專利名稱：肝細胞生長因子激活劑的調控物的制作方法
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一般而言，本發(fā)明涉及分子生物學和生長因子調節(jié)領域。更具體的說，本發(fā)明涉及肝細胞生長因子激活劑功能的調控物，及所述調控物的用途。背景肝細胞生長因子激活劑(HGFA)是一種血漿胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，主要由 肝分泌，調節(jié)肝細胞生長因子(HGF，也稱作散射因子(SF))的促有絲分裂、促運動、和促形態(tài)發(fā)生活性(Shimomura et al. , Cytotech. , 8:219-229 (1992)) HGF 涉及胚胎發(fā)育、組織再生和侵入性腫瘤生長。此活性需要將HGF蛋白水解加工成雙鏈、二硫化物連接的a, ￠-異二聚體形式。HGFA是至今鑒定的最有效力的HGF激活劑之一(Shimomura etal.，Eur. J. Biochem. 229 (1995))。已經(jīng)報告了正常胃腸腎組織中、及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中、以及胰、肝細胞、結腸直腸、前列腺、和肺癌細胞中的HGFA表達(Itoh et al. , Biochim.Biophys.Acta, 1491:295-302(2000);van Adelsberg et al.，J. Biol. Chem.，276:15099-15106(2001);Hayashi et al. , Brain Res. , 799:311-316(1998);Moriyama et al. , FEBSLett. , 372:78-82 (1995) ;Parr et al. , Int.J.Oncol., 19:857-863(2001);Kataoka et al. , Cancer Res.，60:6148-6159(2000);Nagata et al. , Biochem. Biophys. Res.Comm.，289:205-211 (2001))。最近，已經(jīng)將來自多發(fā)性骨髓瘤細胞的HGFA分泌與HGF有力的旁和/或自分泌效應聯(lián)系起來(Tjin et al. ,Blood, 104:2172-2175(2004))。HGFA作為96kDa酶原(proHGFA)分泌，具有與凝血因子XII (FXIIa)相似的域結構，包含6個結構域。那些結構域包括N端纖連蛋白II型域、表皮生長因子(EGF)樣域、纖連蛋白I型域、另一個EGF樣域、三環(huán)域、和C端胰蛋白酶同源性絲氨酸蛋白酶域(Miyazawa, et al.，J. Biol. Chem.，268:10024-10028 (1993))。殘基 Arg372 和 Val373 之間激肽釋放酶敏感性位點處的切割可生成缺失頭5個域的34kDa短形式。HGFA原的96kDa和34kDa兩種形式都能在殘基Arg407和Ile408之間被凝血酶切割成活性HGFA(Shimomuraet al.，J. Biol. Chem.，268，22927-22932 (1993))。凝血酶是促凝刺激的最終效應器，而且活性HGFA的生成會與傷口修復中的HGF活性一致(Bussolino et al. , J. CellBiol.，119:625-641(1992))。在影響HGF/Met信號傳導的因素中有HGFA原的活化和隨后HGFA的抑制。所鑒定的HGFA生理性抑制劑是剪接變體HAI-I和HAI-IB (肝細胞生長因子激活劑抑制劑_1)、和 HAI-2 (也稱作胎盤雙庫尼茨抑制劑(bikunin) ) (Shimomura et al. , J. Biol. Chem.,272:6370-6376(1997);Kawaguchi et al.，J. Biol. Chem.，272:27558-27564 (1997); Kirchhofer et al.，J. Biol. Chem. 278:36341-36349 (2003))。HGFA 具有有限的底物特異性(Kataoka et al. , Cancer metastasis reviews 22，223-239 (2005);Miyazawa et al. ,JBiol Chem 268, 10024-10028(1993)):只知道兩種大分子底物，肝細胞生長因子原(HGF原)(Shinomura et al. , Eur J Biochem 229，257-261 (1995))和巨噬細胞刺激性蛋白原(MSP 原)(Kawaguchi et al, Febs J 276 (13) 3481-3490 (2009))受到 HGFA 加工，例示該酶高度有限的底物特異性。HGFA受到庫尼茨(Kunitz)型抑制劑HGFA抑制劑-I抑制，后者利用N端庫尼茨域-I (KDl)通過規(guī)范抑制機制來抑制HGFA (Shia et al.，J Mol Biol346，1335-1349 (2005))。HGFA經(jīng)HGF原加工及隨之發(fā)生的HGF/Met信號傳導途徑激活來影響組織再生并促進癌生長(Parr and Jiang, Int，I J of Oncol 19, 857-863 (2001)) 根據(jù)定義，酶的變構調節(jié)涉及改變的源自遠端效應器相互作用位點的催化活性。事實上，似乎所有機能蛋白(單體的和多聚體的)都具有變構的潛力(Gunasekaranet al. ,Proteins 57，433-443 (2004))。變構調控及其通訊途徑的闡釋得到了可觀的關注(Swain and Gierasch, Curr Op in Structural Biol 16，102-108 (2006) ; Yu andKosh I and, PNAS 98, 9517-9520 (2001)) 在血紅蛋白中觀察到變構的一個經(jīng)典例子(Perutz, Nature 228，726-739 (1970))，其第一次提供對變構調節(jié)機制的了解。其后出現(xiàn)了數(shù)項X射線結晶學研究,描述變構調節(jié)期間的構象變化(Changeux and Edelstein, Science308, 1424-1428(2005);DiCera, J Biol Chem 281，1305-1308(2006);Pellicena a ndKuriyan, Nature 228，726-739 (2006) ; Xu et al. , Nature 388, 741-750 (1997)) 變構還是一種相當普通的且有力的調節(jié)蛋白酶的催化活性的機制(Hauske et al. , Chembiochem9, 2920-2928 (2008) ; Turk, Nature Reviews 5,785-799(2006))。與活性位點不同，位于遠端的變構位點通常不太保守，而且可用于實現(xiàn)特異性(Hauske et al.，supra)。變構性抗蛋白酶基于蛋白質的藥劑具有巨大的治療潛力，因為它們是有力的且高度特異性的，而且針對它們的靶蛋白酶的任何無意加工得到防護。絲氨酸蛋白酶家族(Clan PA，MER0PS命名法中的家族 SI (Rawlings et al. , Nucleic Acids Res 36，D320-325 (2008)))中的變構調節(jié)劑的例子有HtrA蛋白酶家族中的附屬PDZ域(Sohn et al. ,Cell 131,572-583(2007))、對許多凝血因子而言的鈣(Bjelke et al. , J Biol Chem 283，25863-25870 (2008))、對凝血酶而言的鈉(Huntington, Biological chemistry 389，1025-1035 (2008) ; Wells andDi Cera, Biochem 31，11721-11730 (1992))、對凝血因子Vila而言的輔因子諸如組織因子(Eigenbrot and Kirchhofer, Trends in Cardiovascular Med 12, 19-26 (2002))和進入“活化口袋”的 N 端妝插入(Friedrich et al. , Nature 425，535-539 (2003) ;Huber andBode, Acc Chem Res 11,114-122(1978))。已經(jīng)將蛋白酶與許多人病理過程聯(lián)系起來(Barrett et al. , (1998). Handbookof Proteolytic Enzymes. San Diego: Academic Press (1998);Egeblad and fferb, NatureRev Cancer 2，161-174(2002);Hooper, Proteases in Biology and Medicine. In Essaysin Biochemistry, London:Portland Press (2002);Luttun et al. , Curr Atheroscler. Rep2，407-416(2000))。因此，通過變構抑制劑來調節(jié)蛋白水解活性可能代表活性位點抑制劑的一種有希望的備選辦法(Peterson and Golemis, J Cell Biochem 93, 68-73 (2004)),活性位點抑制劑常常遭受不當?shù)奶禺愋裕驗榛钚晕稽c拓撲學在同一家族的成員間一般是保守的(Hedstrom，Chem Revs 102，4501-4524(2002))。與活性位點不同，位于遠端的變構位點通常不太保守，而且可用于實現(xiàn)特異性(Hauske et al.，supra)。已經(jīng)對凝血因子VIIa和胱天蛋白酶描述了特異性的且有力的變構抑制劑的卓越例子(Hardyet al. , PNAS 101，12461-12466(2004);Hardy and Wells, Curr Op Structural Biol14，706-715(2009))。由于HGF原的活化需要轉變酶諸如HGFA的切割，因此HGFA功能和/或它與其底物相互作用的調控可證明是有效的治療途徑。在這點上，顯然需要能夠調控HGFA活性和/或特異性與HGFA相互作用的臨床相關藥劑。本發(fā)明滿足了這一需求并提供了其它好處。通過述及將所有出版物、專利、和專利文件收入本文，就像通過述及個別收錄。發(fā)明公開本發(fā)明提供了方法、組合物、試劑盒和制品，用于調控肝細胞生長因子激活劑(HGFA)的功能，由此調控HGFA活性的生理學作用。HGFA功能的調控可通過使用本文所述
抗體來實現(xiàn)。本文中描述變構抑制HGFA功能的抗HGFA抗體。變構性抗蛋白酶抗體可具有巨大的治療潛力，因為它們是有力的且高度特異性的，而且針對它們靶蛋白酶的任何無意加工得到防護。在一個方面，本發(fā)明提供適合治療用途且能夠實現(xiàn)不同程度對HGF/c-met信號傳導途徑破壞的抗HGFA治療劑。例如，本發(fā)明提供分離的抗HGFA抗體，其中全長IgG形式的該抗體以小于或等于20pm的結合親和力特異性結合人HGFA。在一個實施方案中，該分離的抗HGFA抗體以約lOXlO^fY1或更快的Km特異性結合人HGFA。在一個實施方案中，該分離的抗HGFA抗體以約I. TXlO-4S-1或更慢的Ktjff特異性結合人HGFA。在一個實施方案中，本發(fā)明提供親和力成熟的抗HGFA抗體，其中該抗體對人HGFA的二價親和力比參照抗體的二價親和力低，例如低至少3、5、7或10倍或更多，諸如40倍或60倍或更多，參照抗體包含下述各項、由下述各項組成或基本上由下述各項組成(a)包含序列 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSYITPPT(SEQ ID NO:7)的 HVR-L3 ; (d)包含序列 GTHH(SEQ IDNO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。如本領域中所完善確立的，配體對其受體的結合親和力可以使用多種測定法之任一種來測定，并以多種定量數(shù)值表示。因而，在一個實施方案中，結合親和力以Kd值表示，并反映內在結合親和力(例如具有最小化的親合效應)。一般且優(yōu)選地，結合親和力是在體外測量的，無論在無細胞的或細胞相關的環(huán)境中。如本文中更為詳細描述的，結合親和力的倍數(shù)差異可根據(jù)人源化抗體(例如以Fab形式)的單價結合親和力數(shù)值和參照/比較抗體(例如以Fab形式)(例如具有供體高變區(qū)序列的鼠抗體)的單價結合親和力數(shù)值的比率量化，其中所述結合親和力數(shù)值是在相似測定條件下測定的。如此，在一個實施方案中，結合親和力的倍數(shù)差異是作為Fab形式人源化抗體和所述參比/比較Fab抗體的Kd值比率測定。例如，在一個實施方案中，如果本發(fā)明抗體(A)具有比參比抗體(M)的親和力“低3倍”的親和力，那么A的Kd值是3x，M的Kd值是lx，而A的Kd對M的Kd的比率是3:1。相反，在一個實施方案中，如果本發(fā)明抗體(C)具有比參比抗體(R)的親和力“高3倍”的親和力，那么C的Kd值是lx，R的Kd值是3x，而C的Kd對R的Kd的比率是1:3。本領域已知的許多測定法中的任一種，包括那些本文所描述的，都可用于獲取結合親和力測量，包括例如Biacore、放射免疫測定法(RIA)和ELISA。在一個方面，本發(fā)明提供分離的抗HGFA抗體，其中該抗體結合HGFA殘基446，449，450, 452, 453, 455, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 496, 499, 501，578，579，580, 636，637，640, 643，644中至少一個殘基、兩個殘基、三個殘基、四個殘基、或
任何數(shù)目殘基，直至所有殘基，且進一步地其中該抗體變構抑制HGFA并與HGFA活性位點封閉劑 KDl 或 Ac-KQLR-氯甲基酮(Ac-KQLR-chloromethyl ketone) (〃KQLR〃披露為 SEQ IDNO: 10)競爭對HGFA的結合，但不與芐脒競爭對HGFA的結合。在一些實施方案中，該抗體在封閉HGFA活性(催化)位點的化合物缺失下結合HGFA，但在封閉HGFA活性位點的化合物存在下不結合HGFA。在一些實施方案中，該抗體競爭性抑制HGFA對HGFA底物的活化。在一些實施方案中，該抗體結合 HGFA 殘基 449，450，452，482，484，485，486，487，488，489，490，491中至少一個殘基、兩個殘基、三個殘基、四個殘基、或任何數(shù)目殘基，直至所有殘基。在一些實施方案中，該抗體結合HGFA殘基446，482，484，490，499，501中至少一個殘基、兩個殘基、三個殘基、四個殘基、或任何數(shù)目殘基，直至所有殘基。在一個方面，本發(fā)明提供分離的抗HGFA抗體，其包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、和/或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSNRAPAT(SEQ ID NO:3)的 HVR-L3 ； (d)包含序列 GTHH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY (SEQ IDNO:6)的HVR-H3。在一些實施方案中，HVR-Hl包含序列NGTYIH(SEQ ID N0:43)。在一些實施方案中，HVR-Hl包含序列GFTFNGTYIH(SEQ ID N0:44)。在一些實施方案中，HVR-H2包含序列 GGIYPAGGATYY (SEQ ID NO: 45)。在一些實施方案中，HVR-H3 包含序列 KffffAWPAFDY (SEQID NO:46)。在一個方面，本發(fā)明提供抗HGFA抗體，其包含輕鏈，該輕鏈包含(a)包含序列RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ;(c)包含序列 QQSNRAPAT (SEQ ID NO: 3)的 HVR-L3。在一個方面，本發(fā)明提供抗HGFA抗體，其包含重鏈，該重鏈包含(a)包含序列GTYIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ; (b)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的HVR-H2 ;和(c)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。在一個方面，本發(fā)明提供抗HGFA抗體，其包含輕鏈和重鏈可變區(qū)，該輕鏈包含(a)包含序列 RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO:2)的HVR-L2 ； (c)包含序列QQSNRAPAT (SEQ ID NO:3)的HVR-L3 ;該重鏈可變區(qū)包含(d)包含序列 GITIH (SEQ ID NO: 4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗HGFA抗體包含輕鏈可變域，且進一步包含重鏈可變域，該輕鏈可變域具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8) 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗HGFA抗體包含重鏈可變域，且進一步包含輕鏈可變域，該重鏈可變域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗HGFA抗體包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域具有序列DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8);該重鏈可變域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYffGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。本發(fā)明的抗體可進一步包含任何合適的框架和/或輕鏈可變區(qū)序列，只要HGFA結合活性基本上得到保留。例如，在有些實施方案中，這些抗體還包含人亞型III重鏈框架共有序列。在這些抗體的一個實施方案中，所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在這些抗體的某些實施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A0在一個實施方案中，這些抗體包含人源化4D5抗體(huMAb 4D5-8) (HERCEPT丨Ni'Genentech, Inc. , South SanFrancisco, CA, USA)的重鏈可變區(qū)框架序列(還可參閱美國專
利 6，407，213 和 Lee et al.，J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-93 (2004))。在一個實施方案中，該人源化4D5-8抗體如美國專利6，407，213中所述。在一個實施方案中，這些抗體還包含人K I輕鏈框架共有序列。一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體競爭結合HGFA的抗體。一方面，本發(fā)明提供了結合HGFA上與任何上述抗體所結合表位相同的表位的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明抗體是親和成熟的、人源化的、嵌合的或人的。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是抗體片段(如本文所述)或基本上全長的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明抗體包含野生型Fe區(qū)或其變體。在一個實施方案中，本發(fā)明抗體是IgG(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE 或 IgD。一方面，本發(fā)明的抗體與毒素諸如細胞毒劑連接。這些分子/物質可與添加劑/增強劑聯(lián)合配制或施用，諸如放射和/或化療劑。HGF/c-met信號途徑涉及多種生物學和生理學功能，包括例如細胞生長刺激(例如細胞增殖、細胞存活、細胞遷移、細胞形態(tài)發(fā)生)和血管發(fā)生。因此，另一方面，本發(fā)明提供了抑制c-met激活的細胞生長(例如增殖和/或存活)的方法，所述方法包括使細胞或組織接觸本發(fā)明的抗體，由此使與c-met活化有關的細胞增殖受到抑制。另一方面，本發(fā)明提供了抑制血管發(fā)生的方法，所述方法包括對具有異常血管發(fā)生相關狀況的細胞、組織和/或受試者施用本發(fā)明的抗體，由此使血管發(fā)生受到抑制。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的核酸在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達載體在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂?！矫?，本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細胞在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂。一方面，本方面提供了本發(fā)明的試劑盒在藥物制備中的用途，所述藥物用于疾病的治療性和/或預防性處理，所述疾病諸如癌癥、腫瘤、細胞增殖性紊亂、免疫(諸如自身免疫)紊亂和/或血管發(fā)生相關紊亂。一方面，本發(fā)明提供了抑制c-met激活的細胞增殖的方法，所述方法包括使細胞或組織接觸有效量的本發(fā)明抗體，由此使與c-met活化有關的細胞增殖受到抑制。一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中與c-met活化的調節(jié)異常有關的病理狀況的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明抗體，由此使所述疾病得到治療。 一方面，本發(fā)明提供了抑制表達c-met或肝細胞生長因子或二者的細胞生長的方法，所述方法包括使所述細胞接觸本發(fā)明的抗體，由此引起所述細胞的生長抑制。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF (例如通過旁分泌作用)。一方面，本發(fā)明提供了治療性處理患癌性腫瘤的哺乳動物的方法，該腫瘤包含表達c-met或肝細胞生長因子或二者的細胞,所述方法包括對所述哺乳動物施用有效量的本發(fā)明抗體分子，由此有效治療所述哺乳動物。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF (例如通過旁分泌作用)。—方面，本發(fā)明提供了用于治療或預防與HGFA的表達或活性增加有關的細胞增殖性紊亂的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的本發(fā)明抗體，由此有效治療或預防所述細胞增殖性紊亂。在一個實施方案中，所述增殖性紊亂是癌癥。一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預防與c-met或肝細胞生長因子或二者的表達或活性增加有關的細胞增殖性紊亂的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的本發(fā)明抗體，由此有效治療或預防所述細胞增殖性紊亂。在一個實施方案中，所述增殖性紊亂是癌癥?！矫?，本發(fā)明提供了用于抑制細胞生長的方法，其中所述細胞的生長至少部分依賴于HGFA的生長強化作用，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明抗體，由此抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF(例如通過旁分泌作用)。一方面，本發(fā)明提供了用于抑制細胞生長的方法，其中所述細胞的生長至少部分依賴于c-met或肝細胞生長因子或二者的生長強化作用，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明抗體，由此抑制所述細胞的生長。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF (例如通過旁分泌作用)。一方面，本發(fā)明提供了治療性處理哺乳動物中腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長至少部分依賴于HGFA的生長強化作用，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明抗體，由此有效治療所述腫瘤。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF (例如通過旁分泌作用)。一方面，本發(fā)明提供了治療性處理哺乳動物中腫瘤的方法，其中所述腫瘤的生長至少部分依賴于c-met或肝細胞生長因子或二者的生長強化作用，所述方法包括使所述細胞接觸有效量的本發(fā)明抗體，由此有效治療所述腫瘤。在一個實施方案中，所述細胞接觸由不同細胞表達的HGF (例如通過旁分泌作用)。本發(fā)明的方法可用于影響任何合適的病理狀態(tài)，例如與HGF/c-met信號途徑調節(jié)異常有關的細胞和/或組織，例如通過與HGFA對HGF的活化作用有關的HGF活性增加。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細胞是癌細胞。例如，癌細胞可選自乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞(例如甲狀腺的)、結腸癌細胞、胰乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞、骨源性肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、前列乳腺癌細胞、胃癌細胞、頭和頸鱗狀癌細胞、間皮瘤細胞、黑素瘤細胞和白血病細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細胞是過度增殖的和/或過度增生的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細胞是發(fā)育異常的細胞。在另一實施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細胞是轉移的細胞。本發(fā)明的方法可進一步包括另外的處理步驟。例如，在一個實施方案中，該方法還
包括其中將祀細胞和/或組織(例如癌細胞)暴露于放射處理或化療劑的步驟。如本文所述，HGF/c-met的活化是重要的生物學過程，它的調節(jié)異常導致許多病理狀況。因此，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所靶向的細胞(例如癌細胞)是其中HGF/c-met的活化與相同組織起源的正常細胞相比增強的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法引起靶細胞的死亡。例如，與本發(fā)明調控物分子的接觸可導致細胞不能通過c-met途徑發(fā)信號，這導致細胞死亡。c-met活化(及由此信號傳導)的調節(jié)異常可源自許多細胞變化，包括例如HGF(c-met的關聯(lián)配體)和/或HGFA的過表達，和/或HGFA對HGF的活化作用增加。因此，在有些實施方案中，本發(fā)明的方法包括靶向這樣的組織，與相同起源的正常組織相比，其中表達和/或存在的HGFA、c-met和肝細胞生長因子中的一種或多種更豐富(例如癌)。表達HGF或c-met的細胞可受到來自多種來源的HGFA調節(jié)，即以自分泌或旁分泌的方式。例如，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，使靶細胞受到被不同細胞所表達的HGFA活化的肝細胞生長因子的接觸/結合(例如通過旁分泌作用)。所述不同細胞可以是相同或不同組織起源的。在一個實施方案中，使靶細胞受到被靶細胞自身所表達的HGFA活化的HGF的接觸/結合(例如通過自分泌作用/環(huán))。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的一種或多種抗體及載體的組合物。在一個實施方案中，所述載體是藥學可接受的。一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體的核酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼調控物分子，其是或者包含抗體或其片段。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。—方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何類型的，例如重組載體，諸如表達載體?？墒褂枚喾N宿主細胞中的任一種。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞，例如大腸桿菌。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了制備調控物分子的方法，該調控物分子是或者包含抗體(或其片段)，所述方法包括在合適的宿主細胞中表達編碼所述抗體(或其片段)的本發(fā)明重組載體，并回收所述抗體。一方面，本發(fā)明提供了包括容器及該容器內所裝有的組合物的制品，其中所述組合物包含本發(fā)明的一種或多種抗體。在一個實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個實施方案中，包含抗體的組合物還包含載體，它在有些實施方案中是藥學可接受的。在一個實施方案中，本發(fā)明的制品還包括關于對受試者施用所述組合物(例如抗體)的說明書。一方面，本發(fā)明提供了包括第一容器和第二容器的試劑盒，其中第一容器裝有包含本發(fā)明的一種或多種抗體的組合物，而第二容器裝有緩沖劑。在一個實施方案中，所述緩沖劑是藥學可接受的。在一個實施方案中，包含抗體的組合物還包含載體，它在有些實施方案中是藥學可接受的。在一個實施方案中，試劑盒還包括關于對受試者施用所述組合物(例如抗體)的說明書。一方面，本發(fā)明提供了診斷疾病的方法，包括通過使樣品接觸本發(fā)明的抗體來測 定組織細胞待測樣品中的HGFA水平，由此被所述抗體結合的HGFA指示樣品中HGFA的存在和/或量。另一方面，本發(fā)明提供了測定個體是否有患病風險的方法，包括通過使待測樣品接觸本發(fā)明的抗體來測定組織細胞待測樣品中的HGFA水平，由此測定樣品中存在的HGFA的量，其中與包含與待測樣品細胞起源相同的正常組織的對照樣品相比，待測樣品中HGFA水平較高指示該個體有患病風險。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，HGFA水平是基于HGFA多肽的量測定的，而后者由待測樣品中抗體所結合的HGFA量指示。所述方法中所采用的抗體可任選進行可檢測標記，附著于固相支持物，等等。一方面，本發(fā)明提供了使本發(fā)明抗體與體液例如血液中存在的HGFA結合的方法。另一方面，本發(fā)明致力于使本發(fā)明抗體與表達和/或響應HGFA的細胞結合的方法，其中所述方法包括在適于所述抗體與HGFA結合且允許它們之間結合發(fā)生的條件下使所述細胞接觸所述抗體。在一個實施方案中，所述抗體與細胞上的HGFA的結合抑制HGFA的生物學功能。在一個實施方案中，所述抗體不抑制HGFA與其底物分子的相互作用。在一個實施方案中，所述抗體與細胞上的HGFA分子結合并抑制另一分子(諸如HGF原)與HGFA分子結合。一方面，本發(fā)明提供了使治療劑靶向宿主中的HGFA相關組織的方法，所述方法包括對宿主施用與本發(fā)明抗體連接形式的所述治療劑，由此使所述藥劑靶向于宿主中的HGFA相關組織。在一個實施方案中，結合HGFA的抗體能夠特異性結合位于細胞上的HGFA(在體外或在體內)，例如在HGFA存在于細胞表面上的情形中。附圖簡述圖I :抗HGFA抗體的CDR序列。殘基依照Kabat編號系統(tǒng)(Kabat et al.，1991)來編號。Ab39和Ab40之間的序列變異標有陰影。Fab40的單個殘基刪除(Trp96H)以粗體突顯。圖 I 披露"CDR-L1"為 SEQ ID NO I, I,和 1，"CDR-L2"為 SEQ ID NO 2，2，和 2，"CDR-L3〃 為 SEQ ID NO 22, 3,和 3，〃CDR_H1"為 SEQ ID NO 23,23，和 23，〃CDR_H2〃 為 SEQID NO 47，47，和47，而"CDR-H3"為SEQ ID NO 46，46，和24，均分別依照出現(xiàn)的次序。圖2 Ab40對HGFA酶活性的抑制。(a)在Ab40的3倍連續(xù)稀釋液存在下HGFA對125I-HGF原的切割。通過SDS-PAGE (還原性條件)及隨后的X射線膠片曝光來分析切割產(chǎn)物HGF a -和0 -鏈。(b) Ab40對產(chǎn)色底物S-2266水解的部分抑制(表述為HGFA分級活性vi/vo)及Ab40. ATrp的抑制的缺失。(c)Ab40 (I y M-0. 004 y M，3倍分步稀釋；實心菱形=“無抗體”對照)抑制HGFA的Eadie-Hofstee曲線圖顯示競爭性抑制(對于對照，Vmax=O. 99 u MpNA/min, Km=O. 23mM ;對于 I y M Ab40,1,: = 0.99 jiM pNA/min ，[r =0.82 mM)。圖3 :活性位點抑制劑對抗體結合HGFA的影響。(a_b，e-f)共注射HGFA(a，e)或HGFA-KQLR(b, f)復合物(〃KQLR〃披露為 SEQ ID NO: 10)后對固定化抗體Ab40 (a_b)或Ab40.A Trp (e-f)的結合的表面等離振子共振(BIAcore)測量。(C)在不同濃度的KDl存在下HGFA對固定化Ab40的競爭結合(BIAcore)。(d)測量濃度漸增的抗體存在下HGFA對生物素化KDl的結合的競爭結合ELISA。圖4 HGFA/Fab40復合物的結構。(a)表面呈現(xiàn)，其中為HGFA (飄帶)和Fab40(輕鏈淺灰色和重鏈深灰色)之間的復合物突顯二級結構。顯示了催化三聯(lián)體(His57-Aspl02-Serl95)殘基，而且以箭頭突顯了 99-環(huán)。(b)HGFA/Fab40 (淺灰色)結構與
HGFA/Fab75 (ffu et al, 2007)(深灰色)的疊加，顯示除了 99-環(huán)(黑色)的變化以外，HGFA的構象沒有顯著變化。(c)Fab40的⑶R環(huán)(Ll-3、Hl-3)與HGFA (表面呈現(xiàn))的相互作用的近視圖。突顯了涉及界面相互作用的關鍵殘基，而且99-環(huán)以紅色指示。除幾個氫鍵(深灰色虛線)之外，觀察到HGFA的Asp241和Fab40的Lys64H之間的一個鹽橋。圖5 HGFA/Fab40表位和互補位，其中HGFA (淺灰色)和Fab40 (輕鏈淺灰色，重鏈深灰色)。(a) HGFA (淺灰色)上Fab40接觸區(qū)(深灰色，4人截留)的表位。指示了催化三聯(lián)體和底物結合亞位點S1-S4。(b)HGFA上Fab40接觸區(qū)的一個不同視圖，F(xiàn)ab40接觸區(qū)與對應于凝血酶(綠色)中exosite-II的區(qū)域部分交疊。(c)Fab40 (虛線,4人截留)上的HGFA接觸區(qū)。重鏈涉及與HGFA的密切接觸且貢獻Fab40結合時HGFA上埋藏的總可及表面積的三分之二。圖6 =HGFA的99-環(huán)的三個結構快照。(a) 99-環(huán)的構象的“變構轉換”導致形成疏水性深口袋(著色深灰色,HGFA的殘基Ala56, Pro90, Tyr88, Val96, Vall05和Ilel07)，容許Fab40的Trp96H結合。(b)HGFA/Fab40. ATrp中疏水性口袋(著色深灰色)的大小受到嚴格限制，源于Val96和此口袋其它襯里殘基的運動。(c)在其它已知結構中找到的HGFA的99-環(huán)的“松弛”狀態(tài)構象(Shia et al. , 2005; Wu et al.，2007)。(d) HGFA 的 99-環(huán)(淺灰色)和HGFA/Fab40 (深灰色)復合物的疊加。99-環(huán)在Fab40結合時的構象轉變，99-環(huán)殘基的主鏈移位> I A，而側鏈構象移動>2. O。在棍棒呈現(xiàn)(上部)中突顯了 Fab40的⑶R-H3環(huán)。(e) HGFA/Fab40. ATrp 的 99-環(huán)與 HGFA 的 99-環(huán)及與 HGFA/Fab40 的 99-環(huán)的疊加。在Fab40. A Trp/HGFA復合物結構中99-環(huán)(淺灰色)的構象幾乎復原到“松弛”狀態(tài)。在棍棒呈現(xiàn)(深灰色)中突顯了 Fab40. ATrp的CDR-H3環(huán)。(f)HGFA/Fab40. ATrp的99-環(huán)與HGFA/Fab40的99-環(huán)的疊加，指示CDR-H3環(huán)在刪除Fab40的Trp96H (虛線圓圈)時的微小變化。圖7 :變構機制。(a)立體視圖，在HGFA_KQLR/Fab40. A Trp復合物(〃KQLR〃披露為 SEQ ID NO: 10)中肽抑制劑 Ac-KQLR-cmk (〃KQLR〃 披露為 SEQ ID NO: 10) (CPK 球體呈現(xiàn)中埋藏的深灰色棍棒，下部)共價連接至HGFA的活性Serl95和His57。P2_Leu針對99-環(huán)的Pro99a (點呈現(xiàn)中埋藏的淺灰色棍棒，上部)壓緊，而且與Ser99的氫鍵穩(wěn)定P4_Lys。(b)自 HGFA/Fab40 結構與 HGFA-KQLR/Fab40. ATrp (〃KQLR〃披露為 SEQ ID NO: 10)疊加獲得的HGFA-KQLR/Fab40 (〃KQLR〃披露為SEQ ID NO: 10)模型立體視圖顯示變構抑制是由于Pro99a和Ser99與99-環(huán)的P2_Leu (點呈現(xiàn)中埋藏的白色棍棒)之間的空間沖突。(c)HGFA-KQLR/Fab40. A Trp (〃KQLR〃 披露為 SEQ ID NO: 10)與 HGFA_KQLR/Fab40 (〃KQLR〃 披露為SEQ ID NO: 10)模型疊加的立體視圖，突顯關鍵構象變化和對HGFA的Ser99和抑制劑的P4-Lys之間的氫鍵的破壞。圖8 :卡通模型，圖示抑制的變構機制。在功能活性狀態(tài)中，結合亞位點是底物可及的，而且“變構轉換”處于“關”狀態(tài)。Fab40優(yōu)先抽取瞬時形成的構象之一并轉換平衡遠離功能活性狀態(tài)，如此驅動酶分子的主要群體從“變構轉換” “關”狀態(tài)變成“開”狀態(tài)。相反，不抑制酶活性的Fab40. A Trp可僅僅結合酶,不驅動狀態(tài)變化。圖9 : (a)抗體特異性。在直接結合ELISA中，將96孔板用2mg/ml HGFA、 matriptase (Kirchhofer et al. (2003) J Biol Chem 278:36341-36349)、尿激酶(AmericanDiagnostica)、或因子 XIIa(American Diagnostica)包被，并與 PBS, 0. 05%(v/v)Tween-20 (PBT)緩沖液中的10mg/ml抗HGFA抗體一起溫育。清洗后，通過添加抗人抗體HRP偶聯(lián)物(在PBT緩沖液中1: 2，500稀釋)和TMB底物來檢測結合的抗體。在微量板閱讀儀上測量450nm處的吸光度。(b) Ab39 (I u M-0. 004 u M, 3倍分步稀釋；實心菱形=“無抗體”對照)抑制HGFA的Eadie-Hofstee曲線圖顯示競爭性抑制(對于對照，Vmax=O. 99 u MpNA/min,Km=O. 25mM ;對于 I u M Ab39,K；^ = 0.97 jiM pNA/min,A;f =0.91 mM)。

圖10 :立體圖像，圖示電子密度圖的質量(在Is成形的2fofc)。(a)在HGFA/Fab40結構中99-環(huán)米取“無能力(non-competent) ”構象。(b)在HGFA/Fab40. ATrp結構中99-環(huán)復原成“有能力(competent) ”構象。(c)HGFA活性位點中共價結合的KQLR肽(SEQID NO: 10)不擾亂 Fab40 A Trp 的結合，因為在 HGFA_KQLR/Fab40. A Trp (〃KQLR〃 披露 為 SEQID NO: 10)結構中99-環(huán)采取“有能力”構象。圖11 HGFA-KQLR/Fab40. A Trp 復合物("KQLR〃披露為 SEQ ID NO: 10)結構中活性位點處的化學結構和氫鍵網(wǎng)絡。肽抑制劑KQLR(SEQ ID NO: 10)(中央)共價結合Serl95和 His57。圖12 HGFA/Fab40. ATrp (淺灰色)和 HGFA_KQLR/Fab40. ATrp (〃KQLR〃 披露為SEQ ID勵10)(更深的灰色，1^1^(5￡0 ID NO: 10)-最深的灰色)復合物結構的疊加。99-環(huán)的構象處于“有能力”構象，正如在HGFA的其它已知結構中找到的。圖 13 :HGFA/Fab40和 HGFA/KDl(Shia et al(2005)J Mol Biol 346(5):1335-49)復合物結構的疊加。Fab40 (深灰色,飄帶)的結合位點不與KDl (深灰色)的結合位點直接交疊，但是99-環(huán)的運動可引起一些針對KDl結合HGFA/Fab40復合物的空間沖突。圖14 HGFA/Fab40 (99-環(huán)的“無能力”構象(可互換稱作“緊張”構象；淺灰色)復合物和已發(fā)表的HGFA (99-環(huán)的“有能力”構象(可互換稱作“松弛”構象)，黑色)結構的疊加。處于“有能力”構象的HGFA的99-環(huán)殘基與Fab40的⑶R-H3環(huán)殘基中的Trp96H、Ala97H和Trp98H之間可發(fā)生空間沖突。圖15 :胰蛋白酶樣蛋白酶域，使用結構同源性的比對。HGFA的天然連續(xù)殘基編號出現(xiàn)在序列上方，而糜蛋白酶原編號出現(xiàn)在序列下方。糜蛋白酶原編號包括相對于糜蛋白酶原序列以小寫字母表示的插入(例如His60a)和刪除(例如沒有殘基編號218，所以217后面是219)。殘基60a、60b、60c和60d在殘基60后面，而殘基111a、111b、Illc和Illd在殘基111后面，而殘基170a和170b在殘基170后面。但是，殘基99a在殘基99前面，殘基184a在殘基184前面，殘基188a在殘基188前面，而殘基221a在殘基221前面。圖15A公開SEQ ID NO 25-33，而圖15B公開SEQ ID NO 34-41，均分別依照出現(xiàn)的次序。圖16 A.抗HGFA抗體的輕鏈可變域序列。B.重鏈可變域序列。殘基依照Kabat編號系統(tǒng)來編號，并且圖示了 Kabat、Chothia和接觸⑶R。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了包含肝細胞生長因子激活劑功能的調控物的方法、組合物、試劑盒和制品。本文提供了這些方法、組合物、試劑盒和制品的細節(jié)。通用技術除非另有說明，本發(fā)明的實行將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術，這些都在本領域的技術范圍內。文獻中充分解釋了這些技術，諸如 “Molecular Cloning: ALaboratory Manual”，secondedition (Sambrook et a I. , 1989) ; “Oligonucleotide Synthesis，，，(M.J. Gait, ed. , 1984) ; “Animal Cell Culture，，，(R. I. Freshney, ed.，1987) ; “Methods inEnzymoIogy^, (Academic Press, Inc. ) f Current Protocols in Molecular Biology”，(F.M.Ausubel et al. , eds. , 1987,and periodic updates) ; “PCR:The PolymeraseChain Reaction，，，(Mullis et al. , ed. , 1994) ; “A Practical Guide to MolecularCloning”，(Perbal Bernard V. , 1988) ; “Phage Display:A Laboratory Manual”，(Barbaset al. , 2001)。定義如本文中使用的，除非另有具體或上下文說明，術語“肝細胞生長因子激活劑”或“HGFA”指能夠在容許下述過程發(fā)生的條件，例如容許HGF雙鏈形式形成的條件下結合HGF和/或活化HGF的任何天然或變異(天然的或合成的)HGFA多肽。術語“野生型HGFA序列”一般指在天然存在HGFA中找到的氨基酸序列，而且包括天然存在的截短或分泌形式、變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。野生型HGFA的一個例子是包含表4所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)的多肽。HGFA的序列編號方式依照SWISS-PR0T條目HGFA_HUMAN登錄號Q04756且如表4所示。對于蛋白酶域內的殘基，有時使用自糜蛋白酶原衍生的備用編號方案。這兩種殘基編號方案的相互轉換見圖15。一般地，會標示貫穿此申請利用的編號系統(tǒng)?！盎罨腍GFA”或其變化指具有野生型HGFA蛋白從單鏈形式轉變成2鏈形式時野生型HGFA所采取的一種或多種構造(conformation)的任何HGFA鏈。在一些實施方案中，轉變至少部分源自HGFA蛋白的殘基407和殘基408之間的切割。在一些實施方案中，構造具體指蛋白酶域的構造。活化的HGFA也可以自全長HGFA的片段，諸如34kDa形式形成。34kDa形式可通過殘基372和373之間的切割來生成。HGFA可以自多種來源分離，諸如人組織或人血衆(zhòng)，或者通過重組或合成方法來制備?；罨腍GFA的一個實施方案包含表5所示氨基酸序列(SEQ ID N0:20)。(編號方式為本文所述天然HGFA的編號方式。)如本文中使用的，“HGFA變體”指具有與參照多肽不同的序列的多肽。在一些實施方案中，參照多肽是包含表4所示序列的HGFA多肽。變體包括“非天然”存在變體。在一些實施方案中，變體與表4所示氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性。變體包括那些具有替代、添加或刪除的多肽。在一些實施方案中，變體具有結合HGF和/或活化它的生物學活性。在其它實施方案中，變體能結合HGF，但不活化它。通常，HGFA變體多肽與包含表4所示氨基酸序列的HGFA多肽或包含表5所示序列的HGFA多肽會具有至少80%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少81%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少82%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少83%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少84%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少85%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少86%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少87%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少88%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少89%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少90%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少91%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少92%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少93%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少94%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少95%序列同 一丨I"生，更優(yōu)選會具有至少96%序列同一丨丨生,更優(yōu)選會具有至少96%序列同一丨丨生,更優(yōu)選會具有至少97%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少98%序列同一性，更優(yōu)選會具有至少99%序列同一性。關于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率?？梢员绢I域技術范圍內的多種方式進行序列對比以測定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列對比計算機程序ALIGN-2而獲得的，如美國專利No. 6，828，146中所述。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIX V4. OD上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設定且不變。在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比較的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(任選可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算分數(shù)X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？深A料到若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一丨I"生。除非另有具體說明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值均是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。術語“載體”在用于本文時意指能夠運輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是“質粒”，指其中可連接另外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導入的宿主細胞中自主復制(如具有細菌復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可在導入宿主細胞后整合到宿主細胞的基因組中，從而隨著宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“重組載體”)。一般而言，在重組DNA技術中有用的表達載體常常是質粒形式。在本說明書中，“質?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質粒是載體的最常用形式?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結構的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分阻斷。多核苷酸還可以在合成后修飾，諸如通過與標記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個或多個天然發(fā)生核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety),諸如例如蛋白質(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(如吖啶、補骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接
(如a端基異構核酸(anomeric nucleic acid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何輕基可用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團替換，用標準保護基團保護，或活化以制備與另外核苷酸的另外連接，或者可偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5’和3’末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機加帽基團取代。其它羥基也可衍生成標準保護基團。多核苷酸還可含有本領域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2’ -氧-甲基、2’ -氧-烯丙基、2’ -氟-或2’ -疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，a -端基異構糖，差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷。可用備選連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限于如下實施方案，其中磷酸酯用 P(O)S (“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S (“二硫代酸酯”(dithioate) )、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate) )、P (0) R、P (0) 0R’、CO 或 CH2 (“ 甲縮醛”(formacetal))替代，其中 R或R’各自獨立為H或者取代或未取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA?！肮押塑账帷痹谟糜诒疚臅r一般指短多核苷酸，通常是單鏈，通常是合成的，長度通常但不是必需小于約200個核苷酸。術語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文關于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苷酸?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)由其天然環(huán)境的一種成分鑒別和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(I)根據(jù)Lowry方法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE，達到同質。既然抗體的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。
術語“依照Kabat的可變區(qū)殘基編號”或“依照Kabat的氨基酸位置編號”及其變體指Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中的抗體編輯用于重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的編號系統(tǒng)。利用此編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應于可變區(qū)FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變區(qū)可包括H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat是殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat的殘基82a、82b和82c等)。指定抗體的Kabat殘基編號可通過將此抗體序列與“標準”Kabat編號序列在同源區(qū)進行比對來確定。除非另有說明，本文中的所有氨基酸位置編號依照Kabat編號系統(tǒng)?！叭斯灿锌蚣堋笔谴砣嗣庖咔虻鞍譜L或VH框架序列選集中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，所述人免疫球蛋白VL或VH選集來自可變區(qū)序列亞型。通常，所述序列亞型是如Kabat等人所述的亞型。在一個實施方案中，對于VL,所述亞型是如Kabat等人所述的亞型K I。在一個實施方案中，對于VH，所述亞型是如Kabat等人所述的亞型III。

“VH亞型III共有框架”包含獲自Kabat等人所述的可變重鏈亞型III中的氨基酸序列的共有序列。在一個實施方案中，VH亞型III共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整個全部EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:11)-Hl-ffVRQAPGKGLEWV(SEQ IDNO:12)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC(SEQ ID NO:13)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:14)?！癡L亞型I共有框架”包含獲自Kabat等人所述的可變輕鏈k亞型I中的氨基酸序列的共有序列。在一個實施方案中，VL亞型I共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整個DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITC(SEQ ID NO:15)-Ll-ffYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:18)。術語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體，只要它們展示期望的生物學活性)，且還可包括抗體片段(如本文中更為詳細描述的)?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。在一個實施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合位點，由此保留結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)e區(qū)的抗體片段，保留通常與所述Fe區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片段是具有與完整抗體基本上相似的體內半衰期的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含與能夠賦予該片段以體內穩(wěn)定性的Fe序列相連的一個抗原結合臂。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體中獲得的抗體，即構成群體的抗體個體是相同的，只是可能以極小數(shù)量存在可能的天然發(fā)生突變。單克隆抗體是高度特異的，即針對單一抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類型或亞型的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類型或亞型的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展示期望的生物學活性(美國專利4，816，567;及Morrison etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。非人(如鼠源)抗體的“人源化”形式是最低限度含有衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是如下人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體高變區(qū)的殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)的殘基替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含沒有在受體抗體中或在供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾是為了進一步改善抗體性能。通常，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個基本上整個可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應于非人免疫球蛋白
中的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的Fe。更多詳情參見Joneset al. , Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988);及Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。還可參見下列綜述性論文及其引用的參考文獻Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998);Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle and Gross, Curr.Op.Biotech. 5:428-433(1994)。“人抗體”是具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列且/或使用本文所公開的用于制備人抗體的任何技術制備的抗體。人抗體的這種定義明確排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。“親和力成熟的”抗體指在其一個或多個CDR中具有導致抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的一處或多處改變的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領域已知流程生成。Marks et al. , Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述了經(jīng)由通過VH和VL結構域改組的親和力成熟。下列文獻描述了⑶R和/或框架殘基的隨機誘變Barbas et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994) ; Schieret al. , Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.，J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al. , J. Immunol. 154 (7) : 3310-9 (1995);及 Hawkins et al. , J. Mol.Biol.226:889-896(1992)?！白钄嘈浴笨贵w或“拮抗性”抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。優(yōu)選的阻斷性抗體或拮抗性抗體實質或完全抑制抗原的生物學活性。“紊亂”是將受益于本發(fā)明物質/分子或方法的治療的任何狀況。這包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使哺乳動物易患所討論紊亂的病理狀況。本文中待治療的紊亂的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質、星形膠質細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質和囊胚腔的病癥；及炎性、免疫學和其它血管發(fā)生相關的紊亂。
術語“細胞增殖性紊亂”和“增殖性紊亂”指與一定程度的異常細胞增殖有關的紊舌L。在一個實施方案中，所述細胞增殖性紊亂是癌癥?！澳[瘤”在用于本文時指所有腫瘤細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前和癌性細胞和組織。術語“癌癥”、“癌性”、“細胞增殖性紊亂”、“增殖性紊亂”和“腫瘤”在本文中提到時并不互相排斥。術語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長/增殖不受調節(jié)的生理狀況。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。這樣的癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的乳腺癌、肺的鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰乳腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液乳腺癌、腎癌、肝癌、前列乳腺癌、外陰癌、甲狀乳腺癌、肝的癌及各種類型的頭和頸癌。血管發(fā)生調節(jié)異?？蓪е驴捎帽景l(fā)明組合物和方法治療的許多紊亂。這些紊亂包括非腫瘤性的和腫瘤性的兩類狀況。腫瘤性的包括但不限于上文所描述的。非腫瘤性紊亂 包括但不限于不想要的或異常的肥大、關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結節(jié)病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡膜新血管形成、眼角的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它組織的移植、慢性炎癥、急性肺損傷/ARDS、膿毒病、原發(fā)性肺動脈高壓、惡性肺積液(malignant pulmonaryeffusion)、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部損傷/外傷有關的)、滑液炎癥、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多囊性卵巢病、子宮內膜異位、第三空間流體病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮平滑肌瘤(uterine fibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD (克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎)、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不想要的或異常的組織塊生長(非癌性的)、血友病性關節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長的抑制、奧-韋二氏(Osler-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關的)、以及胸腔積液?！白陨砻庖卟　痹诒疚闹兄冈从谇裔槍€體自身組織的非惡性疾病或紊亂。自身免疫病在本文中明確排除惡性或癌性疾病或紊亂，尤其排除B細胞淋巴瘤、急性成淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病和慢性成髓細胞白血病。自身免疫疾病或紊亂的實例包括但不限于炎性應答，諸如炎性皮膚病，包括銀屑病和皮炎(如特應性皮炎);系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；與炎性腸病有關的應答(諸如克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結腸炎);呼吸窘迫綜合癥(包括成人呼吸窘迫綜合癥;ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；腎小球腎炎；過敏狀況，諸如濕疹和哮喘及牽涉T細胞浸潤和慢性炎性應答的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細胞粘著缺陷；類風濕性關節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);糖尿病(如I型糖尿病和胰島素依賴性糖尿病)；多發(fā)性硬化癥；雷諾氏(Reynaud)綜合癥；自身免疫性甲狀腺炎；特應性腦脊髓炎；斯耶格倫氏(Sjorgen)綜合癥；幼發(fā)型糖尿??；通常在肺結核、結節(jié)病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎中發(fā)現(xiàn)的與細胞因子和T-淋巴細胞介導的急性和遲發(fā)性超敏反應有關的免疫應答；惡性貧血(阿狄森氏(Addison)病);牽涉白細胞滲出的疾病；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性紊亂；多種器官損傷綜合癥；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥(cryoglobinemia)或庫姆斯氏(Coombs)反應陽性貧血(Coombs positiveanemia));重癥肌無力；抗原-抗體復合物介導的疾病；抗腎小球基膜??；抗磷脂綜合癥；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯氏(Graves)病；蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多種內分泌腺病；萊特氏(Reiter)??；僵體綜合癥(stiff-man syndrome);貝切特氏(Behcet)病；巨細胞動脈炎；免疫復合物腎炎；IgA腎?。籌gM多神經(jīng)??；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。在用于本文時，“治療”指試圖改變所治療個體或細胞的自然進程的臨床干預，可以是為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的期望效果包括預防疾病的發(fā)生或復發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學后果、預防轉移、減緩疾病進展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預后。在有些實施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或紊亂的發(fā)展。“有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的治療或預防效果的數(shù)量。本發(fā)明物質/分子、激動劑或拮抗劑的“治療有效量”可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發(fā)期望應答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的數(shù)量?！邦A防有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的預防效果的數(shù)量。通常而非必然，由于預防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預防有效量將低于治療有效量。術語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化療劑,例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、長春花生物堿(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒性劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學化合物。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents),諸如塞替派(thiotepa)和 CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);橫酸燒基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類(aziridines),諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylameIamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethyIenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bulIatacin)和布拉他辛酮(bulIatacinone) ) ； 8 -9-四氫大麻酷(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酷(dronabinol), MARINOL ) ; 0 -拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9_氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素I和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin) ;pancratistatin ;sarcodictyin ;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼唳氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫 司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素coll (參見例如Agnew，Chem.Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ；埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮_5_氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN 、嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑(DOXIL )和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcelIomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酷酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、撤攬霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、卩票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤、吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加氟(tegafur) ( UFTORAL )、卡培他濱(capecitabine) ( XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone)和 5_ 氟尿啼P定(5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-疏基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鳥 P票呤(thioguanine)；啼卩定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(fIoxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinic acid);醋葡醒內酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);恩尿啼唳(eniluracil);安口丫P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地憐酉先胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ;elfornithine ;依利醋銨(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕脲(hydroxyurea)；香燕多糖(Ientinan);氯尼達明(Ionidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol) ; 二胺硝卩丫唳(nitracrine);噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);卩比柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ;2_ 乙基酸月井(ethylhydrazide);丙卡巴月井(procarbazine)； PSK 多糖復合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2，2’，2 "-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是 T-2 毒素、撫孢菌素(verrucarin) A、桿孢菌素(roridin)A 和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) (ELDSINE ，F(xiàn)ILDESIN );達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside) (“Ara_C”)；塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel) ( TAXOL )、清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) ( TAXOTERE );苯丁酸氮芥(chlorambucil) ;6_ 硫鳥 _呤(thioguanine);疏基票呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin);長春堿(vinblastine) ( VELBAN );鉬；依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine) ( ONCOVIN )；奧沙利鉬(oxaliplatin);亞葉酸(Ieucovorin);長春瑞濱(vinorelbine) ( NAVELBINE );能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本勝酸鹽(ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000; 二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid);任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激素齊U，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) ( EVISTA )、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene) ( FARESTON );抗孕酮類；雌激素受體下調劑類(ERD);雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant) ( FASLODEX );功能為抑制或關閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如醋酸亮丙瑞林(Ieupix)Iide acetate) (LUPRON 和 ELIGARD )、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4 (5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) ( MEGASE )、依西美坦(exemestane) ( AROMASIN )、福
美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole) ( RIVISOR )、來曲唑(Ietrozole) ( FEMARA )和阿那曲唑(anastrozole) ( ARIMIDEX )。另外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS 或OSTAC )、依替膦酸鈉(etidronate) ( DIDROCAL )、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate) ( ZOMETA )、阿倫膦酸鹽(alendronate) ( FOSAMAX )、帕米膦酸鹽(pamidronate) ( AREDIA )、替魯膦酸鹽(tiludronate) ( SKELID )或利塞膦酸鹽(risedronate) ( ACTONEL );以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戍環(huán)核苷胞喃唳類似物)；反義寡核苷酸,特別是抑制牽涉粘著細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf,H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓撲異構酶I抑制劑(例如 LURTOTECAN ) ;rmRH ( ABARELIX ); lapatinibditosylate (ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016) ;C0X_2抑制劑，諸如celecoxib(CELEBREX ; 4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-I-基)苯磺酰胺；及任何上述物質的藥學可接受鹽、酸或衍生物。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內抑制其生長依賴于HGF/c-met活化的細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期的HGF/c-met依賴性細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥齊U，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vinca)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉燒類(taxane)、和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯,例如DNA燒化劑諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5_ 氟尿P密唳(fIuorouracil)和 ara_C。其它信息可參見《The Molecular Basis of Cancer)),Mendelsohn 和 Israel 編，第 I 章，題為 “Cell cycle regulation, oncogenes, andantieioplastic drugs，，，Murakaini 等人，WB Saunders, Philadelphia, 1995,尤其是第13頁。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))皆為衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL , Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導致對細胞有絲分裂的抑制?！岸嗳岜刃?Doxorubicin)”是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學名是(8S-順式)-10- [ (3-氨基-2，3，6- 二脫氧-a -L-來蘇-卩比喃己糖基)氧基]_7，8, 9, 10-四氫-6，8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-甲氧基-5，12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2, 3,6-trideoxy-a -L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11-trihydroxy-8- (hydroxyacetyl)-l-methoxy-5, 12_naphthacenedione)0載體、宿主細胞和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復制載體，用于進一步克隆(DNA擴增)或表達?？墒褂贸Ｒ?guī)流程容易的分離編碼抗體的DNA并測序(如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細胞。通常，優(yōu)選的宿主細胞是原核或真核(通常是哺乳動 物)起源的。使用原核宿主細胞生成抗體:載體構律可使用標準重組技術來獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構件的多核苷酸序列。可從抗體生成細胞諸如雜交瘤細胞分離期望的多核苷酸序列并測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復制并表達異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可使用本領域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉化的具體宿主細胞。根據(jù)其功能(擴增或表達異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細胞的相容性，每種載體含有多種構件。載體構件通常包括但不限于復制起點、選擇標志基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入片段、和轉錄終止序列。一般而言，與宿主細胞一起使用的質粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復制子和控制序列。載體通常攜帶復制位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標志序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒PBR322轉化大腸桿菌。PBR322包含編碼氨芐青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，由此提供輕松鑒定轉化細胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質?；蚴删w還可包含或經(jīng)修飾而包含可被微生物生物體用于表達內源蛋白質的啟動子。Carter等人,美國專利5，648，237中詳細記載了用于表達特定抗體的pBR322衍生物的實例。另外，可將包含與宿主微生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉化載體。例如，可使用噬菌體諸如、GEM. TM. -11來構建可用于轉化易感宿主細胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。本發(fā)明的表達載體可包含兩種或多種啟動子-順反子對，它們編碼每一種多肽構件。啟動子是位于順反子上游(5’)的非翻譯調控序列，它調控順反子的表達。原核啟動子通常分成兩類，誘導型和組成性。誘導型啟動子指響應培養(yǎng)條件的變化(如營養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源DNA中的啟動子并將分離的啟動子序列插入本發(fā)明的載體，由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用于指導靶基因的擴增和/或表達。在有些實施方案中，使用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，它們通常容許所表達靶基因的更高轉錄和更高產(chǎn)量。適用于原核彳百王的啟動子包括PhoA啟動子、0 _半乳糖昔酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而,在細菌中有功能的其它啟動子(諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕 鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlist et al. ,Cell 20:269(1980))。在本發(fā)明的一個方面，重組載體內的每個順反子都包含指導所表達多肽穿膜轉運的分泌信號序列構件。一般而言，信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切除)的信號序列。對于不識別并加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細胞，將信號序列用選自例如下組的原核信號序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、IPP、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發(fā)明的一個實施方案中，表達系統(tǒng)的兩個順反子中都使用的信號序列是STII信號序列或其變體。在另一方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可在宿主細胞的細胞質中發(fā)生，因 此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那點上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細胞質內表達、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利于二硫鍵形成的細胞質條件，從而容許所表達蛋白質亞基的正確折疊和裝配。Probaand Pluckthun, Gene 159:203(1995))。本發(fā)明提供了可調控所表達多肽構件的數(shù)量比率，從而將分泌且正確裝配的本發(fā)明抗體的產(chǎn)量最大化的表達系統(tǒng)。這種調控是至少部分通過同時調控多肽構件的翻譯強度而實現(xiàn)的。Simmons等人,美國專利5，840，523中公開了用于調控翻譯強度的一種技術。它在順反子內利用翻譯起始區(qū)(TIR)的變體。對于指定TIR，可創(chuàng)建具有一定范圍翻譯強度的一系列氨基酸或核苷酸序列變體，由此提供針對特定鏈的期望表達水平調節(jié)此因素的方便手段。可通過常規(guī)誘變技術導致能改變氨基酸序列的密碼子變化(盡管優(yōu)選核苷酸序列中的沉默變化)從而生成TIR變體。TIR中的改變可包括例如Shine-Dalgarno序列的數(shù)目或間距的改變，及信號序列中的改變。用于生成突變型信號序列的一種方法是在編碼序列的開端生成不改變信號序列氨基酸序列的“密碼子庫”(即變化是沉默的)。這可通過改變每個密碼子的第三個核苷酸位置來實現(xiàn)；另外，有些氨基酸，諸如亮氨酸、絲氨酸、和精氨酸，具有多種第一個和第二個位置，這可在建庫中增加復雜性。Yansura et al. , METHODS:ACompanion to Methods in Enzymol. 4:151-158 (1992)中詳細記載了這種誘變方法。優(yōu)選的是，對于載體中的每個順反子，生成具有一定范圍TIR強度的一組載體。這個有限集合提供了每條鏈的表達水平以及期望抗體產(chǎn)物的產(chǎn)量在各種TIR強度組合下的比較?？赏ㄟ^量化報道基因的表達水平來測定TIR強度，Simmons等人，美國專利5，840，523中有詳細描述。根據(jù)翻譯強度的比較，選擇期望的個別TIR在本發(fā)明的表達載體構建物中進行組合。
適于表達本發(fā)明抗體的原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)和真細菌(Eubacteria),諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸埃希氏菌E. coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌 B. subtilis)、腸桿菌屬(Enterobacteria)> 假單胞菌屬(Pseudomonas)(如銅綠假單胞菌P. aeruginosa)物種、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreosci I la)、或副球菌屬(Paracoccus)。在一個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，使用大腸桿菌細胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌株的實例包括菌株W3110 (Bachmann, Cellularand Molecular Biology,第 2卷，Washington, D. C.，美國微生物學學會，1987,第 1190-1219頁；ATCC保藏號27，325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 A fhuA ( A tonA) ptr3 lac IqlacL8 A ompT A (nmpc-fepE) degP41 kanR 的菌株 33D3(美國專利號 5，639，635)。其它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31，446)、大腸桿菌8、大腸桿菌入1776(410 31,537)和大腸桿菌RV308 (ATCC 31，608)也是合適的。這些實例只是例示而非限制。本領域知道用于構建具有指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法，參見例如Bass et al. , Proteins8:309-314(1990)。通常必需考慮復制子在細菌細胞中的可復制性來選擇適宜的細菌。例 如，在使用眾所周知的質粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供復制子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細胞應當分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑?？贵w牛成用上述表達載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。轉化即將DNA導入原核宿主，使得DNA能夠進行復制，或是作為染色體外元件或是通過染色體成分。根據(jù)所用宿主細胞，使用適于這些細胞的標準技術進行轉化。采用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉化方法采用聚乙二醇/DMS0。使用的還有一種技術是電穿孔。在本領域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明多肽的原核細胞。合適培養(yǎng)基的實例包括添加了必需營養(yǎng)補充物的LB培養(yǎng)基(Luria broth) 0在有些實施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達載體的構建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達載體的原核細胞生長。例如，向用于培養(yǎng)表達氨芐青霉素抗性基因的細胞的培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素。除了碳、氮、和無機磷酸鹽來源以外，還可含有適當濃度的任何必需補充物，或是單獨加入或是作為與另一種補充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細胞。例如，對于培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選的溫度范圍是約20°C至約39°C，更優(yōu)選約25°C至約37°C，甚至更優(yōu)選約30°C。主要取決于宿主生物體，培養(yǎng)基的PH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6. 8至約7. 4，更優(yōu)選約7.0。
如果本發(fā)明的表達載體中使用誘導型啟動子，那么在適于激活啟動子的條件下誘導蛋白質表達。在本發(fā)明的一個方面，使用PhoA啟動子來控制多肽的轉錄。因此，為了誘導，在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過轉化的宿主細胞。優(yōu)選的是，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是C.R.A.P 培養(yǎng)基(參見例如 Simmons et al. , J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002))。根據(jù)所采用的載體構建物，可采用多種其它誘導物，正如本領域所知道的。在一個實施方案中，所表達的本發(fā)明多肽分泌到宿主細胞的周質中并從中回收。蛋白質回收通常牽涉破壞微生物,通常通過諸如滲透休克(osmotic shock)、超聲處理或裂解等手段。一旦細胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞?？梢酝ㄟ^例如親和樹脂層析進一步純化蛋白質?；蛘撸鞍踪|可能轉運到培養(yǎng)液中并從中分離?？蓮呐囵B(yǎng)液清除細胞，并將培養(yǎng)物上清液過濾和濃縮，用于進一步純化所生成蛋白質?？墒褂闷毡橹赖姆椒ㄖT如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡分析進一步分離和鑒定所表達蛋白質。在本發(fā)明的一個方面，通過發(fā)酵過程大量進行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)模補料-分批發(fā)酵流程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1，000至
100,000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指在體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中進行的發(fā)酵，范圍可以是約I升至約100升。在發(fā)酵過程中，通常在將細胞在合適條件下培養(yǎng)至期望密度(如0D550約180-220，在此階段細胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動蛋白質表達的誘導。根據(jù)所采用的載體構建物，可使用多種誘導物，正如本領域知道的和上文描述的?？稍谡T導前將細胞培養(yǎng)更短的時間。通常將細胞誘導約12-50小時，但是可使用更長或更短的誘導時間。為了提高本發(fā)明多肽的產(chǎn)量和質量，可修改多項發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可使用過度表達伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA (具有伴侶活性的一種肽基脯氨酰-順式，反式-異構酶)的額外載體來共轉化宿主原核細胞。已經(jīng)證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生成的異源蛋白質的正確折疊和溶解度。Chen et al. , J. Biol. Chem. 274:19601-19605 (1999) ;Georgiou 等人，美國專利 6, 083, 715;Georgiou 等人，美國專利 6, 027, 888;Bothmannand Pluckthun, J. Biol. Chem. 275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun, J. Biol.Chem. 275:17106-17113(2000);Arie et al. , Mol. Microbiol. 39:199-210(2001))。為了將所表達異源蛋白質(尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質)的蛋白水解降至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發(fā)明。例如，可修飾宿主細胞菌株，在編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT、DegP, Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合?？梢垣@得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參見例如 Joly et al. , (1998)見上文；Georgiou 等人,美國專利 5，264，365;Georgiou 等人,美國專利 5，508，192; Hara et al. , Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。在一個實施方案中，在本發(fā)明的表達系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過過度表達一種或多種伴侶蛋白的質粒轉化的大腸桿菌菌株作為宿主細胞?？贵w純化在一個實施方案中，進一步純化本文中生成的抗體蛋白質以獲得基本上同質的制品，用于進一步的測定和使用?？刹捎帽绢I域知道的標準蛋白質純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示免疫親和或離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如S^hadexG-75的凝膠過濾。在一個方面，將固定在固相上的蛋白A用于本發(fā)明全長抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細胞壁蛋白質,它以高親和力結合抗體 Fe 區(qū)。Lindmark et al.，J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白 A 固定其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異結合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異結合的污染物。最后通過洗脫從固相回收目的抗體。使用真核宿主細胞生成抗體:載體構件通常包括但不限于如下一種或多種信號序列、復制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。(i)信號序列構件在真核宿主細胞中使用的載體還可在目的成熟蛋白質或多肽的N端包含信號序列或具有特異切割位點的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切除)的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導，例如單純皰疫病毒gD信號。將這些前體區(qū)的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。(ii)復制起點通常，哺乳動物表達載體不需要復制起點構件。例如，SV40起點通?？赡苤灰虬缙趩幼硬攀褂?。(iii)選擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，如氨節(jié)青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補足相應的營養(yǎng)缺陷；或(C)提供不能從復合培養(yǎng)基獲得的關鍵營養(yǎng)物。選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。經(jīng)異源基因成功轉化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實例使用藥物新霉素、霉酌'fe和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個實例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種競爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如ATCC CRL-9096)。或者，可通過在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標志諸如氨基糖苷3’-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包含內源DHFR的野生型宿主)。參見美國專利4，965，199。(iv)啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉錄的位點上游約25至30個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游70至80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3’端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體中。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、 乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)的、來自熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若這些啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復制起點。方便的以HindIII E限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利4，419，446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種修改。關于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人P -干擾素cDNA還可參見Reyeset al. , Nature 297:598-601 (1982)。或者,可使用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。(V)增強子元件構件常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核細胞對編碼本發(fā)明抗體多肽的DNA的轉錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、a -胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括SV40復制起點晚期側的增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起點晚期側的增強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv，Nature297:17-18(1982)。增強子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5’或3’位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5’位點。(vi)轉錄終止構件在真核宿主細胞中使用的表達載體通常還包含終止轉錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？蓮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5’端和偶爾的3’端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見W094/11026及其中公開的表達載體。(vii)宿主細胞的選擇和轉化適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括本文描述的高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細胞系的實例有經(jīng)SV40轉化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL1651)、人胚腎系(293細胞或為懸浮培養(yǎng)而亞克隆的293細胞，Graham et al.，J. Gen.Virol. 36:59(1977))、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CH0，Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))、小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23:243-251(1980))、猴腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VER0-76，ATCC CRL 1587)、人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2)、犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺細胞(W138，ATCC CCL75)、人肝細胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51),TRI 細胞(Matheret al. ,Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) )、MRC 5 細胞、FS4 細胞和人肝細胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。為了生成抗體，用上文所述表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。(viii)宿主細胞的培養(yǎng)可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明抗體的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏 FlO (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、和 Dulbecco 氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可使用下列文獻中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基Ham et al. , Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Barnes et al. , Anal.Biochem. 102:255 (1980);美國專利 4，767，704; 4，657，866; 4，927，762; 4，560，655; 5，122，469;W090/03430;W0 87/00195;或美國專利復審30，985。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件諸如溫度、PH等即為表達而選擇的宿主細胞先前所用的，這對于普通技術人員是顯然的。(ix)抗體的純化在使用重組技術時，可在細胞內生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細胞內生成抗體，那么首先需要通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細胞或是裂解片段。如果抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自這些表達系統(tǒng)的上清液?？稍谌魏紊鲜霾襟E中包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長?？墒褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術是親和層析)來純化從細胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fe結構域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人Y I、Y 2、或y4重鏈的抗體(Lindmark et al. , J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白 G 推薦用于所有小鼠同種型和人Y3(Guss et al. , EMBO J. 5:1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質最常用的是瓊脂糖，但是可使用其它基質。物理穩(wěn)定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結構域，則可使用Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)進行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAR0SE 上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有目的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用層析，使用PH約2. 5-4. 5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(如約0-0. 25M鹽)進行?；钚詼y定法可通過本領域知道的多種測定法對本發(fā)明的抗體鑒定它們的物理/化學特性和生物學功能?？赏ㄟ^一系列測定法進一步鑒定純化的免疫球蛋白，包括但不限于N端測序、氨基酸分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發(fā)明的某些實施方案中，對本文在生成的免疫球蛋白分析它們的生物學活性。在有些實施方案中，對本發(fā)明的免疫球蛋白測試它們的抗原結合活性。本領域知道的且可用于本文的抗原結合測定法包括但不限于使用諸如Western印跡、放射免疫測定法、 ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)、“三明治”免疫測定法、免疫沉淀測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法等技術的任何直接或競爭性結合測定法。下文在實施例部分中提供了例示性的抗原結合測定法。在一個實施方案中，本發(fā)明設想了具有一些但非所有效應物功能的改良抗體，這使得它在抗體體內半衰期是重要的但某些效應物功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的許多應用中成為期望的候選物。在某些實施方案中，測量所生成免疫球蛋白的Fe活性以確保只保留了期望的特性?？蛇M行體外和/或體內細胞毒性測定法以確認CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如，可進行Fe受體(FcR)結合測定法以確認抗體缺乏Fe YR結合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fe Y RIII，而單核細胞表達Fe Y RI、FcyRII和FcyRIII。Ravetchand Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)第 464 頁表 3 總結了造血細胞上的 FcR表達。美國專利5，500，362或5，821，337中記載了用于評估目的分子的ADCC活性的體外測定法的實例。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所公開的。還可進行Clq結合測定法以確認抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoro et al. , J. TmmunoI. Methods 202:163 (1996)中所述。還可使用本領域知道的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期測定。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)?；旧峡勺裱璚inter及其同事的方法進行人源化(Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al. , Nature332:323-327 (1988) ; Verhoeyen et al.，Science239:1534-1536 (1988))，即用非人高變區(qū)序列替代人抗體的對應序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點的殘基替代。
用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對已知人可變區(qū)序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Simset al. , J. Immunol. 151:2296 (1993) ; Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞類(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285(1992);Presta et al. , J. Immunol. 151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性。為了達到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過程來制備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領域技術人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的計算機程序。通過檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)
揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實質的牽涉對抗原結合的影響。杭體奪體一方面，本發(fā)明提供了在構成Fe區(qū)的Fe多肽界面中包含修飾的抗體，其中該修飾推動和/促進異多聚化。這些修飾包括將突起導入第一 Fe多肽和將腔導入第二 Fe多肽，其中突起可位于腔中，從而促進第一和第二 Fe多肽的復合。本領域知道生成具有這些修飾的抗體的方法，例如美國專利5，731，168中所述。在有些實施方案中，設想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特性?？贵w的氨基酸序列變體是通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或通過肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內的殘基刪除和/或插入和/或替代。進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構建物，倘若最終的構建物具有期望的特征?？稍谥苽湫蛄袝r將氨基酸改變引入主題抗體氨基酸序列?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法有“丙氨酸掃描誘變”,如 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)中所述。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲對替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身的本質不必預先決定。例如，為了分析指定位點處突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對所表達免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍由一個殘基至包含上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(如用于ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進行替代誘變的位點包括高變區(qū)，但是也設想了 FR改變。表A中“優(yōu)選替代”欄顯示了保守替代。如果此類替代導致生物學活性變化，那么可導入表A中稱為“例示替代”的更實質變化，或如下文參照氨基酸分類進一步所述，并篩選產(chǎn)物。表A
權利要求
1.一種分離的抗HGFA抗體，其中該抗體的全長IgG形式以20pm或更低的結合親和力特異性結合人HGFA。
2.權利要求I的抗體，其中該抗體對人HGFA的二價親和力低于包含下述各項、由下述各項組成或基本上由下述各項組成的抗體的二價親和力(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQID NO: I)的 HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 7)的 HVR-L3 ； (d)包含序列 GTYIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ ID NO:5)的 HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ IDNO:6)的 HVR-H3。
3.權利要求I的抗體，其中該抗體結合HGFA殘基449，450，452，453，455，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，496，578，579，580，636，637，640，643，644 中至少一個殘基、兩個殘基、三個殘基、四個殘基、或任何數(shù)目殘基，直至所有殘基，且進一步地其中該抗體變構抑制HGFA并與HGFA活性位點封閉劑KDl或Ac-KQLR-氯甲基酮("KQL R"披露為SEQ ID NO: 10)競爭對HGFA的結合，但不與芐脒競爭對HGFA的結合。
4.權利要求I的抗體，其中該抗體包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、和/或六種選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(a)包含序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的HVR-Ll ； (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的 HVR-L2 ； (c)包含序列 QQSNRAPAT (SEQ ID NO: 3)的 HVR-L3 ；(d)包含序列 GITIH(SEQ ID NO:4)的 HVR-Hl ; (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG(SEQ IDNO:5)的 HVR-H2;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。
5.權利要求4的抗體，其包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含(a)包含序列 RASQDVSTAVA(SEQ ID NO: I)的 HVR-Ll ; (b)包含序列 SASFLYS (SEQ ID NO: 2)的HVR-L2 ；(c)包含序列QQSNRAPAT (SEQ ID NO:3)的HVR-L3 ;該重鏈可變區(qū)包含(d)包含序列 GITIH (SEQ ID NO: 4)的 HVR-Hl ； (e)包含序列 GIYPAGGATYYADSVKG (SEQ ID NO: 5)的HVR-H2 ;和(f)包含序列 WffAWPAFDY(SEQ ID NO:6)的 HVR-H3。
6.權利要求5的抗體，其包含輕鏈可變域，且進一步包含重鏈可變域，該輕鏈可變域具有序列DIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8)
7.權利要求5的抗體，其包含重鏈可變域，且進一步包含輕鏈可變域，該重鏈可變域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
8.權利要求5的抗體，其包含輕鏈可變域和重鏈可變域，該輕鏈可變域具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQSNRAPATFGQGTKVE IKR (SEQ ID NO: 8)，該重鏈可變域具有序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNGTYIHWVRQAPGKGLEWVGGIYPAGGATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKffffAffPAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。
9.前述權利要求任一項的抗體,其中該抗體包含人K亞組共有框架序列。
10.前述權利要求任一項的抗體，其中該抗體包含重鏈人亞組III共有框架序列。
11.權利要求10的抗體，其中該抗體包含第71位或第73位中一個或多個位置處的替代。
12.權利要求11的抗體，其中所述替代是R71A、N73T、或N78A中的一個或多個。
13.前述權利要求任一項的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。
14.前述權利要求任一項的抗體，其中該抗體選自下組嵌合抗體，人源化抗體，親和力成熟抗體，人抗體，和雙特異性抗體。
15.前述權利要求任一項的抗體，其中該抗體是抗體片段。
16.—種多核苷酸,其編碼權利要求1-15任一項的抗體。
17.—種宿主細胞,其包含權利要求16的多核苷酸。
18.—種用于生成權利要求1-15任一項的抗體的方法,所述方法包括培養(yǎng)權利要求17的宿主細胞，使得該抗體生成。
19.權利要求18的方法，進一步包括自所述宿主細胞回收所述抗體。
20.一種免疫偶聯(lián)物，其包含權利要求I的抗體和細胞毒劑。
21.一種藥物配制劑，其包含權利要求I的抗體和藥學可接受載體。
22.權利要求21的藥物配制劑，其進一步包含別的治療劑。
23.作為藥物使用的權利要求I的抗體。
24.在治療癌癥中使用的權利要求I的抗體。
25.在抑制血管發(fā)生中使用的權利要求I的抗體。
26.在抑制細胞增殖中使用的權利要求I的抗體。
27.權利要求I的抗體在制造藥物中的用途。
28.權利要求27的用途，其中所述藥物用于治療癌癥。
29.權利要求27的用途，其中所述藥物用于抑制血管發(fā)生或抑制細胞增殖。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于調控肝細胞生長因子激活劑功能的方法和組合物。
文檔編號C07K16/40GK102791739SQ201080055074
公開日2012年11月21日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權日2009年10月19日
發(fā)明者D.科赫霍弗, R.甘尼桑 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司