專利名稱：純化糖蛋白的方法
純化糖蛋白的方法 本發(fā)明涉及純化糖蛋白，比如FSH(卵泡刺激激素)，LH(黃體化激素)，CG(絨毛膜促性腺激素)和TSH (甲狀腺-刺激激素)的方法，以及使用各自的純化過程制備重組目的糖蛋白。糖蛋白是含有共價(jià)連接至多肽側(cè)鏈的低聚糖鏈的蛋白。糖蛋白能夠具有非常多祥的不同生物學(xué)功能，包括結(jié)構(gòu)、保護(hù)性、載體、激素或酶功能。相應(yīng)地，各種糖蛋白能夠用作藥物。從而，高度希望提供這樣的糖蛋白?，F(xiàn)今數(shù)種糖蛋白能夠重組地產(chǎn)生，然而其需要繁復(fù)的純化程序來將靶標(biāo)糖蛋白自細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中提出。ー類重要的糖蛋白是促性腺激素，四種緊密相關(guān)的激素類的家族，其包括FSH，LH，CG 和 TSH(Glycobiology，vol. 13，no. 3，pages 179-189，2003)。FSH用于例如在女性和男性患者中治療不育和繁殖障礙。另外，hCG和LH也用于生育治療，単獨(dú)或與FSH組合。 在自然界，F(xiàn)SH通過垂體腺產(chǎn)生。對(duì)于藥物用途，F(xiàn)SH可以重組地產(chǎn)生(rFSH)，或者其可以分離自經(jīng)絕后女性的尿(uFSH)。FSH用于女性患者的排卵誘導(dǎo)(OI)和控制性卵巢過度刺激(COH)的輔助繁殖技術(shù)(ART)。在典型的排卵誘導(dǎo)治療方案中，對(duì)患者毎日給予FSH或變型(約75至300IU FSH/天)的注射劑，持續(xù)約6至約12天的時(shí)間段。在典型的控制性卵巢過度刺激治療方案中，每日對(duì)患者給予FSH或變型(約150-600IU FSH/天，但是也低至75IU FSH/天)注射劑，持續(xù)約6至約12天的時(shí)間段。FSH也用來誘導(dǎo)罹患精液缺乏的男性的精子發(fā)生。用150IU FSH 3次/周與2’ 500IU hCG兩次/周組合的方案已成功實(shí)現(xiàn)罹患促性腺激素分泌不足型性腺功能減退癥男性的精子計(jì)數(shù)的改善(Burgues 等人；Subcutaneous self-administration of highlypurified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for thetreatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group onMale Hypogonadotrophic Hypogonadism;Hum. Reprod. ;1997，12，980-6)。因?yàn)椋現(xiàn)SH在治療生育障礙中的重要性，提供高純度和高特異活性的FSH是希望的。FSH治療需要重復(fù)注射。高度純化FSH制劑能夠經(jīng)皮下給予，允許患者自行給藥，從而増加患者舒適度和順從性。Lynch %=人(The extraction and purification of human pituitaryfo11icIe_stimuI ating hormone and luteinising hormone ; ActaEndocrinologica, 1988, 288, 12-19)描述純化人類垂體FSH的方法。該方法牽涉陰離子和陽離子交換色譜法，免疫親和萃取和尺寸排阻色譜法。WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA)描述純化人類尿 FSH 的方法，開始于稱為人類絕經(jīng)促性腺激素(hMG)的尿提取物。該方法使用在弱堿性陰離子交換樹脂DE[Xi]AE的離子交換色譜法，隨后在具有蒽醌衍生物作為配體的樹脂上的親和色譜法。WO 00/63248 (Instituto Massone SA)描述自人尿純化促性腺激素，包括FSH的方法。該方法牽涉下述步驟采用磺基丙基類強(qiáng)陽離子樹脂的離子交換色譜法，采用強(qiáng)陰離子樹脂的離子交換色譜法，和疏水相互作用色譜法(HIC)。
Chiba 等人[Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSHfrom canine pituitary gland;Endocrinol. J.，1997，44，205-218]描述純化犬垂體促性素，包括FSH的技術(shù)，用Concanavalin (Con) A親和色譜法，疏水相互作用色譜法(HIC)和Cu++的固定化金屬離子色譜法。WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)描述自尿純化人類FSH的方法。該方法牽涉免疫色譜，其中FSH-特異性固定化的單克隆抗體通過ニこ烯基砜結(jié)合至Sepharose 4B,隨后反相HPLC。EP 1106623A1公開通過使用染料親和色譜法自生物學(xué)樣品例如人類垂體腺或人類經(jīng)絕后尿的純化FSH的方法。純化重組FSH 的方法公開于 WO 2005/063811 Al, W02006/051070 Al, WO2007/065918 A2 和 WO 2009/000913 Al。
WO 2009/000913 Al公開產(chǎn)生FSH的細(xì)胞克隆，用該細(xì)胞克隆產(chǎn)生FSH并且純化自細(xì)胞培養(yǎng)物上清液獲得的重組FSH的方法。純化可以通過專家已知的ー個(gè)或多個(gè)步驟進(jìn)行，包括離子交換色譜法，疏水相互作用色譜法，羥基磷灰石色譜法，親和色譜法和凝膠過濾。WO 2005/063811 Al公開純化重組FSH的方法用步驟(I)離子交換色譜法，(2)固定化金屬離子色譜法，和(3)疏水相互作用色譜法。WO 2006/051070 Al公開純化重組FSH的方法用步驟(I)染料親和色譜法，(2)疏水相互作用色譜法，和(3)反相色譜法，它們可以以任意次序進(jìn)行。WO 2007/065918 A2公開純化重組FSH方法用步驟(I)染料親和色譜法，(2)弱陰離子交換色譜法，(3)疏水相互作用色譜法，和(4)強(qiáng)陰離子交換色譜法，它們可以以任意次序進(jìn)行。因此，本發(fā)明目的是提供優(yōu)選成本有效的純化過程，其以高收率和純度產(chǎn)生糖蛋白比如FSH。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及糖蛋白比如FSH的純化方法，包括對(duì)含有所述糖蛋白的液體進(jìn)行下述步驟a)反相色譜法(RPC)；b)尺寸排阻色譜法(SEC);和c)疏水相互作用色譜法(HIC)。步驟a)，b)和c)可以以任意次序進(jìn)行。優(yōu)選的是，反相色譜法或疏水相互作用色譜法作為三個(gè)色譜法步驟中的第一步進(jìn)行。在更優(yōu)選實(shí)施方式中，反相色譜法作為三個(gè)色譜法步驟中的第一步進(jìn)行。純化過程可以任選地包含額外的步驟，例如離子交換色譜法比如陰離子交換色譜法或陽離子交換色譜法，親和色譜法比如染料親和色譜法，免疫親和色譜法，凝集素親和色譜法或過硼酸鹽親和色譜法，過濾比如透析過濾，超濾或納米過濾，和/或至少ー個(gè)病毒滅活步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明過程包括離子交換色譜法(AEX)作為第四色譜法步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(a)，(b)和(C)以這樣的次序進(jìn)行(I)反相色譜法，(2)尺寸排阻色譜法，和
(3)疏水相互作用色譜法。
優(yōu)選作為第一色譜法步驟進(jìn)行RPC，原因是該實(shí)施方式使得可以選擇將相當(dāng)〃粗制的"生物學(xué)液體比如粗制糖蛋白、天然來源液體、細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞溶解產(chǎn)物直接加載于RPC上，任選地描述如下的在清潔(例如過濾)、濃縮和/或緩沖劑交換步驟之后。該實(shí)施方式提供的優(yōu)勢(shì)是，即使在使用這種樣品液體的情況下，能夠?qū)⒏吡康臉悠芳虞d與色譜法柱上，而不存在堵塞或過載柱的危險(xiǎn)。另外，RPC需要的緩沖劑條件不會(huì)導(dǎo)致樣品溶液組分的過度團(tuán)聚?？傮w來說，用RPC作為第一色譜法步驟減少了在開始色譜純化之前所必需的制備步驟數(shù)，并且允許使用高量的樣品溶液，該樣品溶液含有高量的除目的糖蛋白之外的其它組分。在又一優(yōu)選實(shí)施方式中，在尺寸排阻色譜法(2)之后且在疏水相互作用色譜法
(3)之前進(jìn)行陰離子交換色譜法(d)。如上文描述，除了所述步驟以及在所述步驟之間還可以進(jìn)行額外的步驟。本發(fā)明的純化方法提供高純度的糖蛋白比如FSH，其可以然后配制為藥物組合物。純度通常高于90%,優(yōu)選>95%w/w,更優(yōu)選>99%w/w,甚至更優(yōu)選>99. 5%w/w,按總蛋白質(zhì)計(jì)。另外，本發(fā)明的純化方法可容易地放大，甚至達(dá)到エ業(yè)規(guī)模，而不需顯著改變純化條件。形成根據(jù)本發(fā)明的純化過程的原料的粗制糖蛋白可以以天然來源提供或者得自天然來源的液體或者通過重組技術(shù)比如在含有糖蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中得到。一般地，在進(jìn)行第一色譜步驟之前，得自天然來源或細(xì)胞收獲物、優(yōu)選細(xì)胞收獲物的原料首先進(jìn)行清潔(例如過濾)，然后任選地濃縮(例如用超濾)和/或進(jìn)行緩沖劑交換(例如經(jīng)過透析過濾步驟)。在色譜法步驟中，使用一般可商購的樹脂，優(yōu)選聚合物類樹脂或瓊膠糖類樹月旨。還可能使用膜色譜法，其中樹脂用官能化膜比如Sartobind 膜(Sartorius)或ChromaSorb (Mi 11 ipore)替換。本發(fā)明純化過程的步驟在下文更詳細(xì)地描述。反相色譜法步驟(a)該過程牽涉反相色譜法(a)步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，特別是在重組糖蛋白的情況下，將反相色譜法用作捕獲步驟，其中糖蛋白得以富集，例如自天然來源液體或細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。優(yōu)選在自RPC柱洗脫之后施行病毒滅活。"反相色譜法"根據(jù)本發(fā)明尤其是指這樣的色譜法步驟，其中使用非極性固定相和優(yōu)選極性流動(dòng)相。在反相色譜法中，通常極性化合物首先洗脫，而非極性化合物得以保
&3甶o反相色譜法通常這樣進(jìn)行平衡并加載柱，隨后洗滌，然后洗脫，各自使用優(yōu)選含有有機(jī)溶劑比如こ腈或異丙醇的緩沖劑。有機(jī)溶劑比如異丙醇能夠用于在洗脫之后病毒滅活。平衡、加載、洗滌和洗脫優(yōu)選通過用這樣的流動(dòng)相進(jìn)行，其緩沖于弱堿性pH，例如為或約為PH7至8. 5，更優(yōu)選為或約為7. 5。在優(yōu)選實(shí)施方式中，緩沖物質(zhì)是磷酸緩沖劑，優(yōu)選磷酸鈉。適用于pH為或約為7. 5的替代緩沖液包括BES，MOPS,こ酸銨，TES, HEPES0優(yōu)選，在步驟(a)之后不進(jìn)行緩沖劑交換，利于隨后進(jìn)行步驟(b) (SEC)的情況。那么，緩沖劑交換能夠通過隨后SEC實(shí)現(xiàn)通過將后續(xù)色譜法步驟比如AEX或HIC色譜法的優(yōu)選緩沖劑用作運(yùn)行緩沖劑。在優(yōu)選實(shí)施方式中，用于RPC步驟的緩沖溶液含有有機(jī)溶劑，對(duì)于不同色譜法步驟階段(平衡、加載、洗滌和洗脫)調(diào)節(jié)其濃度。優(yōu)選，有機(jī)溶劑是可與水混合的有機(jī)溶劑比如こ腈或醇(比如甲醇、こ醇等)，更優(yōu)選異丙醇。在平衡和加載緩沖溶液中，以及在洗滌緩沖溶液中，有機(jī)溶劑優(yōu)選包含為總緩沖溶液的5至15%v/v的量，優(yōu)選總緩沖溶液的5至12%v/v的量。洗滌緩沖劑一般地等同于加載緩沖劑。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑在洗脫緩沖溶液中比在加載緩沖劑中量更高，優(yōu)選為總緩沖溶液15至22%v/v的量，更優(yōu)選總緩沖溶液16至20%v/v的量。在優(yōu)選實(shí)施方式中，反相色譜法步驟能夠包括病毒滅活步驟。病毒滅活可以通過在有機(jī)溶劑優(yōu)選異丙醇或こ醇存在下溫育加載至、結(jié)合至或洗脫自柱的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選選擇溫育時(shí)間和溫育溫度以引起希望的病毒滅活度，其尤其取決于所用有機(jī)溶劑的濃度和 性質(zhì)。另外，這些參數(shù)也應(yīng)取決于待純化糖蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，蛋白質(zhì)溫育至少15分鐘，優(yōu)選至少30分鐘，至少45分鐘，至少I小時(shí)，至少2小時(shí)，至少3小時(shí)或至少6小時(shí)。溫育能夠在低溫比如等于或低于4° C或等于或低于10°C進(jìn)行，或者其能夠在約室溫進(jìn)行。溫育能夠直接進(jìn)行在將樣品加載至柱上之后，在洗滌步驟期間或在其之后，在施用洗脫緩沖劑之后但在洗脫糖蛋白之前，或者在洗脫糖蛋白之后。如果異丙醇用作有機(jī)溶劑，病毒滅活優(yōu)選在至少15%(v/v)，優(yōu)選約18%(v/v)的異丙醇濃度下完成。在該情況下，糖蛋白優(yōu)選溫育約2小時(shí)，優(yōu)選在室溫下。優(yōu)選地，病毒滅活在自反相色譜法柱洗脫糖蛋白之后，優(yōu)選在所用的洗脫緩沖劑中進(jìn)行。然而，在自柱洗脫之后，任選地可以將其它組分加入糖蛋白溶液，尤其是用于增強(qiáng)病毒滅活和/或糖蛋白穩(wěn)定性。在RPC期間用病毒滅活步驟的情況下，則本發(fā)明方法可以不用任意其它病毒滅活步驟地進(jìn)行。然而，各種病毒滅活步驟還可以相組合，例如在RPC期間的病毒滅活和如本文描述的經(jīng)由納米過濾和/或經(jīng)由pH調(diào)整的病毒滅活。在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，RPC步驟(平衡，加載，洗滌，洗脫)的產(chǎn)品-接觸緩沖液含有抗氧化劑，比如L-甲硫氨酸。另選的抗氧化劑包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2，6- ニ(I, I-ニ甲基こ基)-4-甲基苯酚；焦亞硫酸氫鉀或鈉，亞硫酸氫鈉。反相柱物質(zhì)由疏水物質(zhì)可以連接至的樹脂構(gòu)成。典型的柱物質(zhì)是ニ氧化硅和聚苯こ烯；疏水配體可以任選地連接。在經(jīng)取代樹脂的情況下，樹脂用疏水配體取代，所述配體一般地選自(但不限于)脂族，比如C2，C4, C6, C8, C10, C12, C14, C16,或C18或它們的衍生物例如氰基丙基(CN-丙基)，或支化脂族，或苯類芳族比如苯基，或其它極性或非極性配體。配體可以是這些配體中兩個(gè)或更多個(gè)的混合物。適宜的聚苯こ烯類樹脂包括，不受限制地，Rohm Haas 供給的樹脂(例如 Amberlite XAD 或 Amberchrom CG), Polymer Labs 供給的樹月旨(例如PLRP-S), GEHealthcare供給的樹脂(例如來源RPC), Applied Biosystems供給的樹脂(例如Poros R)。特別優(yōu)選的樹脂是Source 30RPC (GE Healthcare)。柱物質(zhì)的制備過程和最佳特征常常需要在樹脂與配體之間插入聯(lián)接基團(tuán)也稱為間隔物(spacer)。本發(fā)明方法中的其它參數(shù)包括載量，也即加載至柱的蛋白質(zhì)的量，以及流速。這些參數(shù)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。一般地，糖蛋白以至少約0. Img姆ml樹脂，例如至少約0. 2mg,0. 5mg, lmg, 2mg,5mg, 10,或 20mg 甸 ml 樹脂；或 0. l_200mg,例如 0. 1-lOOmg, 0. 5-100mg, l_50mg,或 2_30mg每mL樹脂的濃度加載至柱上；優(yōu)選載量為至少Img每mL樹脂。堆積樹脂體積的測量一般以懸浮或相似模式完成。尺寸排阻色譜法步驟(b)本發(fā)明過程也牽涉尺寸排阻色譜法(b)步驟，例如用于進(jìn)ー步純化和/或再緩沖糖蛋白。尺寸排阻色譜法包括平衡并將先前色譜法步驟的洗脫物加載至用緩沖劑平衡的凝膠過濾基質(zhì)的步驟，所述緩沖劑具有貯藏或進(jìn)ー步處理糖蛋白所希望的組合物，PH—般為
6.5至9，優(yōu)選約8. 5。對(duì)于進(jìn)行尺寸排阻色譜法，凝膠一般選自高分子凝膠的組，包括但不限于右旋糖酐類凝膠比如Sephadex (例如Sephadex G-25)或聚丙烯酰胺凝膠比如Sephacryl (例如Sephacryl-S400),瓊膠糖類凝膠比如 Superose 或 Sepharose (例如 Sepharose CL-4B),和制備自兩種凝膠的復(fù)合物凝膠比如Superdex 200組合右旋糖酐(Sephadex )和交聯(lián)瓊膠糖(Superose )凝膠。在優(yōu)選實(shí)施方式中，緩沖劑選自磷酸鈉，こ酸銨，MES(2-(N_嗎啉代)こ磺酸)，Bis-Tris (2- ニ(2-羥基こ基)氨基_2_ (羥基甲基)_1，3-丙ニ醇)，ADA (N- (2-こ酰氨基)亞氨基ニこ酸)，PIPES (哌嗪-N，N' -ニ(2-こ磺酸)，ACES (N-(2-こ酰氨基)-2-氨基こ磺酸)，BES (N，N-ニ(2-羥基こ基)-2-氨基こ烷-磺酸)，MOPS (3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)，TES (N-三(羥基甲基)甲基-2-氨基こ磺酸)，HEPES (N-2-羥基こ基-哌嗪-N，-2-こ磺酸)，優(yōu)選磷酸鈉或こ酸銨，更優(yōu)選こ酸銨。任選地，所述緩沖劑此外包含無機(jī)鹽，優(yōu)選堿土金屬鹵化物，更優(yōu)選氯化鉀或氯化鈉，最優(yōu)選氯化鈉，其中所述無機(jī)鹽的濃度是約0至500mM，優(yōu)選0至300mM，最優(yōu)選約0至50mM。在優(yōu)選實(shí)施方式中，緩沖劑是不含鹽(salt free) 0在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，SEC (平衡，加載，洗脫)步驟(b)的產(chǎn)品-接觸緩沖液含有抗氧化劑，比如L-甲硫氨酸。備擇抗氧化劑包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2，6-ニ(1，I-ニ甲基こ基)-4-甲基苯酚；焦亞硫酸氫鉀或鈉，亞硫酸氫鈉。尺寸排阻色譜法還包括通過等度洗脫來自所述凝膠過濾基質(zhì)洗脫糖蛋白的步驟，也即洗脫緩沖劑具有與用于平衡和/或加載的緩沖劑大致相同的、優(yōu)選相同的組成。可以通過280nm的UV吸收記錄溢流(flow through),收集含有糖蛋白的級(jí)分。疏水相互作用色譜法步驟(C)本發(fā)明過程也牽涉疏水相互作用色譜法(C)步驟。疏水相互作用色譜法通常通過平衡并加載柱、隨后洗滌和隨后洗脫來進(jìn)行。疏水相互作用色譜法(HIC)是利用蛋白疏水特性的分離方法。吸附作用通過在蛋白質(zhì)非極性區(qū)域與固體支持物上的固定化疏水配體之間的疏水相互作用得以加強(qiáng)。吸附在含水流動(dòng)相中于高鹽濃度實(shí)現(xiàn)，通過降低鹽濃度使得便于洗脫。疏水相互作用色譜法物質(zhì)是用疏水配體比如こ基、丁基、苯基或己基基團(tuán)的取代的基質(zhì)。優(yōu)選的物質(zhì)是用丁基或苯基配體取代的基質(zhì)。疏水相互作用色譜法(HIC)樹脂是本領(lǐng)域已知的，且包括樹脂比如ButylSepharose (GE Healthcare),苯基 Sepharose (低和高取代)，辛基 Sepharose 和燒基Sepharose (全部來自GE Healthcare ;其它HIC樹脂來源包括Biosepra,法國；E. Merck,德 國；BioRad USA)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，疏水相互作用色譜法用樹脂比如Butyl Sepharose HP(可得自GE Healthcare)進(jìn)行。應(yīng)理解步驟(C)可以用具有相似特征的替代樹脂進(jìn)行。可以使用的備擇樹脂如下Toyopearl Butyl650M(可得自 Tosoh Biosep Inc.),苯基 Sepharose6Fast Flow (低取代);苯基 Sepharose 6Fast Flow (高取代)；Butyl Sepharose 4Fastrlow ；羊基;Sepnarose 4Fast Flow ； 5 Sepharose high Performance ；Sourcel5ETH ；Source 15IS0 ；Source 15PHE 全部來自 GE Biosciences (800) 526-3593。其它樹脂是Hydrocell C3 或 C4 ;Hydrocell Phenyl,來自 BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558 ;(參見www. biochrom. com)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，平 衡、加載、洗滌和洗脫緩沖劑選自磷酸鈉，MES, Bis-Tris,ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES，優(yōu)選磷酸鈉。在HIC樹脂上的結(jié)合通常通過使用高電導(dǎo)率的平衡和加載緩沖劑來實(shí)現(xiàn)，所述緩沖劑例如通過加入鹽比如NaCI、(NH4)2SO4或Na2SO4，優(yōu)選硫酸銨來獲得。優(yōu)選的鹽濃度是I至2M，優(yōu)選約I. 5M(NH4)2S04。洗滌一般地使用加載緩沖劑。疏水相互作用色譜法的洗脫步驟優(yōu)選通過降低流動(dòng)相電導(dǎo)率(降低鹽濃度)進(jìn)行。所述減少能夠以線性方式或分步實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選使用這樣的平衡、加載、洗滌和洗脫緩沖劑，其具有為或約為6至為或約為9，更優(yōu)選為或約為7. 0至為或約為8. 5，最優(yōu)選為或約為7. 5的pH。特別優(yōu)選的平衡、加載和洗滌緩沖劑系統(tǒng)含有磷酸鈉和硫酸銨，優(yōu)選pH為或約為7. 5。優(yōu)選的洗脫緩沖劑含有pH為或約為7. 5的磷酸鈉。在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，HIC步驟(C)(平衡、加載、洗滌、洗脫)的產(chǎn)品-接觸緩沖液含有抗氧化劑，比如L-甲硫氨酸。備擇抗氧化劑包括叔丁基-4-甲氧基苯酚，2，6- ニ(I, I-ニ甲基こ基)-4-甲基苯酚；焦亞硫酸氫鉀或鈉，亞硫酸氫鈉。額外的步驟除了三個(gè)主要色譜法步驟(a)，(b)和(C)，本發(fā)明過程可以任選地包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的額外的步驟，例如色譜法步驟，過濾步驟或病毒滅活步驟。優(yōu)選的額外的步驟是離子交換色譜法比如陰離子交換色譜法或陽離子交換色譜法，親和色譜法比如染料親和色譜法，免疫親和色譜法，凝集素親和色譜法或過硼酸鹽親和色譜法，過濾比如透析過濾，超濾或納米過濾，或病毒滅活。陰離子交換色譜法步驟(d)在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明過程還包含陰離子交換色譜法(d)。陰離子交換色譜法通常通過平衡和加載柱，隨后洗滌并隨后洗脫來進(jìn)行。陰離子交換色譜法這樣進(jìn)行優(yōu)選用季銨樹脂，比如CaptoQ(可得自GEHealthcare),或具有相似特征的樹脂比如ToyoPearl QEA(可得自Tosoh), Q SepharoseFF(可得自 GE Healthcare)或 Fractogel EMD, Fractogel TMAE 或 Fractogel HICAP(可得自 Merck KGaA, Darmstadt 德國)。陰離子交換色譜法樹脂優(yōu)選通過使用具有溫和堿性pH的緩沖劑來平衡的，加載和洗漆，所述溫和堿性pH例如為或約為7. 2至為或約為9. 0,或?yàn)榛蚣s為8. 0至為或約為
9.0，最優(yōu)選為或約為8. 5。適宜的緩沖液包括，例如硼酸緩沖劑，三こ醇胺/亞氨基ニこ酸，三(2-氨基-2-羥基甲基-丙烷-1，3-ニ醇)，磷酸鈉，こ酸銨，曲辛(N-(三(羥基甲基)甲基)甘氨酸)，N-ニ羥こ基甘氨酸(2-( ニ(2-羥基こ基)氨基)こ酸)，TES, HEPES,TAPS (N-三(羥基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸)。最優(yōu)選こ酸銨，pH為或約為8. 5。自離子交換樹脂的洗脫通過由加入鹽優(yōu)選NaCl來増加流動(dòng)相電導(dǎo)率而實(shí)現(xiàn)。適宜的緩沖液包括，例如硼酸緩沖劑，三こ醇胺/亞氨基ニこ酸Tris，こ酸銨，曲辛，N-ニ羥こ基甘氨酸，TES，HEPES，TAPS。優(yōu)選是こ酸銨。陰離子交換色譜法能夠用來選擇性地洗脫不同的電荷同種型，這些不同類型主要源自糖蛋白聚糖部分的不同唾液酸化和/或硫酸化水平。糖蛋白這樣構(gòu)建肽骨架和低聚糖以0-連接方式連接至絲氨酸和/或蘇氨酸殘基的OH-基團(tuán)和/或以N-連接方式連接至天冬酰胺的酰胺基團(tuán)。低聚糖結(jié)構(gòu)常常終止于帶負(fù)電的糖神經(jīng)氨酸(也命名為唾液酸)。糖蛋白產(chǎn)品的體內(nèi)活性顯得受末端半乳糖的唾液酸化度影響。例如De Leeuw等 人(1996，Mol Hum Reprod. 1996年5月；2(5) :361-9)顯示具有高唾液酸含量的FSH同種型引發(fā)相比具有較低唾液酸含量的那些較高的特異活性，原因是延長的循環(huán)半衰期。然而，具有較低唾液酸含量的FSH同種型顯示較高的受體結(jié)合活性。因此，對(duì)于FSH特定應(yīng)用，可以需要具有不同唾液酸化度的不同同種型。術(shù)語"同種型"，如本文所用，是指含有糖蛋白的糖蛋白制劑/級(jí)分，所述糖蛋白具有等同或很相似的氨基酸序列以及共同的等電點(diǎn)，但是它們可以在所連接的半乳糖基和唾液酰基的程度、復(fù)雜性、性質(zhì)、觸角性和次序上有區(qū)別。根據(jù)本發(fā)明的同種型還可以包含相同或很相似的氨基酸序列和等電點(diǎn)的多種糖蛋白形式，其額外地區(qū)別于其它的電荷攜帶修飾比如こ酰化和硫酸化。術(shù)語"很相似的氨基酸序列"指出蛋白質(zhì)也的氨基酸序列包含功能等同于野生型氨基酸序列和從而發(fā)揮相同功能的那些序列。尤其是，"很相似的氨基酸序列〃共享與參比氨基酸序列至少70%，優(yōu)選至少80%，至少90%，至少95%，最優(yōu)選至少98%的序列同源性，優(yōu)選序列同一性；在一段連續(xù)氨基酸內(nèi)代表整個(gè)參比氨基酸序列的至少50%，優(yōu)選至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，更優(yōu)選100%。從而，糖蛋白同種型優(yōu)選能夠通過它們的等電點(diǎn)和氨基酸序列進(jìn)行定義，而各種這樣定義的同種型可以實(shí)際上包含嚴(yán)格化學(xué)意義的多個(gè)同種型(具有相同原子組分但空間結(jié)構(gòu)不同的分子)。尤其是，相同同種型的不同糖蛋白的等電點(diǎn)差異優(yōu)選不超過2単元，更優(yōu)選不超過I単元，不超過0. 5単元或不超過0. 2単元，而最優(yōu)選等電點(diǎn)差異不超過0. I單元。對(duì)于不同地帯電同種型比如不同地唾液酸化的同種型的選擇性洗脫來說，優(yōu)選使用兩種或更多種，優(yōu)選PH和/或鹽含量不同的兩種洗脫緩沖液A和B，它們各自基于例如こ酸銨，硼酸緩沖劑，三こ醇胺/亞氨基ニこ酸，Tris，磷酸鈉，こ酸銨，曲辛，N-ニ羥こ基甘氨酸，TES, HEPES或TAPS，優(yōu)選こ酸銨。使用不同的洗脫緩沖液，洗脫能夠以分步方式進(jìn)行，首先用一種洗脫緩沖劑，然后用另ー種洗脫緩沖劑，任選地也用洗脫緩沖液的不同混合物進(jìn)行ー種或多種中間洗脫步驟。另選地或額外地，洗脫能夠使用梯度進(jìn)行，開始于第一混合比例的洗脫緩沖液(例如100%的第一洗脫緩沖劑)，逐漸變?yōu)榈诙旌媳壤南疵摼彌_液(例如100%的第二洗脫緩沖劑)。首先使用的洗脫緩沖劑(緩沖劑A)通常能夠是a)溫和酸性緩沖劑，其不含，或b)中性或溫和堿性緩沖劑，具有低含鹽量比如NaCl (優(yōu)選20至200mM)。緩沖劑A能夠用來 洗脫低電荷例如低唾液酸化度的糖蛋白。在變型a)中，緩沖劑A具有的pH例如為或約為3.O至為或約為6. 5,或?yàn)榛蚣s為4. O至為或約為6. 0,最優(yōu)選為或約為5。在變型b)中，緩沖劑A具有pH例如為或約為7. 0至9. 0，優(yōu)選8. 5。第二使用的洗脫緩沖劑(緩沖劑B)通常是含鹽的溫和堿性緩沖劑，含鹽量比緩沖劑A更高，其能夠用來洗脫高電荷例如高唾液酸化度的糖蛋白。緩沖劑B具有的pH例如為或約為7. 0至為或約為9. 0,或?yàn)榛蚣s為8. 0至為或約為9. 0,最優(yōu)選為或約為8. 5。鹽優(yōu)選是NaCl。緩沖劑B中的含鹽量優(yōu)選是200mM至1M。使用不同的洗脫緩沖液和梯度或分步洗脫，加載于陰離子交換色譜法柱上的不同的糖蛋白同種型將取決于其電荷在不同的級(jí)分中洗脫。例如，待純化的糖蛋白可以出現(xiàn)在流過級(jí)分中，也即其僅弱地結(jié)合至陰離子交換色譜法柱或者完全不與其結(jié)合，其可以用第一洗脫緩沖劑，特定混合比例的第一和第二洗脫緩沖劑，或者用第二洗脫緩沖劑進(jìn)行洗脫。糖蛋白級(jí)分用于進(jìn)ー步純化步驟，從而，待純化的糖蛋白同種型主要取決于糖蛋白所希望的應(yīng)用。無關(guān)的其它糖蛋白同種型能夠用陰離子交換色譜法步驟除去。關(guān)于FSH，例如僅具有高唾液酸化度和從而具有高循環(huán)半衰期的FSH，或僅具有低唾液酸化度和從而具有高受體結(jié)合活性的FSH，可以得以純化。 在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，離子交換色譜法的產(chǎn)品-接觸緩沖液(平衡，洗滌，洗脫)含有抗氧化劑，優(yōu)選L-甲硫氨酸。備擇抗氧化劑如上文所述。作為備擇或除標(biāo)準(zhǔn)陰離子交換色譜法以外，能夠進(jìn)行色譜聚焦。色譜聚焦是根據(jù)其等電點(diǎn)(PD差異分離蛋白的色譜法技木。尤其是，能夠使用帶電固定相，加載于色譜聚焦柱上的蛋白能夠用PH梯度洗脫。例如，固定相可以帶正電而pH梯度可以從第一 pH進(jìn)展至第二較低pH,例如從約pH 9至約pH 6或者從約pH 7至約pH 4。由于特定色譜聚焦條件，按其等電點(diǎn)順序的蛋白洗脫物和優(yōu)選特定Pl的蛋白聚焦至窄帶中。由于PH高于其pi的蛋白帶負(fù)電且結(jié)合至帶正電固定相而導(dǎo)致移動(dòng)減慢。在洗脫梯度PH達(dá)到蛋白質(zhì)pi的情況下，其整體呈電荷中性，從而隨流動(dòng)相流動(dòng)而遷移。在低于蛋白質(zhì)Pl的PH，蛋白質(zhì)由于帶正電荷而被固定相排斥，從而將其加速。由此在聚焦區(qū)后部的蛋白遷移比前部那些更快速，逐漸形成更窄的蛋白帯。在該環(huán)境下，具有最高Pl的蛋白質(zhì)第一洗脫，具有最低Pl的蛋白質(zhì)最后洗脫。適宜的固定相是,例如,用帶電緩沖胺比如Mono P(可得自GEHealthcare)取代的介質(zhì)或者其它陰離子交換色譜法物質(zhì)。對(duì)于形成洗脫P(yáng)H梯度，能夠使用適宜的緩沖系統(tǒng)比如Polybuffer 74或Polybuffer 96 (可得自GE Healthcare)。柱的平衡、加載和洗漆能夠用任意條件完成，該條件下目的糖蛋白和/或任意雜質(zhì)結(jié)合至柱物質(zhì)。例如，可以使用上述陰離子交換色譜法條件。在用降低的PH梯度的情況下，優(yōu)選將具有等于或高于洗脫梯度開始PH的pH的緩沖劑用于平衡、加載和/或洗滌。在用増加的pH梯度的情況下，優(yōu)選將具有等于或低于洗脫梯度開始PH的pH的緩沖劑用于平衡、加載和/或洗滌。優(yōu)選，對(duì)于平衡、加載和洗漆，使用的緩沖劑具有類似洗脫開始的PH梯度的那些?？傮w過程反相色譜法、尺寸排阻色譜法、疏水相互作用色譜法和陰離子交換色譜法的步驟可以以任意次序進(jìn)行，盡管優(yōu)選首先進(jìn)行反相色譜法步驟。剰余步驟可以以任意次序進(jìn)行，盡管優(yōu)選按照(I)反相色譜法，(2)尺寸排阻色譜法，(3)陰離子交換色譜法，(4)疏水相互作用色譜法的次序。任選的是隨后的超濾和/或透析過濾的濃縮和/或緩沖劑交換步驟(5),和納米過濾的步驟(6)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，純化根據(jù)本發(fā)明的糖蛋白的方法不包括免疫親和色譜法和/或陽離子交換色譜法。更優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的方法不包括除本文描述那些之外的任何其它色譜步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選包括僅三種色譜步驟，也即反相色譜法、尺寸排阻色譜法和疏水相互作用色譜法，或者僅四種步驟，也即反相色譜法、尺寸排阻色譜法、陰離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法。陰離子交換色譜法還可以用上述的色譜聚焦步驟替換。然而，還可以進(jìn)行除此以外以及在步驟之間其它非色譜步驟，優(yōu)選本文描述的那些優(yōu)選，這些其它步驟包括用于減少或滅活不希望或危險(xiǎn)物質(zhì)比如細(xì)菌、病毒、核酸或朊病毒蛋白的步驟，例如無菌過濾、納米過濾、吸附和/或PH滅活步驟。在備擇實(shí)施方式中，除上述步驟之外，根據(jù)本發(fā)明的過程可以包含用于減少或滅活不希望或危險(xiǎn)物質(zhì)的色譜步驟，包括例如吸附色譜法。優(yōu)選，本發(fā)明的純化過程包含至少ー個(gè)，更優(yōu)選至少兩種，最優(yōu)選至少三種病毒減少或滅活步驟。在這方面，也可以將根據(jù)本發(fā)明的純化過程的色譜法步驟，尤 其是尺寸排阻色譜法步驟(b)，用作病毒減少步驟，原因是它們通常將病毒與糖蛋白分離。例如，病毒和病毒類顆粒與糖蛋白相比具有大得多的尺寸，從而在尺寸排阻色譜法期間有效地與其分開。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在尺寸排阻色譜法之前直接和/或在其之后直接不包括緩沖劑交換步驟。尤其是，如果本發(fā)明方法進(jìn)行以(I)反相色譜法，(2)尺寸排阻色譜法，任選的(3)陰離子交換色譜法，和(4)疏水相互作用色譜法的次序，優(yōu)選在反相色譜法與尺寸排阻色譜法之間和/或在尺寸排阻色譜法與陰離子交換色譜法或疏水相互作用色譜法之間無緩沖劑交換。其它步驟在第一色譜法步驟之前(特別在反相色譜法步驟之前)，可以希望進(jìn)行超濾步驟以濃縮粗制糖蛋白。另外，額外地透析過濾步驟可以在第一色譜法步驟之間進(jìn)行以進(jìn)行緩沖劑交換。超濾步驟和透析過濾步驟可以同時(shí)地或按順序地進(jìn)行。超濾和/或透析過濾優(yōu)選用膜進(jìn)行具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為3-30kD，最優(yōu)選為或約為10kD。然而，本發(fā)明也涵蓋這樣的純化過程，其中在第一色譜法步驟之前不進(jìn)行超濾步驟和/或不進(jìn)行透析過濾步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在一種或多種色譜法步驟之后(特別在色譜法最終步驟之后)，對(duì)糖蛋白樣品進(jìn)行超濾和/或透析過濾步驟。優(yōu)選進(jìn)行超濾和/或透析過濾以獲得具有所希望組合物的整體料(bulk)。超濾(和/或透析過濾)優(yōu)選用截?cái)嘀禐榛蚣s為3-30kD，最優(yōu)選為或約為IOkD的膜進(jìn)行。優(yōu)選的是，在超濾和/或透析過濾期間對(duì)預(yù)配制劑緩沖劑施行緩沖劑交換，所述預(yù)配制緩沖劑例如選自磷酸鈉，枸櫞酸鈉，MES, Bis-Tris,ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES,優(yōu)選磷酸鈉，優(yōu)選含有穩(wěn)定劑例如蔗糖和抗氧化劑比如L-甲硫氨酸的磷酸鈉。pH優(yōu)選為6. 5至7. 5，更優(yōu)選約7. 0至7. I。在根據(jù)本發(fā)明的純化過程能夠進(jìn)行的其它任選步驟包括一種或多種無菌過濾步驟。這些步驟能夠用來除去生物學(xué)污染比如真核和/或原核細(xì)胞，尤其是細(xì)菌，和/或病毒。優(yōu)選，這些步驟在純化過程結(jié)束時(shí)或接近結(jié)束時(shí)進(jìn)行以預(yù)防在無菌過濾步驟之后的進(jìn)ー步污染。為了除去細(xì)菌或其它細(xì)胞，用于無菌過濾的濾器優(yōu)選具有的孔徑尺寸為0. 22 y m或少，優(yōu)選0. I 或少。為了除去病毒或病毒類顆粒，可以進(jìn)行描述如下的納米過濾步驟。根據(jù)本發(fā)明的純化過程中能夠進(jìn)行的又一額外步驟是經(jīng)由在特定pH溫育糖蛋白的病毒滅活步驟。例如，糖蛋白在4. O或少，優(yōu)選約pH 3.6的pH溫育。溫育時(shí)間優(yōu)選為至少15分鐘，至少30分鐘，至少60分鐘，至少90分鐘，至少2小時(shí)，至少3小時(shí)或至少6小時(shí)。溫育可以在低溫度比如10°C或少或4°C或少，或在約室溫進(jìn)行。例如，糖蛋白物質(zhì)可以在約3. 6的pH在約室溫溫育約90分鐘。該病毒滅活步驟能夠在純化過程期間的任意時(shí)間進(jìn)行，優(yōu)選在最后色譜法步驟之后進(jìn)行。在ー種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明過程包括次序如下所示的下述步驟(0)超濾(任選地額外的透析過濾步驟；優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為IOkD的膜)； (I)反相色譜法(RPC)(優(yōu)選用 Source 30RPC 柱);(Ia)超濾(優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為IOkD的膜)；(2)尺寸排阻色譜法(優(yōu)選用Superdex 200柱)；(3)陰離子交換色譜法(優(yōu)選用CaptoQ柱);(4)疏水相互作用色譜法(HIC)(優(yōu)選用Butyl HP柱)；(5)超濾和/或透析過濾(優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐镮OkD的膜)。可以希望的是對(duì)糖蛋白樣品進(jìn)行納米過濾步驟，尤其是病毒清除步驟；也即降低糖蛋白制劑被源自細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒或病毒類顆粒污染的風(fēng)險(xiǎn)。納米過濾可以在純化過程的任意階段進(jìn)行，然而，特別優(yōu)選在色譜程序之后進(jìn)行納米過濾。納米過濾可以進(jìn)行多于ー次，例如其可以進(jìn)行兩次。優(yōu)選納米過濾裝置具有的孔徑尺寸為約15至20nm。在又一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明方法從而包括以如下所示次序的下述步驟(0)超濾(優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為IOkD的膜)，(I)反相色譜法(RPC)(優(yōu)選用Source 3ORPC柱)(Ia)超濾(優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為IOkD的膜)，(2)尺寸排阻色譜法(優(yōu)選用Superdex 200柱)；(3)陰離子交換色譜法(優(yōu)選用CaptoQ柱);(4)疏水相互作用色譜法(HIC)(優(yōu)選用Butyl HP柱)；(5)超濾和/或透析過濾(優(yōu)選使用具有的截?cái)嘀禐镮OkD的膜)；(6)納米過濾(優(yōu)選包括病毒清潔(clarification))。上述特定純化過程優(yōu)選不再包括任何其它色譜法步驟和/或超濾步驟和/或透析過濾步驟地進(jìn)行。然而，在特別的實(shí)施方式中，上述純化過程可以還包括額外步驟，尤其是本文描述的額外步驟中的ー種或多種，例如用于除去或滅活不希望或和/或危險(xiǎn)物質(zhì)的那些。優(yōu)選的是，抗氧化劑或具有抗氧化及捕獲效果的游離氨基酸或ニ肽包括在根據(jù)本發(fā)明的純化方法的各步驟的某些或全部之中。更特別地，抗氧化劑存在于用來純化和/或濃縮和/或過濾糖蛋白比如FSH的緩沖液中的任意之中?？寡趸瘎┰谔幚砥陂g防止糖蛋白比如FSH氧化。A優(yōu)選的抗氧化劑是L-甲硫氨酸。優(yōu)選，L-甲硫氨酸以為或約為0，I至IOmM的濃度使用。抗氧化劑的其它實(shí)例包括叔丁基-4-甲氧基-苯酚，2，6-ニ(1，1_ ニ甲基こ基)-4-甲基苯酚；焦亞硫酸氫鉀或鈉，亞硫酸氫鈉。游離氨基酸和具有抗氧化及捕獲效果的ニ肽的實(shí)例是組氨酸，?；撬幔拾彼?，丙氨酸，肌肽，鵝肌肽，I-甲基組氨酸或其組
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本發(fā)明優(yōu)勢(shì)在于純化過程是高度有效的，減少色譜步驟數(shù)至最少3個(gè)色譜步驟，或者在包括富集高度唾液酸化的糖蛋白分子的情況下，減少至最少4個(gè)色譜步驟。尤其是，使用根據(jù)本發(fā)明的純化過程，成本昂貴且有問題的純化步驟尤其比如親和カ純化步驟，特別是免疫親和純化步驟，變得不再必要且可以避免。本發(fā)明方法提供高度的糖蛋白純度和特定生物活性，其>90%，優(yōu)選>98%，更優(yōu)選>99%w/w，各自按例如通過HCP-ELISA測量的總蛋白質(zhì)計(jì)。另外，根據(jù)本發(fā)明的純化過程提供令人驚訝地高的原料中存在的目的糖蛋白的回收。糖蛋白糖蛋白是含有多肽側(cè)鏈的低聚糖鏈(聚糖)共價(jià)連接至的蛋白。糖蛋白可以包含ー種或多種聚糖，其優(yōu)選偶合至多肽的氮原子(N-糖基化)或氧原子(0-糖基化)。從而，糖蛋白可以是N-糖基化的和/或0-糖基化的。優(yōu)選，糖蛋白包含天然聚糖。然而，術(shù)語"糖蛋白"包含蛋白或多肽，其具有天然聚糖和/或非天然聚糖，尤其是合成產(chǎn)生的聚糖和/ 或包含非天然或修飾的單糖單元的聚糖。待純化的糖蛋白優(yōu)選選自促性腺激素的組，比如FSH (卵泡-刺激激素)，CG (絨促性素)，LH(黃體化激素)和TSH(甲狀腺-刺激激素)包括其全部同種型和變型。術(shù)語〃糖蛋白〃，〃FSH〃，〃CG〃，〃LH〃和"TSH〃，如本申請(qǐng)中所有，總是包括所述糖蛋白的全部同種型和變型，特別是下文描述和在步驟(d) (AEX)的那些。術(shù)語"促性腺激素"根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選是指天然促性腺激素比如FSH、CG、LH和TSH但也指其重組形式以及其任意同種型、變型和類似物。優(yōu)選，促性腺激素的同種型、變型和類似物展示天然促性腺激素的ー種或多種生物學(xué)活性。然而，根據(jù)本發(fā)明的純化糖蛋白的方法也適于純化其它糖蛋白例如紅細(xì)胞生成素，各種抗體，尤其是單克隆抗體，粒性白細(xì)胞，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-群落-刺激因子，和組織纖溶酶原活化劑。貯藏/凍干上述純化過程得到且含有純化糖蛋白的液態(tài)組合物可以原樣或者在純化之后冷凍貯藏，洗脫物可以進(jìn)行凍干("冷凍-干燥")以除去溶剤。所得液體或凍干的產(chǎn)品稱為〃糖蛋白料(Bulk)'配制劑本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明方法純化的糖蛋白可以配制用于任意類的給藥方法，優(yōu)選用于肌內(nèi)或皮下注射，優(yōu)選皮下注射。糖蛋白配制劑可以冷凍-干燥，在該情況下臨注射之前將其溶于注射用水。糖蛋白配制劑還可以是液體配制劑，在該情況下其能夠直接注射，而不事先溶解。配制劑可以含有已知賦形劑和穩(wěn)定劑且可以額外包含抗氧化劑和/或表面活性剤。糖蛋白配制劑可以是單劑量或多劑量。如果是多劑量，則其應(yīng)優(yōu)選含有抑菌齊U，例如烷基芐酷，苯甲醇，間-甲酚，麝香草酚或苯酚，優(yōu)選甲基芐酯或間-甲酚。單劑量配制劑還可以包含抑菌劑。適宜的配制劑描述于例如WO 2004/087213, WO 00/04913, WO2007/092829和EP0853945，通過援引加入本文。本發(fā)明的糖蛋白可以與已知賦形劑和穩(wěn)定劑例如蔗糖和甘露醇一起配制。其還可以包含抗氧化劑比如甲硫氨酸。其還可以包含表面活性劑，比如吐溫(優(yōu)選吐溫80)，或普流羅尼克(Pluronic)(優(yōu)選普流羅尼克F68)。在特別優(yōu)選的多劑量配制劑中，通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的糖蛋白這樣配制將其與蔗糖、磷酸緩沖劑(pH 6. 5至7. 5)、普流羅尼克F68、甲硫氨酸和抑菌劑一起溶解在注射用水中。適應(yīng)癥本發(fā)明的糖蛋白適用于糖蛋白作為指征的全部治療中。例如FSH特別適用于排卵誘導(dǎo)中的皮下給藥，輔助繁殖技術(shù)的控制性卵巢過度刺激，和治療精液缺乏。其可以與其它促性腺激素比如LH和CG組合使用。其還可以與增加對(duì)FSH應(yīng)答的其它化合物一起使用，比如檸檬酸氯米芬，芳香酶抑制劑比如阿那曲唑、來曲唑、法倔唑和YM-511。另外，LH和CG還可以在生育治療中單獨(dú)使用。重組糖蛋白使用術(shù)語〃重組〃是指通過使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的糖蛋白比如FSH的制劑。用重組技術(shù)表達(dá)糖蛋白的方法的ー個(gè)實(shí)例是用包含編碼目的糖蛋白的DNA序列的表達(dá)媒介 轉(zhuǎn)染適宜宿主細(xì)胞優(yōu)選真核宿主細(xì)胞。通常，表達(dá)媒介攜帯驅(qū)動(dòng)糖蛋白表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子例如CMV或SV40，以及已摻入媒介的用于選擇宿主細(xì)胞的適宜的選擇標(biāo)記物。轉(zhuǎn)染可以是穩(wěn)定的或暫時(shí)的。適宜的重組表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的，從而不需要詳述。優(yōu)選，真核宿主細(xì)胞選自靈長類細(xì)胞，優(yōu)選人類細(xì)胞和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。為了重組表達(dá)FSH，將真核宿主細(xì)胞用編碼FSH的a和P亞單位的DNA序列轉(zhuǎn)染，于ー種媒介或于兩種媒介上提供具有單獨(dú)啟動(dòng)子的各亞單位，描述于歐洲專利號(hào)EP 0 211 894和EP 0 487512。編碼FSH的DNA可以是cDNA或者其可以含有內(nèi)含子。使用重組技術(shù)產(chǎn)生FSH的又ー實(shí)例是通過使用同種重組來將在操作連接中的異源調(diào)節(jié)片段插入編碼FSH亞單位之一或兩種的內(nèi)源序列，描述于歐洲專利號(hào)EP 0 505500 (Applied Research Systems ARS Holding NV)。還預(yù)期這樣方法，比如公開于 WO99/57263 (Transkaryotic Therapies)的那些,其中將亞單位之一異源地插入細(xì)胞中，而另一亞單位經(jīng)過借助同種重組插入異源調(diào)節(jié)片段而活化基因組序列來表達(dá)。本發(fā)明的方法可以用來純化用這些方法和其它方法中任意表達(dá)的FSH。根據(jù)本發(fā)明純化過程用于純化天然以及重組糖蛋白，包括同種型及其變型。糖蛋白同種型優(yōu)選是指如前文所定義的同種型。術(shù)語"變型"優(yōu)選涵蓋衍生自天然糖蛋白的糖蛋白，比如其突變體形式，其融合蛋白，其片段和/或具有不同糖基化模式的糖蛋白。還包括糖蛋白的模擬化合物，包括包含擬糖結(jié)構(gòu)和/或擬肽結(jié)構(gòu)的蛋白。優(yōu)選，糖蛋白變型和/或同種型展示ー種或多種活性，其定性地和/或定量地相似或等同于天然糖蛋白的那些。措辭〃糖蛋白變型〃比如〃 FSH變型〃意在涵蓋氨基酸序列，糖基化位點(diǎn)數(shù)(包括額外或刪除的糖基化位點(diǎn))或亞單位間連接與人類糖蛋白不同但展示其活性的一種或多種的那些分子。FSH變型的實(shí)例包括CTP-FSH，長效的修飾重組FSH，由野生型[a ]-亞單位和雜交[P ]-亞單位組成，其中hCG的羧基末端肽已稠合至FSH[ 0 ]_亞單位的C-末端，如 LaPoIt 等人的描述;Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; or Klein 等人;Developmentand characterization 01 a long-acting recombinant hFSHagonist;HumanReprod. 2003,18, 50-56] o還包括單鏈CTP-FSH，其是由下述序列(自N-末端至C-末端)組成的單鏈分子[旦]FSH,[ P ] hCG CTP (113-145)，[ a ] FSH其中[@]FSH表示FSH 的[@]-亞單位，[^JhCG CTP(113-145)表示 hCG 的羧基末端肽和[a]FSH表示FSH的[a ]-亞單位,如Klein等人的描述[Pharmacokineticsand pharmacodynamics of single—chain recombinant human follicle-stimulatinghormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptidein the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002，77，1248-1255]。FSH 變型的其它實(shí)例包括具有摻入[a]-和/或[ 0]-亞單位的額外的糖基化位點(diǎn)的FSH分子，如WOO1/58493 (Maxygen)的公開，和具有亞基間S-S鍵的FSH分子，如W098/58957的公開。FSH變型的其它實(shí)例包括嵌合的分子，其包含來自FSH的序列和來自hCG或LH的序列，比如描述于 WO 91/16922 和 W092/22568 的那些。本文提及的FSH變型也包括P亞單位的羧基末端缺失，其比完全長度的成熟蛋白質(zhì)更短。應(yīng)理解P鏈的羧基末端變型與已知a亞單位形成復(fù)合物以形成FSH變型異ニ聚體。另外，F(xiàn)SH變型也包括融合蛋白，其中a-鏈和￠-鏈或其部分在一個(gè)多肽鏈中組合，優(yōu)選包含兩條鏈間的連接體。在FSH融合蛋白的其它實(shí)例中，F(xiàn)SH鏈之ー或兩者稠合至抗體或其部分比如抗體的Fe片段。本文提及的FSH變型也包括來自不同的種類例如馬(Equus cabalIus)，豬(Susscrofa),牛(Bos taurus),貓(Felis catus),犬(Canis familiaris)的 FSH0在優(yōu)選實(shí)施方式中，F(xiàn)SH在血清中或在不含血清的媒介中重組地產(chǎn)生。在又ー優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的純化FSH適于皮下給藥，這使得患者自行給藥成為可能。上述關(guān)于FSH作示范性糖蛋白的糖蛋白變型也以相似方式適用于其它糖蛋白，酌情，尤其適用于其它促性腺激素比如LH，TSH和CG。措辭"粗制重組糖蛋白"是指在進(jìn)行任意色譜步驟之前來自表達(dá)重組細(xì)胞的糖蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。該措辭涵蓋上清液的粗形式(自細(xì)胞分離)以及濃縮和/或過濾和/或超濾的上清液。制備糖蛋白的過程還提供通過進(jìn)行本文描述的純化糖蛋白過程用于制備目的糖蛋白的過程。糖蛋白能夠得自天然來源或重組地獲得。在優(yōu)選實(shí)施方式中，提供制備目的糖蛋白的過程，包括下述步驟i)重組地表達(dá)目的糖蛋白；ii)純化所述重組地表達(dá)的目的糖蛋白，通過對(duì)含有所述糖蛋白的液體進(jìn)行至少下述步驟a)反相色譜法，b)尺寸排阻色譜法，和c)疏水相互作用色譜法。各自制備過程導(dǎo)致產(chǎn)生很純的糖蛋白，其尤其適用于藥物配制劑中。所述制備過程優(yōu)選包含與純化過程結(jié)合的至少ー種或更多種上述步驟。上述各公開內(nèi)容也適用于根據(jù)本發(fā)明的制備過程，請(qǐng)參照上述公開以避免重復(fù)。另外，根據(jù)本發(fā)明的制備過程可以包括將目的糖蛋白配制為藥物配制劑形式的步驟。適宜的液體或凍干的配制劑是現(xiàn)有技術(shù)中已知的且描述與上文，請(qǐng)參見上述各自的公開。
優(yōu)選，通過根據(jù)本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的目的糖蛋白選自促性腺激素，優(yōu)選選自FSH、CG、LH 和 TSH0實(shí)驗(yàn)部分下述實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明的過程，且不以任何方式期望限制本公開。步驟0:超濾形成粗制FSH的原料源自含有重組FSH的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。在超濾步驟之前，在室溫經(jīng)2 Pm深濾器過濾清潔上清液。然后，用具有的截?cái)嘀禐榛蚣s為IOkD的膜，不超過I. 2巴的跨膜壓カ進(jìn)行超濾。步驟I :反相色譜法(Source30 RPC柱) 加載緩沖劑20mM磷酸鈉，pH 7. 5/10%v/v異丙醇(含有甲硫氨酸)洗脫緩沖劑20mM磷酸鈉，pH 7. 5/18%v/v異丙醇(含有甲硫氨酸)將得自濃縮和超濾(步驟0)的物質(zhì)用濃度相當(dāng)于加載緩沖劑的異丙醇補(bǔ)充。將Source30柱用加載緩沖劑平衡。在將物質(zhì)加載至柱上之后，通過加載緩沖劑將未結(jié)合的物質(zhì)洗出約15CV。通過將異丙醇濃度增加至18%v/v洗脫FSH在洗脫緩沖劑中(約8CV)。通過超濾濃縮洗脫液以進(jìn)行后續(xù)步驟。該步驟在室溫下進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.純化糖蛋白的方法，包括對(duì)含有所述糖蛋白的液體進(jìn)行下述步驟 a)反相色譜法， b)尺寸排阻色譜法，和 c)疏水相互作用色譜法。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述步驟以下述順序進(jìn)行 (1)反相色譜法， (2)尺寸排阻色譜法，和 (3)疏水相互作用色譜法。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中在反相色譜法步驟a)中洗脫緩沖劑含有有機(jī)溶齊U，優(yōu)選異丙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任ー項(xiàng)的方法，其中在尺寸排阻色譜法步驟b)中進(jìn)行緩沖劑交換。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任ー項(xiàng)的方法，額外地包含選自色譜法步驟、過濾步驟和病毒滅活步驟的ー個(gè)或多個(gè)步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任ー項(xiàng)的方法，其中所述額外步驟選自離子交換色譜法、親和色譜法、透析過濾、超濾、納米過濾和病毒滅活。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任ー項(xiàng)的方法，額外地包含陰離子交換色譜法步驟d)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中在尺寸排阻色譜法步驟b)之后進(jìn)行陰離子交換色譜法步驟d)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中在陰離子交換色譜法步驟d)中使用含有至少ー種鹽的洗脫緩沖劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任ー項(xiàng)的方法，其中所述糖蛋白的不同帶電同種型得以分離。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任ー項(xiàng)的方法，其中所述糖蛋白選自FSH、CG、LH和TSH^t選 FSH。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任ー項(xiàng)的方法，其中所述糖蛋白重組地產(chǎn)生。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任ー項(xiàng)的方法，包括按順序進(jìn)行下述步驟 (0)超濾 (1)反相色譜法； (Ia)任選地超濾； (2)尺寸排阻色譜法； (3)陰離子交換色譜法； (4)疏水相互作用色譜法； (5)超濾和/或透析過濾； (6)納米過濾。
14.制備目的糖蛋白的方法，包括下述步驟 i)重組地表達(dá)目的糖蛋白； ii)通過對(duì)含有所述糖蛋白的液體進(jìn)行至少下述步驟，純化所述重組地表達(dá)的目的糖蛋白a)反相色譜法， b)尺寸排阻色譜法，和 c)疏水相互作用色譜法。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的制備方法，包括下述步驟中的至少ー個(gè) i)如權(quán)利要求I至13中所定義的ー個(gè)或多個(gè)步驟；和/或 ii)將目的糖蛋白配制為藥物配制劑形式的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的制備方法，其中所述糖蛋白選自促性腺激素，優(yōu)選選自FSH、CG、LH 和 TSH0
全文摘要
本發(fā)明涉及純化糖蛋白的方法，包括對(duì)含有所述糖蛋白的液體進(jìn)行下述步驟a)反相色譜法，b)尺寸排阻色譜法，和c)疏水相互作用色譜法。還提供產(chǎn)生目的糖蛋白的制備方法。
文檔編號(hào)C07K14/59GK102656182SQ201080056651
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者L·施特克爾, S·戈勒茲 申請(qǐng)人:葛萊高托普有限公司