核苷酸同一性。在包含序列SEQ ID NO. X的本發(fā)明核酸的某些實施方案中，所述序列SEQ ID NO. X選自這樣的核酸，所述核酸具有與選自序列SEQ IDN0S. 3、6至35、37和38的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15個連續(xù)的核苷酸。在包含序列SEQ ID NO. X的本發(fā)明核酸的某些實施方案中，所述序列SEQ ID NO. X選自這樣的核酸，所述核酸與選自序列SEQ ID N0S. 3、6至35、37和38的序列具有至少41 42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 100% 的核苷酸同一性。在本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案中，所述適配體選自這樣的核酸，所述核酸包含與選自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15個連續(xù)核苷酸的序列。在本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案中，所述適配體選自這樣的核酸，所述核酸包含選自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列的至少15個連續(xù)核苷酸的序列。在本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案中，所述適配體選自這樣的核酸，所述核酸包含與選自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列。在本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案中，所述適配體選自這樣的核酸，所述核酸包含選自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列。在本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案中，所述適配體選自這樣的核酸，所述核酸由選自序列SEQ ID N0S. 3、4和6至39的序列組成。由上述可得出，本發(fā)明涵蓋了單鏈核酸家族，所述單鏈核酸家族具有上文定義的通式(I)系列的至少15個連續(xù)核苷酸。出于本發(fā)明的目的，兩條核酸序列之間的“百分比同一性”是通過比較窗ロ，比較兩條最佳比對的序列來確定的。因而，相比參照序列(不包含這些添加或這些缺失)，比較窗口中的核苷酸序列部分可以包括添加或缺失(例如空位)，從而獲得兩條序列間的最佳比對。百分比同一性如下計算通過確定在兩條比較序列中都觀察到的相同核酸堿基的位置數，之后用兩條核酸堿基之間相同的位置數除以比較窗ロ中的位置總數，再將結果乘以ー百，從而獲得兩條序列相對于彼此的百分比核苷酸同一性?？梢酝ㄟ^使用已知算法的計算機執(zhí)行用于比較的序列的最佳比對。完全優(yōu)選的，使用CLUSTAL W軟件(I. 82版)確定百分比序列同一性，參數固定如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2) ALIGNMENT = “完全，，；(3) OUTPUT FORMAT = “aln w/ numbers” ； (4) OUTPUT ORDER = “ 比對的” ；(5) COLOR ALIGNMENT = “否”;(6)KTUP (字長)=“默認 ” ；(7) WINDOW LENGTH = “ 默認 ” ；(8) SCORE TYPE = “ 百分比 ” ；(9) TOPDIAG = “ 默認” ；(10)PAIRGAP = “默認” ；(II)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “無” ；(12)MATRIX =“默認” ；(13) GAP OPEN = “默認” ；(14) END GAPS = “默認” ；(15) GAP EXTENSION = “默認”；(16) GAP DISTANCES = “默認”；(17) TREE TYPE =“進化樹”和(18) TREE GRAPH DISTANCES=“隱藏”。通過闡明并且對于本發(fā)明的核酸適配體的某些實施方案，本領域技術人員基于上面式(I)的核酸適配體的結構定義，可以容易地自動產生所有可能序列SEQ ID N0.X，例如通過數字計算機，其內存加載一組合適的指令。適當時，本領域技術人員通過所述數字計算機可以自動分別確定(i)空間結構模型與具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA核酸適配體相似或相同的那些序列，和(ii)核酸適配體結構與具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA核酸適配體的不同的那些序列?？臻g結構與具有序列SEQ ID NO. 4 的抗-GLA核酸適配體相似或相同的核酸適配體包括包含與其相似或相同的一系列環(huán)和莖的那些核酸適配體。為了確定式(I)的核酸的二級空間結構，本領域技術人員可以尤其基于其核苷酸序列的描述使用 Zuker(2003, Nucleic Acids Research, Vol231 (13) :3406-3413)所述的mFold 計算機程序產生模型，所述程序也可以在以下網址使用http://mfold. bioinfo,rpi. edu/0優(yōu)選地，根據下面的參數使用mFold計算機程序(i)具有線性序列的DNA，(ii)折疊溫度25°C，(iii)離子條件[Na+] 150mM；[Mg++] 4mM, (iv)校正類型寡聚體，(v) “次優(yōu)”數目百分比2，(vi)所計算的折疊數目的上限50，(vii)兩個堿基對之間的最大距離無限制，和(viii)對其他參數使用默認值。本領域技術人員可以實施(i)適配體的結構模型和(ii)剛產生的式(I)的適配體的結構模型之間的比較步驟，并且如果剛產生的式(I)的適配體的結構模型與具有序列SEQ ID NO. 4的抗-GLA適配體的相同或相似，那么他們肯定選擇剛產生的式(I)的適配體。在任何情況下，為了證實剛產生的式(I)的適配體的肯定選擇，本領域技術人員可以例如根據本說明書、尤其實施例中描述的方法之一驗證結合選自人因子VII/VIIa、人因子IX/IXa和人因子X/Xa的GLA-結構域凝血蛋白的性質。在本發(fā)明的抗GLA核酸適配體的某些優(yōu)選的實施方案中，所述核酸適配體包括這樣的多核苷酸的至少15個連續(xù)的核苷酸，所述多核苷酸與通式(I)的核酸具有至少80%核苷酸同一性，從而涵蓋了包括這樣的多核苷酸的至少15個連續(xù)的適配體，所述多核苷酸與通式(I)的所述核酸具有至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 100%核苷酸同一性。根據本發(fā)明的核酸適配體涵蓋了序列SEQ ID NO. 4的核酸適配體。記得序列SEQID NO. 4的適配體由通式(I)的適配體組成,其中序列SEQID NO. X由序列SEQ ID NO. 3組成。還記得序列SEQ ID NO. 3的適配體由通式(1-3)的適配體組成，其中缺少序列SEQ IDNO. I 和序列 SEQ IDN0. 2。申請人:顯示序列SEQ ID NO. 3的適配體具有選擇性結合活性GLA結構域凝血蛋白的能力，所述能力與序列SEQ ID NO. 4的適配體的能力相似。這些結果顯示在序列SEQ IDNO. 4的適配體的特定結合特性中存在序列SEQ ID NO. 3的核酸的基本性質。一般而言，這些結果顯示序列SEQ IDN0.X的核酸在通式(I)的適配體中的關鍵性質，序列SEQ ID NO. X的核酸賦予通式(I)的適配體選擇性結合活性GLA結構域凝血蛋白的能力。本發(fā)明的核酸適配體因而也涵蓋了序列SEQ ID NO. 3的適配體。實施例中還顯示多種適配體,包括序列SEQ ID N0S. 6至35的適配體，具有選擇性結合GLA結構域凝血蛋白的能力，適當時具有不同親和力水平。作為示例，在序列SEQ IDNOS. 6至35的適配體中，具有與人因子IX最大結合能力的適配體是序列SEQ ID NO. 35的適配體，也可被表不為“Mapt-1. 2. -CS”。實施例中也鑒別了具有大于上述Mapt-1. 2. -CS適配體的結合GLA結構域凝血蛋白的能力的適配體。此類適配體的實例是序列SEQ ID NO. 36的適配體，也可被表示為“Mapt-1. 2. -CS0”。序列SEQ ID NO. 36的Mapt_l. 2. -CSO適配體是包括這樣的多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的適配體，所述多核苷酸與下列通式(I)的長度為62個核苷酸的核酸具有至少40%的核苷酸同一性5’-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID NO. 35]-3’，并且由這樣的核酸組成，所述核酸是所述通式(I)的核酸中從位置10的核苷酸至位置 49的核苷酸。實施例中還顯示，序列SEQ ID N0S. 37至39的每種核酸都具有結合GLA結構域凝血蛋白的能力。序列SEQ ID N0S. 39的適配體還可表示為“Mapt-2”。序列SEQ IDN0S. 37的適配體還可表示為“Mapt-2-CS”。序列SEQ ID N0S. 38的適配體還可表示為“Mapt-2. 2-CS”。應說明的是Mapt-2-CS適配體的序列包括在Mapt-2適配體的序列內■ 它是Mapt-2適配體的“核心序列” SEQ ID NO. X。實施例中顯示，本發(fā)明的抗GLA適配體可成功用于生產親和層析支持體，所述支持體用于分離GLA結構域凝血蛋白和其他蛋白質的樣品。特別是為了制備親和層析支持體，本發(fā)明的抗GLA核酸適配體優(yōu)選包括在化學結構中，在本說明書中也被稱為“化合物”，所述化學結構具體包括間隔區(qū)手段，以及恰當時包括用于固定在固相支持體上的手段。在某些實施方案中，核酸適配體包括在下列通式(II)的化合物的結構中[IMM]x-[SPAC]y_[APT] (II)，其中-[IMM]表示固定在支持體上的化合物，-[SPAC]表示間隔區(qū)鏈，-[APT]表示本說明書中定義的抗GLA適配體，-X是等于0或I的整數，和_y是等于0或I的整數。在通式(II)的化合物的某些實施方案中，[APT]由序列是選自序列SEQ ID NO :3、4和6至39的脫氧核糖核酸組成。在通式(II)的化合物中表示為[SPAC]的“間隔區(qū)鏈”可以是任何已知的類型。所述間隔區(qū)鏈的功能是物理上分隔核酸與固相支持體的表面，所述表面上可以固定所述化合物，并允許核酸相對于其固定的固相支持體的表面的相對移動。間隔區(qū)鏈限制或防止了位阻影響在所述核酸和可與其產生接觸的凝血蛋白分子之間的結合事件，其中所述位阻是由于在固相支持體和核酸之間太接近導致的。在通式(II)的化合物中，間隔區(qū)鏈優(yōu)選與核酸適配體的5’端或3’端連接。有利的，間隔區(qū)鏈同時與適配體的一端和固相支持體連接。具有含間隔區(qū)的構造具有不將適配體直接固定在固相支持體上的優(yōu)勢。優(yōu)選的，間隔區(qū)鏈是非特異性的寡核苷酸或聚乙二醇(PEG)，或另一種親水性的基于烴的鏈。當間隔區(qū)鏈由非特異性的寡核苷酸組成時，所述寡核苷酸有利的包括至少5個核苷酸的長度,優(yōu)選長度在5至15個核苷酸之間。在間隔區(qū)鏈由聚乙二醇組成的通式(II)的化合物的實施方案中，所述間隔區(qū)鏈涵蓋了由例如Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)類型的聚乙二醇。如實施例所示，用包含間隔區(qū)鏈[SPAC]的通式(II)的化合物，和不具有間隔區(qū)鏈[SPAC]的通式(II)的化合物都可進行GLA結構域凝血蛋白的純化。為了將適配體固定在間隔區(qū)鏈上，可以用多種化學基團化學修飾核酸，例如使得能夠共價固定所述核酸的基團，例如巰基、胺或任何其他能夠與固相支持體上存在的化學基團反應的基團。在通式(II)的化合物中，化合物[IMM]由這樣的化合物組成，所述化合物選自(i) 能夠與固相支持體材料形成一個或多個共價鍵的化合物，和(ii)能夠通過弱的非共價鍵(包括氫鍵、靜電力或范德華氏力)特異性結合在固相支持體上的化合物。在某些情況下，化合物[MM]由于是由通過共價鍵彼此連接的原子鏈組成，因而可以具有間隔區(qū)鏈的行為。然而，根據定義，，化合物[IMM]絕不可以表示在根據本發(fā)明的通式(II)的化合物中的[SPAC]鏈。換言之，在通式(II)的化合物中，當存在[SPAC]鏈時，其不可以通過共價鍵或弱的非共價鍵與層析支持體直接連接。第一種類型的化合物[I麗]涵蓋了雙功能偶聯劑，例如戊二醛、SIAB或SMCC。SIAB 化合物，如 G. T. Hermanson(1996, Bioconjugate techniques, San Diego Academic Press,第239-242頁)所述,是下列通式(A)的化合物
Na+ O-0
I //
O^=S. U
o
(A)SIAB化合物包含兩個反應基，分別是碘乙酸基和硫代-NHS酯基，這些基團分別與
氣基和疏基反應。SMCC 化合物，如 M. K. Samoszuk 等人(1989，Antibody, ImmunoconjugatesRadiopharm.，2(1) :37_46)所述，是下列通式(B)的化合物
權利要求
1.純化GLA結構域凝血蛋白的方法，其包括下列步驟a)將含有ー種或多種GLA結構域凝血蛋白的樣品與親和支持體接觸，所述親和支持體上固定了特異性結合多種GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，以便在(i)所述核酸適配體和Qi)所述GLA結構域凝血蛋白之間形成復合體，b)從步驟a)中形成的復合體釋放GLA結構域凝血蛋白，和c)以純化的形式回收所述GLA結構域凝血蛋白。
2.權利要求I的方法，其特征是所述核酸適配體由脫氧核糖核酸適配體組成。
3.權利要求I和2之一的方法，其特征是所述核酸適配體包括在下列通式(I)的化合物的結構中[IMM]x-[SPAC]y-[APT] (I)，其中-[IMM]表示固定在支持體上的化合物，-[SPAC]表示間隔區(qū)鏈，-[APT]表示特異性結合GLA結構域蛋白的核酸，-X是等于O或I的整數，和-y是等于O或I的整數。
4.權利要求1-3之一的方法，其特征是所述GLA結構域凝血蛋白是維生素K依賴性的凝血因子。
5.權利要求1-4之一的方法，其特征是所述GLA結構域凝血蛋白選自因子II、因子 VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
6.權利要求1-4之一的方法，用于同時純化至少兩種選自因子II、因子VII、因子IX、 因子X、蛋白C和蛋白S的GLA結構域凝血蛋白。
7.權利要求1-4之一的方法，用于同時純化至少三種選自因子II、因子VII、因子IX、 因子X、蛋白C和蛋白S的GLA結構域凝血蛋白。
8.權利要求1-4之一的方法，用于同時純化因子II、因子VII、因子IX和因子X。
9.權利要求1-8之一的方法，其特征是所述核酸適配體由具有選自序列SEQID NO 3, 4和6至39的序列的適配體組成。
10.特異性結合一種或多種GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，它結合靶GLA結構域蛋白的能力不受高離子強度環(huán)境的改變。
11.權利要求10的適配體，其特征是它結合靶GLA結構域蛋白的能力不受具有至少0.5M的最終NaCl濃度的高離子強度環(huán)境的改變。
12.特異性結合GLA結構域蛋白的核酸適配體，其包含選自具有序列SEQID NO :3、4和 6至39的序列的核酸的核酸。
13.權利要求10-12之一的核酸適配體，其特征是它由脫氧核糖核酸適配體組成。
14.親和支持體,其上固定了權利要求10-13之一的核酸適配體。
全文摘要
本發(fā)明涉及純化GLA結構域凝血蛋白的方法，包括下列步驟a)將含有一種或多種GLA結構域凝血蛋白的樣品與親和支持體接觸，所述親和支持體上固定了特異性結合多種GLA結構域凝血蛋白的核酸適配體，以便在(i)所述核酸適配體和(ii)所述GLA結構域凝血蛋白之間形成復合體，b)從步驟a)中形成的復合體釋放GLA結構域凝血蛋白，和c)以純化的形式回收所述GLA結構域凝血蛋白。
文檔編號C07K14/745GK102639701SQ201080043629
公開日2012年8月15日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權日2009年7月31日
發(fā)明者G·佩雷, N·比霍羅, S·什圖魯 申請人:Lfb生物技術公司