專(zhuān)利名稱(chēng)：患有牛新生兒全血細(xì)胞減少癥的小牛中的圓環(huán)病毒的檢測(cè)的制作方法
患有牛新生兒全血細(xì)胞減少癥的小牛中的圓環(huán)病毒的檢測(cè)描述本發(fā)明涉及作為牛中的骨髓再生障礙伴出血性疾病的誘因劑的新的圓環(huán)病毒(CV)。本發(fā)明提供了用于診斷和治療用途的新的核酸和蛋白序列。簡(jiǎn)介牛中的出血性疾病與多種誘因有關(guān)，包括病毒感染、遺傳疾病、免疫介導(dǎo)的疾病、細(xì)菌性敗血病和中毒。出血傾向和血小板減少癥與非細(xì)胞病變2型牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染相關(guān)(Ellis等人，1998, Rebhun等人，1989)。描述了西門(mén)塔爾牛(Simmentalcattle)的遺傳性出血體質(zhì)。這種西門(mén)塔爾遺傳性血小板病是由血小板功能紊亂引起的(Steficek等人，1993)。免疫介導(dǎo)的血小板減少癥在牛中是罕見(jiàn)的狀況。其可被分類(lèi)為特發(fā)性血小板減少性紫癜或繼發(fā)性實(shí)體(Yeruham等人，2003)。細(xì)菌感染的實(shí)例包括多殺巴 斯德菌(Pasteurella multocida),其是小牛中的出血性敗血病的熟知的誘因，臨床表現(xiàn)為瘀點(diǎn)性和瘀斑性出血、泛發(fā)性充血和肺炎(Rhoades等人，1967，Rimler, 1978)。有幾種毒素可能是牛中的致命性出血體質(zhì)的原因。由于喂給小牛的三氯乙烯提取的大豆油柏中的二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC) (Lock等人，1996)以及抗生素呋喃唑酮(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)中度,產(chǎn)生致命性再生障礙性貧血,顯著的骨髓非細(xì)胞性和廣泛的出血。攝入羊齒植物[歐洲蕨(Pteridium aquiIinum)]引起牛急性中毒，還伴有不可逆轉(zhuǎn)的骨髓低常增生(Maxie and Newman，2007，Valli，2007)。另外，已經(jīng)描述了反會(huì)動(dòng)物中Stachybotrys chartarum(atra)的真菌毒素中毒,導(dǎo)致全細(xì)胞減少疾病，其特征在于很多組織中的大出血和壞死(Harrach等人，1983，Valli, 2007)。雞感染性貧血是與本文報(bào)告的小牛中的出血性疾病非常類(lèi)似的疾病。誘因劑是雞感染性貧血病毒(CIAV)。在感染了 CIAV的雞中，一致性發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的貧血、嚴(yán)重的骨髓再生障礙、胸腺和法布里劉烏斯氏囊的萎縮，以及出血(Kuscu and Gurel, 2008, Yuasa等人，1979)。實(shí)驗(yàn)性接種了 CIAV的一日齡的SPF雞顯示出血細(xì)胞比容值的降低，變得瘦弱和抑郁并伴有貧血，特別是在接種后12-20天時(shí)(Goryo等人，1989)。CIAV在分類(lèi)上屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae) (Todd等人,2005)。其僅感染雞，是環(huán)病毒屬(Gyrovirus)的唯一成員。然而，在哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)物種中已經(jīng)檢測(cè)到了另一個(gè)屬，圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的數(shù)個(gè)成員，包括豬圓環(huán)病毒PCVl和PCV2。圓環(huán)病毒科的成員是無(wú)被膜的二十面體顆粒，具有環(huán)狀的單鏈DNA(ssDNA)基因組，大小為1759至2319個(gè)核苷酸(nt) (Todd等人，2005)。圓環(huán)病毒屬中的病毒具有雙義基因組結(jié)構(gòu)，從有意鏈編碼復(fù)制相關(guān)(Itep)蛋白(開(kāi)放閱讀框[ORF]-VI)，從互補(bǔ)鏈編碼衣殼蛋白(ORF-Cl)。在一些圓環(huán)病毒中已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了另外的小的0RF，例如，在PCV2感染的細(xì)胞中編碼調(diào)亡誘導(dǎo)性蛋白的0RF3 (Liu等人，2005，Timmusk等人,2008)。在非編碼區(qū)，存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其含有保守性的九聚體序列并參與病毒基因組復(fù)制的起始(Steinfeldt等人，2001)。最近有人對(duì)圓環(huán)病毒的分子生物學(xué)進(jìn)行了綜述(Mankertz,2008) 除了 PCVl之外，所有已知的圓環(huán)病毒都是病原體，引起免疫抑制和淋巴網(wǎng)狀組織的破壞(Mankertz, 2008, Segales 等人，2005, Segales and Mateu, 2006, Todd, 2000)。PCV2是與豬中的多種不同癥狀和疾病相關(guān)的病毒性病原體，例如斷奶后多系統(tǒng)消瘦綜合癥(PMWS)、豬呼吸道病復(fù)合體(PRDC)、與PCV2相關(guān)的繁殖障礙，豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)。然而，通過(guò)PCV2接種在不哺喂母乳的仔豬和常規(guī)豬中僅證明了 PMWS的典型損傷(Ellis等人，1999，Kennedy等人，2000)，尚未完全研究透PCV2在除了 PMWS之外的豬疾病中的參與(Allan 等人，2003，Chae, 2005)。關(guān)于牛中的圓環(huán)病毒感染僅存在有限的數(shù)據(jù)。通過(guò)PCR證明了圓環(huán)病毒在100例牛呼吸道疾病中的6例、30例流產(chǎn)胎兒中的4例中的肺組織樣品中的存在(Nayar等人，1999)。該病毒的基因組，臨時(shí)命名為牛圓環(huán)病毒(BCV)，幾乎與PCV2相同，具有99%的總體核苷酸序列同一性。已經(jīng)報(bào)道了與人、小鼠和牛的血清中的豬圓環(huán)病毒反應(yīng)的抗體的存在(Tischer等人，1995)。然而,在另一項(xiàng)研究中，在來(lái)自牛、綿羊、馬和人的血清中未檢測(cè)到針對(duì)PCV2的抗體(Allan等人，2000，Ellis等人，2001)。另外，實(shí)驗(yàn)性感染了 PCV2的I只血清陰性新生小牛和6只血清陰性的6月齡肉牛未產(chǎn)生針對(duì)該病毒的抗體(Ellis等人，2001)。
從2007年開(kāi)始，在全德國(guó)的小牛中有了農(nóng)場(chǎng)主和獸醫(yī)關(guān)于無(wú)法解釋的出血性疾病的報(bào)道。具有自發(fā)性出血的56只小牛被送到巴伐利亞動(dòng)物健康服務(wù)中心以鑒定損傷并通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究來(lái)研究病因。在不同品種的幼牛出生頭一個(gè)月內(nèi)觀察到該疾病。雄性和雌性小牛同樣受影響。主要發(fā)現(xiàn)為出血，尤其是皮膚、皮下組織和胃腸道中的出血。其它零星發(fā)現(xiàn)有炎性損傷。組織學(xué)研究表明在所有的動(dòng)物中存在嚴(yán)重的骨髓減少至再生障礙，在43%的受影響的小牛中存在淋巴細(xì)胞消減(lymphocytic depletion)。5只動(dòng)物的血液分析揭示有再生障礙性全血細(xì)胞減少癥。相信所產(chǎn)生的血小板減少癥代表該出血性疾病綜合征(HDS)、也稱(chēng)作出血體質(zhì)(HD)的主要病理機(jī)理。同時(shí)，HDS/HD的更常見(jiàn)的和科學(xué)上接受的名稱(chēng)是牛新生兒全血細(xì)胞減少癥(BNP)。不同的名稱(chēng)和縮寫(xiě)可以在本申請(qǐng)中相互替換地使用。細(xì)菌感染和牛病毒性腹瀉病毒或藍(lán)舌病毒感染被排除是該疾病的誘因。未檢測(cè)到已知引起骨髓再生障礙的特定毒素。系譜分析沒(méi)有給出該疾病的遺傳性的指示。使用寬譜PCR，本發(fā)明人能夠證明圓環(huán)病毒在受影響的小牛中的存在。全病毒基因組測(cè)序揭示了與2b型豬圓環(huán)病毒(PCV2b)的高度相似性。I只小牛的單個(gè)骨髓細(xì)胞顯示出輕度PCV2抗原免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及被鑒定為牛中的出血性疾病綜合征(HDS)或出血體質(zhì)(HD)、現(xiàn)在主要被稱(chēng)作牛新生兒全血細(xì)胞減少癥(BNP)的誘因劑的新的圓環(huán)病毒(CV)的核酸分子。此外，本發(fā)明涉及由該病毒核酸編碼的新的多肽和針對(duì)這些多肽的抗體。所述核酸、多肽和抗體適合于診斷和治療用途，特別是用于開(kāi)發(fā)針對(duì)HD的疫苗。在第一方面，本發(fā)明涉及圓環(huán)病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 1所示的序列或其片段，和/或(b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。在另一方面，本發(fā)明涉及圓環(huán)病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 7所示的序列或其片段，和/或(b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
在另一方面，本發(fā)明涉及圓環(huán)病毒(CV)核酸分子，其包含(a)如SEQ ID NO 11所示的序列或其片段，和/或(b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。所述核酸分子可以是DNA或RNA分子，其是單鏈或雙鏈的、環(huán)狀或線性的。在一些實(shí)施方式中，所述核酸分子可以這樣存在，或連接于另外的核酸分子，例如可操作地連接于異源表達(dá)控制序列。核酸分子也可以封裝于病毒衣殼中。本發(fā)明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :1的完整序列和/或其互補(bǔ)物或其片段。同樣，本發(fā)明的核酸分子可以包含SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :11的完整序列和/或其互補(bǔ)物或其片段。所述片段優(yōu)選包含如SEQ ID NO :1、7或11所示的至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的CV核酸分子相對(duì)于相關(guān)的圓環(huán)病毒株、例如圖6中所不的GeneBank登記號(hào)的圓環(huán)病毒株具有至少一個(gè) 核苷酸的差異。本發(fā)明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補(bǔ)物。本發(fā)明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補(bǔ)物。本發(fā)明還涉及以下核酸分子(a)與SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性；(b)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列雜交；或(c) (a)或(b)的互補(bǔ)物。給定核酸分子與參考核酸分子(即，例如，SEQ ID NO 1或其片段)的同一性可通過(guò)如下確定I = n/Lxl00,其中I是以百分率表示的同一性，n是給定核酸分子與參考物的相同核苷酸的數(shù)目；和L是給定核酸分子與參考物的序列重疊的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下雜交的意思是以IXSSC緩沖液和0. I % SDS在50°C、優(yōu)選55°〇、更優(yōu)選621、最優(yōu)選68°C洗滌I小時(shí)之后，尤其是以0. 2XSSC和0. 1% SDS在50°C、優(yōu)選55°C、更優(yōu)選62°C、最優(yōu)選68°C洗滌I小時(shí)之后，觀察到陽(yáng)性雜交信號(hào)。雜交程序?yàn)?，例如，公開(kāi)于 Wahl 和 Berger (Methods Enzymol. 152 (1987), 399-407)以及 Kimmel (MethodsEnzymol. 152 (1987)，507-511)，其內(nèi)容通過(guò)引用方式并入本文。本發(fā)明的另一方面涉及編碼圓環(huán)病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1034-1735 (Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)于(a)的序列的核苷酸序列 ；或(c)根據(jù)(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本發(fā)明的另一方面涉及編碼圓環(huán)病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 IOM-I735(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根據(jù)(a)或(b)的核苷酸序列的片段。本發(fā)明的另一方面涉及編碼圓環(huán)病毒多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含(a)如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸 51-995 (Itep)(ii)核苷酸 1033-1734(Cap)(iii)核苷酸 357-671 (0RF3);或(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)于(a)的序列的核苷酸序列；或(c)根據(jù)(a)或(b)的核苷酸序列的片段。優(yōu)選地，核酸分子編碼選自下列的CV多肽R印(SEQ ID NO 2) >Cap (SEQ ID NO 3)和0RF3(SEQ ID NO :4)，或其片段。核酸分子還可以編碼選自下列的CV多肽R印(SEQ IDNOs 8 和 12)、Cap (SEQ ID NOs 9 和 13)和 0RF3 (SEQ ID NOs 10 和 14)，或其片段。上述CV多肽的片段可以例如包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO :8_10或12-14所示氨基酸序列的至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)或至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。另外，本發(fā)明涉及編碼與SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽的核酸分子。另外，本發(fā)明涉及編碼與SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽的核酸分子。給定多肽與參考多肽、例如SEQ ID NO :2，3或4之間的同一性程度可以根據(jù)上文就核酸分子所述的來(lái)確定。本發(fā)明的核酸分子可以可操作地連接于異源表達(dá)控制序列，例如允許在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列。用于表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的異源表達(dá)控制序列的實(shí)例，例如原核或真核的，包括哺乳動(dòng)物表達(dá)控制序列，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如公開(kāi)于Sambrook 等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Press,和 Ausubel 等人(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley andSons，其內(nèi)容通過(guò)引用方式并入本文。本發(fā)明還包括以如上文所述的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的非人宿主細(xì)胞，例如原核或真核宿主細(xì)胞，例如酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。以核酸分子、例如位于載體例如病毒載體或質(zhì)粒上的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，描述于例如Sambrook等人(見(jiàn)上文)或Ausubel等人(見(jiàn)上文)。本發(fā)明的另一方面是由如上文所述的核酸分子編碼的圓環(huán)病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)選自下列的氨基酸序列⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 3(Cap)，、(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 4(0RF3);或(b)其片段。本發(fā)明的另一方面是由如上文所述的核酸分子編碼的圓環(huán)病毒(CV)多肽。CV多肽可以包含(a)選自下列的氨基酸序列(i)氨基酸序列 SEQ ID NO 8 和 12 (Rep)，(ii)氨基酸序列 SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)，(iii)氨基酸序列 SEQ ID NO 10 和 14(0RF3);或(b)其片段。本發(fā)明包括CV多肽或片段，所述片段包含如SEQ ID N0:2，3或4或SEQ ID NO:8-10或12-14所示氨基酸序列的至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)或至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的CV多肽相對(duì)于相關(guān)的圓環(huán)病毒株、例如圖6中所示的GeneBank登記號(hào)的圓環(huán)病毒株具有至少一個(gè)氨基酸的差異。本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO :2，3或4所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一性的多肽。本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO :8，9，10，12，13或14所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90 %、至少92 %、至少94 %、至少96 %、至少98 %或至少99 %同一性的多肽。本發(fā)明的另一方面是針對(duì)如上文所述的多肽的抗體或此類(lèi)抗體的抗原結(jié)合片段。產(chǎn)生抗體、例如多克隆或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如,可以通過(guò)注射具有免疫原性的本發(fā)明的多肽免疫多種哺乳動(dòng)物宿主，例如小鼠或兔子。如果需要，本發(fā)明的多肽可以偶聯(lián)于載體，例如鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)?？梢酝ㄟ^(guò)熟知的方法從經(jīng)免疫的宿主獲得多克隆抗體或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。可以通過(guò)已知的技術(shù)，例如B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(KShler等人，Nature256 ;(1975)495-497)(其內(nèi)容通過(guò)引用方式并入本文)或相關(guān)技術(shù)制備針對(duì)本發(fā)明的多肽的單克隆抗體。本發(fā)明還包括此類(lèi)抗體的嵌合、人源化或人類(lèi)抗體，或抗原結(jié)合片段，它們可通過(guò)已知技術(shù)獲得。本發(fā)明的另一方面是包含如上文所述的核酸分子的圓環(huán)病毒。所述病毒可以是活性病毒。備選地，所述病毒可以是滅活的病毒或減毒的病毒。可以按照下文的詳細(xì)描述進(jìn)行滅活和減毒。本發(fā)明的核酸分子、多肽、病毒和抗體可用作診斷或藥物試劑，例如，用于診斷或預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物、特別是牛、更特別是小牛中的HD。在診斷性的實(shí)施方式中，核酸分子或多肽可以攜帶報(bào)告基團(tuán)，例如任何適合用于診斷方法中的報(bào)告基團(tuán)，例如熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、染料、酶、半抗原或生物素。特別地，對(duì)于診斷性實(shí)施方式，如本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”還包括核酸類(lèi)似物，例如肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或本領(lǐng)域已知的其它類(lèi)型的核酸類(lèi)似物。因此，本發(fā)明的其它方面是包含如上文所述的核酸分子、多肽、病毒或抗體以及可接受的載體的診斷組合物。 診斷組合物可用于診斷HD、特別是牛中的HD的方法，其中，將來(lái)自待診斷的受試者的樣品與如上文所述的診斷組合物接觸，從而測(cè)定該樣品中CV的存在和/或數(shù)量，特別是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的存在和/或數(shù)量，或針對(duì)CV、特別是PCV2-Ha08株、PCV2_Ha09株或PCV2_HalO株的抗體的存在和/或數(shù)量。所述樣品可以是體液樣品，例如血液、血清、血漿、唾液、痰或淋巴液，或組織樣品，例如，來(lái)自肝、肺、骨髓或淋巴組織的樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法可以包括在基于核酸的檢驗(yàn)中測(cè)定CV核酸分子，所述檢驗(yàn)可以涉及核酸雜交和擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR。另外，本發(fā)明的診斷方法包括在免疫檢驗(yàn)中測(cè)定CV多肽，使用本發(fā)明的抗體作為診斷試劑并測(cè)定CV多肽與探測(cè)抗體的免疫復(fù)合物的存在。另一方面，本發(fā)明的診斷方法可以包括測(cè)定樣品中的抗-CV抗體，例如使用如上文所述的CV多肽作為探測(cè)抗原。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是如上文所述的核酸分子、多肽、病毒和抗體用于治療性應(yīng)用的用途，特別是用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物生物、特別是牛中的HD。因此，本發(fā)明還包括用于治療性用途的組合物，其包含如上文所述的核酸分子、多肽、抗體或病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。在優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物是疫苗或免疫原性組合物，例如，基于核酸的疫苗或免疫原性組合物，或基于多肽的疫苗或免疫原性組合物，或基于病毒的疫苗或免疫原性組合物，或基于抗體的疫苗。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物是基于多肽的疫苗或免疫原性組合物，并包含能夠在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的CV多肽，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物是基于病毒的疫苗或免疫原性組合物，并包含能夠在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的圓環(huán)病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。本發(fā)明還包括預(yù)防或治療HD、特別是哺乳動(dòng)物受試者、例如牛中的HD的方法，其中向有此需要的受試者施用有效量的如上文所述的治療性組合物。對(duì)于治療性應(yīng)用，核酸分子可以以下列形式使用基于核酸的疫苗或免疫原性組合物，或者核酸效應(yīng)子分子、例如反義分子、或能夠RNA干擾的分子。本發(fā)明的多肽或病毒可用于治療性應(yīng)用，用于制備如上文所述的基于多肽或基于病毒的疫苗或免疫原性組合物?？贵w可用于治療性應(yīng)用，用于治療已經(jīng)存在的CV感染。發(fā)明詳述以下定義可適用于本發(fā)明的實(shí)施方式的描述中使用的術(shù)語(yǔ)。以下定義取代每篇通過(guò)引用方式并入本文的各個(gè)參考文獻(xiàn)中的任何矛盾定義。除非在本文中另有定義，否則本發(fā)明中使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)將具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文需要，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指任何作為免疫應(yīng)答的非特異性刺激物的物質(zhì)。合適的佐劑包括但不限于RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)，明礬氫氧化鋁凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，例如弗氏完全佐劑和不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGa.), SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN 佐劑，離子多糖，阜苷，QuiI A, QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass.)，GPI-0100 (GalenicaPharmaceuticals, Inc. , Birming-ham, AL)或其它阜苷級(jí)份，Procision-A (包含 Quil A、AMPHIGEN 和膽固醇的混合物的佐劑)、單磷酰脂質(zhì)A，阿夫立定脂質(zhì)-胺佐劑，來(lái)自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組的或其它方式)，霍亂毒素，或胞壁酰二肽，等本領(lǐng)域 技術(shù)人員所知的。提及“離子多糖”應(yīng)理解為任何帶正電或負(fù)電的多糖或其衍生物或化學(xué)等同物。所述離子多糖可以是可溶或不可溶形式。優(yōu)選地，所述離子多糖是離子葡聚糖。更優(yōu)選地，所述離子葡聚糖是DEAE-葡聚糖，硫酸葡聚糖或QAE-葡聚糖。最優(yōu)選地，所述離子葡聚糖是DEAE葡聚糖。優(yōu)選地，所述離子葡聚糖的葡聚糖成分具有250，000至4，000，OOODa的分子量，更優(yōu)選為 500, 000 至 I, 500，OOODa0皂苷的佐劑特性已長(zhǎng)久為人所知，因?yàn)槠渚哂性鰪?qiáng)針對(duì)免疫原的抗體效價(jià)的能力。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“皂苷”是指一組植物來(lái)源的表面活性的糖苷，其由與留類(lèi)或三萜類(lèi)結(jié)構(gòu)的疏水性區(qū)域結(jié)合的親水性區(qū)域(通常是數(shù)個(gè)糖鏈)組成。皂苷可從多個(gè)不同來(lái)源獲得，已經(jīng)從南美樹(shù)木阜樹(shù)(Quillaja saponaria) (Molina)中得到了具有有用的佐劑活性的皂苷。來(lái)自該來(lái)源的皂苷被用于分離“均一的”級(jí)份，該級(jí)份被稱(chēng)作"Quil A" (Dalsgaard,1974)。劑量-位點(diǎn)反應(yīng)性是在疫苗制備物中使用Quil A用于獸用和人類(lèi)的一個(gè)主要考慮。避免Quil A的這種毒性的一種方式是使用免疫刺激復(fù)合物(稱(chēng)作Iscoms ，ImmunoStimulating COMplexes的縮寫(xiě))。這是主要的，因?yàn)楫?dāng)摻入到免疫刺激復(fù)合物中時(shí)，QuilA的反應(yīng)活性沒(méi)那么高，因?yàn)槠渑c復(fù)合物中的膽固醇的結(jié)合降低了其與細(xì)胞膜中的膽固醇結(jié)合的能力，因此降低了其細(xì)胞裂解效應(yīng)。另外，產(chǎn)生相似水平的佐劑效應(yīng)所需的Quil A的量較少。已經(jīng)在多個(gè)公開(kāi)物中描述了 Quil A皂苷的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)和當(dāng)把它們摻入免疫刺激復(fù)合物時(shí)將會(huì)從這些皂苷產(chǎn)生的額外益處，例如Cox和Coulter，1992 (Cox，J. C. and Coulter, A. R. , “Advances in Adjuvant Technology and Application，，，見(jiàn)Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology,第 4 章，編者Yong, ff. K. , CRCPress (1992)) ；Dalsgaard, 1974 ；Morein 等人，澳大利亞專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)號(hào) 558258、589915、590904 和 632067。本發(fā)明情境下有用的佐劑和添加劑的數(shù)量和濃度可由技術(shù)人員容易地確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含大約50 ii g至大約2000 ii g佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所包括的佐劑的量是大約IOOii g至大約1500ii g，或大約250ii g至大約IOOOiI g，或大約350i! g至大約750 i! g。在另一個(gè)實(shí)施方式中，包括的佐劑的量是大約500 u g/2ml劑量的免疫原性組合物或疫苗。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及按照類(lèi)似于天然產(chǎn)生的氨基酸發(fā)揮作用的氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些后來(lái)被修飾的氨基酸，例如，羥基脯氨酸、羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如a和a-雙取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的合適的成分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4_羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、e -N, N，N-三甲基賴(lài)氨酸、e -N-乙?；?lài)氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙?；z氨酸、N-甲?；琢虬彼?、3-甲基組氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、O -N-甲基精氨酸，和其它類(lèi)似的氨基酸和亞氨基酸。氨基酸類(lèi)似物是指具有與天然產(chǎn)生的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的碳)的化合物。示例性的氨基酸類(lèi)似物包括，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸甲基锍。此類(lèi)類(lèi)似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸) 或修飾的肽骨架，但是保持與天然產(chǎn)生的氨基酸基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、但是按照類(lèi)似于天然產(chǎn)生的氨基酸的方式發(fā)揮作用的化學(xué)化合物。在本文中可以通過(guò)它們通常已知的三字符或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字符來(lái)指稱(chēng)氨基酸。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指能夠通過(guò)識(shí)別表位的方式結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子?？贵w可以是多克隆的混合物或單克隆的?？贵w可以是來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組來(lái)源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)活性部分?？贵w可以以多種形式存在，包括，例如，F(xiàn)v, Fab’，F(xiàn)(ab’)2，以及單鏈。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”是指包含一個(gè)或多個(gè)表位(線性、構(gòu)象或二者)的分子，其在暴露于受試者之后將誘導(dǎo)特異于該抗原的免疫應(yīng)答。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”可以指減毒的、滅活的或修飾的活體細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)或其它微生物。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”還可以指亞基抗原，其相對(duì)于與抗原天然結(jié)合的整個(gè)生物體是分離的和離散的。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”還可以指抗體，例如抗獨(dú)特型抗體或其片段，以及指合成的肽模擬位，其可以模擬抗原或抗原決定簇(表位)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原”還可以指在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在DNA免疫應(yīng)用中的那些。在用于疫苗中之前，本發(fā)明的圓環(huán)病毒可以是“減毒的”或“滅活的”。減毒和滅活的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。減毒方法包括但不限于在合適的細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代，紫外光輻射，和化學(xué)誘變。滅活方法包括但不限于使用福爾馬林、P -丙內(nèi)酯(BPL)或二乙烯亞胺(BEI)處理，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。通過(guò)福爾馬林滅活可以這樣進(jìn)行將病毒懸浮液與37%的甲醛混合至甲醛的最終濃度為0. 05%。通過(guò)在室溫恒定攪拌大約24小時(shí)而混合病毒-甲醛混合物。然后通過(guò)檢驗(yàn)在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中的生長(zhǎng)而就殘余活體病毒測(cè)試滅活的病毒混合物。通過(guò)BEI滅活可以這樣進(jìn)行將本發(fā)明的病毒懸浮液與0. IM BEI (2-溴代-乙胺，在0. 175N NaOH中)混合至BEI的最終濃度為ImM。通過(guò)在室溫恒定攪拌大約48小時(shí)而混合病毒-BEI混合物，然后加入I. OM硫代硫酸鈉至0. ImM的終濃度。再繼續(xù)混合2小時(shí)。通過(guò)通過(guò)檢驗(yàn)在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系中的生長(zhǎng)而就殘余活體病毒測(cè)試滅活的病毒混合物。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”或“宿主細(xì)胞”意思是病毒在其中可復(fù)制和/或被維持的原核或真核細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性組合物”意思是能夠在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或抗原性應(yīng)答的組合物。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指這樣的物質(zhì)在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合用于與人或動(dòng)物的組織接觸而無(wú)不適毒性、刺激、變應(yīng)性應(yīng)答等，與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)，并對(duì)于它們的意欲用途有效。本發(fā)明的疫苗可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，例如所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖，等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。穩(wěn)定劑包括白蛋白等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。防腐劑包括硫柳汞等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸或核酸分子”意思是由鏈中共價(jià)結(jié)合的核苷酸單體組成的有機(jī)聚合物分子。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有不同生物功能的多核苷酸的實(shí)例。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”意思是抑制微生物的復(fù)制、抑制微生物的傳播或抑制微生物在其宿主中建立其自身。如本文使用的該術(shù)語(yǔ)也可意指抑制或阻斷一個(gè)或多個(gè)感染跡象或癥狀。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療劑”意思是在其所施用至的受試者中引起免疫應(yīng)答的微生物(或其部分)或亞基抗原或多肽或多核苷酸分子，以及它們的組合。所述免疫應(yīng)答可以包括但不限于細(xì)胞和/或體液免疫力的誘導(dǎo)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療”意思是減少或消除微生物引起的感染。如本文使用的該術(shù)語(yǔ)也可意指減少微生物的復(fù)制、減少微生物的傳播或降低微生物在其宿主中建立其自身的能力。如本文使用的該術(shù)語(yǔ)還可以意指減少、緩解或消除微生物引起的感染的一個(gè)或多個(gè)跡象或癥狀，或加速?gòu)奈⑸镆l(fā)的感染的復(fù)原。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”和“疫苗組合物”意思是預(yù)防或減少感染、或預(yù)防或減少感染的一個(gè)或多個(gè)跡象或癥狀的組合物。疫苗組合物針對(duì)病原體的保護(hù)性效應(yīng)通常是通過(guò)在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的或體液免疫應(yīng)答或二者的組合)而實(shí)現(xiàn)。一般而言，感染的消除或降低的發(fā)生率，跡象或癥狀的緩解，或微生物從被感染的受試者的加速的消除，是疫苗組合物的保護(hù)性效應(yīng)的指示。本發(fā)明的疫苗組合物提供針對(duì)圓環(huán)病毒(CV)引起的感染的保護(hù)性效應(yīng)。提供了以下描述的附圖和實(shí)施例以輔助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。雖然如此，這些描述不應(yīng)被解釋為不恰當(dāng)?shù)叵拗票景l(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可以不脫離本發(fā)明的精神或范圍而對(duì)本文討論的實(shí)施方式進(jìn)行修飾和改變。



圖I.患病小牛中的出血位置。A :頭部皮膚中的病灶性急性出血。干燥后的血液使小束毛發(fā)粘在一起。B :下唇和牙齦的粘膜中的瘀點(diǎn)性和瘀斑性出血。C :除了與注射位點(diǎn)和耳朵打標(biāo)記相關(guān)的出血之外，無(wú)創(chuàng)傷性皮膚損傷的跡象。D :小腸和大腸的腸系膜中的中度病灶性出血。小腸的節(jié)段性暗紅色變色是由于嚴(yán)重的管腔內(nèi)的出血。E :腕骨的皮下組織。在骨突出物和身體的力學(xué)緊張部分最常見(jiàn)到皮下出血。圖2.在患有全血細(xì)胞減少癥和出血性疾病(BNP)的小牛中的額外發(fā)現(xiàn)的頻率。一些動(dòng)物顯示出數(shù)個(gè)額外損傷。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)不同器官的炎癥，但是所研究的動(dòng)物中有30%不具有另外的損傷。GIT:胃腸道。圖3.脫鈣、HE染色之后骨髓(胸骨)的組織學(xué)研究，放大倍數(shù)100。A :具有造血組織、包括數(shù)個(gè)巨核細(xì)胞(箭頭)的3周齡小牛的正常骨髓。B :嚴(yán)重?fù)p失了造血組織的受影響的小牛的骨髓。僅保留了間質(zhì)成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。圖4.來(lái)自患有出血性疾病的小牛的樣品中的圓環(huán)病毒DNA的檢測(cè)。使用提取自小牛的骨髓(泳道3、5、9-12)、血液(泳道4和8)、肝(泳道6)或腎(泳道7)的DNA進(jìn)行巢式寬譜PCR，在泳道上標(biāo)示了數(shù)字。Neg :陰性分離對(duì)照；p0s :陽(yáng)性PCR對(duì)照；M :分子量標(biāo)記物，在左側(cè)以bp標(biāo)示了大小。在溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠中分離了大小為約350bp的、次級(jí)PCR產(chǎn)物。圖5.用于檢測(cè)PCV2-特異性抗原的免疫組織化學(xué)，胸骨，I號(hào)小牛。單一骨髓細(xì)胞顯示出輕微至中度的細(xì)粒細(xì)胞質(zhì)染色。比例尺100iim。圖6.在具有2型豬圓環(huán)病毒株的德國(guó)小牛中檢測(cè)到的圓環(huán)病毒PCV2_Ha08的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。基于參考株P(guān)CV2a、PCV2b和PCV2c (黑體)、加拿大牛圓環(huán)病毒(BCV)和通過(guò)BLAST搜索發(fā)現(xiàn)的與PCV2-Ha08最密切相關(guān)的10種圓環(huán)病毒的完整核苷酸序列建立系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。以箭頭標(biāo)示了 PCV2-Ha08。在括號(hào)中顯示了序列的GenBank登記號(hào)。該樹(shù)以核苷酸替換單兀(nucleotide substitution units)定標(biāo)。圖7.根據(jù)未公布的Gen Bank條目登記號(hào)FJ804417的PCV-2株Ha08的核苷酸和
氨基酸序列。圖8.根據(jù)未公布的Gen Bank條目登記號(hào)HQ231329的PCV-2株Ha09的核苷酸和
氨基酸序列。圖9.根據(jù)未公布的Gen Bank條目登記號(hào)HQ231328的PCV-2株HalO的核苷酸和
氨基酸序列。圖10.在原型物種非依賴(lài)性PCV2酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)(ELISA)中分析血清。實(shí)線代表豬PCV2陰性血清，虛線代表豬PCV2陽(yáng)性血清，點(diǎn)線代表牛BNP血清。
實(shí)施例材料和方法病史在2007年10月至2009年5月期間，對(duì)56頭具有出血性疾病的小牛(產(chǎn)自德國(guó)巴伐利亞的45頭奶牛)進(jìn)行尸檢。就年齡、性別和品種縱覽醫(yī)學(xué)記錄。詢(xún)問(wèn)主人關(guān)于小牛的既往疾病和既往的醫(yī)學(xué)處理、小牛飼養(yǎng)、飼料被霉菌或羊齒植物污染以及殺嚙齒動(dòng)物藥的使用情況。根據(jù)表I對(duì)HDS (BNP)病例和對(duì)照組動(dòng)物編號(hào)。對(duì)照組動(dòng)物如文本中所指定。包括了由于出血性疾病之外的原因而被送去進(jìn)行病理學(xué)檢查的8頭小牛作為圓環(huán)病毒特異性PCR的對(duì)照；它們被列舉于表I中。I號(hào)對(duì)照屬于與患出血性疾病的兩個(gè)病例(11和15號(hào))相同的家畜，于出生后不久由于不明原因死亡。在該例中沒(méi)有可檢出的感染性試劑。對(duì)照組中包括的7頭小牛(由于它們年齡的緣故)患有嚴(yán)重的多關(guān)節(jié)炎或嚴(yán)重的腸炎，在出生后I個(gè)月內(nèi)死亡。對(duì)照組動(dòng)物均未顯示任何骨髓消減的跡象。組織病理學(xué)所有動(dòng)物均進(jìn)行尸檢，收集標(biāo)準(zhǔn)系列組織，包括股骨和胸骨的骨髓、肺、肝、腎、脾和淋巴結(jié)，以進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)需要，根據(jù)其它病理學(xué)發(fā)現(xiàn)收集另外的樣品。器官組織的樣品固定于10%緩沖的福爾馬林。胸骨骨髓樣品在OssaFixona (Waldeck,Miinster, Germany)中進(jìn)行過(guò)夜脫I丐。就石臘包埋進(jìn)行處理之后，切取4 y m厚的切片并以蘇木精和曙紅01E)染色。免疫組織化學(xué)
在封片于Superfrost Plus載玻片上的4mm切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢查(IHC)。將針對(duì) PCV2 的 VP2 蛋白(0RF2)的小鼠單克隆抗體 36A9 (Ingenasa, Madrid, Spain)應(yīng)用于2頭受影響的小牛的骨髓、脾和淋巴結(jié)的組織切片。在收集自確認(rèn)具有PCV2感染(基于免疫組化和PCR分析)的豬的淋巴結(jié)和派爾斑(Payers Patch)的切片上在每次運(yùn)行中檢測(cè)抗體的反應(yīng)活性。染色前處理包括二甲苯洗滌以使切片去石蠟化和連續(xù)乙醇洗滌以復(fù)水化，然后以3%過(guò)氧化氫處理以猝滅內(nèi)源性組織過(guò)氧化物酶活性。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用Hist0stam -PlusBulkKit和色原試劑AEC Single Solution(Invitrogen ,Camarillo, CA, USA)進(jìn)行染色。最后，以Mayer的蘇木精對(duì)切片進(jìn)行對(duì)比染色。被分類(lèi)為PCV2陽(yáng)性的玻片顯示出胞質(zhì)內(nèi)的顆粒式樣的亮紅色信號(hào)。血液病學(xué)從5個(gè)病例(2和53-56號(hào))可獲得EDTA血液樣品，在收集后48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血液分析。使用CELL-DYN 3500 (Abbott, Wiesbaden, Germany)設(shè)備進(jìn)行全血計(jì)數(shù),包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平和紅細(xì)胞參數(shù)。使用顯微鏡方法測(cè)定血球計(jì)數(shù)器玻片上的血小板數(shù)目。毒理學(xué)就特定毒素測(cè)定以下樣品使用特定方法分析21和22號(hào)病例的尿液和血液樣品，以檢測(cè)二氯乙烯基半胱氨酸(DCVC)及其代謝物。使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法檢測(cè)25號(hào)病例的尿液樣品和8號(hào)病例的腎組織中的揮發(fā)性有機(jī)化合物、香豆素衍生物和化療藥物，例如磺酰胺。使用GC-MS方法和高效液相色譜(HPLC)方法測(cè)定3個(gè)病例(23、34和36號(hào))的尿液和肝樣品中的藥物。從具有2例受影響病例(I號(hào)和2號(hào)小牛)的農(nóng)場(chǎng)收集飼料樣品(青貯飼料、枯草、大豆萃取粉和稻草)。稻草樣品是可疑的，因?yàn)樽兓疑蜕沟奈兜馈＞忘S曲霉毒素BI和葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)的毒素進(jìn)行真菌毒理學(xué)研究以及細(xì)胞毒性檢驗(yàn)。使用最近發(fā)表的LC-MS/MS分析法(Gottschalk等人，2008)嘗試證明真菌毒素(煙曲致震顫毒素C、Verrucologen、黃曲霉毒素BI、夫馬潔林、膠霉毒素、Verrucarol NH4+、脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、黑葡萄穗霉毒素G、黑葡萄穗霉毒素H、疣孢菌素A、桿孢菌素A、桿孢菌素L、黑葡萄穗霉毒素F和疣孢菌素J)的存在。根據(jù)Reubel等人(1987)的方法進(jìn)行細(xì)胞毒性(MTT)檢驗(yàn)。微生物培養(yǎng)就細(xì)菌的存在情況檢查本研究和對(duì)照組中的所有動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)器官組(肺、肝、脾、腎和小腸)以及另外的樣品(取決于病理學(xué)發(fā)現(xiàn))。通過(guò)接種含有5%去纖維的綿羊血液的哥倫比亞血瓊脂和Water-blue-metachrome-yellow lactose agar來(lái)研究每個(gè)樣品。使用腦心浸出液瓊脂和巧克力瓊脂檢測(cè)肺中的微需氧微生物。對(duì)于厭氧檢測(cè)，使用Zeissler瓊脂。在緩沖的蛋白胨水和木糖賴(lài)氨酸去氧膽酸鹽瓊脂中預(yù)富集之后，在Rappaport-Vassilioadis培養(yǎng)基中分離沙門(mén)氏菌屬。病毒學(xué)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用診斷試劑盒(Bio-X Diagnostics, Jemelle,Belgium),通過(guò)直接免疫熒光法，就BVDV的存在檢測(cè)所有受影響的動(dòng)物的腎和甲狀腺組織。為了分離 BVDV,將單層牛 KOP-R 細(xì)胞(RIE 244, CCLV Federal Research Centre for VirusDiseases of Animals, Island of Riems, Germany)接種器官勻衆(zhòng)物。每日篩選細(xì)胞的細(xì)胞病變方面的變化。在第二次細(xì)胞培養(yǎng)物傳代之后，按照描述的方法通過(guò)直接免疫熒光檢驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞并通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)BVDV特異性抗原(SERELISA BVD p80 Ag MonoIndirect, Synbiotics, Lyon,France)。為了顯不BVDV特異性核苷酸序列，使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)從組織樣品分離RNA,根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用商售的實(shí)時(shí)RT-PCR 程序(Virotype BVDV Kit ；Labor Diagnostik Leipzig, Leipzig, Germany)。為了檢測(cè)BTV特異性序列，使用分離自所有受影響小牛的脾組織的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR程序，覆蓋所有24個(gè)BTV血清型(Toussaint等人，2007)。在研究組中的總共56頭小牛中，隨機(jī)選擇25頭(病例號(hào)1，2，4-13，15-22, 31，34，41,42,45)以檢測(cè)哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)圓環(huán)病毒，包括PCV2 ;也研究了對(duì)照組中的所有小牛(稱(chēng)作對(duì)照I號(hào)、對(duì)照2號(hào)等)。使用高純PCR模板制備試劑盒(Roche,Mannheim, Germany)從組織、包括血液、骨髓、脾、胸腺、腎和肝提取DNA，并根據(jù)最近的描述(Halami等人，2008)進(jìn)行巢式寬譜PCR程序。根據(jù)Bogner等人(2005)進(jìn)行另外的PCR程序，其常規(guī)被用于PCV2的特異性檢測(cè)。在PCR分析過(guò)程中要小心以排除實(shí)驗(yàn)室DNA污染。使用不同組的移液搶和專(zhuān)用過(guò)濾槍頭在另外的房間進(jìn)行DNA分離、PCR標(biāo)準(zhǔn)混合物的制備和PCR產(chǎn)物的分析。使用陰性對(duì)照試劑和陰性DNA分離對(duì)照就污染情況篩選每組反應(yīng)。在進(jìn)行本研究之前，該實(shí)驗(yàn)室從未用于PCV2感染的常規(guī)PCR診斷。圓環(huán)病毒全基因組的擴(kuò)增使用一對(duì)反向引物(inverseprimer) (5 ' -AGC TCC ACA CTC GATCAGTAAG-3' (SEQ ID NO :5)和 5' -CCT AGA TCT CAG GGA CAACGG AG-3' (SEQ ID NO :6))通過(guò)PCR擴(kuò)增所檢測(cè)的圓環(huán)病毒的完整基因組，所述引物是根據(jù)巢式寬譜PCR擴(kuò)增的序列設(shè)計(jì)的。使用高保真PCR酶混合物(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany),使用下列循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增首先在95°C變性5分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)的“95°C，30sec ；58°C,30sec和70°C，4分鐘”，最后在70°C延伸10分鐘。DNA測(cè)序和系譜分析。使用GeneJET. PCR CloningKit (Fermentas, St. Leon-Rot,Germany)克隆 PCR 產(chǎn)物。使用引物 pjetl forward 和 pJetIreverse (Fermentas, St. Leon-Roth, Germany)或特異性引物在 ABI Prism 裝置(AppliedBiosystems)中對(duì)質(zhì)粒的插入物進(jìn)行測(cè)序。使用Lasergene DNASTAR軟件包(DNASTAR,Inc. , Madison, WI, USA)里的EditSeq模塊從序列片段重新裝配所檢測(cè)的圓環(huán)病毒的完整基因組序列，然后存于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登記號(hào)為FJ804417。使用BLAST 2. 2. 14檢索設(shè)施進(jìn)行序列相似性檢索。使用CLUSTAL W方法(Thompson等人，1994)，使用上述的軟件包中的MegAlign模塊進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建。株的命名和GenBank登記號(hào)顯示于圖6中。系譜分析通過(guò)它們的耳朵標(biāo)記鑒定并追蹤所有的小牛及其雙親。從用于德國(guó)和奧地利的聯(lián)合繁殖評(píng)價(jià)的系譜構(gòu)建所有病例的系譜。使用Pedigraph TM軟件進(jìn)行系譜的圖形化呈現(xiàn)，鑒定出現(xiàn)一次以上的父系。
結(jié)果所檢查的小牛有86%是西門(mén)塔爾牛(n = 48)，4%是荷蘭乳牛(n = 2)，11%是混合或未知品種(n = 6)。死亡時(shí)的年齡是7-32天(平均為17天)。85%的小牛在生命的第2至第3周發(fā)病。雄性和雌性小牛以相同比例受影響。臨床病史的回顧分析揭示小牛在出生時(shí)和出生后第一天是健康的。牛的主人和主診獸醫(yī)報(bào)告有自發(fā)性的經(jīng)皮膚的出血，在數(shù)個(gè)粘膜表面無(wú)任何明顯損傷和出血，以及與創(chuàng)傷或標(biāo)準(zhǔn)管理程序例如耳朵打標(biāo)記或感染相關(guān)的過(guò)量出血。有的時(shí)候，記錄另外的跡象，例如發(fā)燒、腹瀉或呼吸困難。似乎僅在無(wú)規(guī)律的間隔在農(nóng)場(chǎng)的單只或幾只小牛中出現(xiàn)出血。醫(yī)學(xué)治療是不成功的。多數(shù)小牛在數(shù)天內(nèi)死亡(n = 50)或者由于血液損失而需要被實(shí)施安樂(lè)死(n = 6)。所有的小牛在出生后第一天皆接受初乳。然后，多數(shù)農(nóng)場(chǎng)主以來(lái)自他們自己的母牛的全奶喂養(yǎng)。一般地，保持小牛不被處理，直至出現(xiàn)出血的第一個(gè)跡象。一些小牛接受預(yù)防性藥物，或者由于急性腹瀉，以針對(duì)隱孢子蟲(chóng)的鹵夫酮處理一些小牛。由于在德國(guó)羊齒植物僅在低程度上是牧草的成分，所以尚未報(bào)道由于羊齒植物污染而造成的任何問(wèn)題。在農(nóng)場(chǎng)上使用了殺嚙齒動(dòng)物藥，但是牛的主人排除了母?；蛐∨z取它們的可能性。僅有一位農(nóng)場(chǎng)主提到由于生霉的飼料而引起的牛中的健康問(wèn)題。系譜分析構(gòu)建了所有小牛的系譜。小牛的家系是各不相同的，未指示疾病的單基因(隱性或顯性)遺傳誘因。雖然一些父系被描述了數(shù)次，但小牛的數(shù)目太少，以致無(wú)法從此分析獲得有意義的結(jié)果?？偛±韺W(xué)在尸檢時(shí)，研究組中的56頭小牛的獸體處于良好的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，體重為38_72kg，取決于年齡(平均為53kg)。在多數(shù)動(dòng)物中，皺胃含有凝固的牛奶，在瘤胃中發(fā)現(xiàn)一些稻草。沒(méi)有跡象表明攝取了有毒植物，例如羊齒植物。所有56個(gè)病例中的主要的病理形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)是在多個(gè)器官和組織中有嚴(yán)重急性出血。88%的動(dòng)物顯示出皮膚和皮下組織中的多病灶瘀點(diǎn)性至瘀斑性出血。在一些具有嚴(yán)重黑糞癥的病例中，在胃腸道的漿膜和粘膜表面上的出血出現(xiàn)得非常頻繁(98%)。此外，心臟、腦膜和骨骼肌中的出血是常見(jiàn)的(多達(dá)84%)。在圖I中顯示了出血的實(shí)例。長(zhǎng)骨和胸骨的骨髓是淡紅色。取決于出血的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度，獸體出現(xiàn)貧血。炎性損傷是另外的散發(fā)性發(fā)現(xiàn)。最經(jīng)常觀察到的是纖維性或化膿性肺炎(合計(jì)27% )和口腔中的病灶性潰瘍性至壞死性炎癥(合計(jì)11% )。另外的病理學(xué)和組織學(xué)發(fā)現(xiàn)列舉于圖2。組織病理學(xué)主要的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)是在56只動(dòng)物中的每一個(gè)的骨髓中有造血組織的明顯的低細(xì)胞至無(wú)細(xì)胞性(圖3)。所有的造血譜系均以相同方式受影響。在一些病例中，仍然保持造血組織的一些島狀物。在這些位置偶然有前體細(xì)胞的病灶性退化和調(diào)亡。間質(zhì)細(xì)胞之間的空間是充血的或填充有勻質(zhì)嗜曙紅性物質(zhì)，或者造血組織被脂肪組織代替。56個(gè)病例中僅有5例(9%)顯示出髓外造血跡象。出血位點(diǎn)未顯示出另外的變化，這將解釋由于之前的組織損傷、例如脈管炎、炎性反應(yīng)或組織破裂而造成的出血傾向。在43%的病例中(n = 24)，隨著淋巴樣濾泡中的調(diào)亡淋巴細(xì)胞數(shù)目的增加或具有小濾泡的脾和淋巴結(jié)的低細(xì)胞性，淋巴組織中的損傷變得明顯。這些變化總結(jié)為淋巴細(xì)胞消減型(lymphocyticdepletion)。偶然的和不常見(jiàn)的發(fā)現(xiàn)是在淋巴組織中存在極少的多核巨大細(xì)胞(n = 2)?？谇坏囊恍冃該p傷中的細(xì)胞炎性反應(yīng)主要由單核細(xì)胞與極少嗜中性粒細(xì)胞組成。同樣，在纖維性肺炎的一些病例中，炎性滲出物由大量的纖維蛋白與極少嗜中性粒細(xì)胞組成。另外的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)也列舉于圖2中。沒(méi)有黃疸或溶血的跡象。在造血或淋巴組織中沒(méi)有見(jiàn)到包涵體。血液病學(xué) 從5個(gè)病例(2、53_56號(hào))可獲得EDTA血液。在所有5個(gè)病例中，血液分析揭示出嚴(yán)重的血小板減少癥(12. 5-82x103細(xì)胞/iil)、中度至嚴(yán)重的白細(xì)胞減少(285-1. 470細(xì)胞/ul)和中度的相對(duì)淋巴細(xì)胞增多(68-96%)。另外，這些病例中的4例顯示出明顯的嗜中性粒細(xì)胞減少(粒細(xì)胞減少，1-4% )。3個(gè)病例為貧血。2個(gè)病例的血細(xì)胞比容仍然介于生理限值。詳細(xì)的血液學(xué)結(jié)果顯示于表2。毒理學(xué)病例號(hào)8和25的尿和腎組織的毒理學(xué)篩選未顯示沒(méi)有諸如三氯乙烯、抗凝劑或磺胺的物質(zhì)的攝取的跡象。使用HPLC方法在病例號(hào)23、34和36的尿和肝樣品中未檢出抗生素呋喃唑酮。然而，在病例號(hào)23和34中發(fā)現(xiàn)了安乃近(metamizol),在病例號(hào)36中發(fā)現(xiàn)了磺胺二甲嘧啶與甲氧芐啶的組合。分析這些結(jié)果是死亡前短時(shí)間內(nèi)的藥物施用造成的。另外，使用檢測(cè)DCVC及其代謝物N-乙?；?DCVC的特定方法分析收集自2個(gè)病例的尿和血液樣品產(chǎn)生了陰性結(jié)果。收集自一個(gè)農(nóng)場(chǎng)的稻草的狀況提示可能有霉菌污染。然而，未檢測(cè)到真菌毒素。細(xì)胞毒性檢驗(yàn)也顯示出陰性結(jié)果。微生物培養(yǎng)物就潛在的致病細(xì)菌的存在測(cè)試了所有患出血疾病的小牛病例。在一些病例中，檢測(cè)到一種以上的試劑。在腸和其它器官中最常檢測(cè)到的是大腸桿菌(n = 29)，其次是產(chǎn)氣莢膜梭菌(C. perfringens) (n = 14)。在少數(shù)病例中發(fā)現(xiàn)多殺巴氏桿菌(P. multocida)(n = 3)和綠膿桿菌(P. aeruginosa) (n = 3)。僅在一只動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)溶血性曼氏桿菌(M. haemolytica)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、諾卡氏菌屬(Nocardia spp.)和腸道沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)(每個(gè)都是n = 1)。在16個(gè)病例中未檢測(cè)到細(xì)菌病原體。26例具有出血性疾病的小牛顯示出另外的炎性損傷(圖2)。最經(jīng)常觀察到的是肺炎(n = 15)。在9個(gè)病例的肺組織中分離了大腸桿菌。在I個(gè)病例的肺組織中檢測(cè)到多殺巴氏桿菌(P. multocida)和綠膿桿菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)和S. uberis,或諾卡氏菌屬(Nocardia spp.)。在其它3例具有肺炎的肺組織中，未分離到病原體。在3個(gè)病例中診斷出由于大腸桿菌(n = 2)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(n = I)感染造成的腸炎。病毒學(xué)就BVDV和BTV測(cè)試了所有具有出血性疾病的動(dòng)物。對(duì)于這些病毒試劑未顯示出病毒抗原或病毒基因組的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。使用具有圓環(huán)病毒基因組的ORF-Vl中的結(jié)合位點(diǎn)的引物，通過(guò)巢式寬譜？0 ，就圓環(huán)病毒DNA的存在研究了從25個(gè)病例(第1，2，4-13，15-22，31，34，41，42，45號(hào))收集的器官組織。在測(cè)定為陽(yáng)性的樣品中，瓊脂糖凝膠電泳揭示了具有預(yù)期長(zhǎng)度大約350bp的帶。圖4顯示了 2號(hào)病例的陰性骨髓樣品(泳道3)，當(dāng)分析血液時(shí)，形成了具有預(yù)期大小的強(qiáng)烈的帶(泳道4)。 在4號(hào)病例中，骨髓、肝、腎和血液是陽(yáng)性的(泳道5-8)。當(dāng)研究收集自其它小牛的樣品時(shí)，檢測(cè)到了較弱的帶(泳道9、10和12);其它的保持為陰性(泳道11)?？傆?jì)，研究組的25個(gè)病例中的5例(第2，4，5，717號(hào))和8個(gè)對(duì)照中的I例在圓環(huán)病毒PCR中經(jīng)測(cè)定為陽(yáng)性。測(cè)序了 3個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物(小牛編號(hào)2，4和17)，當(dāng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的PCV2的核苷酸序列比較時(shí)，獲得了 99%的同一性。在所研究的25個(gè)樣品中，在圓環(huán)病毒特異性PCR中測(cè)定為陽(yáng)性的5例樣品以及從測(cè)定為陰性的樣品中隨機(jī)選擇的4例被送往另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室；常規(guī)使用的PCV2特異性PCR程序揭示所有病例均為陰性結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。PCV2_Ha08株的全基因組序列分析基于PCR產(chǎn)物的序列，產(chǎn)生了反向引物，其能夠擴(kuò)增存在于4號(hào)病例(以骨髓、肝、腎和血液測(cè)定為陽(yáng)性)的樣品中的完整的圓環(huán)病毒基因組。這個(gè)株被稱(chēng)作PCV2-Ha08并進(jìn)行了完整測(cè)序。PCV2-Ha08基因組的長(zhǎng)度為1768個(gè)核苷酸。序列分析揭示出與PCV2 Rep和衣殼蛋白以及與0RF3的產(chǎn)物具有相似性的3個(gè)0RF。在非編碼區(qū)I (NCRl)中存在莖環(huán)結(jié)構(gòu),大小為Ilbp并包含保守性九聚體的序列。PCV2_Ha08基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列的序列相似性搜索揭示出與PCV2分離體DK558control (EF565365)(源自丹麥的一頭豬)的最高程度的同一性(99% )。推導(dǎo)的R印、Cap和0RF3產(chǎn)物的氨基酸序列與所選擇的豬和牛圓環(huán)病毒的比較揭示出68. 5%至100%的同一性(表3)。在所有的病例中，PCV2-Ha08與PCV2b株密切相關(guān)并顯示出與分離體DK558control (EF565365)的最高百分率的同一性。使用PCV2_Ha08、牛圓環(huán)病毒(AF109397)、10種具有最高序列相似性的圓環(huán)病毒(通過(guò)BLAST檢索確定)和3個(gè)確定PCV2a、PCV2b和PCV2c亞型的參考株(Segales等人，2008)的全基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析。如系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所示(圖6)，PCV2-Ha08在PCV2b亞型內(nèi)明顯地簇集；然而，其在該組內(nèi)形成單獨(dú)的分支。與此相反，牛圓環(huán)病毒(AF109397)，其之前被描述為感染加拿大的小牛，與PCV2a —起簇集。在圖7和序列表中顯示了 PCV2_Ha08的3個(gè)開(kāi)放閱讀框的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO :1，2，3 和 4)。PCV2-Ha09 和 PCV2_HalO 的分離根據(jù)上文描述的程序(見(jiàn)“圓環(huán)病毒全基因組的擴(kuò)增”部分)獲得了另外兩個(gè)分離體。
從死于牛新生兒全血細(xì)胞減少癥(BNP)癥狀的來(lái)自巴伐利亞的小牛的血液獲得的分離體被稱(chēng)作PCV2-Ha09，并被完整測(cè)序。與PCV2_Ha08株相似，PCV2_Ha09基因組具有1768個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度并包含與PCV2-R印和衣殼蛋白以及與0RF3的產(chǎn)物具有相似性的3個(gè)ORF。也是死于BNP的來(lái)自Saxonia的小牛的肺和腦的分離體被稱(chēng)作PCV2_HalO，并被完整測(cè)序。PCV2-HalO基因組具有1767個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，與PCV2_Ha08和PCV2_Ha09 —樣，包含與PCV2-Rep和衣殼蛋白以及與0RF3的產(chǎn)物具有相似性的3個(gè)0RF。PCV2-Ha09和PCV-HalO的核苷酸序列以及PCV2_Ha09與PCV-HalO各自的3個(gè)開(kāi)放閱讀框的氨基酸序列顯示于圖8和9以及序列表中(PCV2-Ha09 SEQ ID NOs. 7，8，9和10 ；PCV2-HalO SEQ ID NOs. 11，12，13 和 14)。免疫組織化學(xué)
(IHC)，以檢測(cè)PCV2抗原。I號(hào)病例的僅單一骨髓細(xì)胞顯示出輕微的免疫反應(yīng)活性(圖5)。3號(hào)病例的所有組織和I號(hào)病例的淋巴組織對(duì)于PCV2抗原是陰性的。牛中的PCV2特異性抗體的檢測(cè)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)于受牛新生兒全血細(xì)胞減少癥(BNP)影響的小牛中的PCV2的檢測(cè)提出了關(guān)于其在BNP病理發(fā)生中的作用的問(wèn)題。如果PCV2是BNP的病理發(fā)生中的主要參與者，則人們應(yīng)該能夠在受影響的獸群中檢測(cè)到PCV2特異性抗體應(yīng)答。我們嘗試了通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性方法檢測(cè)牛中的PCV2特異性抗體將以PCV2-0RF2-抗原包被的ELISA平板與PBS中的血清稀釋物(1/2，1/20，1/200，1/2000,1/20000)在37°C在濕室中溫育90分鐘。以PBS潤(rùn)洗測(cè)試板3次。在PBS中按1/500稀釋綴合于辣根過(guò)氧化物酶的抗-PCV2單克隆抗體(mab)，并加入至測(cè)試板中。在濕室中在37°C再溫育90分鐘。以PBS潤(rùn)洗測(cè)試板之后，加入底物(TMB/H202)。通過(guò)加AH2SO4終止顯色，在450nm測(cè)定光密度(OD)。作為參照，包括了兩個(gè)商業(yè)化試劑盒(Synbiotics, Ingenasa)的陽(yáng)性對(duì)照。不含血清的孔(PBS)作為陰性對(duì)照。其中包括了 2例PCV2陰性豬仔的血清、5例PCV2陽(yáng)性豬仔的血清和3例來(lái)自受BNP影響的獸群的牛的血清。結(jié)果總結(jié)于圖10。從1/20的稀釋度開(kāi)始，PCV2陰性和陽(yáng)性的豬血清被清楚地分辨。來(lái)自受BNP影響的獸群的3例牛血清以劑量依賴(lài)性方式抑制PCV2特異性mab的結(jié)合。雖然沒(méi)有觀察到如豬血清那樣的完全抑制，但是抑制超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照物(例如Ingenasa PC OD = 0. 343)。這些數(shù)據(jù)高度指明了牛中的PCV2特異性免疫應(yīng)答。討論在此，我們描述了小牛的出血性疾病(HD，也稱(chēng)作出血性疾病綜合征(HDS)和牛新生兒全血細(xì)胞減少癥(BNP))，其可通過(guò)以下臨床、病理和組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)與其它出血區(qū)別開(kāi)最顯著的臨床跡象是自發(fā)性經(jīng)皮膚的出血而無(wú)明顯損傷，粘膜表面的出血和與標(biāo)準(zhǔn)管理程序相關(guān)的過(guò)量出血。與此一致，出血性疾病在幼牛出生的頭一個(gè)月內(nèi)顯現(xiàn)。在所有病例中發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓低常增生(hypoplasia)，以至再生障礙(aplasia)。血液學(xué)結(jié)果在這些動(dòng)物中的5只中表明了再生障礙性全血細(xì)胞減少癥，這支持上述發(fā)現(xiàn)。由此造成的血小板減少癥引起的出血性疾病被認(rèn)為代表了疾病的主要致病機(jī)理。此外，血液學(xué)結(jié)果揭示了中度至嚴(yán)重的白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞減少。該發(fā)現(xiàn)與所有動(dòng)物中觀察到的嚴(yán)重的骨髓枯竭和43%動(dòng)物中的淋巴組織消減是一致的。推測(cè)增殖性淋巴細(xì)胞的缺乏引起了免疫抑制。這可以解釋損傷的頻發(fā)，例如肺炎和潰瘍性口炎以及這些損傷中的一些中的炎性細(xì)胞的缺乏。在骨髓破壞之后，臨床跡象的出現(xiàn)將很大程度上取決于血液細(xì)胞、尤其是血小板在循環(huán)中的半衰期。由于牛紅細(xì)胞的壽命長(zhǎng)，為120天，貧血不那么顯著，除非并發(fā)出血(Loesch等人，2000，Valli，2007)。血小板的壽命僅有9天，嗜中性粒細(xì)胞在循環(huán)中的半衰期僅8_9h，更短(Paape等人，2003，Valli, 2007)。考慮到這些因素，我們假設(shè)破壞性損傷可能發(fā)生于新生小牛中。為了檢測(cè)HD的病因?qū)W，研究了牛中的由于血小板減少造成的出血的數(shù)個(gè)誘因。在西門(mén)塔爾牛中描述了遺傳性出血性體質(zhì)，其被稱(chēng)作西門(mén)塔爾遺傳性血小板病。其是由血小板的顯著功能失調(diào)引起的(Steficek等人，1993)。在多數(shù)病例中西門(mén)塔爾牛受到影響，但是兩頭荷蘭乳牛顯示出等同的損傷。在德國(guó)南部，西門(mén)塔爾牛是最常見(jiàn)的品種，因此，在本研究中可能過(guò)度表現(xiàn)。不同品種中該疾病的不同的臨床表現(xiàn)和系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明沒(méi)有常染色體顯性或隱性遺傳病。然而，該研究中的動(dòng)物數(shù)目目前不足以達(dá)到確定性結(jié)論。、
由于血小板減少，非細(xì)胞病變2型BVDV感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重的出血傾向(Ellis等人，1998，Rebhun等人，1989)。目前認(rèn)為骨髓的成熟庫(kù)的減少、循環(huán)的血小板數(shù)目的減少和改變的血小板功能造成出血(Ellis等人，1998，Walz等人，2001，Wood等人，2004)。然而，骨髓細(xì)胞構(gòu)成在BVDV感染中不減少。與此相反，在本研究中報(bào)告的病例中持續(xù)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓消減。此外，在所研究的任何小牛中未檢測(cè)到BVDV。根據(jù)這一點(diǎn)，似乎可合理排除BVDV感染。已知數(shù)種毒素和真菌毒素在牛中引起出血?；疾⌒∨５牟∈泛完P(guān)于動(dòng)物飼養(yǎng)的信息給出了個(gè)體病例中可能的中度情況的一些指示，例如，真菌毒素或藥物。然而，在適用于所有受影響的農(nóng)場(chǎng)并對(duì)懷疑特定毒素給出理由的所給出的信息中沒(méi)有一致性。但是，進(jìn)行了毒素的一些隨機(jī)測(cè)試，其保持陰性。特別地，S-(I，2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸(DCVC)或呋喃唑酮中毒(二者都引起骨髓再生障礙和出血)，適于所觀察到的損傷。向小牛喂飼的以三氯乙烯提取的大豆油柏在較高劑量時(shí)產(chǎn)生致命性再生障礙性貧血和腎損傷。DCVC——三氯乙烯的代謝物，是該實(shí)體中的毒性因子。在實(shí)驗(yàn)中，施用10天的低劑量的DCVC (0. 4mg/kg/天，i.v.)導(dǎo)致骨髓的明顯的非細(xì)胞性和廣泛出血(Lock等人，1996)。目前，己烷被用于替代三氯乙烯用于提取大豆油。就三氯乙烯、DCVC及其代謝物N-乙?；?DCVC檢測(cè)總共4頭小牛的血液、腎組織和尿，產(chǎn)生了陰性結(jié)果?？股剡秽蛲糜谥委熁蝾A(yù)防人類(lèi)和動(dòng)物中的細(xì)菌和原蟲(chóng)感染。由于嚴(yán)重骨髓消減，在實(shí)驗(yàn)中，向喂奶小牛施用的每日劑量為4. 0至8. Omg/kg體重的呋喃唑酮產(chǎn)生致命性出血體質(zhì)(Hoffmann-Fezer等人，1974,Hofmann等人，1974)。根據(jù)國(guó)家委員會(huì)的規(guī)定，向產(chǎn)生食物的動(dòng)物施用呋喃唑酮被禁止?？傊?，研究了3頭受影響的小牛，就呋喃唑酮而言被證明是陰性的。羊齒植物[歐洲蕨(Pteridium aquiIinum)]的攝取在食草動(dòng)物中引起中毒癥狀。牛中的急性羊齒植物中毒產(chǎn)生不可逆的骨髓低常增生，導(dǎo)致再生障礙性全血細(xì)胞減少癥。慢性攝取導(dǎo)致地方性動(dòng)物血尿癥并且與下尿道和消化道中的腫瘤相關(guān)(Maxie andNewman, 2007, Valli, 2007) 同樣，在反芻動(dòng)物和馬中描述了蕨類(lèi)真菌毒素中毒為全血細(xì)胞減少疾病(Harrach等人，1983，Valli，2007)。羊齒植物中毒和葡萄穗霉屬中毒似乎在這些病例中是不可能的，因?yàn)榘Y狀應(yīng)該在所有年齡的動(dòng)物中出現(xiàn)，尤其是那些喂以含粗糙食物的食品的動(dòng)物。在本研究中，飼料樣品對(duì)于真菌毒素測(cè)定為陰性，也沒(méi)有表明小?；蚰概?duì)羊齒植物的攝取。特發(fā)性血小板減少性紫癜被描述為母牛中的罕見(jiàn)病況(Yeruham等人，2003)。該自身免疫疾病的誘因可能是免疫介導(dǎo)的血小板破壞(Lunn and Butler，1991)。已報(bào)告的血小板減少性紫癜與近期的多價(jià)肉毒中毒類(lèi)毒素接種或分別針對(duì)乳頭瘤病毒和梭狀芽胞桿菌的滅活疫苗相關(guān)(Lunn and Butler, 1991, Yeruham等人,2003)。本研究中的小牛未經(jīng)接種。此外，母牛中骨髓破壞的發(fā)生與所描述的免疫介導(dǎo)的血小板減少不相一致。已知B或E型多殺巴氏桿菌感染在小牛中引起出血性敗血病(Rimler，1978)。內(nèi)毒素在該感染的病理發(fā)生中發(fā)揮重要作用(Horadagoda等人，2001)。在本研究中，僅在3頭小牛中存在多殺巴氏桿菌。未進(jìn)行分型。在我們的研究中，器官樣品的微生物研究揭示出患病小牛中的寬譜的潛在致病細(xì)菌。然而，未發(fā)現(xiàn)與出血性疾病相關(guān)的特定致病細(xì)菌的一致性證據(jù)。在29%的病例中(n= 16)，未檢測(cè)到致病性細(xì)菌。在17頭小牛中，分離的細(xì)菌與另外的炎性損傷、例如肺炎或腸炎相關(guān)?？梢约僭O(shè)這些小牛中的淋巴組織和骨髓的消減導(dǎo)致了嚴(yán)重的與免疫抑制和次級(jí)感染相關(guān)的白細(xì)胞減少及粒細(xì)胞減少。
使用PCR，在一些臨床患病的小牛中檢測(cè)到了圓環(huán)病毒。目前，尚未令人信服地描述牛中的圓環(huán)病毒感染。關(guān)于圓環(huán)病毒特異性抗體的血清學(xué)研究產(chǎn)生了矛盾的結(jié)果(Allan等人，2000，Ellis等人，2001，Tischer等人，1995)。僅有一篇論文顯示了可以在牛的肺組織和胎兒中檢測(cè)到與PCV2密切相關(guān)的圓環(huán)病毒(Nayar等人，1999)。PCR結(jié)果的分析有時(shí)是困難的，尤其是就DNA污染而言。然而，在我們的研究中，我們使用了嚴(yán)格的方案以排除實(shí)驗(yàn)室的DNA污染。從I例樣品成功擴(kuò)增了完整PCV2基因組，這駁斥了短的PCR產(chǎn)物的污染。常規(guī)PCV2特異性PCR程序的陰性結(jié)果可以這樣解釋相對(duì)于寬譜PCR的巢式程序，該程序的靈敏性較低。圓環(huán)病毒PCV2_Ha08的全基因組序列分析揭示了與PCV2b的密切關(guān)系。源自牛組織的唯一圓環(huán)病毒序列(Nayar等人，1999)(可從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得)也與PCV2密切相關(guān)。然而，詳細(xì)分析顯示兩個(gè)株簇集進(jìn)入不同的亞型，因此，排除了能夠感染牛的獨(dú)特的PCV2株的存在。同時(shí)，分離了另外兩個(gè)株P(guān)CV2-Ha09和PCV2-HalO。圓環(huán)病毒一般被認(rèn)為具有窄的宿主范圍，詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)生分析表明了圓環(huán)病毒與它們的宿主的嚴(yán)格的共進(jìn)化(Johne等人，2006)。然而，對(duì)于PCV2，已經(jīng)描述了稍有不同的進(jìn)化和流行病學(xué)式樣，其與該病毒以前的有限傳播的延長(zhǎng)的時(shí)間段、然后是該病毒的最近的世界范圍內(nèi)的擴(kuò)散是一致的(Hughes and Piontkivska, 2008)?？梢酝茰y(cè)PCV2已經(jīng)獲得了特定的允許迅速擴(kuò)散的性質(zhì)，并且在極少病例中，跨越物種屏障而傳播。另外，在來(lái)自對(duì)照組的小牛之一中檢測(cè)到了 PCV2。對(duì)照動(dòng)物已經(jīng)被送去進(jìn)行病理學(xué)檢查以確定除了出血性疾病以外的原因。PCV2與豬中的不同癥狀和疾病相關(guān)。據(jù)此可以推測(cè)圓環(huán)病毒造成小牛中的數(shù)種疾病。還可以想象具有HD的小牛中的免疫抑制增強(qiáng)對(duì)其它感染的易感性。在本例中，小牛中的PCV2檢測(cè)可以反映出機(jī)會(huì)性感染。最后，眾所周知的是，圓環(huán)病毒感染可能在不同的時(shí)間段、或甚至在被感染個(gè)體的終身維持臨床隱性。圓環(huán)病毒感染將與很多所觀察到的臨床跡象一致，因?yàn)槎鄶?shù)圓環(huán)病毒引起淋巴細(xì)胞消減，相關(guān)的CIAV也在被感染的雞中引起再生障礙性貧血和出血。然而，在我們的研究中，使用可用的診斷方法，在所有臨床病例中都未檢出PCV2。同樣，通過(guò)PCR進(jìn)行的檢測(cè)不一定意味著被復(fù)制性病毒感染。然而，在一些個(gè)體骨髓細(xì)胞中通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到PCV2抗原指示著病毒基因組表達(dá)和復(fù)制。表格表I :動(dòng)物病例和對(duì)照組的特性，包括通過(guò)PCR檢測(cè)圓環(huán)病毒基因組序列和最終的
診斷
權(quán)利要求
1.圓環(huán)病毒(CV)核酸分子,其包含 (a)如SEQID NO 1所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 7所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
3.權(quán)利要求I的核酸分子，其包含 (a)如SEQID NO 11所示的序列或其片段；和/或 (b)根據(jù)(a)的核苷酸序列的互補(bǔ)物。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述片段包含SEQID N0:l、7或11所示的至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)物。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的核酸分子 (a)與SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同一性； (b)在嚴(yán)格條件下與SEQID NO :1、7或11所示的核苷酸序列雜交；或 (c)(a)或(b)的互補(bǔ)物。
6.編碼CV多肽或其片段的CV核酸分子，其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 1所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補(bǔ)物； (b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)于(a)的序列的核苷酸序列；或 (c)根據(jù)(a)或(b)的核苷酸序列的片段。
7.權(quán)利要求6的CV核酸,其中所述核酸分子包含 (a)如SEQID NO 7所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸51-995 (Itep)(ii)核苷酸1034-1735 (Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3)； 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補(bǔ)物 (b)如SEQID NO 11所示的核苷酸序列的區(qū)域(i)核苷酸51-995 (Itep) (ii)核苷酸1033-1734(Cap) (iii)核苷酸357-671 (ORF3);或 和/或⑴、(ii)和/或(iii)的互補(bǔ)物 (c)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)對(duì)應(yīng)于(a)或(b)的序列的核苷酸序列；或 (d)根據(jù)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的片段。
8.權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的核酸分子，其中所述多肽或其片段包含如SEQID NO2-4,8-10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)或至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。
9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的CV核酸，其編碼與SEQID NO =2-4,8-10或12-14所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%同一丨I"生的多肽。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的核酸分子，其可操作地連接于異源表達(dá)控制序列。
11.以權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的非人宿主細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子，其用作診斷劑。
13.權(quán)利要求12的核酸分子，其攜帶報(bào)告基團(tuán)。
14.權(quán)利要求12或13的核酸分子，其用于診斷出血性體質(zhì)(HD)。
15.權(quán)利要求14的核酸分子，其用于診斷牛中的HD。
16.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子，其用作治療劑。
17.權(quán)利要求16的核酸分子，用于預(yù)防和/或治療HD。
18.權(quán)利要求16或17的核酸分子，用于預(yù)防和/或治療牛中的HD。
19.權(quán)利要求16-18任一項(xiàng)的核酸分子,其作為基于核酸的疫苗或用于產(chǎn)生基于多肽的疫苗。
20.由根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子編碼的多肽。
21.圓環(huán)病毒(CV)多肽，其包含 (a)選自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 2 (Rep)， (ii)氨基酸序列SEQ ID NO 3(Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 4(ORF3);或 (b)其片段。
22.權(quán)利要求21的圓環(huán)病毒(CV)多肽，其包含 (a)選自下列的氨基酸序列 ⑴氨基酸序列SEQ ID NO 8和12 (Rep)，(ii)氨基酸序列SEQ ID NO 9 和 13 (Cap)， (iii)氨基酸序列SEQ ID NO 10 和 14(ORF3);或 (b)其片段。
23.權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)的多肽，其包含如SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示任意氨基酸序列的至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)或至少30個(gè)連續(xù)氨基酸。
24.權(quán)利要求20-23的多肽，其與SEQID NO :2-4、8_10或12-14所示的氨基酸序列的任意項(xiàng)具有至少90 %、至少92 %、至少94%、至少96 %、至少98 %或至少99 %的同一性。
25.權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的多肽，其用作診斷劑。
26.權(quán)利要求25的多肽，其攜帶報(bào)告基團(tuán)。
27.權(quán)利要求25或26的多肽，其用于診斷HD，特別是牛中的HD。
28.權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的多肽，其用作免疫原。
29.權(quán)利要求28的多肽，其用于產(chǎn)生抗-CV抗體。
30.權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的多肽，其用于預(yù)防和/或治療HD，特別是牛中的HD。
31.權(quán)利要求30的多肽，其用作疫苗。
32.針對(duì)權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段。
33.權(quán)利要求32的抗體，其特異于CV株P(guān)CV2-Ha08。
34.權(quán)利要求32或33的抗體，其用作診斷劑。
35.權(quán)利要求32或33的抗體，其用于預(yù)防和/或治療HD，特別是牛中的HD。
36.包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子的圓環(huán)病毒。
37.權(quán)利要求36的病毒，其是滅活的圓環(huán)病毒。
38.權(quán)利要求37的病毒，其是減毒的圓環(huán)病毒。
39.包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的核酸分子、或權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的多肽、權(quán)利要求32或33的抗體、或權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的病毒，以及可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑的組合物。
40.權(quán)利要求39的組合物，其是疫苗。
41.權(quán)利要求40的組合物，其是基于多肽的疫苗。
42.權(quán)利要求40的組合物，其是基于病毒的疫苗。
43.權(quán)利要求39的組合物，其是免疫原性組合物。
44.權(quán)利要求43的組合物，其是基于多肽的免疫原性組合物。
45.權(quán)利要求43的組合物，其是基于病毒的免疫原性組合物。
46.權(quán)利要求39-45任一項(xiàng)的組合物，其用于診斷用途。
47.權(quán)利要求39-45任一項(xiàng)的組合物，其用于治療用途。
48.診斷HD、特別是牛中的HD的方法，其包括 將來(lái)自待診斷的受試者的樣品與權(quán)利要求46的診斷組合物接觸，并測(cè)定所述樣品中CV或抗-CV抗體的存在和/或數(shù)量。
49.預(yù)防或治療HD、特別是牛中的HD的方法，其包括 向有此需要的受試者施用有效量的權(quán)利要求47的治療組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及作為牛中的骨髓再生障礙伴出血性疾病的誘因劑的新的圓環(huán)病毒(CV)。本發(fā)明提供了用于診斷和治療用途的新的核酸和蛋白序列。
文檔編號(hào)C07K14/01GK102711816SQ201080047391
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者B·沙德, E·凱普, H·米勒, J·伯切爾, M·Y·哈拉米 申請(qǐng)人:動(dòng)物健康服務(wù)拜恩非營(yíng)利組織, 萊比錫大學(xué)