專利名稱：從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液純化琥珀酸的制作方法
從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液純化琥珀酸相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年12月31日提交的美國臨時申請系列號61/335，189的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
我們在微生物生物化學(xué)途徑中進(jìn)行遺傳操作的能力方面取得的進(jìn)展，連同發(fā)酵方法技術(shù)的改善，已經(jīng)有可能利用農(nóng)業(yè)和林業(yè)可再生原料產(chǎn)生商業(yè)上大量的琥珀酸。經(jīng)工程化以產(chǎn)生琥珀酸的全部微生物在一個狹窄pH范圍內(nèi)部達(dá)到它們的最大生產(chǎn)率。出于這個原因，在琥珀酸的發(fā)酵生產(chǎn)期間，通過添加某些中和性堿化合物補(bǔ)償培養(yǎng)基PH的降低，將發(fā)酵培養(yǎng)基的PH維持在接近中性pH。這導(dǎo)致琥珀酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中以琥珀酸堿式鹽的形式積累。因而根據(jù)所用的中和性堿的性質(zhì)，琥珀酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累為琥珀酸鈉或琥珀酸鉀或琥珀酸鈣或琥珀酸銨。因此，發(fā)酵液的進(jìn)一步下游加工需要從含有琥珀酸堿式鹽的 發(fā)酵液提取出純琥珀酸。從發(fā)酵液回收琥珀酸同時釋放中和劑的下游加工方法是以商業(yè)成功方式制造琥珀酸時需要的。已經(jīng)按照幾種不同方法以從發(fā)酵液純化有機(jī)酸，所述方法包括沉淀、蒸汽蒸餾、液-液萃取、逆流萃取、酯化和電滲析與萃取組合。通常，將發(fā)酵液進(jìn)行微濾和超濾以在經(jīng)歷回收琥珀酸的任何特定方法之前移除細(xì)胞碎片。已經(jīng)報道了用于從含有琥珀酸堿式鹽的發(fā)酵液回收琥珀酸的眾多方法。對于以商業(yè)規(guī)模從發(fā)酵液產(chǎn)生琥珀酸而言，發(fā)現(xiàn)用于從發(fā)酵液回收琥珀酸的全部這些已知方法是冗長和昂貴的。轉(zhuǎn)讓給密歇根生物技術(shù)學(xué)院(Michigan Biotechnology Institute)的美國專利號5，034，105提供了一種用于從含有琥珀酸鈉的發(fā)酵液制備琥珀酸的方法。這種方法包括步驟使培養(yǎng)液經(jīng)歷常規(guī)電滲析以制備含水但不飽和的琥珀酸鹽溶液，使所述不飽和琥珀酸鹽溶液經(jīng)歷水分解電滲析以產(chǎn)生超飽和琥珀酸溶液并且隨后使琥珀酸從所述超飽和溶液結(jié)晶。這種方法不適于以大規(guī)模從發(fā)酵液中純化琥珀酸，如這種方法在其存在的最后二十年期間缺少商業(yè)利用所證實。轉(zhuǎn)讓給Applied CarboChemicals 的美國專利號 5，958，744 和 6,265，190 提供了一種用于從含有琥珀酸鈣的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法。根據(jù)這種方法，發(fā)酵液通過添加硫酸來酸化。作為這種酸化方法的結(jié)果，琥珀酸根陰離子從琥珀酸鈣釋放，獲得質(zhì)子，并且從發(fā)酵液沉淀所得到的琥珀酸。將所得到的沉淀物過濾并且用醇洗滌以獲得琥珀酸。仍待觀察如此產(chǎn)生的琥珀酸是否滿足所要求的純度水平。此外，硫酸鈣(石膏)的處置帶來環(huán)境擔(dān)憂。轉(zhuǎn)讓給Roquette Freres的最近公開的美國專利申請公開號US 2010/0297715描述了一種用于從含有琥珀酸鎂的發(fā)酵液分離和純化琥珀酸的方法。在這份公開的專利申請中描述的分離方法是復(fù)雜和昂貴的。該分離方法包括雙極電滲析、蒸發(fā)性結(jié)晶和高溫處理以出于循環(huán)目的的回收試劑。由于參與從發(fā)酵液回收琥珀酸的這些方法步驟，以商業(yè)規(guī)模使用這種方法產(chǎn)生琥珀酸的成本正在變得十分昂貴。
轉(zhuǎn)讓給BASF的最近的美國專利申請公開號2007/011294已經(jīng)公開了一種用于從發(fā)酵液酯化琥珀酸的反應(yīng)性蒸餾方法。然而，這份專利申請公開沒有提供用于從實際的發(fā)酵液中回收琥珀酸的任何實際方法。也已經(jīng)進(jìn)行眾多工作以使用涉及離子交換樹脂的方法從發(fā)酵液回收羧酸。離子交換樹脂以兩種不同方式用于從包含羧酸鹽的發(fā)酵液分離羧酸中。根據(jù)一種方法，離子交換樹脂以離子排阻模式使用。在另一種方法中，離子交換樹脂化學(xué)地與發(fā)酵液中羧酸的鹽相互作用以實現(xiàn)從羧酸鹽分離羧酸。第一種方法稱作離子排阻層析，并且第二種方法稱作離子交換層析。美國專利號5，132，456提供了一種用于從含水原料回收羧酸的方法，在所述方法中，羧酸是首先吸附到堿性固體吸附劑或適當(dāng)堿性的離子交換樹脂上，并且隨后通過以下方式從吸附劑釋放用含水烷基胺或氨處理所述吸附劑，從而導(dǎo)致烷基銨或羧酸銨形成，所述烷基銨或羧酸銨分解成所需的羧酸和烷基胺或氨。美國專利號5，143，834提供了一種用于從發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，其使用脫鹽性電解和水分解電解，隨后使用強(qiáng)酸性離子交換劑移除任何鈉離子或其他陽離子和游離堿 形式的弱堿性離子交換劑移除任何硫酸根離子或硫酸，以獲得高度純化的琥珀酸產(chǎn)物。美國專利號5，168，055提供了一種用于從含有琥珀酸鈣的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法。在第一階段，將發(fā)酵液酸化以從琥珀酸鈣釋放琥珀酸。使如此釋放的琥珀酸通過強(qiáng)酸性離子交換樹脂和弱堿性離子交換劑以獲得高度純化的琥珀酸產(chǎn)物。在通過陽離子交換劑期間，移除鈣和其他陽離子。在隨后通過含有陰離子交換樹脂的第二柱期間，移除陰離子雜質(zhì)如硫酸鹽和其他含氮雜質(zhì)。美國專利號5，641，406提供了一種通過在強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂上離子交換層析，從含有乳酸鹽的發(fā)酵液提取純?nèi)樗岬姆椒?。在這種方法的第一階段，在含有H+形式的弱酸性陽離子交換劑的一個或多個“初步柱”中借助真實離子交換，將乳酸鹽轉(zhuǎn)化成游離酸。在這種方法的第二階段，通過使用一個或多個“分離柱”中的強(qiáng)酸性離子交換樹脂，將游離的乳酸與發(fā)酵溶液中存在的糖類和其他雜質(zhì)分開。該方法在高于50° C的溫度并且優(yōu)選地在70° C至80° C之間實施。美國專利號5，068，418和5，068，419提供一種使用吸附劑從發(fā)酵液分離有機(jī)酸的方法，其中所述吸附劑包含擁有叔胺或吡啶官能團(tuán)的水不溶性大網(wǎng)狀或凝膠型弱堿性陰離子交換樹脂或擁有季胺官能團(tuán)的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。用水或稀無機(jī)酸如硫酸使有機(jī)酸從離子交換樹脂解吸。美國專利號5，786，185提供了用于產(chǎn)生乳酸的改進(jìn)發(fā)酵方法。就這種方法本身而言，將包含游離乳酸的發(fā)酵液與有效量的含有吡啶基的固相聚合物接觸以在乳酸積累時吸附它，并且使處理的流體發(fā)酵液返回至發(fā)酵容器。美國專利號6，160，173描述了水不互溶性陰離子交換劑從包含乳酸和乳酸鹽混合物的進(jìn)料溶液中回收乳酸的用途。在第一步驟中，將進(jìn)料溶液與陰離子交換劑接觸，并且形成陰離子交換劑-乳酸加合物。從該陰離子交換劑-乳酸加合物中，經(jīng)縮合反應(yīng)產(chǎn)生乳酸酯或胺。轉(zhuǎn)讓給Roquette Freres的美國專利號6，280，985公開了一種使用離子排阻層析法以陽離子交換樹脂從發(fā)酵液分離和純化乳酸的方法。除了經(jīng)陽離子交換樹脂的層析分離之外，這種方法包括幾個單元操作。因而，原始發(fā)酵液在第一階段濃縮，接著用濃酸酸化以實現(xiàn)游離乳酸/乳酸銨比率85/15。使酸化的培養(yǎng)液通過與至少4%二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂以獲得具有最大25%乳酸鹽的級分。在第一級分中通過用水洗脫去除全部雜質(zhì)，如未耗盡的糖和蛋白質(zhì)和多價離子鈣、鎂的無機(jī)酸鹽類型和與發(fā)酵液中任何解離的乳酸鹽相對應(yīng)的任何堿。下一個級分含有游離形式和以原始發(fā)酵液中存在的乳酸鹽干重計最多25%的乳酸。這個級分進(jìn)一步經(jīng)歷雙極分級分離電滲析以獲得純化的濃縮乳酸。美國專利號6，284，904公開了使用陰離子交換層析法純化有機(jī)酸的方法，其中有機(jī)酸如琥珀酸與陰離子樹脂結(jié)合，隨后有機(jī)酸由強(qiáng)堿性陰離子溶液或這樣的酸置換，所述酸具有比與陰離子樹脂結(jié)合的有機(jī)酸的PKa更低的pKa。美國專利號6，319，382教導(dǎo)了一種用于從含有乳酸銨的發(fā)酵液回收乳酸的方法，其中所述方法包括納米過濾步驟、使用主要移除二價陽離子如鈣和鎂的螯合樹脂的離子交換和一個終末兩步驟電滲析過程。美國專利7，238，837提供了一種用于從含有乳酸鹽的水溶液回收乳酸的方法，通過使用陽離子交換樹脂的方法，乳酸鈉至乳酸的轉(zhuǎn)化效率是56%。美國專利7，439，392提供了一種使用吸附劑從發(fā)酵液分離檸檬酸的方法，其中所述吸附劑包含水不溶性大網(wǎng)狀或凝膠、擁有季胺或叔胺官能團(tuán)的強(qiáng)堿性或弱堿性陰離子交換劑樹脂、具有交聯(lián)的丙烯酸樹脂或苯乙烯樹脂基質(zhì)的陰離子交換樹脂和包含水或稀硫酸的解吸附劑。維持進(jìn)料的PH低于檸檬酸的第一電離常數(shù)(pKal)以維持選擇性。美國專利申請公開號2006/0276674描述了一種用于從發(fā)酵液純化琥珀酸的方法。根據(jù)這種方法，可以通過使用某個量的H型強(qiáng)酸性陽離子樹脂的離子交換法與結(jié)晶方法組合，高效地移除含有琥珀酸的液體中的雜質(zhì)，旨在以良好產(chǎn)率產(chǎn)生高純度琥珀酸。 在專利合作條約下公布的國際申請?zhí)朩O 2007/040458提供了一種用于在從含有乳酸的發(fā)酵液回收乳酸的過程中使用離子交換樹脂移除陽離子雜質(zhì)和陰離子雜質(zhì)的方法。銨離子使用強(qiáng)陽離子交換樹脂移除，并且陰離子交換樹脂用來移除硫酸鹽雜質(zhì)。專利合作條約下公布并轉(zhuǎn)讓給Amylum Belgium的國際申請?zhí)朩O 98/30712提供了一種使用陽離子交換樹脂從天冬氨酸銨回收晶狀天冬氨酸的方法。迄今檢驗過的從發(fā)酵液回收有機(jī)酸的多種方法已經(jīng)表現(xiàn)出局限性并且因而為改善提供機(jī)會。因而本發(fā)明的目的是提供用于從包含琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的商業(yè)可行方法。附圖簡述圖I琥珀酸下游回收方法的程序框圖。在經(jīng)歷連續(xù)離子交換(CIX)過程之前，發(fā)酵液經(jīng)歷微濾和超濾。來自連續(xù)離子交換過程的琥珀酸級分(SAC)經(jīng)歷納米過濾/精加工步驟，隨后經(jīng)歷蒸發(fā)和后續(xù)結(jié)晶步驟以回收晶體形式的琥珀酸。來自連續(xù)離子交換過程的硫酸銨(AMS)級分經(jīng)歷蒸發(fā)過程以回收硫酸銨晶體。圖2陽離子交換和琥珀酸銨在陽離子離子交換樹脂表面上轉(zhuǎn)化成琥珀酸的示意圖。在陽離子交換樹脂的表面上，琥珀酸銨分解成琥珀酸根陰離子和銨陽離子。將銨陽離子與陽離子交換樹脂表面上的質(zhì)子交換，質(zhì)子的釋放形成陽離子交換樹脂。如此釋放的質(zhì)子與琥珀酸根陰離子合并，從而導(dǎo)致琥珀酸的形成。
圖3用仏504再生陽離子交換樹脂以產(chǎn)生硫酸銨的示意圖。在從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法的第一步驟中，使發(fā)酵液與陽離子交換樹脂接觸。琥珀酸銨在陽離子交換樹脂的表面上分解，并且所得到的銨陽離子與陽離子交換樹脂表面上的質(zhì)子交換。在第二再生步驟中，使用強(qiáng)酸如硫酸使與陽離子交換樹脂表面結(jié)合的銨釋放。采用硫酸處理，將樹脂表面上的銨離子與質(zhì)子交換。從樹脂表面如此釋放的銨離子與因硫酸解離產(chǎn)生的硫酸根離子組合，從而導(dǎo)致硫酸銨的形成。圖4澄清含有琥珀酸銨的發(fā)酵液的方案。所用的縮寫PF=進(jìn)料壓力；PIN=入口膜壓力；PQUT=出口膜壓力(接近于F) ；PpEEM=滲透壓(由閥門開口調(diào)節(jié))；dp=pin-pqut :壓力降(大約 I. 5 巴)；TMP=(Pin+Pqut)/2_Pp腦跨膜壓力。圖5含有琥珀酸銨的發(fā)酵液在含有Dowex G-26H樹脂的層析柱上的層析圖譜。陽離子型離子交換樹脂的再生用5%(WZV)H2SO4進(jìn)行。導(dǎo)入進(jìn)料流的時間點和緩慢沖 洗、快速沖洗、回洗及硫酸添加的起始點由X-軸上的下指箭頭顯示，所述X-軸顯示以分鐘為單位的時間。Y-軸上顯示從層析柱流出的樣品的折射率值。在該實驗中獲得的洗脫圖中見到兩個不同的峰。在第一峰中，可以容易地識別兩個不同的子峰。呈扁平的第一子峰對應(yīng)于琥珀酸的洗脫。高于第一子峰的第二子峰對應(yīng)于從柱流出的未解離的琥珀酸銨級分。在本圖中僅部分形成的第二峰對應(yīng)于硫酸銨級分。圖6含有琥珀酸銨的發(fā)酵液在含有Dowex G-26H樹脂的層析柱上的層析圖譜。陽離子型離子交換樹脂的再生用10%(WZV)H2SO4進(jìn)行。導(dǎo)入進(jìn)料流的時間點和緩慢沖洗、快速沖洗、回洗及硫酸添加的起始點由X-軸上的下指箭頭顯示，所述X-軸顯示以分鐘為單位的時間。Y-軸上顯示從層析柱流出的樣品的折射率值。呈扁平的第一子峰對應(yīng)于琥珀酸的洗脫。高于第一子峰的第二子峰對應(yīng)于從柱流出的未解離的琥珀酸銨級分。在本圖中僅充分形成的第二峰對應(yīng)于硫酸銨級分。圖7含有琥珀酸銨的發(fā)酵液在含有Dowex G-26H樹脂的層析柱上的層析圖譜。陽離子型離子交換樹脂的再生用10%(WZV)H2SO4進(jìn)行。本圖中顯示與為后續(xù)分析所收集的五個不同層析級分相對應(yīng)的色譜圖的部分。圖8含有琥珀酸銨的發(fā)酵液在含有Lanxess SlOOH陽離子樹脂的層析柱上的多重層析圖譜。陽離子型離子交換樹脂的再生用10%(w/w)H2SO4進(jìn)行。使用如表5中所顯示不同的進(jìn)料體積，從實驗1、2、3、4、5和6獲得六個不同的層析圖譜。緩慢沖洗和快速沖洗用I個柱體積的去離子水進(jìn)行。兩個柱體積的10%(w/w)硫酸用來再生樹脂，隨后以緩慢沖洗模式添加3個柱體積的去離子水并以快速沖洗模式添加6個柱體積的去離子水。圖9含有琥珀酸銨的發(fā)酵液在含有Lanxess SlOOH陽離子樹脂的層析柱上的層析圖譜。陽離子型離子交換樹脂的再生用10%(w/w)H2SO4進(jìn)行。將I. 5個柱體積的進(jìn)料加載到柱上。緩慢沖洗和快速沖洗用I個柱體積的去離子水進(jìn)行。兩個柱體積的10%(w/w)硫酸用來再生樹脂，隨后以緩慢沖洗模式添加3個柱體積的流體并以快速沖洗模式添加6個柱體積的去離子水。

圖10采用陰離子型離子交換樹脂時從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液分離琥珀酸的連續(xù)離子交換層析法的模塊。連續(xù)離子交換工序在10根裝填有陰離子樹脂(每根0.4L)的柱上進(jìn)行。試驗分成4個區(qū)域，每個區(qū)域由I至3根柱組成。每個工序分成如本圖中所顯示的2個步驟。琥珀酸鹽在陰離子樹脂上截獲并且在酸再生期間釋放。再生以順流模式(co-current mode)進(jìn)行。在萃余液中回收硫酸銨，并且在提取物中回收琥拍酸。試驗期間，連續(xù)離子交換過程在50° C進(jìn)行以避免任何琥珀酸進(jìn)入離子交換柱中結(jié)晶。圖11從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸時納米過濾方法的滲透流速。X-軸中顯示體積濃度系數(shù)，并且在Y-軸上是流速(L/m2/hr)和溫度。圖12從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液獲得的琥珀酸結(jié)晶的冷卻圖。將琥珀酸在85° C濃縮直至420g/L。結(jié)晶用純的琥珀酸晶種(80μπι)啟動。在20小時內(nèi)實現(xiàn)從85° C至20° C的溫度轉(zhuǎn)變。圖13從采用陰離子型離子交換樹脂的連續(xù)離子交換層析設(shè)備獲得的琥珀酸晶體 的掃描電子顯微鏡照片。在左側(cè)顯示在沒有涉及納米過濾的精加工步驟情況下所獲得的晶體的掃描電子顯微鏡照片。在該圖右側(cè)顯示在涉及納米過濾的精加工步驟后所獲得的晶體的掃描電子顯微鏡照片。圖14從涉及含有琥珀酸銨的發(fā)酵液的離子交換層析過程中回收的硫酸銨晶體的掃描電子顯微鏡照片。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是從含有琥珀酸中性鹽形式的2至10%琥珀酸的發(fā)酵液中回收至少90%(w/w)琥珀酸。如此回收的琥珀酸將具有白色晶體的外觀并且具有99. 5%(w/w)或更高純度。琥珀酸級分中優(yōu)選的硫酸鹽濃度是IOOppm以下。在如根據(jù)本發(fā)明方法所獲得的琥珀酸級分中最優(yōu)選的硫酸鹽濃度是30ppm以下。本發(fā)明提供了用于從發(fā)酵液中存在的琥珀酸銨鹽制備琥珀酸的方法。本發(fā)明的方法包括在以商業(yè)有意義的量回收純形式的琥珀酸中使用離子交換樹脂。雖然本發(fā)明詳細(xì)地描述了用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，但是從生物原料產(chǎn)生有機(jī)酸的領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)⒈景l(fā)明的層析方法應(yīng)用于從含有除琥珀酸銨之外的鹽形式的琥珀酸的發(fā)酵液中回收琥珀酸，以及應(yīng)用于以商業(yè)有意義的量以具備成本效益的方式從發(fā)酵液回收任何其他有機(jī)酸鹽。在本發(fā)明中，離子交換樹脂用來介導(dǎo)鹽分解反應(yīng)，目的是從發(fā)酵液中存在的琥珀酸銨釋放琥珀酸。本發(fā)明的鹽分解反應(yīng)可以使用陰離子型或陽離子型離子交換樹脂實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個方面，從含有琥珀酸銨的溶液純化琥珀酸的離子交換過程使用陽離子型離子交換樹脂。使用陽離子型離子交換樹脂從含有琥珀酸銨的水溶液純化琥珀酸的方法包括以下步驟(a)提供包含琥珀酸銨鹽的水溶液；(b)使陽離子型離子交換樹脂與包含琥珀酸銨鹽的水溶液接觸；(C)在水溶液中將所述琥珀酸銨鹽轉(zhuǎn)化成琥珀酸和銨陽離子；(d)將銨陽離子從水溶液分離,從而使琥珀酸留在水溶液中；和(e)回收水溶液中的琥珀酸。一旦與陽離子型離子交換樹脂接觸，琥珀酸銨分解成銨離子和琥珀酸根離子。從鹽分解反應(yīng)中如此產(chǎn)生的銨離子結(jié)合到陽離子樹脂的表面，從而陽離子型離子交換樹脂因而轉(zhuǎn)化成銨鹽形式。隨后，銨鹽形式的陽離子型離子交換樹脂通過用強(qiáng)酸如鹽酸或硫酸洗滌而再生成其初始形式。因陽離子型離子交換樹脂的再生步驟產(chǎn)生的銨鹽可以進(jìn)行商業(yè)利用或再循環(huán)至發(fā)酵過程。為了實現(xiàn)從含有琥珀酸銨的水溶液中分離琥珀酸的最佳效率，使用陽離子型離子交換樹脂的連續(xù)方法優(yōu)于涉及使用陽離子型離子交換樹脂的常規(guī)柱層析的分批方法。在本發(fā)明的又一個實施方案中，基于使用陰離子型離子交換樹脂的離子交換方法用來從含有琥珀酸銨的水溶液回收琥珀酸。如同涉及陽離子型離子交換樹脂的離子交換層析那樣，使用陰離子型離子交換樹脂從含有琥珀酸銨的水溶液純化琥珀酸包括鹽分解反應(yīng)。琥珀酸銨在陰離子型離子交換樹脂的表面上分解成銨陽離子和琥珀酸根陰離子，并且如此產(chǎn)生的琥珀酸根陰離子與樹脂表面上的陰離子種類交換。因而，琥珀酸陰離子在樹脂的表面上捕獲，而從陰離子型離子交換樹脂釋放的陰離子與銨陽離子組合以產(chǎn)生替代水溶液中的原初琥珀酸銨鹽的新銨鹽。新形成的銨鹽從離子交換柱洗脫至萃余液級分中。與陰離子型離子交換樹脂結(jié)合的琥珀酸根離子隨后在添加強(qiáng)無機(jī)酸時從離子交換樹脂釋放。從離子交換樹脂釋放琥珀酸之外還涉及強(qiáng)無機(jī)酸的這個洗滌步驟使陰離子型離子交換樹脂再生成其原初形式，從而一旦再次添加含有琥珀酸銨的新水溶液時，所述樹脂可以介導(dǎo)鹽分解反應(yīng)。從含有琥珀酸銨的發(fā)酵過程回收琥珀酸的離子交換過程以分批模式或以連續(xù)模式操作。以連續(xù)模式操作這個離子交換過程優(yōu)于分批模式。可以將涉及離子交換樹脂的這種連續(xù)或分批方法中所用的發(fā)酵液加工，隨后以一種或其他方式用于離子交換過程中以改善琥珀酸的回收。在本發(fā)明的一個方面，發(fā)酵液經(jīng)歷涉及有機(jī)溶劑的脫水方法。在本發(fā)明的另一個方面，含有琥珀酸銨的發(fā)酵液經(jīng)歷微濾和 超濾，以移除發(fā)酵液中的顆粒物質(zhì)，目的在于改善酸形式的琥珀酸的回收。從離子交換過程獲得的琥珀酸經(jīng)歷結(jié)晶過程以獲得晶體形式的琥珀酸。作為離子交換過程中副產(chǎn)物所回收的硫酸銨還經(jīng)歷結(jié)晶或濃縮過程。在本發(fā)明的另一個實施方案中，從離子交換過程回收的琥珀酸經(jīng)歷精加工過程以改善從發(fā)酵液回收的琥珀酸的品質(zhì)。在本發(fā)明的一個方面，從離子交換過程回收的琥珀酸經(jīng)歷納米過濾，從而納米過濾過程后獲得的琥珀酸晶體具有所需的顏色和最小水平的污染物。發(fā)明詳述圖I提供了從如本發(fā)明中所述的包含琥珀酸銨的發(fā)酵液中回收琥珀酸的程序框圖。已經(jīng)報道眾多微生物在它們依賴生物原料的發(fā)酵生長期間產(chǎn)生顯著量的琥珀酸。這些微生物中的一些已經(jīng)進(jìn)行基因修飾以實現(xiàn)以商業(yè)有意義的量產(chǎn)生琥珀酸。例如，在專利合作條約下以公開號WO 2008/115958和2010/115067公布的國際專利申請中描述的大腸桿菌(Escherichia coli)KJ122菌株據(jù)報道在其發(fā)酵生長期間產(chǎn)生商業(yè)有意義量的琥珀酸。KJ122菌株在如Jantama等人(2008a、2008b)描述的幾個不同階段經(jīng)過眾多理性設(shè)計的遺傳操作和代謝進(jìn)化過程從大腸桿菌C菌株(ATCC 8739)衍生。大腸桿菌KJ122菌株理想用于通過發(fā)酵途徑產(chǎn)生琥珀酸。KJ122據(jù)報道具有在發(fā)酵容器中每升產(chǎn)生70至90克琥珀酸的能力。除KJ122之外，如美國專利號5，770，435、6，159，738,6, 455，284和7，223，567和美國專利申請公開號2007/011294中所述的經(jīng)基因修飾以產(chǎn)生琥珀酸的其他大腸桿菌菌株也用于以商業(yè)有意義的量產(chǎn)生琥珀酸。來自全部這些大腸桿菌菌株的以琥珀酸的中性鹽形式含有琥珀酸的發(fā)酵液適用于本發(fā)明中。除了這些基因修飾的大腸桿菌菌株外，也已經(jīng)鑒定和開發(fā)了眾多天然存在的產(chǎn)琥珀酸微生物用于以商業(yè)有意義的量發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸。例如，在專利合作條約下以公開號WO 2009/065778和WO 2009/065780公布的國際專利申請中描述了黑曲霉(Aspergillus niger)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的產(chǎn)玻拍酸菌株。已經(jīng)報道以顯著量產(chǎn)生琥拍酸的其他微生物的名單包括琥拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogens)、產(chǎn)玻拍酸曼氏溶血桿菌(Mannheimia succiniproducens)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃短桿菌(Brevibacterium fIavum)和產(chǎn)玻拍酸厭氧螺菌(Anaerobiospirilum succiniproducens)。由這些微生物中任一者在其發(fā)酵生長期間產(chǎn)生的琥珀酸可以使用本發(fā)明中描述的一種或多種方法，以高的純度水平回收。歸因于琥珀酸的酸性性質(zhì)，琥珀酸在微生物生長培養(yǎng)基中的持續(xù)積累預(yù)期降低培養(yǎng)基的PH并最終導(dǎo)致生物生長速率和琥珀酸產(chǎn)率下降。通過基于需要添加某種PH中和堿至微生物生長培養(yǎng)基，克服這種局限。添加中和堿至微生物生長培養(yǎng)基導(dǎo)致琥珀酸以中性鹽形式積累。因而當(dāng)使用氫氧化銨作為堿以中和因琥珀酸產(chǎn)生所致的PH下降時，琥珀酸銨在發(fā)酵容器中積累。在發(fā)酵運(yùn)行結(jié)束時，培養(yǎng)液含有琥珀酸鹽、重金屬、有色物質(zhì)、代謝副產(chǎn)物、微生物細(xì)胞及細(xì)胞碎片和無機(jī)鹽。因此，直接利用發(fā)酵液是不可能的，并且需要另外的加工步驟以 從發(fā)酵液提取純的琥珀酸。在用于從發(fā)酵液回收純琥珀酸的方法的第一步驟中，需要借助萃取水濃縮培養(yǎng)液。這種濃縮步驟將減少待加工流體的體積并且最終幫助降低回收純琥珀酸所需要的每一個后續(xù)單元操作的成本。含有琥珀酸鹽的發(fā)酵液可以通過使用低分子量仲胺和季胺如三乙胺、二異丙胺、N，N-二乙胺及其混合物移除顯著量的水予以濃縮。在30° C至50° C溫度范圍，這些有機(jī)胺可以從稀的水溶液如含有琥珀酸鹽的發(fā)酵液提取大量的水。在這個低溫范圍，有機(jī)胺相含有20-35%的水和明顯降低量的發(fā)酵鹽類。通過升高所述溫度并從而允許所述胺再循環(huán)和再使用來提取額外的水，可以從胺中逐步縮減水。通過使用這種方法，可以使用常規(guī)多級、逆流提取步驟從含有3%琥珀酸銨的發(fā)酵液提取82. 5%的水，從而導(dǎo)致產(chǎn)生濃縮五倍的含有15%琥珀酸銨的發(fā)酵液。在本發(fā)明的實施中，將包含琥珀酸鹽的發(fā)酵液澄清以除去發(fā)酵液中存在的顆粒物質(zhì)?？梢酝ㄟ^在80° C至90° C高溫處理移除發(fā)酵液中的細(xì)胞組分和蛋白質(zhì)組分。高溫處理可以伴隨堿處理以殺死微生物和使蛋白質(zhì)凝固。因這些高溫處理和堿處理產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)可以通過過濾或離心移除。使用微濾和/或超濾裝置，可以進(jìn)一步澄清因高溫處理和堿處理產(chǎn)生的發(fā)酵液。用于微濾和超濾微生物發(fā)酵液的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域熟知的。適于微濾和超濾微生物發(fā)酵液的膜是從眾多供應(yīng)商可商業(yè)獲得的。離心步驟可以替代微濾步驟。來自離心步驟的上清液可以經(jīng)歷超濾步驟。將來自這些過濾方法的截留液棄去或再循環(huán)，并且在接下來的階段中使用琥珀酸鹽富化的滲透物(滲透液)作為利用離子交換樹脂純化琥珀酸的來源。來自微濾和/或超濾方法步驟的滲透物可以如美國專利號6，319，382中所述，在經(jīng)離子交換樹脂處理之前任選地通過主要結(jié)合二價離子如鈣和鎂的螯合樹脂。作為解釋從發(fā)酵液回收琥珀酸的本發(fā)明方法的方式，首先提供在描述本發(fā)明時使用的多個術(shù)語的以下定義?！皩游觥敝赣糜诨旌衔锖透鹘M分的化學(xué)分離的任何分析技術(shù)，所述化學(xué)分離依賴于將混合物的各組分選擇性吸引至固相。實例包括吸附層析、離子交換層析和離子排阻層析。本發(fā)明重點在于使用離子交換層析并且不涉及離子排阻層析。作為區(qū)分離子排阻層析和離子交換層析的方式，提供以下定義。離子排阻是用來描述下述機(jī)制的術(shù)語，其中離子交換樹脂借助所述機(jī)制用于中性種類和離子種類的分級分離。樣品中待分級分離的離子化合物被樹脂排斥，并且它們洗脫于柱的空體積中。非離子或弱離子性物質(zhì)滲入填充材料的孔，并且因而當(dāng)它們在樹脂粒子內(nèi)部和外部的液體之間分配時，實現(xiàn)分離。離子排阻層析也由幾個其他名稱提到，包括離子排阻分配層析、離子層析-排阻模式和Donnan排阻層析。如本發(fā)明中所用的術(shù)語“離子交換或離子交換層析”用來描述這樣的機(jī)制，其中借助所述機(jī)制，中性化學(xué)分子與離子交換樹脂相互作用時分解成其帶電荷組分。從中性分子產(chǎn)生帶電荷種類的這種現(xiàn)象定義為鹽分解?；谡谑褂玫臉渲男再|(zhì)，因鹽分解反應(yīng)產(chǎn)生的離子組分之一與樹脂結(jié)合，并且另一分子從樹脂粒子流走。當(dāng)使用陽離子交換樹脂時，因鹽分解反應(yīng)產(chǎn)生的帶正電荷的離子將與離子交換樹脂結(jié)合，并且?guī)ж?fù)電荷的種類從樹脂流走。另一方面，當(dāng)使用陰離子交換樹脂時，因鹽分解反應(yīng)產(chǎn)生的帶負(fù)電荷的離子與陰離子交換樹脂結(jié)合，并且?guī)д姾傻姆N類從樹脂流走。下文用從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法解釋本發(fā)明的這種離子交換過程。當(dāng)琥珀酸銨分子與陽離子型離子交換樹脂接觸時，琥珀酸銨分子分解成帶正電荷的銨陽離子和帶負(fù)電荷的琥珀酸根陰離子。銨陽離子與樹脂結(jié)合，替換來自樹脂表面的氫離子。從陽離子型離子交換樹脂表面如此釋放的氫離子與琥珀酸根陰離子合并以產(chǎn)生琥珀 酸分子。與樹脂表面結(jié)合的銨離子隨后因強(qiáng)酸而從樹脂表面釋放，所述強(qiáng)酸還使離子交換樹脂再生成原初形式。當(dāng)琥珀酸銨分子與陰離子型離子交換樹脂接觸時，琥珀酸銨分子分解成帶正電荷的銨陽離子和帶負(fù)電荷的琥珀酸根陰離子。帶負(fù)電荷的琥珀酸根陰離子與樹脂表面結(jié)合并且從而替換帶負(fù)電荷的陰離子，如來自樹脂表面的硫酸根。從樹脂表面釋放的帶負(fù)電荷的硫酸根陰離子與銨陽離子反應(yīng)以產(chǎn)生進(jìn)入萃余液級分的硫酸銨。與樹脂表面結(jié)合的琥珀酸根離子因強(qiáng)酸處理而從樹脂表面釋放，所述強(qiáng)酸除了使所述樹脂再生成原初形式之外，還使琥珀酸根離子從樹脂的表面作為琥珀酸釋放。硫酸和鹽酸適于這種目的?！拔絼痹诒疚闹型ǔＳ脕碇冈趯游鲋兴玫墓滔?，流動相組分對其顯示選擇性親和力。因為這種親和力可以采取除吸附之外的多種形式，包括大小排阻，所以該術(shù)語指吸附混合物組分的固相并且指這樣的固相，所述固相在技術(shù)上不吸附來自流動相的組分，但是卻通過減慢一種組分相對于層析系統(tǒng)中另一組分的遷移速率而像吸附劑那樣發(fā)揮作用。本發(fā)明中使用的離子交換樹脂是吸附劑的實例。本發(fā)明的離子交換吸附劑的特殊能力在于，它可以將吸附于其表面上的中性分子化學(xué)地分解成該分子的離子組分并且基于電荷化學(xué)地結(jié)合所述離子組分之一。術(shù)語“純化的”指其相對濃度(組分或級分的重量除以混合物中全部組分或級分的重量)增加至少20%的組分或級分。當(dāng)組分或級分從中純化的組分的相對濃度(從中純化的組分或級分的重量除以混合物中全部組分或級分的重量)下降至少20%時，也可以稱該組分或級分被純化?！斑M(jìn)料混合物”是含有待通過層析方法分離的一種或多種提取物組分和一種或多種萃余液組分的混合物。術(shù)語“進(jìn)料流”表示傳到在所述方法中使用的吸附劑的進(jìn)料混合物流?！疤崛∥锝M分”是被吸附劑更選擇性吸附的組分或類型，而“萃余液組分”是更少選擇性吸附的化合物或化合物類型。
術(shù)語“解吸劑材料”應(yīng)當(dāng)通常意指能夠解吸提取物組分的材料。換而言之，與離子交換樹脂結(jié)合的帶電荷材料因解吸劑材料而從離子交換樹脂的表面釋放。術(shù)語“解吸劑流”或“解吸劑輸入流”表示解吸劑材料經(jīng)其傳到吸附劑的流。術(shù)語“萃余液流”或“萃余液輸出流”意指經(jīng)其從吸附劑移除萃余液組分的流。萃余液流的組成可以從基本上100%解吸劑材料至基本上100%萃余液組分變動。術(shù)語“提取物流”或“提取物輸出流”應(yīng)當(dāng)意指提取材料已經(jīng)由解吸劑材料解吸的流從吸附劑中移除。提取物流的組成可以從基本上100%解吸劑材料至基本上100%提取物組分變動。提取物流的和優(yōu)選來自層析柱的萃余液流的至少一部分經(jīng)過分離裝置如級分收集器，在其中分離至少一部分的解吸劑材料以產(chǎn)生提取物產(chǎn)物和萃余液產(chǎn)物。術(shù)語“提取物產(chǎn)物”和“萃余液產(chǎn)物”意指由所述方法產(chǎn)生的產(chǎn)物，其分別含有濃度比提取物流和萃余液 流中存在的那些提取物組分和萃余液組分更高的提取物組分和萃余液組分。已經(jīng)認(rèn)識到吸附劑的某些特征對于任何層析過程的成功運(yùn)行是必需的。吸附劑的合乎需要的特征是(I)吸附劑的吸附量、(2)吸附劑的選擇性和(3)吸附和解吸附的速率。吸附劑吸附特定體積提取物組分的能力是一項重要特征。吸附劑吸附提取物組分的能力越高，吸附劑越好。隨著吸附劑的能力增加，可以減少為分離特定進(jìn)料混合物中所含有的已知濃度的提取物組分所需要的吸附劑的量。第二個必需吸附劑特征是吸附劑分離進(jìn)料組分的能力。吸附劑將一種組分與其他組分分離的這種能力稱作吸附選擇性。相對選擇性可以不僅對一種進(jìn)料組分與另一組分相比時表現(xiàn)，而且也可以在任何進(jìn)料混合物組分和解吸劑材料之間表現(xiàn)。如此處所用的吸附劑選擇性定義為在平衡條件下，兩種組分在吸附相上的比率對相同兩種組分在非吸附相中的比率。在兩種組分的選擇性逼近I. O的情況下，不存在吸附劑相對于一種組分而優(yōu)先吸附另一種組分；它們均彼此以大約相同的程度被吸附(或不吸附)。當(dāng)選擇性變得小于或大于1.0，存在對一種組分相對于另一種組分的優(yōu)先吸附。當(dāng)吸附劑對提取物組分相對于萃余液組分的選擇性大于I時，盡管提取物組分與萃余液組分的分離在理論上是可能的，然而優(yōu)選的選擇性接近值2。吸附劑的第三個合乎需要的特征與吸附劑交換提取物組分的速率相關(guān)。理想的吸附劑必須不僅能夠以較大速率吸附提取物組分，與此同時還應(yīng)當(dāng)具有在適宜的解吸劑附存在下輕易解吸結(jié)合的提取物組分的能力。較快的交換速率減少為去除提取物組分所需的解吸劑材料的量并且因此允許降低方法的運(yùn)行成本。在交換速率較快的情況下，可以將較少的解吸劑材料泵送經(jīng)過該過程并且與提取物流分離用于該過程中的再利用。為了選擇適于特定分離方案的吸附劑，可以利用動態(tài)測試裝置，將一組吸附劑進(jìn)行脈沖試驗。通過實施脈沖試驗，可以在參考所選擇吸附劑的吸附容量、選擇性和交換速率的情況下，確定它們的特征。用于實施脈沖試驗的裝置可以具有簡單的結(jié)構(gòu)。該裝置由填充有試驗吸附劑的吸附劑室組成。吸附劑室可以是直柱或螺旋柱。吸附劑室可以在環(huán)境溫度運(yùn)行或可以維持在溫度受控的環(huán)境內(nèi)。需要在最佳條件下進(jìn)行層析分離。吸附劑室的最佳溫度將提供樹脂分離容量的增加。最佳溫度還將改善吸附劑的有效容量。除了溫度環(huán)境之外，吸附劑柱可以與壓力控制設(shè)備連接以按照恒定的預(yù)定壓力運(yùn)行吸附劑室。定量及定性分析性儀器如折射儀、旋光儀和UV/可見光分光光度計可以與吸附劑室的出口管線連接并且用來定量地檢測離開吸附劑室的流出液流中的一種或多種組分。通過使特定解吸劑材料經(jīng)過吸附劑室，將吸附劑室中的吸附劑用所述解吸劑材料填充至平衡。在便利的時間，注入含有已知濃度示蹤劑和已知濃度特定提取物組分或萃余液組分或這兩者(均稀釋于解吸劑中)的進(jìn)料脈沖持續(xù)幾分鐘時間。示蹤劑是已知與吸附劑具有確定相互作用的組分?；謴?fù)解吸劑流動，并且洗脫示蹤劑和提取物組分或萃余液組分(或這兩者)。流出液可以進(jìn)行流上(on-stream)分析，或備選地，可以定期收集流出液樣品并稍后分析。從脈沖試驗的結(jié)果中，可以確定吸附劑的吸附容量、吸附劑對特定提取物組分的選擇性和交換吸附劑表面上特定提取物組分的速率。通過確定提取物組分在進(jìn)料混合物中和在萃余液流中的量并且計算吸附劑在吸附劑室中的量，可以確定特定吸附劑相對于特定提取物組分的吸附容量?？梢詮奶崛∥锝M分峰值包跡和示蹤劑峰值包跡(或其他參比點)的中心之間距離 與萃余液組分峰值包跡和示蹤劑峰值包跡的中心之間相應(yīng)距離的比率，確定吸附劑相對于萃余液組分對特定提取物組分的選擇性。提取物組分與解吸劑交換的速率可以通常以峰值包跡在一半強(qiáng)度時的寬度為特征。峰值寬度越窄，解吸速率越快。解吸速率也可能以示蹤劑峰值包跡的中心之間的距離和剛剛解吸的提取物組分消失為特征。這種距離再次是這個時間間隔期間所泵送的解吸劑的體積。為從包含琥珀酸銨的發(fā)酵液層析分離琥珀酸所選擇的吸附劑可以用于具有密實緊湊床的常規(guī)柱層析中。在這種緊湊固定床層析中，可以使用在固定床流體-固體接觸中所用的任何常規(guī)裝置。在這種緊湊床層析中，使吸附劑備選地與進(jìn)料混合物和解吸劑材料接觸。在本發(fā)明的一個實施方案中，吸附劑以單個固定床的形式使用，并且該方法僅是半連續(xù)的，因為進(jìn)料僅在萃余液流和解吸劑流輪替的間隔期中施加至吸附劑。在密實緊湊固定床層析的另一個實施方案中，可以在與適宜閥門接觸的固定床中使用一組兩個或更多個固定床，從而使進(jìn)料混合物經(jīng)過一個或多個吸附劑床，同時可以使解吸劑材料經(jīng)過該組中的一個或多個其他床。進(jìn)料混合物和解吸劑材料的流可以是向上或向下穿過解吸劑。與單柱洗脫層析相關(guān)的問題之一在于，柱材料在分離段(即其中組分分解的柱段)中未得到有效使用。分離段實際上隨組分流過而收縮。一種克服這種局限的方式是在柱頂部依次添加多份樣品。然而，這種依次的添加要求在載入之間小心定時的延遲以避免與先前樣品重疊，并且僅提供有效柱分離段的略微增加。固相仍大多利用不足，并且該方法還要求過多量的溶劑。與單柱洗脫層析相關(guān)的這些局限可以通過使用連續(xù)離子交換層析來克服。連續(xù)離子交換層析比固定的吸附劑床系統(tǒng)更高效并且是實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。在連續(xù)離子交換層析中，吸附和解吸操作連續(xù)地進(jìn)行，并且因此，存在進(jìn)料的連續(xù)使用，伴隨提取物的連續(xù)產(chǎn)生。連續(xù)交換層析可以按幾種不同方式實施。適于本發(fā)明的連續(xù)離子交換層析可以在兩個不同的模式下運(yùn)行，即(I)移動端口系統(tǒng)和(2)移走柱系統(tǒng)。移動端口系統(tǒng)由再分成眾多互連區(qū)室的垂直柱組成，并且每個區(qū)室的流體入口和出口受特別設(shè)計的旋轉(zhuǎn)式主閥門控制。移走柱系統(tǒng)包含安裝在旋轉(zhuǎn)式轉(zhuǎn)盤上的多個層析柱。在本發(fā)明方法中待使用的吸附劑將包含強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂、強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂和弱酸性陽離子交換樹脂。適于實施本發(fā)明的陰離子交換樹脂擁有交聯(lián)聚合物基質(zhì)(例如二乙烯苯交聯(lián)的丙烯酸基或苯乙烯樹脂)中的季銨、叔胺或吡啶官能團(tuán)。以珠形式產(chǎn)生時，它們是特別合適的，并且具有高度均勻的聚合孔隙度并且顯示化學(xué)和物理穩(wěn)定性.樹脂可以是凝膠狀(或“凝膠”)或“大網(wǎng)狀的”。適用于本發(fā)明中的陰離子的交換樹脂的名單包括Amberlite IRA400 和 900 系列吸附劑、由 Rohm and Haas Company 制造的 XE 275 (IRA-35)和 IRA-68 吸附齊[J、由8101^(1制造的六61、六62、六61^-1、六63-父4六和六64-父4樹脂和由00￥ Chemical Company出售的相當(dāng)?shù)臉渲鏒owex 1、2、11、MSA-I和MSA-2。本發(fā)明的強(qiáng)陽離子交換層析材料優(yōu)選地包含一個或多個層析支持物材料(即，固定相)。合適的層析支持物材料包括，但不限于礬土、硅酸鎂、二氧化硅、玻璃、孔徑受控玻 璃、碳、多孔石墨碳、磷酸鋯、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鎂和聚合物或樹脂。合適的聚合物或樹脂包括，但不限于羥烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯(polymacrylate)、聚(丙烯酸羥乙酯)、聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯)和(乙烯基吡啶)。優(yōu)選聚合物或樹脂。更優(yōu)選苯乙烯-二乙烯苯共聚物。本發(fā)明的強(qiáng)陽離子交換層析材料還包含選自適用于強(qiáng)離子交換的一個或多個官能團(tuán)中的多種配體。這些官能團(tuán)包括但不限于磺酸、烷基磺酸、苯磺酸、烷基苯基磺酸及其鹽。優(yōu)選的是磺酸官能團(tuán)及其鹽。可以使用的酸性陽離子交換聚合物或樹脂的具體實例包括AMBERLITE 200、AMBERLITE IR-118H、AMBERLITE IR-120PLUS、AMBERLITE IR-122、AMBERLITE IR-130C、AMBERLITE 16641、AMBERLITE IRP-69, DOffEX 50X1-100, DOffEX 50X2-100, DOffEX50X2-200、DOffEX 50X2-400、DOffEX 50X4-100、DOffEX 50X4-200、DOffEX 50X4-200R、DOffEX50X4-400、DOffEX 18880、DOffEX 50X8-100、DOffEX 50X8-200、DOffEX 50X8-400、DIAION1-356UDIAI0N 1-3565,DIAION 1-3570,DIAION 1-3573,DIAION 1-3577,DIAION 1-3581、DUOLITE D 5427 和 DUOLITE D 5552，它們從 Sigma-Aldrich, St. Louis Missouri,(美國)可獲得；DIAION HPK25,DIAION PK208,DIAION PK228,DIAION SK1B、DIAI0N SK1BS,DIAIONSK104、DIAION SK112、DIAION SKl 16、DOWEX HCR-S、DOWEX HCR-W2, DOffEX MSC-U DOffEX650C、DOWEX G-26H、DOWEX 88、DOWEX M0N0SPHERE 88、DOWEX M0N0SPHERE 99K/320、DOWEXM0N0SPHERE 99K/350、DOffEX M0N0SPHERE 99Ca/320、DOffEX M0N0SPHERE 99Ca/350、DOffEXMarathon C、D0WEX-032、D0WEX-406、D0WEX_437、DUOLITE C-280 和 DUOLITE C-291，它們從Supelco, Inc.，Bellefonte, Pennsylvania(美國)可獲得；AMBERLITE IR-120、AMBERLITEIR-120B、AMBERLITE IR-200C、AMBERLITE CG 6000、DIAION SK-IB、DOWEX XUS 40406.00、DOffEX XUS 43518 和 DOWEX C500ES。優(yōu)選 AMBERLITE IR-120、AMBERLITE IR-120B、AMBERLITE IR-200C,DOffEX C500ES,DOffEX XUS 43518和DOWEX XUS 40406. 00。最優(yōu)選的是DOffEX XUS 40406. 00、LEWATIT S100、S109、SP112、SP120 (由 Bayer 制造)等。具體而言，具有窄粒度分布的工業(yè)層析用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，如UBK-530、UBK-550(由itsubishiChemical Cooperation 制造)。根據(jù)本發(fā)明，層析柱中的吸附劑以離子交換模式發(fā)揮作用。當(dāng)層析柱中的吸附劑作為離子交換樹脂發(fā)揮作用時，可以直接使用包含琥珀酸銨或琥珀酸任何其他鹽的發(fā)酵液，無需任何化學(xué)處理。琥珀酸鹽在吸附劑的表面上經(jīng)歷“鹽分解”反應(yīng)，并且根據(jù)所用樹脂的化學(xué)性質(zhì)，在萃余液流中或在提取物流中回收在該過程中釋放的琥珀酸。因而根據(jù)本發(fā)明，將含有琥珀酸鹽的發(fā)酵液直接施加至含有離子交換樹脂的層析柱。這與離子排阻層析中的要求相反。在用于分離琥珀酸的離子排阻層析中，含有琥珀酸鹽的發(fā)酵液首先酸化以使琥珀酸沉淀，并且基于吸附劑的電荷排斥程度，將所產(chǎn)生的琥珀酸與酸化發(fā)酵液中的其余組分分開。圖2和圖3說明在陽離子型離子交換樹脂表面上的鹽分解反應(yīng)。琥珀酸銨經(jīng)水相發(fā)酵產(chǎn)生，目的是在分離和純化步驟后產(chǎn)生琥珀酸分子。在本發(fā)明方法中，進(jìn)料流中存在的琥珀酸銨經(jīng)過氫形式的陽離子交換樹脂柱。當(dāng)進(jìn)料流流經(jīng)該柱時，陽離子交換發(fā)生，其中樹脂“分解”琥珀酸銨鹽，并且釋放的銨陽離子(NH4+)與樹脂結(jié)合，同時最初在樹脂上的氫離子(H+)釋放至溶液中。圖2中顯示這種離子交換反應(yīng)的示意圖。 一旦從陽離子型離子交換樹脂釋放，氫離子與琥珀酸根陰離子合并，從而形成琥珀酸。如此產(chǎn)生的琥珀酸經(jīng)水沖洗工序流出該柱進(jìn)入層析峰級分中。在“鹽分解”離子交換層析的第二步驟中，結(jié)合的銨陽離子通過通入稀硫酸溶液而從樹脂釋放。這個過程再生陽離子型離子交換樹脂用于后續(xù)使用。在這個再生步驟期間，發(fā)生第一離子交換步驟的逆轉(zhuǎn)；來自充分電離的硫酸溶液的氫離子與樹脂結(jié)合，同時釋放先前結(jié)合的銨陽離子。釋放的銨陽離子隨后與電離的硫酸的硫酸根陰離子合并，在溶液中產(chǎn)生硫酸銨。借助一系列純水洗滌，隨后將硫酸銨從柱中洗出至其自身的層析峰級分中。圖3中顯示陽離子交換樹脂再生伴以產(chǎn)生硫酸銨的方案。吸附劑對發(fā)酵液中存在的琥珀酸銨分子實施‘鹽分解’反應(yīng)的能力由吸附劑和琥珀酸銨分子的酸解離常數(shù)值決定。酸解離常數(shù)也稱作“pKa”，并且它與酸在水溶液中解離成其組分陽離子和陰離子的平衡常數(shù)相關(guān)。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含琥珀酸銨的水溶液與酸性離子交換樹脂接觸，其中所述酸性離子交換樹脂具有比琥珀酸銨的酸解離常數(shù)小至少O. 5的pKa值。因“鹽分解”反應(yīng)而釋放的銨陽離與離子交換樹脂結(jié)合。與離子交換樹脂結(jié)合的銨離子可以因涉及酸的洗滌步驟而釋放，其中所述酸具有比處于其鹽形式的離子交換樹脂的PKa值小至少O. 5的pKa值。在本發(fā)明的另一個實施方案中，使用陰離子型離子交換樹脂作為吸附劑。在反應(yīng)的第一階段，源自琥珀酸銨的琥珀酸陰離子通過在琥珀酸分子和樹脂上的離子交換位點之間形成離子鍵而吸附至強(qiáng)陰離子交換樹脂。在這個階段，大部分中性或陽離子材料或大分子或細(xì)胞碎片穿過樹脂。在下一個階段，樹脂用水洗滌以移除離子交換樹脂中截留的未結(jié)合污染物。在這個洗滌步驟后，通過將吸附的琥珀酸離子交換為更強(qiáng)的無機(jī)離子，從樹脂移出琥珀酸陰離子。從該柱移出琥珀酸后，通過使樹脂上的陰離子交換位點再生，將陰離子交換樹脂準(zhǔn)備用于琥珀酸吸附的進(jìn)一步循環(huán)。這通過用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸處理樹脂完成，所述強(qiáng)酸引起無機(jī)陰離子交換成琥珀酸根陰離子。使用陰離子交換樹脂連同含有琥珀酸銨的發(fā)酵液的凈結(jié)果是分離出純化的琥珀酸。通過層析方法從發(fā)酵液如此回收的琥珀酸可以進(jìn)一步經(jīng)納米過濾法純化。實施例實施例I發(fā)酵液的澄清對孔徑O. I μ M的適于微濾(MF)的膜和截斷值150kDa的適于超濾(UF)的另一個膜測試它們在澄清包含琥珀酸銨的發(fā)酵液方面的效率。下表I中顯示這兩種不同膜的特征。圖4中提供了采用這兩種膜的澄清中試方案。將滲透液流速測量為每種膜的 跨膜壓力(TMP)的函數(shù)。對于這個步驟，進(jìn)料培養(yǎng)液流經(jīng)所述膜并且通過開啟滲透環(huán)路變動TMP0將滲余物和滲透液恒定地再循環(huán)以保持體積濃度系數(shù)(VCF)處于I。用兩種膜獲得的滲透液是清亮的，不過采用最寬膜(截斷值0. I μ M)時的流速較高。在TMP=O. 8巴時，具有O. I μ M孔直徑的膜顯示流速2501/h/m2。在TMP=L 6巴時，用于超濾的具有150kDa截斷值的另一種膜顯示流速3001/h/m2。使用150kDa截斷值膜，在35-39° C以分批模式隨后澄清包含琥珀酸銨的發(fā)酵液，以確保良好滲透液質(zhì)量并限制腐壞風(fēng)險。在TMP>2巴，在中試規(guī)模達(dá)到濃度系數(shù)VCF: 10，平均流速1431/h/m2。在VCF=IO時澄清后，估計的琥珀酸鹽回收率87%。額外的滲濾幫助增加琥珀酸鹽回收率直至94%。在工業(yè)規(guī)模，可以用以下參數(shù)實現(xiàn)直至99%的琥珀酸鹽回收率空柱體積(FCV) =20和滲濾比率水/滲余物=4. 5/1 (表2)。實施例2陽離子離子交換層析在本發(fā)明方法中，使用含有強(qiáng)酸陽離子交換樹脂如Dowex G-26H或Lanxess LewitMonoPlus S IOOH的制備性層析柱(I. 6cm直徑x IOOcm長度)以分解琥珀酸銨分子并且為每琥拍酸鹽分子提供兩個(2)氫離子(H+)。也可以使用Lanxess樹脂108H替代Lanxess樹脂S 100H。這種方法產(chǎn)生在溶液中的琥珀酸，所述琥珀酸隨后經(jīng)‘緩慢’和‘快速’純水沖洗工序從該柱洗出。當(dāng)琥珀酸銨分子借助強(qiáng)酸陽離子交換樹脂分解時，銨陽離子(NH4+)與陽離子交換樹脂。在純水沖洗已經(jīng)實施以洗出琥珀酸后，樹脂床用適宜濃度的硫酸洗滌以使陽離子樹脂珠再生。在這個步驟中，來自硫酸的氫離子((H+)與先前結(jié)合的銨離子(NH4+)交換，從而產(chǎn)生在溶液中的硫酸銨(NH4) 2S04。硫酸銨隨后經(jīng)‘緩慢’和‘快速’純水沖洗工序從該柱洗出至該柱自身的層析峰級分中。這種方法的操作循環(huán)包含以下步驟(I)以適宜的體積并且以適宜的流速添加進(jìn)料?？梢园碔. O個柱體積(CV)至2. 5CV的體積施加進(jìn)料。在優(yōu)選的實施方案中，進(jìn)料以I. 2CV至2. 2CV添加，并且在最優(yōu)選的實施方案中，進(jìn)料以I. 5CV至I. 7CV添加。應(yīng)當(dāng)牢記，待添加的進(jìn)料的體積十分依賴于進(jìn)料中琥珀酸銨的濃度和正在使用的離子交換樹脂的吸附容量。基于發(fā)酵液中存在的琥珀酸銨的濃度和正在使用的離子交換樹脂的吸附容量，可以計算出待添加的進(jìn)料的合適體積，從而進(jìn)料中存在的全部量的琥珀酸銨在離子交換樹脂的表面上分解，并且取決于正在使用的離子交換樹脂的類型和萃余液流中琥珀酸銨的過流，不存在離子交換樹脂被銨或琥珀酸鹽飽和的問題。類似地，進(jìn)料流速可以在每小時2至4個床體積的范圍內(nèi)(BVH)。在優(yōu)選的實施方案中，進(jìn)料流速可以在2.5至3. 5BVH范圍內(nèi)，并且在最優(yōu)選的實施方案中，進(jìn)料流速在2.9至3. 2BVH范圍內(nèi)。(2)其中層析柱用I至4個CV的水洗滌的緩慢沖洗步驟，所述水以流速I至4BVH添加；(3)快速沖洗步驟，其中層析柱用I至4個CV的水洗滌，所述水以流速5-10BVH添加；在優(yōu)選的實施方案中，快速沖洗以流速7至9BVH實施。(4)再生步驟，其中柱用I至4CV適宜濃度的強(qiáng)酸以流速1-4BVH洗滌。適于本發(fā)明的強(qiáng)有機(jī)酸選自鹽酸、硝酸、硫酸和磷酸。以如此方式選擇強(qiáng)酸的濃度，從而離子交換樹脂在短時間內(nèi)完全再生，如層析圖譜所證實。(5)緩慢沖洗步驟，其中柱用1-4CV的水以流速1-4BVH洗滌；和(6)快速沖洗步驟，其中柱用6-10CV的水以流速5-10BVH洗滌。僅提供這些運(yùn)行條件作為實例?？梢赃m當(dāng)?shù)匦薷倪@些運(yùn)行條件以實現(xiàn)琥珀酸的最大回收，伴以極高的純度水平。來自含有陽離子交換樹脂的柱的流體經(jīng)過折射儀(帶有控制單元CBM-28的Shimadzu RID-10)以測量來自層析柱的流體的折射率(圖5)。來自折射儀的流體管線也經(jīng)過UV 二極管陣列分光光度計以檢測210nm處的吸光度。除了對來自層析柱的流體 進(jìn)行這些光學(xué)測量外，還對從層析柱收集的級分進(jìn)行化學(xué)分析。在305分鐘時程期間從層析柱收集五個不同級分,如表3中和圖7中顯示。分析如表3中所述那樣收集的五個不同級分的琥珀酸、乙酸、S042_和NH4+含量。在配有BioRad Aminex HPX-87H柱的Agilent 1200HPLC裝置上分析在發(fā)酵液中存在的琥珀酸和其他有機(jī)酸雜質(zhì)。使用BioRad Microguard陽離子H+作為保護(hù)柱。在O. 008N硫酸中制備HPLC分析用標(biāo)準(zhǔn)物。HPLC柱溫維持在50° C。使用O. 008N濃度的硫酸作為流速
O.6ml/分鐘的流動相。通過測量多種組分在210nm處的吸收,進(jìn)行所述組分的定量。使用具有能夠以mv報道的計量儀的Mettler Toledo聯(lián)合NH4+離子選擇性電極(ISE)，測量銨離子濃度。通過將硫酸銨溶解于水中，制備標(biāo)準(zhǔn)溶液(5000、500、50和5ppm銨)。通過在純水中溶解已知量的琥珀酸晶體制備試樣。使用如美國俄亥俄州辛辛那提美國環(huán)境保護(hù)署的研究開發(fā)辦公室的環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)實驗室提供的用于離子層析法測定無機(jī)離子的方法300. O (修訂2. 1，1993年8月)，進(jìn)行硫酸鹽分析。采用Dowex G-26H樹脂的初步開發(fā)工作集中在優(yōu)化針對用水快速沖洗后再生Dowex G-26H樹脂所要求的硫酸濃度上。圖5和圖6顯示來自以下實驗的結(jié)果，所述實驗用于優(yōu)化涉及琥珀酸銨的初始鹽分解反應(yīng)后用于離子交換樹脂再生的硫酸需求。這兩個圖顯示了兩個不同實驗中初始160分鐘期間，來自層析柱的溶液的折射率的圖譜。在層析運(yùn)行期間，還在不同時間進(jìn)行琥珀酸、乙酸、SO/—和甘油的測量。將使用大腸桿菌KJ122菌株所獲得的具有65g/L初始琥珀酸銨濃度的發(fā)酵液裝載在具有Dowex G-26H樹脂的層析柱上。將2. 36CV的進(jìn)料添加至該層析柱。在圖5中描述的實驗中，在60分鐘洗脫的級分中觀察到峰值琥珀酸濃度64. 69g/L。在相同時間點，在從該柱洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)甘油濃度是I. 67g/L并且發(fā)現(xiàn)乙酸濃度是3. 94g/L。然而，折射值繼續(xù)增加直至80分鐘，并且在60和80分鐘之間存在一個不同的峰。在60和80分鐘之間的第二個峰代表突破峰，所述突破峰可歸因于陽離子交換樹脂被源自頭60分鐘期間鹽分解反應(yīng)的銨陽離子充分飽和后琥珀酸銨的洗脫。如本發(fā)明中所定義，術(shù)語“突破峰”對應(yīng)于離子交換樹脂被硫酸根離子飽和后從柱中洗脫的級分。換而言之，突破峰基本上含有進(jìn)料溶液的原始組分。在64分鐘從柱洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)硫酸鹽濃度是167. 7ppm,并且在77分鐘洗脫的級分中，硫酸鹽是檢測不到的。在85分鐘洗脫的級分中，琥珀酸濃度是O. 44g/L并且琥珀酸濃度下降至O. llg/L的水平。這個觀察結(jié)果表明，通過優(yōu)化適宜的進(jìn)料濃度，可以消除因進(jìn)料材料中過量的琥珀酸銨所致的第二峰。我們在圖6內(nèi)描述的實驗中觀察到相似的層析圖譜。兩個不同的峰是在分離的頭80分鐘內(nèi)是可檢測的。第一峰歸因于琥珀酸的洗脫，如在較早時間點的級分中存在高濃度琥珀酸所證實。在45分鐘洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)琥珀酸濃度是72. 45g/L，該濃度在55分鐘洗脫的級分中下降至66. 12g/L的水平并且在72分鐘洗脫的級分中降至O. 55g/L的水平。在92分鐘洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)琥珀酸濃度是O. 07g/L。在45分鐘洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)硫酸鹽濃度是810ppm,所述硫酸鹽濃度在72分鐘洗脫的級分中下降至18. 2ppm水平。這些觀察結(jié)果共同表明，在圖5和圖6內(nèi)所報道的實驗中，第二峰歸因于硫酸銨的洗脫，所述硫酸銨沒有經(jīng)歷在陽離子離子交換樹脂表面上的鹽分解反應(yīng)，這歸咎于陽離子離子 交換樹脂被源自琥珀酸銨分解的硫酸根離子所飽和。在5圖所示的實驗中，作為使陽離子交換樹脂再生的方式，在110分鐘添加2CV的5%(w/w)硫酸以啟動再生過程。這種再生過程預(yù)期釋放硫酸銨，如添加硫酸后來自層析柱的流體的折射率增加所證實。如在160分鐘的折射率所示，在160分鐘用5%硫酸洗滌時，硫酸銨的釋放不完全。在150分鐘洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)硫酸鹽濃度是9585ppm。然而，如圖6中所示，通過增加硫酸濃度至10%，可以實現(xiàn)陽離子交換樹脂的完全再生，如折射率值達(dá)到基礎(chǔ)水平所證實。在10%(w/w)硫酸用于再生陽離子離子交換樹脂的情況下，發(fā)現(xiàn)在92分鐘洗脫的級分中的硫酸鹽濃度是20128ppm。在139分鐘洗脫的級分中，發(fā)現(xiàn)硫酸鹽濃度是2664ppm,并且在221分鐘,硫酸鹽濃度下降至水平36. 6ppm。在確定10%硫酸濃度對于實現(xiàn)完全再生陽離子交換樹脂是最佳后，使用DowexG-26H樹脂實施另外七項實驗(實驗4-10)。7圖中顯示了這七項實驗中的一項實驗的折射率圖譜。圖7還顯示了與收集的多個級分相對應(yīng)的折射率圖譜區(qū)。表4提供了用DowexG-26H樹脂進(jìn)行的實驗4-10的級分F2中琥珀酸的純度和回收百分比。在優(yōu)化再生陽離子交換樹脂所需要的硫酸濃度后，用另一種陽離子交換樹脂Lanxess S100H進(jìn)行實驗以優(yōu)化進(jìn)料體積以實現(xiàn)將琥珀酸峰與突破峰分開。如表5中所示，使用I. 5至2. 16CV范圍內(nèi)不同體積的進(jìn)料材料實施六個不同實驗。圖8中顯示這六個不同實驗的折射率圖譜。如8圖中所示，通過降低進(jìn)料體積至I. 5CV，可以消除突破峰并且以不同的單峰實現(xiàn)琥珀酸回收。為清晰起見，圖9僅顯示使用
I.5CV進(jìn)料，采用Lanxess S100H陽離子交換樹脂的試驗5的折射率圖譜。表6提供了定量分析在8圖內(nèi)所示峰I和峰2級分中的琥珀酸、乙酸、SO廣和NH4+含量的結(jié)果。如圖8和表6中所示的結(jié)果顯示，通過控制進(jìn)料體積，可以消除突破峰并且以單峰實現(xiàn)琥珀酸回收。這還由以下事實證實在試驗5中，添加I. 5CV進(jìn)料的情況下，以單峰回收琥珀酸是可能的。這個峰顯示NH4+的最小值。NH4+在試驗5的峰I級分中的量比來自其余試驗的峰I級分中的NH4+含量低100倍，其中在所述其余試驗中使用更高體積的進(jìn)料。此外，峰I級分的S042—值在全部試驗中是較低的，表明在這些實驗中使用的沖洗方案對于用下一輪進(jìn)料添加弓I發(fā)柱之前除去全部雜質(zhì)是最佳的。實施例3陰離子交換樹脂層析的脈沖試驗結(jié)果
為了選擇待用于連續(xù)離子交換層析中的陰離子交換樹脂，用發(fā)酵液和三種不同的陰離子交換樹脂實施脈沖試驗。發(fā)酵液具有如表7中所示的組成。表8中提供了本發(fā)明中所測試的三種不同陰離子交換樹脂的化學(xué)特征。表9中提供使用這三種陰離子交換樹脂中每一種的樣品洗脫順序圖譜。柱(最初在硫酸鹽形式下)用具有表9中所提供體積的原始培養(yǎng)液過載以估計最大樹脂容量。柱用水沖洗，隨后是包括用10%硫酸洗滌和用水沖洗的再生步驟。表10中提供本發(fā)明中所測試的三種樹脂的每一者的性能總結(jié)。樹脂XA 3121顯示在琥珀酸鹽容量方面的不良效率。在第一循環(huán)期間，樹脂XA 4122和XA 3114產(chǎn)生總交換容量或所需沖洗體積方面十分接近的結(jié)果。在評審來自采用三種不同陰離子交換樹脂的脈沖試驗的結(jié)果后，選擇XA 3114用 于連續(xù)離子交換試驗。選擇XA 3114樹脂用于連續(xù)離子交換操作是基于以下兩個理由(I)在工業(yè)規(guī)模上，再生速率受限于使化學(xué)品消耗最小化。為了保持處于琥珀酸鹽進(jìn)入萃余液的可接受泄漏值，與實驗室規(guī)模下測量的最大容量相比，可以降低樹脂的工作容量。因而，可以用比XA4122具有更大容量的XA 3114實現(xiàn)更大的離子交換容量。(2)XA 3114是有助于增加分離效率和最小化沖洗水體積的單球體型樹脂。實施例4采用陰離子交換樹脂的連續(xù)離子交換層析與分批模式相比，連續(xù)離子交換允許增加琥珀酸級分的純度、降低總體化學(xué)組成和降低水消耗。連續(xù)離子交換層析在10根裝填有陰離子樹脂(0.4L/柱)的柱上進(jìn)行。試驗分成4個區(qū)域，每個區(qū)域由I至3根柱組成。每個工序分成如圖10中所顯示的2個步驟。琥珀酸鹽在陰離子樹脂上截獲并且在酸再生期間釋放。再生以順流模式(co-currentmode)進(jìn)行。在萃余液中回收硫酸銨，并且在提取物中回收琥珀酸。試驗期間，連續(xù)離子交換過程在50° C進(jìn)行以避免進(jìn)入離子交換柱的琥珀酸的任何結(jié)晶。在正常基礎(chǔ)上，將入口和出口從一個柱至下一個柱布置在下游以模擬樹脂的逆流置換。例如，在圖10上，在步驟結(jié)束時，I號柱變成用于下一個工序的4號柱。進(jìn)行與六種不同設(shè)定相對應(yīng)的六個不同試驗以達(dá)到回收和純度目標(biāo)。注入產(chǎn)物的體積和進(jìn)料及再生劑的濃度對于每種設(shè)定是不同的。表11提供使用陰離子樹脂的連續(xù)離子交換的順序描述。對于設(shè)定I至3，將再生的出口切成兩個部分第一部分收集為提取物產(chǎn)物，而收集物的末尾送至稀的再生劑(DRG)流。對于設(shè)定4至6，將完整的出口再生物收集為提取物產(chǎn)物。將再生劑濃度固定在80g/LH2S04以避免過高琥珀酸濃度進(jìn)入提取物級分，這可能導(dǎo)致酸結(jié)晶至柱中。此外，柱恒溫保持在50° C。表12中報告了與先前設(shè)定中每一者相對應(yīng)的不同流的組成。對于設(shè)定I至5，進(jìn)料琥珀酸鹽濃度是55_60g/L。從設(shè)定6起，將進(jìn)料產(chǎn)物稀釋至50g/L琥珀酸鹽，以改善與陰離子樹脂上的硫酸鹽交換并且減少琥珀酸鹽丟失至萃余液中。后一種設(shè)定在萃余液中產(chǎn)生80g/L硫酸銨，伴以2.8g/L琥珀酸鹽泄漏。將提取物濃縮至41g/L琥珀酸并且摻雜有少量其他陰離子(低于lg/L硫酸鹽)。稀的進(jìn)料濃度是2g/L琥珀酸銨，但是含有3g/L的硫酸根陰離子。這可以用作澄清步驟中的滲濾水。在稀的再生劑中，硫酸鹽濃度達(dá)到35g/L。這種稀的再生劑可以直接用作再次制備再生劑的溶劑。它含有大約2g/L琥珀酸鹽，所述琥珀酸鹽隨后再循環(huán)至柱，并且不丟失。質(zhì)量平衡總體上平衡并且的確證實所述結(jié)果。對于濃縮較少的乙酸鹽，質(zhì)量平衡更難以建立。表13總結(jié)了對每種設(shè)定計算的性能。應(yīng)當(dāng)指出，琥珀酸載量和回收速率將因采用氯化物形式的樹脂工作并且用HCl代替H2SO4進(jìn)行再生而更高。實際上，均為二價的琥珀酸鹽和硫酸鹽之間在樹脂上的競爭是高的。這導(dǎo)致較多琥珀酸鹽泄漏至萃余液中，原因是兩個種類之間的交換在生產(chǎn)模式下更困難。另一方面，琥珀酸鹽和氯化物之間的競爭有利于琥珀酸鹽，因為樹脂對二價種類親和力比一價種類親和力更大。因此，用HCl再生樹脂將導(dǎo)致較少琥珀酸鹽泄漏至萃余液和高的回收率。此外，H2SO4被視為一種非完全解離的酸，這意味樹脂需要比完全解離的HCl更高的H2SO4再生速率以實現(xiàn)相同的再生效率。實施例5 精加工試驗精加工試驗的目的是確定確保優(yōu)異琥珀酸晶體質(zhì)量的必需設(shè)計。這個步驟包括使用納米過濾(NF)，并且精加工步驟的最終目的是獲得99. 5%純度的白色琥珀酸晶體。離子交換提取物由NF處理以在輸送產(chǎn)物至結(jié)晶步驟之前除去顏色。將NF滲透液(脫色的琥珀酸)輸送至結(jié)晶步驟。在表15中提供納米過濾中使用的濾器的特征。使用來自離子交換提取設(shè)定6的進(jìn)料產(chǎn)物作為精加工試驗期間的原料。當(dāng)達(dá)到FCV=31時，實驗因低滲余物水平而終止。進(jìn)行兩個終末滲濾(水/滲余物比=各自1/1)以增加琥珀酸鹽回收率。圖11中報道滲透液流發(fā)展。如圖11中所示，精加工試驗展示了不尋常的行為。在顯示標(biāo)準(zhǔn)下降趨勢之前，流速顯示流速增加。這可以由平行發(fā)生的和在相對恒定的滲余物組成下發(fā)生的溫度增加的兩種效應(yīng)解釋。表16中提供流出液組成。如在420nm的光密度測量，在進(jìn)料和滲透液之間存在因納米過濾產(chǎn)生的86%光密度減少。如預(yù)期那樣，在滲透液中回收大部分琥珀酸。表17中顯示估計的停留率和滲透液級分，所述滲透液級分代表回收至滲透液中的進(jìn)料內(nèi)容物級分。大多處于其締合酸形式的弱有機(jī)酸(琥珀酸和乳酸)存在于pH2. 5處。因此，它們是大多未電離的，并且它們的水溶劑化數(shù)(water salvation number)很低。作為小分子它們可以容易地穿過NF膜至滲透液流；故它們的停留率低(或?qū)τ谌樗?，甚至為?fù))。在VCF=31處的運(yùn)行允許回收96%的琥珀酸。額外的滲濾幫助實現(xiàn)98%的回收。該比率可以再次容易地改進(jìn)。鹽(硫酸鹽和銨)在離子形式下更多地溶劑化并且隨后占據(jù)更大的體積，尤其是二價硫酸根陰離子。另外，考慮到溶液的電中性，硫酸鹽和銨仍保持偶聯(lián)。它們的停留率均聞。實施例6琥珀酸的蒸發(fā)和結(jié)晶蒸發(fā)從連續(xù)離子交換層析回收的琥珀酸以達(dá)到足夠的琥珀酸濃度以啟動結(jié)晶步驟。琥珀酸具有253° C的沸點，而琥珀酸制備物中其他可能的有機(jī)酸雜質(zhì)如乙酸和乳酸具有較低沸點。乙酸的沸點是118° C并且乳酸的沸點是122° C。因而，使用一個蒸發(fā)步驟，除了移除一些乙酸和乳酸雜質(zhì)外，還將琥珀酸濃縮至多到420g/L。通過冷卻容器，使?jié)饪s的琥珀酸結(jié)晶。以下方案用于結(jié)晶(I)在85° C濃縮琥珀酸至多到420g/L。⑵用80 μ m直徑的純琥珀酸晶種啟動結(jié)晶。(3)根據(jù)圖12中所示的圖譜，將產(chǎn)物經(jīng)20小時從85° C冷卻至20° C。(4)用飽和的純琥珀酸溶液洗滌最終晶體。采用以下三種不同的琥珀酸制備物實施結(jié)晶過程。(I)來自連續(xù)離子交換層析的未精加工的提取物；(2)來自連續(xù)離子交換層析的NF精加工的提取物；(3)含有25g/L硫酸根陰離子的合成性琥珀酸制備物。表18提供了三種不同的琥珀酸制備物進(jìn)行的結(jié)晶實驗的結(jié)果。如表20中所示結(jié)果顯示，對于測試的全部三種樣品，均實現(xiàn)多于99. 85%的晶體純度。結(jié)晶產(chǎn)率是89%至93%。通過測量過濾的100g/L終產(chǎn)物溶液的光密度，確定晶狀琥珀酸的顏色(表19)。 從離子交換層析的未精加工提取物產(chǎn)生的琥珀酸晶體為棕色。晶體為針形，長度l_2mm。如圖13內(nèi)的掃描電子顯微鏡照片中所示，NF精加工的晶體是白色的，并且與來自未精加工的提取物中的晶體相比，在尺寸上較大。實施例7硫酸銨流出液的結(jié)晶使用以設(shè)定2-4產(chǎn)生的萃余液混合物作為鹽流出液結(jié)晶試驗的原料。開始結(jié)晶之前，在95° C通過恒定蒸發(fā)，將萃余液濃縮50倍。以兩個步驟進(jìn)行萃余液的濃縮。在第一步驟中，使用反滲透以將萃余液從80g/L硫酸銨濃度濃縮至160g/L硫酸銨濃度。在第二步驟中，借助蒸發(fā)實現(xiàn)進(jìn)一步濃縮。表20匯總了從萃余液獲得的硫酸銨晶體的組成，其中以連續(xù)離子交換層析的設(shè)定2-4產(chǎn)生所述萃余液。在晶體中檢測不到有機(jī)鹽。晶體為棕色并且具有如圖14內(nèi)的掃描電子顯微鏡照片中所示的不同的形狀。
表I UFfMF膜特征I類型截斷值線性速度交換表面積溫度壓力
___m/s__m2__0C￡■>
Ο.ΙμΜ
MF Ρ 5 0.2S/mb 35-38 IJ-3__DlAM_____
UF ISOkDa50J5/mb 35^38 1:5:3 I
權(quán)利要求
1.一種用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，其中所述方法包括步驟 (a)提供包含琥珀酸銨鹽的水溶液； (b)將酸性離子交換樹脂與包含琥珀酸銨鹽的水溶液接觸； (C)在水溶液中將所述琥珀酸銨鹽轉(zhuǎn)化成琥珀酸和銨陽離子； (d)將銨陽離子從水溶液分離到離子交換樹脂的表面上用于交換質(zhì)子，從而使琥珀酸留在水溶液中；并且 (e)回收水溶液中的琥珀酸； 其中如下完成所述轉(zhuǎn)化及分離步驟(C)和(d):將包含琥珀酸銨鹽的水溶液與具有比琥珀酸的酸解離常數(shù)小至少0. 5的酸解離常數(shù)(pKa)的酸性離子交換樹脂接觸，以形成包含琥珀酸的水溶液和含有非水銨陽離子的酸性離子交換樹脂。
2.權(quán)利要求I的方法，還包括步驟 (a)用酸洗滌含有銨陽離子的酸性離子交換樹脂，所述酸具有比離子交換樹脂的酸解離常數(shù)小至少0. 5的酸解離常數(shù)(pKa);并且 (b)回收銨鹽，其包含所述銨陽離子和洗滌酸的共軛堿。
3.權(quán)利要求I的方法，其中用于洗滌含有銨陽離子的酸性離子交換樹脂的酸選自硫酸、磷酸、鹽酸和硝酸。
4.一種用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，其中所述方法包括步驟 (a)提供含有琥珀酸銨的發(fā)酵液和陰離子型離子交換樹脂； (b)將陰離子型離子交換樹脂與含有琥珀酸銨的發(fā)酵液接觸； (C)使發(fā)酵液中的琥珀酸銨轉(zhuǎn)化成琥珀酸根陰離子和銨陽離子； (d)將琥珀酸根陰離子與所述離子交換樹脂上的陰離子交換； (e)在合適條件下洗滌所述離子交換樹脂以除去與所述離子交換樹脂結(jié)合的琥珀酸根陰離子之外的物質(zhì)； (f)通過用含有比來自離子交換樹脂的琥珀酸根陰離子更強(qiáng)的陰離子的酸以有效置換所述琥珀酸根陰離子的量洗滌所述樹脂，將所述琥珀酸根陰離子置換為琥珀酸；并且 (g)收集含有琥珀酸的級分。
5.權(quán)利要求4的方法，其中用于洗滌含有銨陽離子的酸性離子交換樹脂的酸選自硫酸、磷酸、鹽酸和硝酸。
6.如權(quán)利要求I或4中所述的用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，其中所述離子交換樹脂和所述發(fā)酵液之間的接觸以分批模式實現(xiàn)。
7.如權(quán)利要求I或4中所述的用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液回收琥珀酸的方法，其中所述離子交換樹脂和所述發(fā)酵液之間的接觸以連續(xù)離子交換模式實現(xiàn)。
8.權(quán)利要求I或4的方法，還包括步驟使用選自離心、高溫處理、堿性處理、微濾、超濾和滲濾的方法澄清包含琥珀酸銨的水溶液。
9.權(quán)利要求I或4的方法，還包括精加工回收的琥珀酸的步驟，其中回收的琥珀酸經(jīng)納米膜過濾以實現(xiàn)脫色。
10.權(quán)利要求I或4的方法，還包括蒸發(fā)步驟，其中將回收的琥珀酸蒸發(fā)以實現(xiàn)至少IOOg琥珀酸/升的濃度。
11.權(quán)利要求I或4的方法，還包括結(jié)晶步驟，其中將含水形式的回收的琥珀酸轉(zhuǎn)化成晶體形式。
12.權(quán)利要求I或4的方法，其中從所述方法回收的琥珀酸具有小于IOOppm的硫酸鹽濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液純化琥珀酸的方法。本發(fā)明中描述的用于純化琥珀酸的方法包括使用離子交換樹脂以分解發(fā)酵液中的琥珀酸銨。在發(fā)酵液流經(jīng)陽離子型離子交換樹脂期間，琥珀酸銨分解成銨陽離子和琥珀酸根陰離子。將樹脂表面上的質(zhì)子交換銨離子，并且琥珀酸根陰離子還原成琥珀酸，而質(zhì)子從離子交換樹脂釋放。在添加強(qiáng)酸如硫酸時，結(jié)合的銨從樹脂釋放并且因而再生離子交換樹脂用于后續(xù)使用。因這種方法的再生步驟產(chǎn)生的硫酸銨副產(chǎn)物可以用作肥料來源。用于從含有琥珀酸銨的發(fā)酵液分離琥珀酸的這種方法也可以用陰離子型離子交換樹脂實施，其中所述琥珀酸根陰離子滯留在離子交換樹脂的表面上并且隨后在再生步驟期間從所述離子交換樹脂釋放。
文檔編號C07B63/00GK102781900SQ201080059513
公開日2012年11月14日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者R·辛格, S·J·格貝爾丁 申請人:麥蘭特公司