專利名稱：Dll4結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人治療，特別是癌癥治療的領(lǐng)域以及適用于該治療中的藥物及組合物。
背景技術(shù)：
如US 2008/0014196中所概述，血管生成牽涉在包括實體瘤及轉(zhuǎn)移的很多疾病的發(fā)病機(jī)制中。在腫瘤生長的情況下，血管生成對于自增生轉(zhuǎn)變?yōu)榱鲂纬杉皩τ跒槟[瘤生長及轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的(Folkman等人，Nature 339-58 (1989)),這使腫瘤細(xì)胞相比于正常細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢。因此，抗血管生成治療已成為若干類型腫瘤的重要治療選擇。這些治療已集中于阻斷VEGF路徑(Ferrara等人,Nat Rev Drug Discov. 2004年5月； 3(5) :391-400)。Notch信號傳導(dǎo)路徑對細(xì)胞與細(xì)胞間的通信至關(guān)重要，該路徑涉及控制胚胎發(fā)育期間及成人有機(jī)體中多種細(xì)胞分化過程的基因調(diào)控機(jī)制。Notch信號傳導(dǎo)在許多癌癥中，例如在T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病中及在實體腫瘤中調(diào)控異常(Sharma等人2007，CellCycle 6 (8) : 927-30 ；Shih 等人，Cancer Res. 2007 年 3 月 I 日；67 (5) : 1879-82)。Dl 14 (或Delta樣4或Delta樣配位體4)為Notch配位體的Delta家族成員。Dl 14的細(xì)胞外域由N-末端域、Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)域，和一串八個表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)構(gòu)成。一般而言，認(rèn)為EGF域包含氨基酸殘基218-25UEGF-I ;域I)、252_282 (EGF-2 ；域 2)、284-322 (EGF-3 ；域 3)、324-360 (EGF-4 ;域 4)和 362-400 (EGF-5 ;域 5)，同時 DSL域在hD114的約氨基酸殘基173-217處，并且N-末端域在約氨基酸殘基27-172處(W02008/076379)。已報導(dǎo)D114由血管內(nèi)皮高度選擇性表達(dá)，特別是在動脈內(nèi)皮中高度選擇性表達(dá)(Shutter 等人(2000)Genes Develop. 14:1313-1318)。近來在小鼠中的研究已顯示，D114由VEGF誘導(dǎo)且為限制血管萌芽及分枝的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。與此作用一致，缺失或抑制D114會導(dǎo)致血管生成過度(Scehnet等人，Blood. 2007年6月I日;109 (11) :4753-60)。這種不受限制的血管生成由于非生產(chǎn)性(non-productive)血管的形成而反常地減緩腫瘤生長，即使在對抗VEGF治療具有抗性的腫瘤中也是如此(Thurston等人，Nat Rev Cancer. 2007年5 月；7(5) :327-31 ；W0 2007/070671 ；Noguera-Troise 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122))。此外，已證明在多個腫瘤類型的異種移植模型中，相比于單獨的抗VEGF，VEGF與D114的組合抑制會提供優(yōu)越的抗腫瘤活性(Noguera-Troise等人,Nature. 2006年12月21 日；444 (7122) : 1032-7 ；Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444 (7122) : 1083-7)。由于這些結(jié)果，D114被視為ー種用于癌癥治療的有希望的靶點，且已公開處于臨床(前)研發(fā)中的若干靶向于D114的生物化合物REGN-421 (=SAR153192 ；Regeneron,Sanofi-Aventis ；W0 2008076379)及 0PM-21M18(OncoMed) (Hoey 等人，Cell StemCell. 2009 年 8 月 7 日；5 (2) : 168-77)，兩者均為完全人 D114 抗體；YW152F (Genentech)，一種人化 D114 抗體(Ridgway 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122) : 1083-7)；D114-Fc (Regeneron, Sanofi-Aventis), 一種由 D114 細(xì)胞外區(qū)域及人 IgGl 的 Fe 區(qū)域構(gòu)成的重組融合蛋白(Noguera-Troise 等人，Nature. 2006 年 12 月 21 日；444(7122)) 然而，現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體(MAb)及融合蛋白鑒于其治療應(yīng)用具有若干缺點為了防止其降解，其必須儲存在接近冰點的溫度。此外，因為其在消化道中快速消化，所以其不適于ロ服給藥。MAb用于癌癥治療的另一主要限制為轉(zhuǎn)運不良，這導(dǎo)致濃度較低以及不能靶向于腫瘤中的所有細(xì)胞。鑒于以上所述，本發(fā)明的ー個目標(biāo)在于提供用于人治療的改良的D114結(jié)合分子。這些D114結(jié)合分子或D114拮抗劑適用作預(yù)防、治療、減輕和/或診斷與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病或病癥的組合物中的藥理學(xué)活性剤。這些疾病的實例為癌癥和眼病，包括與年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)及糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)。本發(fā)明的另ー個目標(biāo)在于提供預(yù)防、治療、減輕和/或診斷這些疾病、病癥或癥狀的方法，其涉及使用和/或給予這些藥劑及組合物。特別地，本發(fā)明的ー個目標(biāo)在于提供所述藥理學(xué)活性劑、組合物和/或方法，其相比于當(dāng)前使用的和/或本領(lǐng)域中已知的藥物、組合物和/或方法可提供某些優(yōu)勢。尤其相比于如上所述的常規(guī)抗D114抗體或其片段，這些優(yōu)勢包括改良的治療性質(zhì)和/或藥理學(xué)性質(zhì)和/或其他例如對于制造目的而言為有利的性質(zhì)。更特別地，本發(fā)明的ー個目標(biāo)在于提供新的D114結(jié)合分子和/或含有其的多肽，且具體為結(jié)合至哺乳動物D114、尤其是人D114的D114結(jié)合分子，其中所述分子或多肽適用于如本文所述的治療及診斷目的。本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供特異性結(jié)合D114的免疫球
蛋白單一可變域。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)第一方面，提供Dl 14結(jié)合分子，優(yōu)選Dl 14結(jié)合免疫球蛋白單一可變域，如VHH及VH。在另一方面中，本發(fā)明涉及編碼D114結(jié)合分子的核酸以及含有所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及ー種產(chǎn)品或組合物，其含有或包含至少ー種本發(fā)明的D114結(jié)合分子以及任選地含有或包含這些組合物的ー種或多種其它組分。本發(fā)明還涉及制備或產(chǎn)生本文所述的D114結(jié)合分子、核酸、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品及組合物的方法。本發(fā)明還涉及本文所述D114結(jié)合分子、核酸、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品及組合物的應(yīng)用及用途，以及預(yù)防和/或治療與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病及病癥的方法。本發(fā)明的這些及其他方面、實施方案、優(yōu)勢及應(yīng)用將由下文進(jìn)ー步描述而變得明確。定義除非另有指示或定義，否則所有所用術(shù)語均具有本領(lǐng)域中的通常含義，該含義將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊■，如Sambrook等人，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual7，、弟 2 版)，弟 1-3 巷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989) ；Lewin, “Genes IV”，Oxford University Press, New York, (1990);及 Roitt等人，“ Immunology”(第 2 版)，Gower Medical Publishing, London, New York (1989),以及本文中引用的一般現(xiàn)有技木；此外，除非另有說明，否則未具體詳述的所有方法、步驟、技術(shù)及操作均可以且已經(jīng)以本身已知的方式進(jìn)行，該方式將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。亦參考例如標(biāo)準(zhǔn)手冊、上述一般現(xiàn)有技術(shù)及其中引用的其他參考文獻(xiàn)。除非另有說明，否則術(shù)語“免疫球蛋白”在本文中無論是指重鏈抗體還是指常規(guī)4鏈抗體，均用作一般術(shù)語以包括全長抗體、其單個的鏈以及其所有部分、域或片段。除非另有說明，否則術(shù)語“D114結(jié)合分子”包括抗D114抗體、抗D114抗體片段、“抗D114抗體樣分子” 及與任何上述物質(zhì)的綴合物?？贵w包括但不限于單克隆抗體及嵌合單克隆抗體。術(shù)語“抗體”包括通過于宿主細(xì)胞中重組表達(dá)產(chǎn)生的完全免疫球蛋白(如單克隆抗體)、以及D114結(jié)合抗體片段或“抗體樣分子”，包括單鏈抗體及線型抗體，例如公開于TO 02/056910中的所謂的“SMIP” ( “小模塊免疫藥物”)；抗D114抗體樣分子包括如本文定義的免疫球蛋白單一可變域?？贵w樣分子的其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或⑶R移植分子。如本文所用的術(shù)語“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“(単一)可變域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的術(shù)語中)一般應(yīng)理解為既包括相關(guān)氨基酸序列，又包括編碼所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解釋。兩個D114結(jié)合分子序列之間的“序列一致度”指示序列之間相同氨基酸的百分比。其可如WO 08/020079第49及50頁段落f)中所述加以計算或測定。“序列相似度”指示相同或表達(dá)保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。如本文所用的術(shù)語(多肽或蛋白的)“域”是指折疊蛋白結(jié)構(gòu)，其能夠獨立于蛋白的其余部分維持其三級結(jié)構(gòu)。一般而言，域負(fù)責(zé)蛋白的單個的功能性質(zhì)，且在許多情況下可添加、移除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白而不損失蛋白的其余部分和/或域的功能。如本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白域”是指抗體鏈(例如常規(guī)4鏈抗體的鏈或重鏈抗體的鏈)的球形區(qū)域，或是指基本上由這類球形區(qū)域組成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其維持抗體分子的免疫球蛋白折疊特征，其由排列在兩個3折疊片中任選由保守ニ硫鍵穩(wěn)定的約7個反平行P折疊股的2層夾層(sandwich)組成。如本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白可變域”是指基本上由本領(lǐng)域及下文中分別稱為“框架區(qū)I ”或“ FR I ”、“框架區(qū)2 ”或“ FR2 ”、“框架區(qū)3 ”或“ FR3 ”、和“框架區(qū)4 ”或“ FR4 ”的四個“框架區(qū)”組成的免疫球蛋白域；所述框架區(qū)由本領(lǐng)域及下文中分別稱為“互補決定區(qū)I”或“⑶R1”、“互補決定區(qū)2”或“⑶R2”、和“互補決定區(qū)3”或“CDR3，，的三個“互補決定區(qū)”或“CDR”中斷。因此，免疫球蛋白可變域的一般結(jié)構(gòu)或序列可如下表示為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變域正是因具有抗原結(jié)合位點而賦予抗體對抗原的特異性。如本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白單一可變域”是指能夠在不與其他免疫球蛋白可變域配對的情況下特異性結(jié)合抗原的表位的免疫球蛋白可變域。本發(fā)明含義中的免疫球蛋白單一可變域的實例為“域抗體”，例如免疫球蛋白單一可變域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白單一可變域的另ー實例為如下文定義的駱駝科的“ VHH域”(或簡稱為“VHH”)。鑒于以上定義，常規(guī)4鏈抗體(例如本領(lǐng)域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常規(guī)4鏈抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如ニ硫鍵連接的Fv或scFv片段)、或雙特異抗體(均為本領(lǐng)域中已知)的抗原結(jié)合域，通常不視為免疫球蛋白單一可變域，這是因為與抗原的各別表位發(fā)生結(jié)合通常并非通過ー個(単一)免疫球蛋白域，而是通過共同結(jié)合各別抗原的表位的ー對(締合)免疫球蛋白域(例如輕鏈及重鏈可變域)，即通過免疫球蛋白域的VHVL對?！癡HH域”，亦稱為VHH、VhH域、VHH抗體片段，和VHH抗體，已最初描述為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結(jié)合免疫球蛋白(可變)域(Hamers-CastermanC，Atarhouch T, Muyldermans S，Robinson G, Hamers C，Songa EB, Bendahman N，HamersR. : “Naturally occurring antibodies devoid of light chains，，；Nature363，446-448 (1993))。已經(jīng)選擇術(shù)語“VHH域”以將這些可變域與存在于常規(guī)4鏈抗體中的重鏈可變域(其在本文中稱為“VH域”)以及存在于常規(guī)4鏈抗體中的輕鏈可變域(其在本文中稱為“ん域”)進(jìn)行區(qū)分。VH或VL域正常情況下不與作為單ー抗原結(jié)合域的表位結(jié) 合，而與之相反，VHH域可在無其他抗原結(jié)合域下特異性結(jié)合表位。VHH域為由單一免疫球蛋白域形成的小型穩(wěn)定及高效的抗原識別單元。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語VHH域、VHH、VhH域、VHH抗體片段、VHH抗體以及“Nanobody ”及“N Nanobody 域，，(“Nanobody，，為 Ablynx N. V 公司，Ghent,Belgium 的商標(biāo))可互換使用且表示免疫球蛋白單一可變域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的通式結(jié)構(gòu)且無需第二免疫球蛋白可變域的存在即可特異性結(jié)合表位)，且其由例如WO2009/109635圖I中定義的所謂“印記殘基(hallmark residue) ”與VH區(qū)分。源自4鏈抗體，具體地源自人抗體的“ VH域”及“ VL域”(或簡稱為“VH”或“VL”)分別為“單域抗體”，也稱為“域抗體(domain antibodies, Domain Antibodies)”、“Dab” 及“dAb”(術(shù)語“域抗體(Domain Antibodies)，，及“dAbs，，被 GlaxoSmithKline 公司集團(tuán)用作商標(biāo))，已公開于下列文獻(xiàn)中Ward, E. S.，等人“Binding activities of arepertoire of single immunoglobulin variable domains secreted irom Escherichiacoli，，； Nature 341:544-546 (1989) ；Holt, L. J.等人“Domain antibodies:proteins fortherapy” ； TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003);及 WO 2003/002609。單域抗體對應(yīng)于非駱駝科哺乳動物抗體(具體為人抗體)的重鏈或輕鏈的可變域。為了以單ー抗原結(jié)合域形式，即在不分別與VL域或VH域配對的情況下結(jié)合表位，需要例如通過使用人単一 VH或VL域序列的文庫對這些抗原結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行具體選擇。如同VHH的域抗體的分子量為約13kDa至約16kDa，且若源自完全人序列，則不需要進(jìn)行人化以供例如人治療使用。在VHH域的情況下，域抗體在原核表達(dá)系統(tǒng)中也很好地得以表達(dá)，從而顯著降低總制造成本。如例如Riechmann 及 Muyldermans, J. TmmunoI. Methods 231, 25-38 (1999)的圖 2中所示，對于駱駝科的VHH域所應(yīng)用的免疫球蛋白單一可變重域的氨基酸殘基，根據(jù)Kabat等人給出的VH域的一般編號法來編號(“Sequence of proteins of immunologicalinterest”，US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,公開案第 91 號)。根據(jù)該編號法，例如-FRl包含在位置1-30處的氨基酸殘基，-⑶Rl包含在位置31-35處的氨基酸殘基，-FR2包含在位置36-49處的氨基酸，-⑶R2包含在位置50-65處的氨基酸殘基，
-FR3包含在位置66-94處的氨基酸殘基，-⑶R3包含在位置95-102處的氨基酸殘基，且-FR4包含在位置103-113處的氨基酸殘基。如例如WO 2006/040153及WO 2006/122786中所詳述，VHH域可根據(jù)框架區(qū)內(nèi)氨基酸的特定組合而具體分為三個組，即(a) “GLEW組”，也包括“ GLEW樣”序列；(b) “KERE組”，也包括KQRE序列；及(c) “103P，R，S組”，且可進(jìn)ー步由具體的“印記殘基”表征。
“親和力成熟的D114結(jié)合分子”在ー個或多個⑶R中具有ー個或多個變化，所述變化導(dǎo)致對D114的親和カ相比于其各自的親本D114結(jié)合分子有所増加。本發(fā)明的親和カ成熟的D114結(jié)合分子可通過例如由以下所述的本領(lǐng)域中已知的方法來制備Marks 等人，1992，Biotechnology 10:779-783 或 Barbas,等人，1994，Proc.Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813. ；Shier 等人，1995，Gene 169:147-155 ;Yelton 等人，1995，Immunol. 155:1994-2004 Jackson 等人，1995，J. Immunol. 154(7):3310-9 ；及Hawkins 等人，1992，J. MoI. Biol. 226(3) :889896 ;KS Johnson 及 RE Hawkins, “Affinitymaturation of antibodies using phage displayへ Oxford University Press 19%。對于本發(fā)明，若未另有說明，則關(guān)于相關(guān)序列(例如完全免疫球蛋白單一可變域序列或CDR序列)，“SEQ ID NO: X的氨基酸序列”包括a)與各別SEQ ID N0:x中所示序列100%—致的氨基酸序列；b)與各別SEQ ID N0:x中所示序列具有至少80%氨基酸一致性的氨基酸序列；c)與各別SEQ ID N0:x中所示序列具有3個、2個或I個氨基酸差異的氨基酸序列?？苫Q使用的術(shù)語“表位”及“抗原決定簇”是指例如多肽的大分子的一部分，其由抗原結(jié)合分子(例如常規(guī)抗體或本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域)識別，且更具體地由所述分子的抗原結(jié)合位點識別。表位定義免疫球蛋白的最小結(jié)合位點，因而為免疫球蛋白賦予了特異性。如本文所用的術(shù)語“雙互補位(biparatopic)D114結(jié)合分子”或“雙互補位免疫球蛋白單一可變域”是指包含如本文定義的第一免疫球蛋白單一可變域和第二免疫球蛋白單一可變域的D114結(jié)合分子，其中所述分子能夠結(jié)合D114抗原的兩個不同表位。本發(fā)明雙互補位多肽由具有不同特異性的免疫球蛋白單一可變域構(gòu)成?？乖Y(jié)合分子(例如本發(fā)明的抗體或多肽)識別表位的部分稱為互補位?？伞敖Y(jié)合”或“特異性結(jié)合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或抗原表位)、對其“具有親和力”和/或“具有特異性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗體、本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽、或一般為抗原結(jié)合分子或其片段)是指“対抗”或“針對”該表位、抗原或蛋白，或為關(guān)于該表位、抗原或蛋白的“結(jié)合”分子。一般而言，術(shù)語“特異性”是指特定抗原結(jié)合分子或抗原結(jié)合蛋白(例如本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域)分子可結(jié)合的不同類型抗原或表位的數(shù)目?？苫诳乖Y(jié)合分子的親和カ和/或親抗原性(avidity)確定其特異性。由抗原與抗原結(jié)合蛋白的解離平衡常數(shù)(Kd)所表示的親和力，是表位與抗原結(jié)合蛋白上抗原結(jié)合位點之間結(jié)合強(qiáng)度的量度Kd值越小，表位與抗原結(jié)合分子之間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)(或者，親和カ也可表示為親和力常數(shù)(KA)，其為1/Kd)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解(例如基于本文其他公開的內(nèi)容)，取決于具體感興趣的抗原，可以以以本身已知方式測定親和力。親抗原性為抗原結(jié)合分子(例如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽)與相關(guān)抗原之間結(jié)合強(qiáng)度的量度。親抗原性與以下兩者有關(guān)與其抗原結(jié)合分子上的抗原結(jié)合位點之間的親和力，以及存在于抗原結(jié)合分子上的相關(guān)結(jié)合位點的數(shù)目?？乖Y(jié)合分子識別表位的部分稱為互補位。氨基酸殘基將根據(jù)如本領(lǐng)域中公知且達(dá)成一致的標(biāo)準(zhǔn)三字母或一字母氨基酸碼加以指示。在比較兩個氨基酸序列時，術(shù)語“氨基酸差異”是指相比于第二序列，在參考序列某一位置處指定數(shù)目氨基酸殘基的插入、缺失或取代。在取代的情況下，所述取代將優(yōu)選為保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸殘基被化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的另ー氨基酸殘基置換，且其對多肽的功能、活性或其他生物性質(zhì)影響較小或基本上無影響。這些保守氨基 酸取代在本領(lǐng)域中是公知的，例如根據(jù)WO 98/49185，其中保守氨基酸取代優(yōu)選是以下組(i)-(v)內(nèi)的一個氨基酸被同一組內(nèi)的另ー氨基酸殘基所取代(i)較小脂族非極性或弱極性殘基Ala、Ser、Thr、Pro及Gly ； (ii)極性帶負(fù)電殘基及其(不帶電)酰胺Asp、Asn、Glu及Gln ； (iii)極性帶正電殘基His、Arg及Lys ； (iv)較大脂族非極性殘基Met、Leu、lie、Val及Cys ;及(v)芳族殘基Phe、Tyr及Trp。特別優(yōu)選的保守氨基酸取代如下Ala 被 Gly 或 Ser 取代；Arg 被 Lys 取代；Asn 被 Gln 或 His 取代；Asp 被 Glu 取代；Cys 被 Ser 取代；Gln 被 Asn 取代；Glu 被 Asp 取代； Gly 被 Ala 或 Pro 取代；His 被 Asn 或 Gln 取代；Ile 被 Leu 或 Val 取代；Leu 被 Ile 或 Val 取代；Lys 被 Arg、Gln 或 Glu 取代；Met 被 Leu、Tyr 或 Ile 取代；Phe 被 Met、Leu 或 Tyr 取代；Ser 被 Thr 取代；Thr 被 Ser 取代；Trp 被 Tyr 取代； Tyr 被 Trp 或 Phe 取代；Val 被 Ile 或 Leu 取代。例如相比于其天然生物來源和/或獲得該核酸或多肽分子的反應(yīng)介質(zhì)或培養(yǎng)基，在其已與至少ー種在該來源或介質(zhì)(培養(yǎng)基)中其通常與之相關(guān)的其他組分分離時，多肽或核酸分子視為“(呈)基本上分離(的形式)”(所述其他組分例如另ー核酸、另ー蛋白/多肽、另一生物組分或大分子或至少ー種污染物、雜質(zhì)或微量組分)。特別地，核酸或多肽分子在其已純化至少2倍、特別是至少10倍、更特別是至少100倍且多達(dá)1000倍或1000倍以上時被視為“基本上被分離”。經(jīng)適合的技術(shù)(例如適合色譜技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳)確定，“呈基本上被分離的形式”的多肽或核酸分子優(yōu)選基本上為均質(zhì)的。術(shù)語“癌癥”及“癌性”是指或描述哺乳動物中通常以不受調(diào)控的細(xì)胞生長/増殖為特征的生理癥狀。可用本發(fā)明的D114結(jié)合分子治療的癌癥的實例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤及白血病。如US 2008/0014196中表明用D114拮抗劑治療的這些癌癥的更特定實例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(h印atoma)、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭頸癌。血管生成的調(diào)控異?？蓪?dǎo)致許多可由本發(fā)明組合物及方法治療的病癥。這些病癥包括非腫瘤性癥狀及腫瘤性癥狀兩者。腫瘤性病癥包括但不限于上述病癥。非腫瘤性病癥包括但不限于如US 2008/0014196中所述用D114拮抗劑治療的不欲或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬斑塊、類肉瘤病(sarcoidosis)、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性及其他增生性視網(wǎng)膜病(包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼、年齡相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成(corneal neovascularization)、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管生成、隅角新血管生成(虹膜紅變(rubeosis))、眼新血管病(ocular neovascular disease))、血管冉狹窄(vascular restenosis)、動浄脈畸形(arteriovenous malformations,AVM)、脊膜瘤(meningioma)、血管瘤、血管纖維瘤(angiofibroma)、甲狀腺增生(包括格雷夫氏病(Grave’s disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎癥、肺炎癥、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動脈高壓(primary pulmonary hypertension)、惡性肺積液(malignant pulmonary effusion)、腦水腫(例如與急性中風(fēng)/閉鎖性頭部損傷(closedhead injury) /外傷相關(guān))、滑液炎癥、RA中的血管醫(yī)形成(pannus formation)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥大性骨形成(hypertropic bone formation)、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、難治愈的腹水癥、多囊性卵巢疾病(polycystic ovarian disease)、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)、第 3 間隔體液疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、間_綜合征(compartment syndrome)、灼傷、腸病)、子宮纖維瘤、早產(chǎn)、例如IBD(克羅恩氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性結(jié)腸炎)的慢性炎癥、腎同種異體移植排斥、發(fā)炎性腸病、腎病綜合征、不欲或異常的組織大量生長(非癌)、血友病性關(guān)節(jié)(hemophilic joint)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、頭發(fā)生長抑制、奧斯勒伯綜合征(Osier-Webersyndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生(pyogenic granuloma retrolentalfibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼、血管黏附(vascular adhesion)、滑膜炎(synovitis)、皮炎、子癇前癥(preeclampsia)、腹水癥、心包積液(pericardial effusion)(例如與心包炎(pericarditis)相關(guān)的心包積液)、及胸膜積液(pleural effusion)。發(fā)明詳述在第一方面中，本發(fā)明涉及ー種包含至少ー個具有四個框架區(qū)和三個分別為⑶R1XDR2及⑶R3的互補決定區(qū)的可變域的D114結(jié)合分子，其中⑶R3具有選自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列a) SEQ ID NO: I 至 166 及 458，
b)SEQ ID NO :333 至 353，或c)SEQ ID NO :375 至 395。
選自第一組SEQ ID NO: I至166及458的氨基酸序列a)作為部分序列形式包含于選自表5及SEQ ID NO: 167至332及459中所示的第二組序列的相應(yīng)氨基酸序列中。選自第一組SEQ ID NO:333至353的氨基酸序列b)作為部分序列形式包含于選自表16-A及SEQ ID NO:354至374中所示的第二組序列的相應(yīng)序列中。選自第一組SEQ ID NO:375至395的氨基酸序列c)作為部分序列形式包含于選自表16-B及SEQ ID NO:396至416中所示的第二組序列的相應(yīng)序列中。在第二方面中，該D114結(jié)合分子為ー種分離的免疫球蛋白單一可變域或含有一個或多個所述免疫球蛋白單一可變域的多肽，其中該免疫球蛋白單一可變域由四個框架區(qū)和三個分別為⑶R1、⑶R2及⑶R3的互補決定區(qū)組成，且其中⑶R3具有選自如下所示的氨基酸序列的氨基酸序列a) SEQ ID NO: I 至 166 及 458，b)SEQ ID NO :333 至 353，或c)SEQ ID NO :375 至 395。在另一方面中，該免疫球蛋白單一可變域含有a)氨基酸序列選自SEQ ID NO: I至166及458中所示的第一組氨基酸序列的CDR3 ；b)氨基酸序列如表5中所指示的作為部分序列形式包含于選自SEQ IDNO: 167至332及459中所示的第二組氨基酸序列的序列中的⑶Rl及⑶R2 ；其中SEQ ID No 1-166的第一組的SEQ ID NO: x對應(yīng)于第二組的SEQ ID N0:y，其中 y=x+166。在另一方面中，該免疫球蛋白單一可變域含有a)氨基酸序列選自SEQ ID NO: 333至353中所示的第一組氨基酸序列的CDR3 ；b)氨基酸序列如表16-A中所指示的作為部分序列形式包含于選自SEQ IDNO:354至374中所示的第二組序列的序列中的⑶Rl及⑶R2 ；其中該第一組的SEQ ID NO:X對應(yīng)于該第二組的SEQ ID N0:y，其中y=x+21。在另一方面中，該免疫球蛋白單一可變域具有a)氨基酸序列選自SEQ ID NO:375至395中所示的第一組氨基酸序列的CDR3 ；b)氨基酸序列如表16-B中所指示的作為部分序列形式包含于選自SEQ IDNO:396至416中所示的第二組序列的序列中的⑶Rl及⑶R2 ；其中第一組的SEQ ID NO:X對應(yīng)于第二組的SEQ ID N0:y，其中y=x+21。在一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為VHH。在另一方面中，VHH的氨基酸序列選自表5及SEQ ID NO: 167至332及459中所示的氨基酸序列。在治療應(yīng)用方面具有改良的性質(zhì)(例如增強(qiáng)的親和カ或減少的免疫原性)的D114結(jié)合分子，可通過例如以下的技術(shù)而從本發(fā)明的各別D114結(jié)合分子獲得親和カ成熟(例如從合成、隨機(jī)或天然存在免疫球蛋白序列起始)、CDR接枝、人化、合并源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引物的PCR組裝，和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的類似技術(shù)的技術(shù)；或任何上述者的任一適合組合。例如參考標(biāo)準(zhǔn)手冊以及其它描述及實施例。優(yōu)選地，親和力增加的本發(fā)明的D114結(jié)合分子可通過使另一 D114結(jié)合分子親和力成熟來獲得，該另一 D114結(jié)合分子表示就親和力成熟分子而言的“親本"D114結(jié)合分子。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的D114結(jié)合分子為通過使以上定義的親本免疫球蛋白單一可變域親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及通過使VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。
用于親和力成熟的適合的親本D114結(jié)合分子為例如氨基酸序列顯示于SEQ IDNO: 167至332及459中的上述VHH。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及已通過使氨基酸序列顯示于SEQ IDNO: 197中的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。在另一實施方案中，源自氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 197中的VHH的該免疫球蛋白單一可變域選自氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:354至374中的免疫球蛋白單一可變域。在一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列顯示于SEQ IDNO:358 中的 VHH。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域通過使氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 358中的VHH人化而獲得。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列顯示于SEQID NO:356 中的 VHH0在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及已通過使氨基酸序列顯示于SEQ IDNO:356中的VHH人化而獲得的免疫球蛋白單一可變域。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及已通過使氨基酸序列顯示于SEQ IDNO:224中的VHH親和力成熟而獲得的免疫球蛋白單一可變域。在另一實施方案中，源自氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:224中的VHH的該免疫球蛋白單一可變域選自氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:396至416中的免疫球蛋白單一可變域。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列顯示于SEQID NO:402 中的 VHH0在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域通過使氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:402中的VHH人化而獲得。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列顯示于SEQID NO:416 中的 VHH0在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域通過使氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:416中的免疫球蛋白單一可變域人化而獲得。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列顯示于SEQID NO:407 中的 VHH0在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變域通過使氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:413中的免疫球蛋白單一可變域人化而獲得。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，免疫球蛋白單一可變域(例如VH和VHH)具有大量使其極有利于在治療中用作功能性抗原結(jié)合分子的獨特結(jié)構(gòu)特征及功能性質(zhì)。特別地，且不對其進(jìn)行限制，VHH域(其已基本上經(jīng)“設(shè)計”為在不與輕鏈可變域配對情況下功能性地結(jié)合抗原)可充當(dāng)單一、相對較小、功能性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)單元。由于其獨特性質(zhì)，VHH或VHS (或VLs)等如本文定義的免疫球蛋白單一可變域無論是單獨存在還是作為較大多肽(例如雙互補位分子)的一部分，均提供許多顯著優(yōu)點 僅需要單一域以高親和力及高選擇性地結(jié)合抗原，因而無需存在兩個各別的域，也無需確保這兩個域以正確的空間構(gòu)象及構(gòu)型存在(即通過使用特別設(shè)計的連接子，如scFv的連接子); 免疫球蛋白單一可變域可從單一核酸分子表達(dá)且不需要任何翻譯后修飾(如糖基化)； 免疫球蛋白單一可變域可輕易經(jīng)工程改造為多價及多特異性形式(如本文進(jìn)一步論述)； 免疫球蛋白單一可變域?qū)ζ浒悬c具有高特異性及親和力，具有低遺傳毒性，可通過輸注或注射以外的替代途徑給予； 免疫球蛋白單一可變域?qū)帷H、蛋白酶及其他變性劑或變性條件高度穩(wěn)定，因此可在不使用冷凍設(shè)備情況下制備、儲存或運輸； 免疫球蛋白單一可變域無論是以小規(guī)模還是以生產(chǎn)規(guī)模制備均較為容易且相對廉價。例如，免疫球蛋白單一可變域及含有免疫球蛋白單一可變域的多肽可使用微生物發(fā)酵(例如下文進(jìn)一步公開)產(chǎn)生，不需要像常規(guī)抗體那樣使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)； 相比于常規(guī)4鏈抗體及其抗原結(jié)合片段，免疫球蛋白單一可變域是相當(dāng)小的(約15kDa，或為常規(guī)IgG的1/10)，因此顯示穿透入組織(包括但不限于實體腫瘤及其他致密組織)的穿透性(更)高，且可以以高于這些常規(guī)4鏈抗體及其抗原結(jié)合片段的劑量給予；-VHH具有特定的所謂“空腔結(jié)合性質(zhì)”(尤其是由于其⑶R3環(huán)相比于4鏈抗體的VH域更為延伸)，因此其也能夠進(jìn)入常規(guī)4鏈抗體及其抗原結(jié)合片段不可進(jìn)入的靶點及表位； VHH具有高度可溶及極其穩(wěn)定且不具有凝集趨勢的特別優(yōu)勢(正如由Ward等人，Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠源性抗原結(jié)合域的情況一樣)。 本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域在獲得所述免疫球蛋白單一可變域的具體生物來源或具體制備方法的方面不受限制。例如，獲得VHH可包括以下步驟(I)分離天然存在的重鏈抗體的VHH域；或篩選包含重鏈抗體或VHH的文庫且從中分離VHH ；(2)表達(dá)編碼具有天然存在序列的VHH的核酸分子；(3)任選在親和力成熟之后使具有天然存在序列的VHH “人化，，(如本文所述)，或表達(dá)編碼所述人化VHH的核酸；(4)使動物物種(特別是哺乳動物物種，例如人)的天然存在抗體的免疫球蛋白單一可變重域“駱駝化”(如下所述)，或表達(dá)編碼所述駱駝化域的核酸分子；(5)使VH “駱駝化”，或表達(dá)編碼這類駱駝化VH的核酸分子；
(6)使用以合成方式或半合成方式制備蛋白、多肽或其他氨基酸序列的技術(shù)；(7)使用核酸合成技術(shù)制備編碼VHH域的核酸分子，隨后表達(dá)由此獲得的核酸；(8)使重鏈抗體或VHH經(jīng)受親和力成熟、誘變(例如隨機(jī)誘變或定點誘變)和/或任何其他技術(shù)以增加VHH的親和力和/或特異性；和/或
(9)組合或選擇上述步驟。適于進(jìn)行上述步驟的方法及技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的且將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。根據(jù)一個具體實施方案，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域或存在于本發(fā)明的多肽中的免疫球蛋白單一可變域為氨基酸序列基本上對應(yīng)于天然存在VHH域的氨基酸序列的VHH域，但其已經(jīng)人化(任選在親和力成熟之后)，即通過以人的常規(guī)4鏈抗體可變重域中相應(yīng)位置處存在的一個或多個氨基酸殘基置換該天然存在VHH序列的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基。這可使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行，所述方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式使用。人化VHH可含有一個或多個完全人框架區(qū)序列，且在一個甚至更具體的實施方案中，可含有源自人生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分，或之此高度同源的人框架區(qū)序列。因此，人化方案可包含單獨或組合使用生殖系YH基因(例如DP 47、DP29及DP51)的相應(yīng)骨架1、2和3 (FRl、FR2和FR3)殘基來置換任何VHH殘基。本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域的適合的框架區(qū)(FR)可選自那些例如WO 2006/004678中公開的FR，且具體地包括所謂“KERE”及“GLEW”類型。在約位置44至47處具有氨基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白單一可變域及其分別的人化對應(yīng)物是特別優(yōu)選的。屬于103P，R, S組和/或GLEW組(如下文所定義)的優(yōu)選但并非限制性的VHH域的人化取代為108Q至108L。使免疫球蛋白單一可變域人化的方法在本領(lǐng)域中是已知的。根據(jù)另一實施方案，免疫球蛋白單一可變域為如本文所定義的VH域。在另一實施方案中，本發(fā)明代表性種類的D114結(jié)合免疫球蛋白單一可變域或存在于本發(fā)明的多肽中的D114結(jié)合免疫球蛋白單一可變域的氨基酸序列對應(yīng)于天然存在VH域已經(jīng)“駱駝化”的氨基酸序列，即通過以一個或多個存在于重鏈抗體VHH域中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基置換常規(guī)4鏈抗體的天然存在可變重鏈氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基。這可以本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的本身已知的方式進(jìn)行，且另外參考WO 94/04678。所述駱駝化可優(yōu)先發(fā)生在存在于VH-VL界面的氨基酸位置處及所謂駱駝科印記殘基處(也例如參見W094/04678)。這些“人化”及“駱駝化”技術(shù)及與此相符的優(yōu)選框架區(qū)序列的詳述也可參見WO 2006/040153的第46頁及第98頁及W02006/122786的第107頁。本發(fā)明的D114結(jié)合分子(例如免疫球蛋白單一可變域和/或含有其的多肽)對D114具有特異性，因為其包含與D114分子內(nèi)的一個或多個表位特異性結(jié)合的一個或多個免疫球蛋白單一可變域。D114結(jié)合分子對其抗原D114的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適合的方式，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析和/或競爭性結(jié)合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夾心式競爭分析)及本領(lǐng)域中本身已知的其不同變化形式來測定。關(guān)于抗原Dl 14，本發(fā)明的Dl 14結(jié)合分子(例如免疫球蛋白單一可變域)在物種方面不受限制。因此，若欲用于人中的治療目的，則本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽優(yōu)選結(jié)合至人D114。然而，結(jié)合至另一哺乳動物物種的D114的免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。與一個物種的D114結(jié)合的本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域，可與一個或多個其他物種的D114發(fā)生交叉反應(yīng)。例如，結(jié)合人D114的本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域可表現(xiàn)出與一個或多個其他靈長類物種的D114和/或與用于疾病動物模型(且特別是用于與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病及病癥的動物模型)中的一個或多個動物物種(例如猴(特別是短尾猴或恒河猴)、小鼠、大鼠、兔、豬、犬)(例如本文提及的物種及動物模型)的D114的交叉反應(yīng)性。表現(xiàn)所述交叉反應(yīng)性的本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域，在研究和/或藥物研發(fā)中是有利的，因為其允許在公認(rèn)的疾病模型(例如猴(特別是短尾猴或恒河猴)、或小鼠及大鼠)中對本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域進(jìn)行測試。此外，本發(fā)明的D114結(jié)合分子不限于其所針對的抗原的特定域或抗原決定基或不由其所針對的D114的特定域或抗原決定基限定。優(yōu)選地，鑒于與除人以外的物種(其欲在治療性D114拮抗劑的研發(fā)期間將其用作動物模型)的一種或多種D114分子的交叉反應(yīng) 性，D114結(jié)合分子識別與人D114具有高一致度的感興趣的D114區(qū)域中的表位。例如，鑒于使用小鼠模型，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域識別完全或部分位于D114的EGF-2域內(nèi)的表位，該EGF-2域在人與小鼠之間顯示較高的一致度。因此，根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明涉及D114結(jié)合分子，具體涉及免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽，其中所述免疫球蛋白單一可變域選自與完全或部分地包含于EGF-2域內(nèi)的表位結(jié)合的免疫球蛋白單一可變域，該EGF-2域?qū)?yīng)于SEQ ID NO:417的氨基酸殘基252-282。若本發(fā)明的多肽為如本文所定義的包含多于一個本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域的雙互補位分子，則至少一個免疫球蛋白單一可變域組分與上文所定義的EGF-2域內(nèi)的表位結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域以小于500nM、優(yōu)選小于200nM、更優(yōu)選小于IOnM,例如小于500pM (如如實例5. 7中所述地通過表面等離子共振分析所測定)的親和力結(jié)合D114。優(yōu)選地，如競爭ELISA分析(如實例5. I.中所述)中所測得，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域具有的IC5tl值在10_6至10,摩爾/升或10,摩爾/升以下的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在10_8至10,摩爾/升或10,摩爾/升以下的范圍內(nèi)、且甚至更優(yōu)選在10_9至10,摩爾/升或10,摩爾/升以下的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一非限制性但優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的D114結(jié)合免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽以10_5至10_12摩爾/升(M)或10_12摩爾/升以下、且優(yōu)選10_7至1(T12摩爾/升(M)或1(T12摩爾/升以下、且更優(yōu)選1(T8至1(T12摩爾/升(M)或1(T12摩爾/升以下的解離常數(shù)(Kd)，和/或以至少IO7M'優(yōu)選至少IO8M'更優(yōu)選至少IO9M'例如至少IO12M-1的締合常數(shù)(Ka);且特別是以小于500nM、優(yōu)選小于200nM、更優(yōu)選小于10nM，例如小于500pM的Kd分別結(jié)合D114或VEGF?？蓽y定本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域針對Dl 14的Kd及Ka值。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含兩個或兩個以上在不同非重疊表位處結(jié)合抗原D114的免疫球蛋白單一可變域的D114結(jié)合分子。更具體地，本發(fā)明的該多肽基本上由以下組成或包含以下(i)特異性結(jié)合D114的第一表位的第一免疫球蛋白單一可變域及(ii)特異性結(jié)合D114的第二表位的第二免疫球蛋白單一可變域，其中D114的該第一表位及D114的該第二表位不為同一表位。換言之，本發(fā)明的該多肽包含以下或基本上由以下組成兩個或兩個以上針對至少兩個存在于D114中的不同表位的免疫球蛋白單一可變域，其中所述免疫球蛋白單一可變域以能夠同時結(jié)合D114的方式彼此連接。在此意義中，本發(fā)明的多肽也可視為“二價”或“多 價”免疫球蛋白構(gòu)建體(construct)，且尤其視為“多價免疫球蛋白單一可變域構(gòu)建體”，因為該多肽含有至少兩個D114結(jié)合位點。本發(fā)明的該D114結(jié)合分子包括(至少)兩個抗D114免疫球蛋白單一可變域，其中(該)兩個免疫球蛋白單一可變域是針對D114分子內(nèi)的不同表位。因此，這兩個免疫球蛋白單一可變域?qū)⒕哂胁煌乖禺愋郧乙虼司哂胁煌珻DR序列。為此，由于所述兩個免疫球蛋白單一可變域包括兩個不同互補位，本發(fā)明的這些多肽在本文中也分別稱為“雙互補位多肽”、或“雙互補位單域抗體構(gòu)建體”(若免疫球蛋白單一可變域由或基本上由單域抗體組成)或“雙互補位VHH構(gòu)建體”(若免疫球蛋白單一可變域由或基本上由VHH組成)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，若本發(fā)明的多肽包括多于兩個(即三個、四個或甚至四個以上)抗D114免疫球蛋白單一可變域，則至少兩個所述抗D114免疫球蛋白單一可變域是針對Dl 14分子內(nèi)的不同表位，其中任何另一免疫球蛋白單一可變域可結(jié)合存在于D114分子中的這兩個不同表位的任一個和/或其他表位。根據(jù)本發(fā)明，兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域可彼此獨立地為VH或VHH，和/或如本文定義的任何其它種類的免疫球蛋白單一可變域，例如VL域，條件是這些免疫球蛋白單一可變域?qū)⒔Y(jié)合抗原(即Dl 14)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述第一及第二免疫球蛋白單一可變域基本上由如本文定義的VH序列或VHH序列組成。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，所述第一及第二免疫球蛋白單一可變域基本上由VHH序列組成。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，存在于本發(fā)明的D114結(jié)合分子中的至少兩個免疫球蛋白單一可變域可彼此直接(即不使用連接子)連接或通過連接子連接。連接子優(yōu)選為連接肽且將經(jīng)選擇以允許至少兩個不同免疫球蛋白單一可變域各與同一個D114分子內(nèi)或兩個不同分子內(nèi)的D114的至少兩個不同表位結(jié)合。連接子的選擇將尤其取決于表位，且具體地取決于免疫球蛋白單一可變域所結(jié)合D114上的表位之間的距離，且本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文公開的內(nèi)容，任選在某些有限程度的常規(guī)實驗之后將了解此選擇。作為該實驗的起點，可通常假定存在于本發(fā)明的該類多肽中的兩個免疫球蛋白單一可變域的N-末端與C-末端間的距離優(yōu)選為至少50埃(Angstrom)、且更優(yōu)選約55-200埃、且具體在約65-150埃的區(qū)間內(nèi)，其中該距離的上限并不關(guān)鍵，且例如出于考慮蛋白表達(dá)/產(chǎn)生的便利性的考慮而加以選擇。此外，當(dāng)結(jié)合D114的兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域為VH或VHH時，其可分別通過第三VH或VHH而彼此連接(在這些D114結(jié)合分子中，兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域可直接或通過適合的連接子連接至該第三免疫球蛋白單一可變域)。此類第三VH或VHH可例如為提供增加的半衰期的VH或VHH。例如，后一 VH或VHH可為能夠結(jié)合(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白)或(人)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)的VH或VHH。
或者，結(jié)合D114的兩個或兩個以上免疫球蛋白單一可變域可(直接或通過適合的連接子)串聯(lián)連接且第三VH或第三VHH (其可提供增加的半衰期)可直接或通過連接子連接至這兩個或兩個以上上述免疫球蛋白序列之一。適合的連接子可例如且不限于包含長度優(yōu)選為9個或9個以上氨基酸、更優(yōu)選為多于17個氨基酸，例如約20-40個氨基酸殘基的氨基酸序列。然而，上限并不關(guān)鍵，該上限是由于與例如這些多肽的生物醫(yī)藥生產(chǎn)的便利性的相關(guān)的原因而選擇的。
連接序列可為天然存在序列或非天然存在序列。若用于治療目的，則在給予本發(fā)明的雙特異性結(jié)合分子的受試者中所述連接子優(yōu)選為非免疫原性的。一組適用連接序列為如WO 96/34103及WO 94/04678中所述源自重鏈抗體鉸鏈區(qū)的連接子。其它實例為聚丙氨酸連接序列，例如Ala-Ala-Ala。若本發(fā)明的多肽通過連接聚合物，例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分來修飾，則該連接序列優(yōu)選包括允許連接區(qū)域中的此修飾(例如聚乙二醇化)的氨基酸殘基，例如半胱氨酸或賴氨酸。此外，連接子也可為例如WO 04/081026中所示的聚(乙二醇)部分。在另一實施方案中，本發(fā)明的多肽的至少兩個D114結(jié)合免疫球蛋白單一可變域通過另一部分(任選通過一個或兩個連接子)，例如另一多肽來彼此連接，該另一多肽在一個優(yōu)選但非限制性實施方案中可為如上所述的另一免疫球蛋白單一可變域。該部分可為基本上非活性的或可具有例如改良多肽的所需性質(zhì)的生物效應(yīng)或可賦予多肽一種或多種其他所需性質(zhì)。例如但不限于，該部分可改良蛋白或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，在用作治療劑的用途方面，本發(fā)明的D114結(jié)合分子包括延長本發(fā)明的多肽在患者血清或其他體液中的半衰期的部分。術(shù)語“半衰期”定義為(經(jīng)修飾)多肽的血清濃度(例如由于天然機(jī)制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合)而在體內(nèi)降低50%所花費的時間。更具體地，該半衰期延長部分可共價連接或融合至所述多肽，且可為(但不限于)Fe部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白結(jié)合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白單一可變域)、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合部分(例如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫球蛋白單一可變域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白結(jié)合肽或輕乙基淀粉(HES)衍生物。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含與存在于血液中的抗原結(jié)合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、纖維蛋白原(fibrinogen)或轉(zhuǎn)鐵蛋白，因而使所得本發(fā)明的多肽的體內(nèi)半衰期增加。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，該部分為白蛋白結(jié)合免疫球蛋白且尤其優(yōu)選為白蛋白結(jié)合免疫球蛋白單一可變域，例如白蛋白結(jié)合VHH域。若欲在人中使用，則該白蛋白結(jié)合免疫球蛋白單一可變域?qū)?yōu)選結(jié)合人血清白蛋白，且將優(yōu)選為人化白蛋白結(jié)合VHH域。結(jié)合人血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變域在本領(lǐng)域中是已知的，且進(jìn)一步詳述于例如WO 2006/122786中。特別地，適用的白蛋白結(jié)合VHH為ALB I及其人化對應(yīng)物ALB8 (WO 2009/095489)。然而，也可使用在以上專利公開案中提及的其他白蛋白結(jié)合VHH域。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，所述免疫球蛋白單一可變域可融合至例如公開于WO01/79271及WO 03/59934中的血清白蛋白分子。如例如于W001/79271中所述，融合蛋白可通過以下常規(guī)重組技術(shù)獲得將編碼血清白蛋白或其片段的DNA分子接合至編碼Dl 14結(jié)合分子的DNA，將所得構(gòu)建體插入適于在所選宿主細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞(如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))或細(xì)菌細(xì)胞)中表達(dá)的質(zhì)粒中，接著用融合的核苷酸序列轉(zhuǎn)染該宿主細(xì)胞，并使之在合適的條件下生長。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的多肽的半衰期延長修飾(此修飾亦降低多肽的免疫原性)包含連接藥理學(xué)上可接受的合適的聚合物，例如直鏈或支鏈聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何適合形式的聚乙二醇化，例如本領(lǐng)域中用于抗體及抗體片段(包括但不限于單域抗體及scFv片段)的聚乙二醇化；參考例如Chapman, Nat. Biotechnol. , 54, 531-545 (2002) ；Veronese 及 Harris, Adv.Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003) ;Harris 及 Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003);及WO 04/060965o用于使多肽聚乙二醇化的各種試劑也是市售的，例如可從NektarTherapeutics, USA 或 NOF Corporation, Japan 購得，所述試劑例如Suubrigbt EA 系列、SH 系列、MA 系列、CA 系列及 ME 系列，例如SUHbright ME-100MA、Suilbright ME-200MA 及Sunbriszhl 知 ME-400MA。優(yōu)選使用(特別是通過半胱氨酸殘基的)定點聚乙二醇化(參見例如Yang等人，Protein Engineering 16, 761-770 (2003)) 例如，出于此目的，PEG可連接至天然存在于本發(fā)明的多肽中的半胱氨酸殘基，本發(fā)明的多肽可經(jīng)修飾以便適當(dāng)引入一個或多個用于連接PEG的半胱氨酸殘基，或包含一個或多個用于連接PEG的半胱氨酸殘基的氨基酸序列可融合至本發(fā)明的多肽的N-末端和/或C-末端，以上均使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言本身已知的蛋白工程的技術(shù)。優(yōu)選地,對于本發(fā)明的多肽,使用PEG的分子量大于5kDa(例如大于IOkDa)且小于200kDa (例如小于IOOkDa)，例如在20kDa至80kDa范圍內(nèi)。關(guān)于聚乙二醇化應(yīng)注意，一般而言，本發(fā)明也優(yōu)選涵蓋已在一個或多個氨基酸位置處經(jīng)聚乙二醇化的任何雙特異性結(jié)合分子，該聚乙二醇化(I)增加體內(nèi)半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供對于聚乙二醇化本身已知的一種或多種其他有益性質(zhì)；(4)基本上不影響多肽對其靶點的親和力(例如通過本領(lǐng)域中所述的適合分析所測定，不使該親和力降低50%以上、且更優(yōu)選不使之降低10%以上)；和/或(5)不影響本發(fā)明的雙特異性結(jié)合分子的任何其他所需性質(zhì)。適合的PEG基團(tuán)及用于特異性或非特異性與之連接的方法將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。用于所述聚乙二醇化的試劑盒及試劑可例如從Nektar (CA, USA)獲得。在另一方面中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的D114結(jié)合分子的核酸分子。這些核酸分子在本文中也稱為“本發(fā)明的核酸”且也可呈如本文定義的遺傳構(gòu)建體形式。本發(fā)明的核 酸可為基因組DNA、cDNA或合成DNA (例如具有已特定適于在預(yù)定宿主細(xì)胞或宿主有機(jī)體中表達(dá)的密碼子用途(codon usage)的DNA)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案,本發(fā)明的核酸呈如上定義的基本上分離的形式。
本發(fā)明的核酸也可呈載體形式，可存在于載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質(zhì)粒、粘端質(zhì)粒或YAC。載體可尤其為表達(dá)載體，即可提供D114結(jié)合分子體外和/或體內(nèi)(即在適合宿主細(xì)胞、宿主有機(jī)體和/或表達(dá)系統(tǒng)中)表達(dá)的載體。該表達(dá)載體通常包含至少一種本發(fā)明的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合調(diào)控組件(例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等)。這些組件及其鑒于特測序列在特定宿主中的表達(dá)的選擇為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識。對本發(fā)明D114結(jié)合分子的表達(dá)有用或必需的調(diào)控組件及其他組件的具體實例，例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子、整合因子(integration factor)、選擇標(biāo)記物、前導(dǎo)序列、報告基因(reporter gene)等公開于例如WO 2006/040153的第131至133頁。本發(fā)明的核酸可基于關(guān)于本文給出的本發(fā)明的多肽的氨基酸序列的信息以本身已知的方式(例如通過自動DNA合成和/或重組DNA技術(shù))制備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。在另一方面中，本發(fā)明涉及表達(dá)或能夠表達(dá)一種或多種本發(fā)明的D114結(jié)合分子和/或含有本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)胞。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞；其他適用細(xì)胞為酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。 適合的細(xì)菌細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細(xì)菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細(xì)胞。適合真菌細(xì)胞包括木霉屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及曲菌屬(Aspergillus)的物種的細(xì)胞。適合酵母細(xì)胞包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細(xì)胞。適合的哺乳動物細(xì)胞包括例如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、海拉細(xì)胞(HeLa cell)、C0S細(xì)胞等。然而，也可使用兩棲類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞及本領(lǐng)域中用于表達(dá)異源蛋白的任何其他細(xì)胞。本發(fā)明還提供制造本發(fā)明的D114結(jié)合分子的方法，這些方法通常包含以下步驟-在允許表達(dá)本發(fā)明的Dl14結(jié)合分子的條件下培養(yǎng)包含能夠編碼Dl 14結(jié)合分子的核酸的宿主細(xì)胞；及-從培養(yǎng)物回收或分離由宿主細(xì)胞表達(dá)的多肽；及-任選進(jìn)一步純化和/或修飾和/或調(diào)配本發(fā)明的Dl14結(jié)合分子。對于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)而言，優(yōu)選的宿主有機(jī)體包括適于大規(guī)模表達(dá)、生產(chǎn)及發(fā)酵，且特別是適于大規(guī)模醫(yī)藥表達(dá)、生產(chǎn)及發(fā)酵的大腸桿菌菌株、巴斯德畢赤酵母菌株及釀酒酵母菌株。具體表達(dá)系統(tǒng)的選擇部分取決于某些翻譯后修飾的要求，更特別是糖基化的要求。需要或要求糖基化的本發(fā)明的D114結(jié)合分子的產(chǎn)生，必需使用能夠使所表達(dá)蛋白糖基化的哺乳動物表達(dá)宿主。就此而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解所獲得的糖基化樣式(即所連接殘基的種類、數(shù)目及位置)將取決于用于表達(dá)的細(xì)胞或細(xì)胞株。在如上所述細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明的D114結(jié)合分子或者可以以細(xì)胞內(nèi)方式(例如在細(xì)胞溶質(zhì)中、在胞間質(zhì)(periplasma)中或在包涵體(inclusion body)中)產(chǎn)生,接著從宿主細(xì)胞分離且任選進(jìn)一步純化；或者其可以以細(xì)胞外方式(例如在培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中)產(chǎn)生，接著自培養(yǎng)基分離且任選進(jìn)一步純化。用于重組產(chǎn)生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法、選擇標(biāo)記物、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的方法、培養(yǎng)條件等在本領(lǐng)域中是已知的。類似地，適用于制造本發(fā)明的多肽的方法中的蛋白分離及純化技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在另一方面中，本發(fā)明涉及氨基酸序列選自分別顯示于SEQ ID N0:1至166及458、SEQ ID NO:333至353、或SEQ ID NO:375至395中的氨基酸序列的肽，及編碼該肽的核酸分子。這些肽對應(yīng)于源自本發(fā)明的VHH的⑶R3。這些肽，特別是編碼這些肽的核酸分子，適用于⑶R移植以置換免疫球蛋白鏈中的⑶R3，或適用于插入非免疫球蛋白支架，例如蛋白酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素b562、螺旋束(helix-bundle)蛋白、二硫橋式肽 (disulfide-bridged peptide)、脂質(zhì)運載蛋白(Iipocalin)或抗運載蛋白(anticalin)中，從而賦予此支架靶結(jié)合性質(zhì)。CDR移植方法在本領(lǐng)域中是公知的且已廣泛使用，例如用于使抗體人化(此通常包含將嚙齒動物抗體的CDR移植在人抗體的Fv骨架上)。為了獲得含有本發(fā)明CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，可根據(jù)如例如由Daugherty 等人，1991，Nucleic Acids Research,第 19卷，9，2471-2476所述的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過基因合成、通過寡核苷酸退火或借助于重疊PCR片段來獲得編碼此分子的DNA。將VHH CDR3插入非免疫球蛋白支架中的方法已由Nicaise等人，2004，ProteinScience, 13，1882-1891 公開。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)物或組合物，其含有或包含至少一種本發(fā)明的D114結(jié)合分子及任選的這些組合物的本身已知的一種或多種其他組分，即視組合物的預(yù)定用途而定。對于醫(yī)藥用途而言，本發(fā)明的D114結(jié)合分子或含有本發(fā)明的D114結(jié)合分子的多肽可調(diào)配成醫(yī)藥制劑或組合物，其包含至少一種本發(fā)明的D114結(jié)合分子及至少一種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑及任選的一種或多種其他醫(yī)藥活性多肽和/或化合物。借助于非限制性實例，這類調(diào)配物可呈適于口服給藥、腸胃外給藥(例如通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射或靜脈內(nèi)輸注)、局部給藥或通過吸入、皮膚貼片、植入物、栓劑等給藥的形式。根據(jù)給藥方式，合適的給藥形式可為固體、半固體或液體，且其制備方法及載劑將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解且進(jìn)一步在本文中公開。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有至少一種D114結(jié)合分子，特別是一種本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域或含有該免疫球蛋白單一可變域的多肽，及至少一種適合的載劑、稀釋劑或賦形劑(即適于醫(yī)藥用途)及任選一種或多種其他活性物質(zhì)。本發(fā)明的D114結(jié)合分子可以以本身已知的任何適合方式調(diào)配及給予特別是對于免疫球蛋白單一可變域，例如參考WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、W004/041867 及 WO 08/020079,以及標(biāo)準(zhǔn)手冊，例如 Remington’s PharmaceuticalSciences,第 18 版，Mack Publishing Company, USA(1990) ；Remington, the Science andPractice of Pharmacy,第 21 版,Lippincott Williams and Wilkins (2005)；或 theHandbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel 編)，Wiley, Weinheim, 2007 (參見例如第252-255 頁)。例如，本發(fā)明的免疫球蛋白單一可變域可以以用于常規(guī)抗體及抗體片段(包括ScFv片段及雙特異抗體)及其他醫(yī)藥活性蛋白的本身已知的任何方式調(diào)配及給予。這些調(diào)配物及制備這些調(diào)配物的方法將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，且例如包括適于腸胃外給藥(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腔內(nèi)、動脈內(nèi)或鞘內(nèi)給藥)或局部(即經(jīng)皮或皮內(nèi))給藥的制劑。用于腸胃外給藥的制劑可例如為適于輸注或注射的滅菌溶液、混懸液、分散液或乳液。適用于這些制劑的載劑或稀釋劑，例如包括(但不限于)滅菌水及醫(yī)藥學(xué)上可接受的水性緩沖液及溶液，例如生理磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、葡萄糖溶液及漢克氏溶液(Hank’s solution);含水油(water oil);甘油；乙醇；二醇(例如丙二醇)或以及礦物油、動物油及植物油(例如花生油、大豆油)，以及其適合的混合物。通常將優(yōu)選水性溶液或混懸液。因此，本發(fā)明的D114結(jié)合分子可組合醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體(例如惰性稀釋劑或 可吸收食用載劑)而全身給予(例如口服給予)。對于口服治療性給藥而言，可將本發(fā)明的D114結(jié)合分子與一種或多種賦形劑組合且以可攝取片劑、口腔錠、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸液、糖衆(zhòng)、糯米紙囊劑(wafer)等形式使用。這些組合物及制劑應(yīng)含有至少0. 1%的本發(fā)明的D114結(jié)合分子。其在組合物及制劑中的百分比當(dāng)然可變化且宜介于既定單位劑型重量的約2%與約60%之間。本發(fā)明的D114結(jié)合分子在用于這些治療的組合物中的量為獲得有效劑量濃度的量。所述片劑、丸劑、膠囊劑等也可含有粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及甜味劑或矯味劑，例如在W008/020079的第143-144頁上所提及的。當(dāng)單位劑型為膠囊劑時，其除以上類型的物質(zhì)外也可含有液體載劑，例如植物油或聚乙二醇?？纱嬖诟鞣N其他物質(zhì)作為包衣或者用以修飾固體單位劑型的外形。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可由明膠、蠟、蟲膠(shellac)或糖等包衣。糖漿或酏劑可含有本發(fā)明的D114結(jié)合分子、蔗糖或果糖(作為甜味劑)、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯(作為防腐劑)、色素及矯味劑(例如櫻桃或橙香料)。當(dāng)然，在制備任何單位劑型中使用的任何物質(zhì)均應(yīng)為醫(yī)藥學(xué)上可接受且在所用量下基本上無毒。此外，本發(fā)明的Dl 14結(jié)合分子可并入持續(xù)釋放制劑及裝置中。用于口服給藥的制劑及調(diào)配物也可具有將使本發(fā)明構(gòu)建體抵抗胃環(huán)境且進(jìn)入腸中的腸溶包衣。更一般地，用于口服給藥的制劑及調(diào)配物可經(jīng)適當(dāng)調(diào)配以遞送進(jìn)入胃腸道的任何所需部分中。此外，可使用適合的栓劑以遞送進(jìn)入胃腸道中。如WO 08/020079第144及145頁上所進(jìn)一步公開，本發(fā)明的D114結(jié)合分子也可通過輸注或注射而經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予。對于本發(fā)明的D114結(jié)合分子的局部給藥而言，如W008/020079第145頁上所進(jìn)一步公開，一般需要將其與皮膚可接受的載劑(其可為固體或液體)組合而以組合物或調(diào)配物形式給予皮膚。一般而言，本發(fā)明的D114結(jié)合分子在液體組合物(例如洗劑)中的濃度將為約
0.1-25重量％、優(yōu)選約0. 5-10重量％。在半固體或固體組合物(例如凝膠或粉末)中的濃度將為約0. 1-5重量％、優(yōu)選約0. 5-2. 5重量％。本發(fā)明的D114結(jié)合分子的治療中需要的量不僅依所選具體D114結(jié)合分子，而且也依給藥途徑、所治療癥狀特性及患者年齡及癥狀而變化且將最終由當(dāng)值醫(yī)師或臨床醫(yī)師酌情決定。此外，本發(fā)明的D114結(jié)合分子的劑量視靶細(xì)胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。所需劑量宜呈現(xiàn)為單次劑量或以適當(dāng)間隔給予的分次劑量，例如呈每天兩次、三次、四次或四次以上的亞劑量形式。所述亞劑量自身可經(jīng)進(jìn)一步劃分，例如分成大量單個的松散間隔的給藥；例如來自吹入器(insufflator)的多次吸入或通過對眼中多次滴眼。給藥方案可包括長期每天治療?！伴L期”是指持續(xù)時間至少兩周且優(yōu)選數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。該劑量范圍的必要修改可由一般技術(shù)人員僅使用本文教導(dǎo)的常規(guī)實驗來確定。參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E. ff.第 4 版)，Mack PublishingCo.，Easton, PA。若發(fā)生任何并發(fā)癥，則該劑量也可由單個的醫(yī)師來調(diào)整。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明涉及本發(fā)明的D114結(jié)合分子(例如免疫球蛋白單一可變域或含有其的多肽)的用途，其用于治療目的，例如 -尤其在人中用于預(yù)防、治療和/或減輕與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)或可通過用D114結(jié)合分子調(diào)節(jié)Notch信號傳導(dǎo)路徑來預(yù)防、治療或減輕的病癥、疾病或癥狀，-在一治療需要此治療的患者的方法中，該方法包含給予有需要的個體醫(yī)藥活性量的至少一種本發(fā)明的D114結(jié)合分子(例如免疫球蛋白單一可變域)或含有所述的本發(fā)明的D114結(jié)合分子的藥物組合物；-用于制備預(yù)防、治療或減輕與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的病癥、疾病或癥狀的藥物；-作為用于以上目的藥物組合物或藥物中的活性成分。根據(jù)一個具體的方面，該病癥、疾病或癥狀為如本文定義的癌癥或癌性疾病。根據(jù)另一方面，疾病為與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)或可通過用D114結(jié)合分子調(diào)節(jié)Notch信號傳導(dǎo)路徑來治療或減輕的眼病。視欲治療的癌性疾病而定，本發(fā)明的D114結(jié)合分子可單獨或組合一種或多種特別是選自以下的其他治療劑加以使用化學(xué)治療劑(如DNA損傷劑)，或抑制癌細(xì)胞中血管生成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑或有絲分裂檢查點(mitotic checkpoint)的治療活性化合物。其他治療劑可任選作為同一醫(yī)藥制劑的組分與D114結(jié)合分子的給藥同時給予、或在該Dl 14結(jié)合分子的給藥之前或之后給予。在某些實施方案中，所述其他治療劑可為(而不限于)一種或多種選自以下物質(zhì)的抑制劑EGFR、VEGFR、HER2_neu、Her3、AuroraA、AuroraB, PLK 及 PI3 激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP、PDKl、PTK2、IGF-R或 IR。其他治療劑的其他實例為CDK、Akt, src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c_Myc、Flt3、HSP90 的抑制劑；刺猬拮抗劑(hedgehog antagonist) ;JAK/STAT、Mek、mTor、NF k B、蛋白酶體、Rho的抑制劑；wnt信號傳導(dǎo)的抑制劑或遍在蛋白化(ubiquitination)路徑的抑制劑或Notch信號傳導(dǎo)路徑的另一抑制劑。Aurora 抑制劑的實例為(但不限于)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。PLK抑制劑的一個實例為GSK-461364。raf 抑制劑的實例為 BAY-73-4506 (也為 VEGFR 抑制劑)、PLX 4032、RAF-265 (此外也為VEGFR抑制劑)、索拉非尼(sorafenib)(此外也為VEGFR抑制劑)及XL 281。KSP 抑制劑的實例為伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及 SB-743921。src和/或bcr-abl抑制劑的實例為達(dá)沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228 (也為 IGF-IR 抑制劑)、尼洛替尼(nilotinib)(也為 PDGFR 及 cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(也為cKit抑制劑)及NS-187。PDKl抑制劑的一個實例為BX-517。 Rho抑制劑的一個實例為BA-210。PI3激酶抑制劑的實例為PX-866、BEZ-235 (也為mTor抑制劑)、XL 418 (也為Akt抑制劑)、XL-147及XL 765 (也為mTor抑制劑)。cMet或HGF的抑制劑的實例為XL-184 (也為VEGFR、cKit、Flt3的抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(也為 VEGFR 的抑制劑)、MGCD_265(也為 VEGFR、Ron、Tie2 的抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102 及 AV-299。c-Myc抑制劑的一個實例為CX-3543。Flt3抑制劑的實例為AC-220 (也為cKit及TOGFR的抑制劑)、KW 2449、來他替尼(Iestaurtinib)(也為 VEGFR、PDGFR、PKC 的抑制劑)、TG_101348(也為 JAK2 的抑制劑)、XL-999 (也為 cKit、FGFR、PDGFR 及 VEGFR 的抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(也為 PDGFR、VEGFR及cKit的抑制劑)及坦度替尼(tandutinib)(也為TOGFR及cKit的抑制劑)。HSP90抑制劑的實例為坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素(alvespimycin)、IPI-504 及 CNF 2024。JAK/STAT抑制劑的實例為CYT-997 (其也與微管蛋白相互作用)、TG101348(也為Flt3的抑制劑)及XL-019。Mek 抑制劑的實例為 ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330 及 XL 518。mTor抑制劑的實例為西羅莫司脂化物(temsirolimus)、AP_23573 (其也作為VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(此外也為VEGF抑制劑)、XL_765 (也為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235 (也為PI3激酶抑制劑)。Akt抑制劑的實例為哌立福辛(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。cKit抑制劑的實例為AB-1010、0SI_930(也作為VEGFR抑制劑)、AC_220(也為Flt3及TOGFR的抑制劑)、坦度替尼(也為Flt3及TOGFR的抑制劑)、阿西替尼(也為VEGFR及TOGFR的抑制劑)、XL-999 (也為Fl t3、PDGFR, VEGFR、FGFR的抑制劑)、舒尼替尼(也為Flt3、H)GFR、VEGFR的抑制劑)、及XL-820 (也作為VEGFR及TOGFR抑制劑)、伊馬替尼(也為bcr-abl抑制劑)、尼洛替尼(也為bcr-abl及TOGFR的抑制劑)。刺猬拮抗劑的實例為IPI-609及CUR-61414。CDK 抑制劑的實例為塞來昔布(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK_CDK(亦抑制VEGFR2 及 PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509 及 AG 024322。蛋白酶體抑制劑的實例為硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfiIzomib)及NPI-0052 (也為NF K B的抑制劑)。NFkB路徑抑制劑的一個實例為NPI-0052。
遍在蛋白化路徑抑制劑的一個實例為HBX-41108。在優(yōu)選的實施方案中，所述其他治療劑為抗血管生成劑。抗血管生成劑的實例為FGFRJDGFR及VEGFR或各別配位體的抑制劑(例如VEGF抑制劑，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗體貝伐單抗(bevacizumab))及沙立度胺(thalidomide),這些藥物選自(但不限于)貝伐單抗、莫替沙尼(motesanib)、Q)P_791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK (也為 CDK 的抑制劑)、ABT-869、BMS-690514, RAF-265, IMC-KdR, IMC-18F1、IMiD (免疫調(diào)節(jié)藥物)、沙立度胺衍生物 CC-4047、來那度胺(Ienalidomide)、ENMD 0995、MC_Dll、Ki23057、布里瓦尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999 (也為 cKit 及 Flt3 的抑制劑)、1B3、CP 868596、IMC3G3, R-1530 (也為Flt3的抑制劑)、舒尼替尼(也為cKit及Flt3的抑制劑)、阿西替尼(也為cKit的 抑制劑)、來他替尼(也為Flt3及PKC的抑制劑)、瓦拉他尼(vatalanib)、坦度替尼(也為 Flt3 及 cKit 的抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW786034、PF-337210、IMC-1121B,AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR258、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)(也為Raf的抑制劑)、RAF-265(也為Raf的抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、0SI-930、AEE-788(也為 EGFR 及 Her2 的抑制劑)、BAY-57-9352 (也為 Raf 的抑制劑)、BAY-73-4506 (也為Raf的抑制劑)、XL 880 (也為cMet的抑制劑)、XL-647 (也為EGFR及EphB4的抑制劑)、XL 820 (也為cKit的抑制劑)及尼洛替尼(也為cKit及brc-abl的抑制劑)。其他治療劑也可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體?？笶GFR抗體的實例(但不限于)為西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab);小分子EGFR抑制劑的一個實例為吉非替尼(gefitinib)。EGFR調(diào)節(jié)劑的另一實例為EGF融合毒素。 尤其適用于與本發(fā)明的D114結(jié)合分子組合的EGFR及Her2抑制劑為拉帕替尼(Iapatinib)、吉非替尼、厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、凡德他尼(也為 VEGFR 的抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647, HKI-272、BMS-599626、ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788 (也為 VEGFR 的抑制劑)、ARRY-333786、MC-11F8、Zemab。宜在治療中與本發(fā)明的D114結(jié)合分子組合的其他藥物為替坦托西莫單抗(tositumumab tiuxetan)及替坦伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩種放射性標(biāo)記的抗0)20抗體)、阿侖單抗(alemtuzumab)( 一種抗0)52抗體)、地諾單抗(denosumab)( 一種破骨細(xì)胞分化因子配位體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)( 一種CD80拮抗劑)、奧法木單抗(ofatumumab)( 一種0)20抑制劑)、扎木單抗(zanolimumab)( 一種0)4拮抗劑)、SGN40 ( 一種⑶40配位體受體調(diào)節(jié)劑)、利妥昔單抗(rituximab)( 一種⑶20抑制劑)或馬帕木單抗(mapatumumab)( 一種TRAIL-1受體激動劑)?？膳c本發(fā)明的D114結(jié)合分子組合使用的其他化學(xué)治療藥物選自但不限于激素、激素類似物及抗激素藥(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷諾昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(f Iutamide)、尼魯米特(niIutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環(huán)丙麯辟彈騎(fludarabine)))；郭 It逾郭味 (a^ptJf 獅 (anthracycline)(咎^BbCVM (doxorubicin) >B*I獅 (daunorubicin) > ^BbCVM (epirubicin) ^辟 bCVM (idarubicin)r隊猶獅 -c (mitomycin-c) > _ 補獅 (bleomycin) >鍵煉_ D(dactinomycin) >*士獅 (PliCamyCin) >^^ptml (mitoxantrone) >H^^(pixantroner潘爾 _ (StrePtOZOCin))；惡^味蓉(宣咎 惡( Igpfr+^rHS^^(oxaliplatinr^fm (oarboplatinr^fm Qobaplatinr^fm-(g^r+^^pp^r+ly)) - 0逢(宣咎SM^fT (estramustine) >鐵^(meclorethamine) >#辭cv>(melphalan) >￥MM鐵(chlorambucilrDJS^(busulphanr^^E,#(Q-s3l^2;j^gr^ss猜(Qy^c^cg^ilo-g) > 袖項藉薄猜 Qicgp 曰IQ-①)>^_舞(hydroxyurea) > 頓 0 (temozolomider^^_M (nitrosourea)(宣咎士觸迎 tM(CarmUStine)^茶觸^fT (l〇mustine)r #m(thiotepa))；郭掛隊傘猶逢(宣咎沐#輯味蓉E狀(vincaalkaloids)，^^#E(vinblastiner^#s#(vindesiner^#羅M(vinorelbiner沐#麯I (VinflUnine)^沐順 戴(vincristine)；知減讀S5E(taxanes)，咎減讀@| ^①H-*r^到^讀 ,s-KiM 周蓉^4釀#*(larotaxelr^M^讀到| (SimOtaXel) ；^游_獅 (epothilone)，咎脅^[3麗(ixabepilonersiH^(patupilonerZK-EPO)；進(jìn)4了%甚攝君產(chǎn)逢(宣咎^^15挪 (epipodophyllotoxin) (咎貧^S_ (gr+〇p〇3lo-g)^>喪 (etopophos) .#/& _ (teniposide)r艱XnYS(amsacrinerm^#^(topotecanr^沖 # (irinotecan))， 漱盈矣.琢項^蓉，宣咎MsfT (amifostinerN'fp^ffll(anagrelider^F^ F\a-^E^(procarbaziner^^1 (mitotaner^p 丁制^蜜(porf imerrB^^Bfx (bexarotener >^^讀(CeleCOXib)。〔025亡澤。
〔025S 哲剄窆哲爹MSSELISA燁鈽7裳，鈄姉澀將餵丑m4ss燁鈽im將鈄姉SSD114f f M SSELISA 燁鈽姍澀她菩&鉺纓
25VHH以完全方式阻斷hDLL4/hNotchl-Fc相互作用，并且顯示了親和力成熟VHH在hDLL4/hNotchl-Fc競爭ELISA中的IC5tl (nM)值、及純化的親和力成熟VHH對重組人DLL4及小鼠DLL4的親和力KD (nM)。這表明對于與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病及病癥(例如癌癥)，本發(fā)明的D114結(jié)合分子為具有治療功效的有希望候選者。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供一種通過以下來診斷疾病的方法a)使樣品與如上文定義的本發(fā)明的D114結(jié)合分子接觸，及
b)檢測該D114結(jié)合分子對該樣品的結(jié)合，及c)將步驟(b)中檢測到的結(jié)合與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較，其中相對于該樣品的結(jié)合差異可診斷出與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病或病癥。對于此用途及其它用途，例如通過引入作為特異性結(jié)合對(例如生物素_(鏈菌素)抗生物素蛋白結(jié)合對)的一部分的官能團(tuán)來進(jìn)一步修飾本發(fā)明的D114結(jié)合分子可為有用的。此類官能團(tuán)可用于將本發(fā)明的D114結(jié)合分子與結(jié)合至該結(jié)合對另一半的另一蛋白、多肽或化合物進(jìn)行連接，即通過形成結(jié)合對而連接。例如，本發(fā)明的D114結(jié)合分子可接合至生物素并連接至與抗生物素蛋白或鏈親和素接合的另一蛋白、多肽、化合物或載體。例如，本發(fā)明的這些經(jīng)接合的D114結(jié)合分子可用作例如可檢測信號產(chǎn)生劑接合至抗生物素蛋白或鏈親和素的診斷系統(tǒng)中的報道基因。


圖I :人、恒河猴及短尾猴DLL4的氨基酸序列比對。圖2 :人及小鼠DLL4缺失突變體(上標(biāo)中為氨基酸域邊界)。圖3 :純化的 VHH 阻斷 hDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(ELISA)。圖4 :純化的 VHH 阻斷 hDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(AlphaScreen)。圖5 :純化的 VHH 阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl_Fc 和 CH0mDLL4/hNotchl_Fc 相互作用(FMAT)。圖6 :純化的VHH阻斷DLL4介導(dǎo)的Notchl裂解(報告基因)。圖7 :純化的VHH對重組人及小鼠DLL4的結(jié)合(ELISA)。圖8 :純化的VHH對重組人DLLl及人Jagged-I的結(jié)合(ELISA)。圖9 :純化的VHH對人/小鼠/短尾猴DLL4的結(jié)合(FACS)。圖10 :親和力成熟的VHH阻斷hDLL4/hNotchl_Fc相互作用(ELISA)。圖11 :親和力成熟的 VHH 阻斷 CH0-hDLL4/hNotchl-Fc 和 CH0mDLL4/hNotchl-Fc相互作用(FMAT)。圖12 :純化的VHH對人/小鼠DLL4的結(jié)合(ELISA)。圖13 :純化的親和力成熟的VHH對重組人DLLl及人Jagged-I的結(jié)合(ELISA)。圖14 :純化的VHH對人/小鼠/短尾猴DLL4的結(jié)合(FACS)。圖15 =VHH對Dl 14介導(dǎo)的HUVEC增殖抑制效應(yīng)的評估。材料和方法a)過度表達(dá)人、小鼠及短尾猴Dl 14的CHO及HEK293細(xì)胞株的產(chǎn)生使用按照相應(yīng)序列(參見表I ;SEQ ID N0:421至426)的5’及3’ UTR設(shè)計的寡核苷酸分別從人成人正常組織心臟cDNA文庫(BioChain, Hayward, CA, USA)及小鼠心臟組織cDNA文庫(分離自C57/B16株)擴(kuò)增編碼人(SEQ ID N0:417 ；NM_019074. 2)及小鼠D114(NM_019454. 3)的cDNA。將擴(kuò)增子克隆入哺乳動物表達(dá)載體pCDNA3. 1(+) -neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。表I :用于擴(kuò)增DLL4基因全長直系同源物(orthologue)的寡核苷酸序列。
人DLL4小鼠DLL4短尾.痕DLL4
>Fwd—hDLL4>Fwd—mDLL4>Fwd—cDLL4
GCGAACAGAGCCAGATTG GAGCGACATCCCTAACA GCGAAC AG AGCC AG
AGG__MjC__ATTCAGG_
>Rev_hDLL4>Rev_mDLL4>Rev_cDLL4
GGA 亍 GTCCAGGT AGGCTC CCTCAACTCTGTTCCCTT CC AG AC AG AC ACCC
CTG_[GG_ AAAGGT_使用根據(jù)親緣關(guān)系接近的物種恒河猴的D114編碼序列(稱猴(Macaca mulatta)D114，SEQ ID NO: 418 ；XM_001099250. I)的5’及3’UTR設(shè)計的引物，從短尾猴正常組織心臟cDNA文庫(BioChain, Hayward, CA, USA)擴(kuò)增短尾猴D114cDNA(參見表I)。最終將擴(kuò)增子克隆于哺乳動物表達(dá)載體pQ)NA3. I (+) -neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。顯示短尾猴Dl 14的氨基酸序列與恒河猴100% —致且與人99% —致(參見圖I ;與人序列的差異用粗體加下劃線標(biāo)示)。為了產(chǎn)生過度表達(dá)人D114、小鼠D114或短尾猴D114的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，分別用 pCDNA3. I (+)-neo_hD114、pcDNA3. I (+)-neo_mD114 或 pcDNA3. I (+)-neo_cD114 對親本CHO細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。過度表達(dá)人D114及小鼠D114的人胚腎(HEK293)細(xì)胞是通過分別使用 pCDNA3. I (+) -neo_hD114 質(zhì)?；?pCDNA3. I (+) -neo_mD114 質(zhì)粒的 Fugene (Roche)于HEK293親本細(xì)胞株中進(jìn)行脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的。對于所有條件，轉(zhuǎn)染子均通過添加lmg/mL 遺傳霉素(geneticin) (Invitrogen, Carlsbad CA, USA)來選擇。b)單克隆抗D114IgG及Fab片段的產(chǎn)生在US 2008/0014196 (Genentech)中，公開了人/小鼠交叉反應(yīng)性D114mAb，其由Ridgway等人(2006)使用以顯示大量異種移植模型中VEGF mAb及D114mAb對腫瘤生長的累加效應(yīng)。將該抗D114mAb及其相應(yīng)的Fab純化，以在生物化學(xué)/細(xì)胞分析及異種移植模型中針對噬菌體選擇期間的特異性洗脫來評估該抗體(片段)性質(zhì)。將所公開的D114mAb的可變重鏈及輕鏈序列克隆入hIgG2a K骨架中，在HEK293細(xì)胞中短暫表達(dá)且使用蛋白A色譜法自上清液純化。純化D114mAb在ELISA及FACS (使用CH0_mD114及CH0_hD114細(xì)胞)中顯示對人D114及小鼠D114的結(jié)合，在Biacore中顯示對兩種生長因子直系同源物(orthologue)的低于納摩爾的親和力。通過基于回譯(back-translation)及使用Leto’ s基因最佳化軟件(www.entechelon. com)針對大腸桿菌中的表達(dá)的密碼子最佳化的基因組裝來構(gòu)筑相應(yīng)的D114Fab片段。設(shè)計用于組裝可變輕鏈(')、可變重鏈(Vh)、恒定輕鏈(CJ及重鏈(Chi)的恒定區(qū)I的寡核苷酸引物，并進(jìn)行組裝PCR。分別使用限制位點SfiI、AscI及限制位點Kpnl、NotI，將編碼Vl+Cl&Vh+Ch1的cDNA區(qū)段克隆入源自pUC119的載體中，該載體含有LacZ啟動子、卡那霉素抗性基因、多克隆位點及雜交glll-pelB前導(dǎo)序列。在Fab編碼序列的框架內(nèi)，表達(dá)載體編碼C-末端HA及His6標(biāo)簽。Fab片段在大腸桿菌中表達(dá)為標(biāo)記His6的蛋白，且隨后通過固定化金屬親和力色譜法(IMAC)及尺寸排阻色譜法(SEC)從培養(yǎng)基純化。描述了可變重鏈及可變輕鏈的相關(guān)氨基酸序列(分別為US 2008/0014196的SEQ ID NO: I及SEQ ID NO:2);完全重鏈及輕鏈的氨基酸序列分別顯示于SEQ ID N0:419及420中。c)用于表位定位的D114突變體的產(chǎn)生為了鑒別包含可由抗D114VHH識別的表位的區(qū)域的D114的細(xì)胞外域(E⑶)，產(chǎn)生了 D114E⑶的漸進(jìn)缺失突變體。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含CMV啟動子的哺乳動物表達(dá)載體pSecTag2/Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),該啟動子位于編碼融合至聚His標(biāo)簽的D114ECD的一系列巢式缺失片段的聚核苷酸上游(參見圖2 ;上標(biāo)為氨基酸域邊界)。使用Freestyle 293表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(可從其中收集條件培養(yǎng)基)在經(jīng)短暫轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中表達(dá)這些重組蛋白，并通過IMAC純化。只有缺乏EGF2樣域的Dl 14突變體才顯示對上述人化人/小鼠交叉反應(yīng)性抗D114mAb (通過捕獲型 抗人IgG涂布的Biacore傳感器芯片來固定)的減弱結(jié)合。已知該IgG在該D114域中具有特異性結(jié)合表位(專利申請案Genentech，US2008/0014196A1)。d)D114報告分析質(zhì)粒的產(chǎn)生基本上如Struhl 及 Adachi, Cell. 1998 年 5 月 15 ;93 (4) : 649-60 所述，基于 y 分泌酶介導(dǎo)的Notchl裂解以及Dl 14刺激后Notchl細(xì)胞內(nèi)域(NI⑶)的核轉(zhuǎn)位來開發(fā)報告分析(reporter assay)。將Gal4/VP 16編碼序列插入NIO)編碼序列中。有效雜交轉(zhuǎn)錄活化因子GAL4-VP16插入Notchl跨膜域的羧基末端，該因子由融合至單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄活化域VP16的酵母GAL4DNA結(jié)合片段組成。Y分泌酶將該構(gòu)建體裂解，導(dǎo)致Gal4/VP16NI⑶融合蛋白的釋放，其將該蛋白轉(zhuǎn)位至核，在核中該融合蛋白將結(jié)合至(并以轉(zhuǎn)錄方式激活)含有強(qiáng)力GAL4-UAS啟動子序列的共轉(zhuǎn)染的熒光素酶報告質(zhì)粒(Struhl，G.及Adachi，A.，Cell,第 93 卷，649-660，1998)。將人 Notchl_Gal4/VP 16 表達(dá)盒(expression cassette)克隆于pcDNA3. I(+)-neo(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。將 pGL4. 31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro]載體(Promega，Madison，WI，USA)用作熒光素酶報告質(zhì)粒。實施例I使用來自不同物種的D114免疫來誘導(dǎo)美洲駝(llama)中的體液免疫反應(yīng)I. I.免疫化在經(jīng)獸醫(yī)學(xué)學(xué)院的倫理委員會(theEthical Committee of the faculty ofVeterinary Medicine, University Ghent, Belgium)批準(zhǔn)之后，通過 6 次肌內(nèi)注射(以每周一次的間隔，每次給藥 100 或 50 ii g)重組人 D114(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)來使4只美洲駝(命名為第208、209、230、231號)免疫化。用Stimune (Cedi DiagnosticsBV, Lelystad, The Netherlands)調(diào)配D114抗原。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案,通過4次交替皮下注射如上所述產(chǎn)生的過度表達(dá)人D114的CHO細(xì)胞及過度表達(dá)小鼠D114的CHO細(xì)胞來使另外三只美洲駝(命名為第127b、260、261號)免疫化。將細(xì)胞再混懸于DPBS中且在注射之前保存在冰上。此外，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，通過4次交替肌內(nèi)注射(以兩周一次的間隔，每次給藥 100 或 50iig)重組人 D114 及小鼠 D114(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)來使另外三只美洲駝(命名為第282、283、284號)免疫化。第0天含有人D114的首次注射液是用弗氏完全佐劑(Complete Freund’s Adjuvant, Difco, Detroit, MI, USA)調(diào)配的，而隨后含有人及小鼠D114的注射液是用弗氏不完全佐劑(Incomplete Freun d’s Adjuvant,Difco, Detroit, MI, USA)調(diào)配的。1.2.美洲駝中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的評估為了通過ELISA評估動物中對抗人D114的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，在第0天(免疫前)、第21天及第43天(收集外周血液淋巴細(xì)胞[PBL]的時間)從美洲駝208、209、230及231收集血清；在第0天及第51天從美洲駝127b、260及261收集血清；且在第0天、第28天及第50天從美洲駝282、283及284收集血清。簡言之，g/mL重組人 D114 或小鼠 Dl 14 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)在 4 °C 于 96 孔 MaxiSorp 培養(yǎng)板(Nunc, Wiesbaden, Germany)中固定過夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。在添加血清稀釋液之后，使用辣根過氧化酶(HRP)接合的羊抗美洲駝免疫球蛋白(BethylLaboratories Inc. , Montgomery, TX, USA)且接著使用底物 TMB (3, 3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺)(Pierce, Rockford, IL, USA)存在下的酶促反應(yīng)來檢測經(jīng)特異性結(jié)合的免疫球蛋白，從而顯示誘導(dǎo)對抗D114的顯著抗體依賴性免疫反應(yīng)?？贵w反應(yīng)是由表達(dá)常規(guī)抗體的B細(xì)胞譜系及表達(dá)僅有重鏈的抗體的B細(xì)胞譜系來發(fā)動，因為經(jīng)特異性結(jié)合的免疫球蛋白可用特異性識別常規(guī)美洲駝IgGl抗體或僅有重鏈的美洲駝IgG2或IgG3抗體的抗體來檢測(表 2-A)。在所有注射小鼠D114的美洲駝中，抗體反應(yīng)由表達(dá)常規(guī)抗體及僅有重鏈的抗體的、特異性針對小鼠D114的B細(xì)胞發(fā)動。另外，經(jīng)細(xì)胞免疫的動物的血清效價是通過對過度表達(dá)人及小鼠D114的HEK293細(xì)胞進(jìn)行FACS分析來確認(rèn)的(表2-B)。各美洲駝的D114血清效價反應(yīng)見于表2中。表2 :抗體介導(dǎo)的對抗DLL4的特異性血清反應(yīng)A) ELISA (重組蛋白，涂布于固相上)........................................................................................................................................................................................亨組人 P.LL4..................................................................................................................................................................組:.卜..........................................
美洲駝—免疫原總 IgG IgGl IgG2 IgG3 IjlgG IgGI IgG2 IgG廠
208重組人DLL4 + — I "f* I Hh/<- I Hh/<- III
209— ~ 涵X DL~^+ ; ^^^"ND^^~ND^ NP — ItO^
230重組人 DLL4 ++ ++ H- H- ND ND ND NP
231重組人 DLL4 ++ 十 + ++ ++ ND ND ND ND CHOmUA
127b +++ ++ +/- +/- + ++ +/- +/-
CHO-mPLL4
.....................................CHO-hDLL4......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
260 + +++++ + +++++++
__CHO-mDLL4_________
CHO-hDLL4
261-f~^i~ 今I— 今I -~f~令畫—~l~/—
__CHO-mPLL4_________
282重，t DLL4 ++ ++ ++ ++ ++ ++ + +
__十小鼠DLL4_________
重組人DLL4
283, ^ ++ ++ ++ .+■ H ++ ++ ++__十小鼠DLL4_________
重組人DLL4
284+ + + + ++++++__十小鼠DLL4_________ND :未測定B) FACS (HEK293細(xì)胞上的天然表達(dá)蛋白)
權(quán)利要求
1.ー種D114結(jié)合分子，其包含至少ー個具有四個框架區(qū)和三個分別為⑶R1、⑶R2及CDR3的互補決定區(qū)的可變域，其中CDR3具有選自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列a.SEQ ID NO: I 至 166 及 458，b.SEQID NO:333 至 353，或c.SEQID NO:375 至 395。
2.權(quán)利要求I的D114結(jié)合分子，其為分離的免疫球蛋白單一可變域，或其為含有ー個或多個所述免疫球蛋白單一可變域的多肽，其中所述免疫球蛋白單一可變域由四個框架區(qū)和三個分別為⑶R1、⑶R2及⑶R3的互補決定區(qū)組成，且其中⑶R3具有選自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列a.SEQ ID NO: I 至 166 及 458，b.SEQID NO:333 至 353，或c.SEQID NO:375 至 395。
3.權(quán)利要求2的D114結(jié)合分子，其中所述ー個或多個免疫球蛋白單一可變域含有 a.⑶R3，其具有選自SEQID NO: I至166中所示的第一組氨基酸序列的氨基酸序列； b.⑶Rl和⑶R2，其具有如表5中所示的作為部分序列形式包含于選自SEQID NO: 167至332及459中所示的第二組氨基酸序列的序列中的氨基酸序列； 其中SEQ ID No 1-166的第一組的SEQ ID NO:x對應(yīng)于第二組的SEQ ID NO:y，其中y=x+1660
4.權(quán)利要求2的D114結(jié)合分子，其中該ー個或多個免疫球蛋白單一可變域含有 a.⑶R3，其具有選自SEQID NO: 333至353中所示的第一組氨基酸序列的氨基酸序列； >b.⑶Rl及⑶R2，其具有如表16-A中所示的作為部分序列形式包含于選自SEQIDNO:354至374中所示的第二組序列的序列中的氨基酸序列； 其中第一組的SEQ ID NO:X對應(yīng)于第二組的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
5.權(quán)利要求2的D114結(jié)合分子，其中該ー個或多個免疫球蛋白單一可變域含有 a.⑶R3，其具有選自SEQID NO: 375至395中所示的第一組氨基酸序列的氨基酸序列； b.⑶Rl及⑶R2，其具有如表16-B中所示的作為部分序列形式包含于選自SEQIDNO:396至416中所示的第二組序列的序列中的氨基酸序列； 其中第一組的SEQ ID NO:X對應(yīng)于第二組的SEQ ID NO:y，其中y=x+21。
6.權(quán)利要求2至5中任ー項的Dl14結(jié)合分子，其中所述ー個或多個免疫球蛋白單一可變域為VHH。
7.權(quán)利要求6的D114結(jié)合分子，其中所述ー個或多個VHH具有選自SEQID N0:167至332及459中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的D114結(jié)合分子，其中所述ー個或多個VHH具有選自SEQID N0:354至374中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6的D114結(jié)合分子，其中所述ー個或多個VHH具有選自SEQID N0:396至416中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
10.ー種免疫球蛋白單一可變域，其通過使權(quán)利要求3中定義的免疫球蛋白單ー可變域親和カ成熟而獲得。
11.ー種VHH，其通過使權(quán)利要求7中定義的VHH親和カ成熟而獲得。
12.—種VHH，其具有選自SEQ ID N0:356及358中所示氨基酸序列的氨基酸序列。
13.—種免疫球蛋白單一可變域，其通過使權(quán)利要求12中定義的VHH人化而獲得。
14.ー種VHH，其具有選自SEQ ID N0:402、407及416中所示序列的氨基酸序列。
15.ー種免疫球蛋白單一可變域，其通過使權(quán)利要求14中定義的VHH人化而獲得。
16.—種免疫球蛋白單一可變域，其通過使權(quán)利要求3中定義的免疫球蛋白單ー可變域人化而獲得。
17.ー種免疫球蛋白單一可變域，其通過使權(quán)利要求10中定義的免疫球蛋白単一可變域人化而獲得。
18.權(quán)利要求I的D114結(jié)合分子，其結(jié)合至完全或部分含于EGF-2域內(nèi)的D114的表位，該EGF-2域?qū)?yīng)于SEQ ID NO: 417的氨基酸殘基252至282。
19.權(quán)利要求18的D114結(jié)合分子，其為免疫球蛋白單一可變域或含有該免疫球蛋白單一可變域的多肽。
20.ー種核酸分子，其編碼權(quán)利要求I至19中任ー項的D114結(jié)合分子或含有其的載體。
21.—種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求20的核酸分子。
22.藥物組合物，其含有至少ー種權(quán)利要求I至19中任ー項的D114結(jié)合分子作為活性成分。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其用于治療與D114介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)的疾病。
24.權(quán)利要求22的藥物組合物，其用于治療癌癥及癌性疾病。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，其用于治療眼病。
26.—種肽，其包含具有選自如下所示氨基酸序列的氨基酸序列的序列a.SEQ ID NO: I 至 166 及 458， b.SEQID NO:333 至 353，或c.SEQID NO:375 至 395。
27.ー種核酸分子，其編碼權(quán)利要求26的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及Dll4結(jié)合分子，優(yōu)選Dll4結(jié)合免疫球蛋白單一可變域，如VHH和VH，包含它們的藥物組合物，及其在治療與Dll4介導(dǎo)的血管生成作用相關(guān)疾病中的用途。本發(fā)明涉及還結(jié)合VEGF-A的雙特異性Dll4結(jié)合分子。本發(fā)明涉及編碼Dll4結(jié)合分子的核酸、宿主細(xì)胞及其制備方法。
文檔編號C07K16/28GK102648210SQ201080054889
公開日2012年8月22日 申請日期2010年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者A.格什溫, D.范胡里克, E.伯吉斯, E.德塔沃尼爾, J.科爾克曼, J.鮑克尼厄, P.麥切爾斯 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司