專利名稱：抗微生物肽的制作方法
抗微生物肽 本發(fā)明涉及新的抗微生物肽、這些抗微生物肽的衍生物以及含有上述這些肽的組合物。目前，幾個抗微生物肽或衍生物正在進(jìn)行進(jìn)一步的臨床開發(fā)，主要是以表面給藥的藥物的形式(Andres, E. , Dimarcq, J. -L. Cationic anti-microbial peptides frominnate immunity study to drug development. La revue de medicine interne (2004),25,629-635)。然而，這些分子中僅少數(shù)被建議用于于產(chǎn)養(yǎng)殖，例如分離自南美白對蝦(Penaeus vannamei)的對奸抗菌妝(penaeidins)。參見 EP1000153。其原因可以通過這些抗微生物肽(AMP)中的某些在鹽存在時被抑制這一事實來解釋，然而本發(fā)明的肽并非如此，因為其分離自深海蠕蟲龐貝城蠕蟲(Alvinella pompejana)或龐貝蟲(Pompeii worm)。該蟲是科學(xué)界公認(rèn)的最耐熱的生物之一。實際上，它能忍耐從10°C至80°C的溫度，這提示來自于該蟲的分子例如本發(fā)明所述的肽，是熱穩(wěn)定的，并因此是藥理學(xué)上感興趣的。通過大量使用抗生素而使水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量增加已經(jīng)成為可能。盡管存在法律約束，但預(yù)防性地使用抗生素很普遍，特別是在重要時期(例如，生命的早期、變態(tài)期、動物遷移期)，在動物生長期也使用。大量使用抗生素會促進(jìn)抗生素抗性株系的突生進(jìn)化，從而使動物養(yǎng)殖遭到破壞。多重抗生素抗性(MAR)株系出現(xiàn)在80年代中期。最近三十年幾乎沒有發(fā)現(xiàn)任何新的抗生素家族，并且只提供極少的針對抗性株系的新產(chǎn)品?？蛇x擇的解決方案之一將是使用AMP。這些由動植物天然產(chǎn)生的分子具有廣譜的和持久的抗革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌、抗真菌以及抗包膜病毒的活性。此外，這些AMP不是免疫原性的，它們對細(xì)菌菌膜的作用不會有助于抗生素抗性株系的突生進(jìn)化。開發(fā)于90年代的第一個AMP是爪蟾抗菌肽(Magainin)的衍生物來自于Magainin Pharmaceuticals公司的培昔加南(Pexiganan)。在III期研究中，培昔加南被包含在霜劑中，其顯示出與治療糖尿病期間超感染的皮膚潰瘍的口服抗生素氧氟沙星相同的治療效果。目前開發(fā)的在不久的將來可能會用于臨床的其它AMP中，應(yīng)該提及的是Intrabiotics Pharmaceuticals公司開發(fā)的Iseganan、Micro logix Biotech公司開發(fā)的MBI妝和Periondotix公司開發(fā)的Histatin的衍生肽(Andres等,之前引用的)。但上文所述的對奸抗菌肽與本發(fā)明分離自龐貝城蠕蟲的要求保護(hù)的肽相比似乎具有更大的分子量。通過用本發(fā)明的肽替換一部分使用中的抗生素將減少水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的使用。由于AMP的無害性，它們的使用將有利于樹立良好的品牌形象，也有利于被處理的動物、顧客和環(huán)境的健康，還不必?fù)?dān)心促進(jìn)抗生素抗性株系的突生進(jìn)化。因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有廣譜抗微生素活性的新的AMP。本發(fā)明涉及包含或由SEQ ID NO 1組成的新肽，條件是所述肽不是由序列SEQ IDNO :2至5組成的那些。術(shù)語“肽”的含義是指連續(xù)的氨基酸鏈。如果其含有至少50個氨基酸則該連續(xù)的氨基酸鏈可被稱為蛋白質(zhì)。該連續(xù)的氨基酸鏈可以是天然來源的或人工的(來自化學(xué)合成)。術(shù)語“連續(xù)的氨基酸鏈”的含義是氨基酸的接觸或連接貫穿于不間斷序列。因為SEQ ID NO :1來自于龐貝城蠕蟲，因此稱之為Alvinellacine。Alvinellacine是具有抗微生物活性的最小序列。該肽含有參與形成胱氨酸橋的4個半胱氨酸。詞語“微生物”的含義是指用顯微鏡才能看見的生物，如細(xì)菌、真菌和病毒。本發(fā)明還涉及由SEQ ID NO 6組成的肽，或者SEQ ID NO 1的衍生物-通過在其C端和/或N端修飾，和/或-通過在其肽鏈中置換和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸，和/或 -通過修飾其肽鏈中的至少一個-CO-NH-肽鍵,特別是通過引入反(retro)或反-倒(retro-inverso)型鍵,和/或-通過用非蛋白形成性氨基酸置換其肽鏈中的至少一個氨基酸，特別是那些具有80%以上，優(yōu)選85%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上同源性的肽或肽的片段。根據(jù)本發(fā)明，衍生自SEQ ID NO :1的肽與SEQ ID NO 1的第I至22位的氨基酸具有至少80%的同一性，并具有抗微生物、抗病毒和/或殺真菌活性。SEQ ID N0:6對應(yīng)于Alvinellacine 的前月太。術(shù)語“前肽”的含義是指包含N端信號肽的Alvinellacine的前體蛋白。該前肽在龐貝蟲中經(jīng)歷翻譯后修飾而變成SEQ ID NO :1所示的活性肽。術(shù)語“前體蛋白”的含義是指不具有抗微生物活性的無活性的蛋白。術(shù)語“抗微生物活性”的含義是指針對細(xì)菌、真菌和病毒的作用，導(dǎo)致它們的群體的減少和/或?qū)е挛⑸锷L的抑制。術(shù)語“信號肽”的含義是指SEQ ID NO 6所示的氨基酸鏈的片段，其是指導(dǎo)所述前體蛋白在龐貝城蠕蟲中轉(zhuǎn)運的短序列。SEQ ID NO 6中的信號肽是從第I位至第19位的
氣基酸殘基。術(shù)語“在龐貝蟲中的翻譯后修飾”的含義是指發(fā)生在龐貝城蠕蟲中的刪除過程，相當(dāng)于切除SEQ ID NO 6的N端部分的186個連續(xù)的氨基酸從而得到SEQ ID NO :1。術(shù)語“其C端和/或N端的修飾”的含義是指替代位于SEQ ID N0:1所示的肽的第一位或最后一位的氨基酸中的基團(tuán)，例如-COOH或-NH2，無論如何其目的是替代，例如包被該肽至載體。術(shù)語“引入反型鍵”的含義是指引入反型酰胺鍵，其為SEQ ID N0:1中的-NH-CO-肽鍵。術(shù)語“引入反-倒型鍵”的含義是指引入反-倒型酰胺鍵，其是-NH-CO-肽鍵并偶聯(lián)有氨基酸的反式絕時構(gòu)型。“非蛋白形成性氨基酸”，必須理解為這些氨基酸未在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)(例如肉堿、L-刀豆氨酸或L-D0PA)，或者在標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼中不被編碼的氨基酸(例如羥基脯氨酸和硒代蛋氨酸)。在有利的實施方式中，要求保護(hù)的肽與SEQ ID No : I的肽具有至少80%的同一性。因此，要求保護(hù)的肽可具有這樣的氨基酸序列而無限制其中在所述序列內(nèi)的任何位置置換或缺失一個或多個氨基酸，或者其中向所述序列添加一個或多個蛋白形成性氨基酸，即天然氨基酸，特別是含有SEQ ID NO 1中參與形成胱氨酸橋的四個半胱氨酸的肽。本發(fā)明還涉及上述所定義的肽，其特征在于所述肽是從龐貝城蠕蟲中分離和純化的?！皬凝嬝惓侨湎x中分離和純化”的含義是指所述肽首先從龐貝城蠕蟲中提取，然后再從其他有機碎片分離，例如有針對性地使用商品化的總蛋白質(zhì)提取試劑盒，隨后進(jìn)行親和層析，或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的其它公知的技術(shù)。本發(fā)明還涉及編碼上述所定義的肽的分離的核酸分子，特別是SEQ ID NO 7的核酸分子，條件是所述核酸分子不是由SEQ ID NO 8至25組成的核酸分子。SEQ ID NO 7對應(yīng)于編碼上述SEQ ID NO 6的前肽的核酸分子。 SEQ ID NO 8至25對應(yīng)于編碼SEQ ID NO :2至5的氨基酸鏈的分離的核酸分子。詞語“核酸分子”的含義是指編碼要求保護(hù)的肽的單鏈或雙鏈DNA，或者單鏈或雙鏈RNA，包括DNA/RNA雜合分子。本發(fā)明還涉及包含可操作地連接至表達(dá)載體的上述核酸分子的重組核酸構(gòu)建體。詞語“可操作地連接”的含義是指上述核酸分子以共價連接的方式連接至表達(dá)載體，允許核糖體翻譯要求保護(hù)的核酸分子，或允許RNA聚合酶產(chǎn)生編碼要求保護(hù)的肽的mRNAo術(shù)語“表達(dá)載體”的含義是指由核酸組成的分子，特別是包含啟動子區(qū)和任選的增強子區(qū)的質(zhì)粒。表達(dá)載體可以包含其它基因，例如抗生素抗性基因，以選擇含有編碼要求保護(hù)的肽的核酸分子的宿主細(xì)胞。使用上述表達(dá)載體的重組制備技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。本發(fā)明還涉及包含上述重組核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”的含義是指任何活的細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞，如真菌細(xì)胞(例如，黑曲霉(Aspergillus niger)),但也可以是細(xì)菌細(xì)胞,或者任何包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯裝置的非活體介質(zhì)，任選是來自細(xì)胞的細(xì)胞器，其允許擴增要求保護(hù)的核酸構(gòu)建體和/或產(chǎn)生要求保護(hù)的肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述所定義的肽，其用作藥物，特別是作為抗微生物、抗病毒或殺真菌劑的用途。本發(fā)明的另一個目的是提供包含至少一種上述所定義的肽的組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供上述定義的組合物，其用作針對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的抗細(xì)菌劑的用途。革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌的列表可以在DSMZ目錄中找到(http://www.dsmz. de/microorganisms/bacteria_catalogue. php)。本發(fā)明的另一個目的是提供上述定義的組合物在多種領(lǐng)域的用途，如人和動物衛(wèi)生保健、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，以避免農(nóng)場中傳染病的發(fā)展。術(shù)語“水產(chǎn)養(yǎng)殖”的含義是水生生物的養(yǎng)殖，特別是魚類的養(yǎng)殖、藻類養(yǎng)殖和集成多營養(yǎng)養(yǎng)殖(IMTA)。術(shù)語“水生生物”的含義是指任何淡水或咸水生物，包括但不限于下列生物-魚類，例如鯉魚、鮭魚以及其它的鯉科及鮭科；
-軟體動物類，例如牡蠣、蛤、鳥蛤、蚶、扇貝和貽貝；-甲殼類，例如蟹、龍蝦、蝦和對蝦；-水生植物，例如藻類和浮游植物。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將要求保護(hù)的肽用于其它技術(shù)領(lǐng)域是顯而易見的，例如用以減少不需要的微生物群的疫苗和物理方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的至少一種要求保護(hù)的肽。 “藥學(xué)上可接受的載體”的含義是指由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的任何藥物載體。在這方面，所述肽能與任何藥學(xué)上可接受的賦形劑、以任何藥學(xué)上可接受的形式聯(lián)合使用，例如小膠囊、硬膠囊，其它膠囊、皂和洗劑。在另一個優(yōu)選的實施方式中，要求保護(hù)的藥物組合物進(jìn)一步包含至少一種選自下組中的抗微生物劑-四環(huán)素類,如土霉素或金霉素；-喹諾酮類，如奧索利酸、氟甲喹或沙氟沙星；-磺酰胺,任選地用三甲氧節(jié)二氨卩密唳或歐美德普(ormethoprim)增強效力；-硝基呋喃類藥，如呋喃唑酮；-大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素或螺旋霉素(E710)；-氟苯尼考；-氯霉素。本發(fā)明的另一個目的是提供上述藥物組合物用于動物和/或人抗生素療法中的用途。最佳的給藥途徑(例如口服途徑、表面途徑、沐浴治療)應(yīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，正如最佳的肽使用量和治療持續(xù)時間。本發(fā)明還涉及包含上述定義的組合物的膳食組合物，特別是還包含一種或多種營養(yǎng)成分的食品補充劑。本發(fā)明的另一個目的是提供上述定義的組合物，其中所述肽用膠囊封裝，特別是納米膠囊封裝。膠囊封裝能有幾方面的好處，特別是允許在一段時間內(nèi)運送要求保護(hù)的肽。膠囊化和納米膠囊化技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種消毒劑，其包含含有至少一種要求保護(hù)的肽的組合物。術(shù)語“消毒劑”的含義是提供抗微生物、抗病毒和/或殺真菌活性并用于此目的化合物的混合物。應(yīng)當(dāng)指出，在其它可能的應(yīng)用中要求保護(hù)的肽可用于，例如生長培養(yǎng)基中、特別是用于昆蟲和真核細(xì)胞的培養(yǎng)基中，以防止這些培養(yǎng)基被微生物污染。下述實施例I至3和圖I至3對本發(fā)明進(jìn)行了舉例說明。圖I顯示了龐貝城蠕蟲提取物的色譜圖，如在實驗部分所描述，其通過在Sep-Pakj 20g 柱(Waters )預(yù)先純化，用 C18 250x4. Imm 柱(218TP54 Vydac )反向色譜(RP-HPLC)純化獲得。兩條較粗的線顯示的是具有抗微生物特性的級份。X軸從左至右洗脫時間(分鐘);
y 軸(左側(cè))255nm 的光密度(0. D.)；y軸(右側(cè)):洗脫液中ACN的百分率。圖2顯示了 Alvinellacine在脂質(zhì)體中形成孔的能力，脂質(zhì)體在此用于模擬細(xì)菌的膜，X軸從左至右時間(秒)；y軸(左側(cè)):突光(任意單位)。箭頭指示添加阿拉霉素(Alamethicin)和Alvinellacine的時刻。陰性對照顯示了背景噪聲，對應(yīng)于在未透化處理脂質(zhì)體的情況下所測定的熒光。 圖3顯示了在通過有目的地使用Alvinellacine和兩個其它的AMP (來源于豬的殺菌肽(CeCTopin)和來源于兩棲類的爪蟾抗菌肽)之后革蘭氏陽性細(xì)菌(巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium))和革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌(Escherichia coli))的通透化情況。實驗在PH 7. 4進(jìn)行。對于巨大芽孢桿菌，在加入每一種AMP后10分鐘測定細(xì)菌的通透性，對于大腸桿菌，在加入每一種AMP后120分鐘測定。X軸從左至右Alvinellacine、殺菌肽(Cecropin)和爪蟾抗菌肽的濃度(nM)；y軸(左側(cè))通透化細(xì)菌(％ )。黑色符號代表大腸桿菌，白色符號代表巨大芽孢桿菌。實施例I :來源于龐貝城螺蟲的內(nèi)源Alvinellacine的提取、純化和測序在東太平洋海隆(East Pacific Rise) 3，000米深處收集20條完整的、發(fā)育完全且性成熟的龐貝蟲。將成蟲碾碎，勻漿產(chǎn)生的混合物用IM HCl酸化至pH 3。然后，在10，OOOg離心30分鐘。由此在離心沉淀中濃縮蛋白質(zhì)并除去。含有肽的上清用甲醇預(yù)填充的S印-Pak 20g(Waters )柱預(yù)純化，然后用0. 05%三氟乙酸(TFA)溶液預(yù)酸化的HPLC級水清洗柱子。用0.05%三氟乙酸(TFA)溶液預(yù)酸化的2%至60%的乙腈(ACN)梯度進(jìn)行洗脫。之后用C18250x4. Imm 柱(218TP54 Vydac )通過反相色譜(RP-HPLC)純化以 60%ACN洗脫劑獲得的的級份。在該純化中使用2%至62%的ACN梯度。隨后對每個收集個級份的光密度進(jìn)行檢測，以獲得色譜圖(圖I)。色譜圖中的每個峰對應(yīng)于一級份，該級份在干燥后重懸于純水中，然后測試其抗微生物活性。然后利用C18 250x2. Imm柱(218TP52Vydac )通過連續(xù)RP-HPLC純化具有活性的級份。通過質(zhì)譜估計活性肽的純度和分子量。通過Edman降解法(對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言公知的技術(shù))對純化的肽進(jìn)行測序。結(jié)果顯示對應(yīng)于SEQ ID NO :1的活性肽的一個獲得的序列，該序列是完全未知的序列。根據(jù)來源稱該肽為Alvinellacine。使用經(jīng)典的反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得了編碼該肽的前體蛋白的核酸分子。SEQ ID NO :6的前體蛋白包含序列中第I位至第19位氨基酸的信號肽。進(jìn)一步從其推導(dǎo)出編碼前肽的互補DNA，其由SEQ ID NO 7組成。實施例2 :抗微生物活性機制的評價利用裝有熒光試劑的脂質(zhì)體確定抗細(xì)菌活性的機制。在此，含有雙層磷脂的脂質(zhì)體用于模擬細(xì)菌的膜。脂質(zhì)體的透化處理將導(dǎo)致內(nèi)部化合物的釋放，因此與介質(zhì)反應(yīng)并產(chǎn)生可被光譜測定法檢測的熒光。實驗在設(shè)有陰性和陽性對照下進(jìn)行。利用已知能在細(xì)菌的膜上形成孔的抗生素阿拉霉素作為陽性對照。陰性對照為脂質(zhì)體溶液，目的是檢測背景噪音(圖2)。結(jié)果顯示，Alvinellacine與阿拉霉素同樣地透化雙層磷脂。這種作用模式并不會有助于抗生素抗性株系的突生進(jìn)化。實施例3 :抗細(xì)菌活性的評價及與其它AMP的比較根據(jù)Hancock 的方法(Hancock, R. E. ff. September 19 1999, posting date.[Online. ]Hancock Laboratory Methods. Department of Microbiology and Immunology,University of British Columbia, British Columbia, Canada. http://www. cmdr. ubc.ca/bobh/methods. htm[Antibiotics and Antimicrobial Peptides MIC Determinationby Microtitre Broth Dilution Method, last accessed September 21st.])石角定最小抑菌濃度(MIC) o利用先前描述的方法(Herbst, R. , Ott, C, Jacobs, T. , Marti, T.,Marciano-Cabral, F. , Leippe, M. Pore-forming polypeptides of the pathogenicprotozoon Naegleria fowleri. J. Biol. Chem. 2002. 277 :22353-22360)檢測細(xì)菌的膜的透 性和孔形成活性。在液體生長抑制分析中，純化的Alvinellacine對于人病原體金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MIC 0. 385-0. 75 u M)和給病原體溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus) (MIC 0. 006-0. 012 uM)具有非常好的活性。為了研究AlvinelIacine的作用模式，我們使用了熒光染料SYTOX-Green 和革蘭氏陽性細(xì)菌巨大芽孢桿菌或革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌(圖3)。試驗結(jié)果證明Alvinellacine快速透化細(xì)菌的膜，并具有強的抗革蘭氏陰性細(xì)菌的活性和程度弱些的抗革蘭氏陽性細(xì)菌的活性。在檢測期間，Alvinellacine的針對所測的革蘭氏陰性細(xì)菌的活性比已知的抗微生物肽殺菌肽(CeCTopin)Pl和爪蟾抗菌肽II似乎高出一個數(shù)量級。其抗革蘭氏陽性細(xì)菌的活性與這兩個陽性對照相比較低。我們也通過使用最簡膜系統(tǒng)檢測了Alvinellacine的孔形成活性以進(jìn)一步表征其作用模式。更準(zhǔn)確地，我們監(jiān)測了由偶氮植物凝血素(azolectin)組成的脂質(zhì)體中誘導(dǎo)的膜電位，偶氮植物凝血素是來自大豆的粗磷脂混合物。其孔形成活性在終濃度達(dá)0. 5nM時被檢測到，而陽性對照阿拉霉素在0. InM時產(chǎn)生信號。
權(quán)利要求
1.包含SEQID NO :1或由SEQ ID NO :1組成的肽或衍生自SEQ ID NO 1的肽，所述肽與SEQ ID NO :1的第I至22位氨基酸具有至少80%的同一性，并具有抗微生物、抗病毒和/或殺真菌活性，條件是所述肽不是由SEQ ID NO :2至5組成的肽。
2.權(quán)利要求I的肽，其由SEQID NO 6組成。
3.權(quán)利要求I或2的肽，其特征在于所述的肽分離并純化自龐貝城蠕蟲(Alvinellapompejana)。
4.編碼權(quán)利要求I至3任意一項所述肽的分離的核酸分子，特別是SEQID N0:7所示的核酸分子，條件是所述核酸分子不是由SEQ ID NO 8至25組成的核酸分子。
5.重組核酸構(gòu)建體，其包括與表達(dá)載體可操作性連接的權(quán)利要求4所述的核酸分子。
6.包含權(quán)利要求5所述的重組核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I至3任意一項所述的肽，其用作藥物，特別是用作抗微生物、抗病毒和/或殺真菌劑。
8.包含至少一種權(quán)利要求I至3所述肽的組合物。
9.權(quán)利要求8所述的組合物，其用作抗革蘭氏陰性和/或革蘭氏陽性細(xì)菌的抗細(xì)菌劑。
10.權(quán)利要求8或9所述的組合物，其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。
11.藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的至少一種權(quán)利要求I至3任一項所述的肽。
12.權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含選自下列的至少一種另外的抗微生物劑 -四環(huán)素類，如土霉素或金霉素； -喹諾酮類，如奧索利酸、氟甲喹或沙氟沙星； -磺酰胺，任選地用三甲氧節(jié)二氨喃唳或歐美德普(ormethoprim)增強效力； -硝基呋喃類藥，如呋喃唑酮； -大環(huán)內(nèi)酯類，如紅霉素； -氟苯尼考； -氯霉素。
13.權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其用于動物和/或人體抗生素治療。
14.膳食組合物，特別是進(jìn)一步含有一種或多種營養(yǎng)成分的食品補充劑，其包含權(quán)利要求8或9所述的組合物。
15.權(quán)利要求8至14任意一項所述的組合物，其中所述肽是膠囊封裝的，特別是納米膠囊封裝的。
16.包含權(quán)利要求8所述組合物的消毒劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的新肽，以及含有該新肽的組合物。
文檔編號C07K14/435GK102741274SQ201080058476
公開日2012年10月17日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者A·塔賽姆斯基, F·蓋爾, M·薩爾澤特 申請人:國家科研中心, 里爾科學(xué)技術(shù)大學(xué)