專利名稱：金黃色葡萄球菌抗原的提取方法、金黃色葡萄球菌抗原的提取用試劑及金黃色葡萄球菌 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及金黃色葡萄球菌抗原的提取方法、金黃色葡萄球菌抗原的提取用試劑及金黃色葡萄球菌的判定方法。本申請是與國家等委托討論成果有關的專利申請(適用平成20年度、21年度及22 年度獨立行政法人科學技術振興機構(gòu)、前端計測分析技術 機器開發(fā)事業(yè)、產(chǎn)業(yè)技術力強化法第19條的專利申請)。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus、S. aureus)是在人或動物中引起各種疾病的病原性細菌的一種。當金黃色葡萄球菌將食物污染、并在此處進行增殖時，則會產(chǎn)生菌體外毒素(腸毒素)。當攝入含腸毒素的食物時，在2 6小時后會表現(xiàn)急性胃腸炎的癥狀，之后引起嘔吐、腹痛、腹瀉。為重癥時，伴隨著微熱，還會引起血壓降低、胸悶、意識不清、脈搏減少等顯著的中毒癥狀，還有需要緊急入院的情況。作為金黃色葡萄球菌的一種的甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(以下也稱作MRSA)是成為嚴重社會問題的醫(yī)院內(nèi)感染癥的病原菌。近年來除了甲氧西林之外，還可見對于包含青霉素類及頭孢烯類抗生素的3內(nèi)酰胺的其他多種抗生素也顯示抵抗性的各種多藥耐藥性MRSA。MRSA由于具有這種多藥耐藥性，因而感染時的治療很困難。另一方面，金黃色葡萄球菌還包含甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(以下也稱作MSSA)。最近，還開發(fā)了對MRSA為有效的治療方法，但另一方面從副作用的問題或者預防新型的耐性菌出現(xiàn)的觀點出發(fā)，優(yōu)選對于感染了沒有多藥耐藥性的MSSA的患者也統(tǒng)一地使用對于感染了 MRSA的患者的治療方法。即，極為重要的是早期發(fā)現(xiàn)MRSA并對MRSA感染者或MRSA污染位置進行適當?shù)奶幹?，同時極為重要的是在檢測金黃色葡萄球菌時，可靠地區(qū)分該菌是MRSA還是沒有多藥耐藥性、應該進行與MRSA不同處置的MSSA，并分別進行適當?shù)奶幹?。一直以來，為了判定金黃色葡萄球菌是MRSA還是MSSA，進行使用稀釋法、紙片敏感試驗等通過培養(yǎng)來討論相對于實際藥劑的抵抗性的方法。但是，這些方法具有培養(yǎng)時間需要很長時間、根據(jù)培養(yǎng)中的各種因子(接種菌濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成、所使用的藥劑等)及操作者的熟練程度等結(jié)果有所不同的問題。另一方面，提出了利用非放射性試驗(例如參照非專利文獻1、2)或使用了抗PBP2’的抗體的放射免疫測定法及酶免疫測定法(例如參照專利文獻I、非專利文獻3)等將是否帶有作為MRSA所特有的蛋白質(zhì)、青霉素結(jié)合蛋白(PBP1、PBP2、PBP3及TOP4)的全新代替酶的“PBP2’”作為MRSA/MS SA辨別的關鍵，檢測該PBP2’的方法。但是，這些方法需要通過超離心分離法調(diào)制含抗原的細胞膜級分的復雜操作，利用普通的檢查設施伴有困難。另外，這些方法中由于使用尿素作為變性劑進行抗原的提取，因而在之后的免疫測定中由于尿素殘留于反應體系中，測定時間需要數(shù)小時，因而在日常檢查中使用是不方便的。
進而，還已知利用基于PCR法基因工程技術對編碼多藥耐藥性金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的PBP2’的基因即mecA進行檢測、并以試驗菌株中的該基因的保有狀況為指標進行MRSA鑒別的方法(例如參照非專利文獻4)。但是，mecA的保有狀況未必僅反映金黃色葡萄球菌的多藥耐藥性，還已知有盡管保有mecA基因但沒有多藥耐藥性的金黃色葡萄球菌。另一方面，作為不進行細胞膜級分的超離心分離等復雜操作、從MRSA中提取PBP2’抗原的方法，已知有利用堿金屬的氫氧化物、堿土類金屬的氫氧化物、胺的水溶液等進行提取的方法(例如參照專利文獻2)?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻I :日本特開平5-339289號公報
專利文獻2 :專利第3638731號公報 非專利文獻非專利文獻I D. M. O，Hara 等，F(xiàn)EBS Lett. Vol. 212，No. 2，p237_241, (1987)非專利文獻2 :J. L. Gerberding 等，Antimicrobial Agents and ChemotherapyVol. 35，No. 12,2574-2579, (1991)非專利文獻3 K. Sekiguchi 等、Microbiol. Immunol. Vol. 39, p545_550, (1995)非專利文獻4:生方等、J. Clin. Microbiol.，Vol. 30，p. 1728-1733，(1992)非專利文獻5:Gerber、Journal of Clin. Micro. , pp. 187-189, (1983)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題如上所述，金黃色葡萄球菌的檢測不能說僅檢測MRSA即足以，事實上重要的是首先是否能檢測到金黃色葡萄球菌，在此基礎上區(qū)別其是MRSA還是沒有多藥耐藥性的MSSA，然后進行適當?shù)奶幹?。但是，考慮此情況，基于通過上述方法僅提取PBP2’并對其利用任何方法進行檢測的想法的檢測方法，在可靠性方面仍有改善的余地。具體地說，在僅提取PBP2’進行檢測的方法的情況下，當在作為檢測對象的菌(檢體)的提取物中檢測到PBP2’時，可以判斷此檢體是MRSA。但是，未檢測到PBP2’時，僅由該結(jié)果并不能判斷檢體是MSSA。其原因在于，作為未檢測到PBP2’的理由，除了檢體為MSSA的情況之外，還假設有檢體并非是金黃色葡萄球菌或者雖然是金黃色葡萄球菌(MRSA或MSSA)、但供至試驗的檢體量過少或者是在若干誤操作等不適當?shù)臋z測條件下進行試驗等的多個理由。為了確認檢體是MSSAJf PBP2’及PBP2提取并進行檢測的操作，在此基礎上有必要確認未檢測到PBP2’、僅檢測到PBP2。另外，對于未檢測到PBP2’、且也未檢測到PBP2的檢體而言，認為還有需要進行再測定或更改測定順序并進行包含菌種確認等進一步處理的情況。通過著眼于僅檢測PBP2’的方法很難應對該方面。作為從微生物中提取抗原的公知方法之一例，例如已知使用亞硝酸從鏈球菌屬的微生物提取抗原的“微型亞硝酸提取法”(例如參照非專利文獻5)。但是，發(fā)明人進行確認時發(fā)現(xiàn)，該提取法并不適于從金黃色葡萄球菌進行的抗原提取、例如提取PBP2’及/或PBP2的目的。
S卩，期待可以同時且高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2、并能夠以可進行測定的形態(tài)將兩者保持在提取液中的提取方法；以及對提取的PBP2’及PBP2進行檢測、根據(jù)其結(jié)果能夠簡單且更為可靠地判定成為所述判定對象的金黃色葡萄球菌是甲氧西林耐藥性還是甲氧西林敏感性。本發(fā)明的目的在于提供可以同時且高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2、并能夠以可進行測定的形態(tài)將兩者保持在提取液中的提取方法以及用于該方法的提取試劑。進而本發(fā)明還提供對使用這種提取方法及提取試劑獲得的提取物中的抗原進行檢測、根據(jù)其結(jié)果能夠更為可靠地判定被檢體是MRSA還是MSSA的金黃色葡萄球菌的判定方法。用于解決問題的方案發(fā)明人進行了深入討論，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用含有特定酸的酸性水溶液可以從金黃色葡萄球菌中將兩抗原提取、將兩抗原保持在提取液中；進而利用免疫測定法對提取物中的兩抗原分別進行檢測，可以達成上述目的，進而完成本發(fā)明。S卩，通過本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，其特征在于，使用含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上酸的、pH5. 0以下的提取試劑，從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原。通過該方法，可以同時且有效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2。另外，可以將PBP2’及PBP2穩(wěn)定地保持在提取物中。另外，通過本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌的判定方法，其包括以下工序使用含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上酸的、PH5. 0以下的提取試劑，從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原的工序；通過使用了金黃色葡萄球菌抗原的抗體的免疫測定法對所提取的金黃色葡萄球菌抗原進行檢測的工序；根據(jù)其檢測結(jié)果判定所述被檢體中的金黃色葡萄球菌是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌還是甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌的工序。通過該方法，根據(jù)所得提取物中的抗原的檢測結(jié)果，可以更為可靠地判定被檢體是MRSA還是MSSA。另外，通過本發(fā)明提供一種用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑，其含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸且pH為5.0以下。通過該試劑，可以同時且高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2，另外可以將PBP2’及PBP2穩(wěn)定地保持在提取物中。進而，通過本發(fā)明提供用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒，其包含用于對上述金黃色葡萄球菌抗原進行提取的試劑。通過該試劑盒，根據(jù)所得提取物中的抗原的檢測結(jié)果，可以更為可靠地判定被檢體是MRSA還是MSSA。 發(fā)明的效果通過本發(fā)明，可以同時且高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2 ’及PBP2，另外可以將PBP2’及PBP2穩(wěn)定地保持在提取物中。另外，通過本發(fā)明還可根據(jù)所得提取物中的抗原的檢測結(jié)果，更為可靠地判定被檢體是MRSA還是MSSA。


圖I是所制作的抗體陣列的設計圖。圖2是所得MSSA及MRSA的抗體陣列的測定圖像。
具體實施例方式[術語的說明]
在本說明書中進行使用時,“金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)”是指作為人或動物的皮膚、消化管(腸)常在菌(腸內(nèi)細菌)的葡萄球菌之一。也是引起人的膿腫等各種表皮感染癥或食物中毒、肺炎、腦膜炎、敗血癥等致死性感染癥的病原菌。在本說明書中進行使用時，“甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(Methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus :MRSA)” 是指獲得了對抗生素甲氧西林的耐藥性的金黃色葡萄球菌，包含除了甲氧西林以外對包括青霉素系及頭孢烯系抗生素的P內(nèi)酰胺劑的其他多種抗生素也顯示抵抗性的各種多藥耐藥性MRSA。而本說明書中使用的“甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(Methicillin-susceptible Staphylococcusaureus :MSSA)”是指具有對甲氧西林的敏感性的金黃色葡萄球菌。在本說明書中進行使用時，“PBP2’(青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)2’)”是指肽聚糖合成酶，是與金黃色葡萄球菌原本具有的4種細胞壁合成酶的青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)PBP1、PBP2、PBP3及PBP4不同的交聯(lián)酶，是MRSA所特有的蛋白質(zhì)。即，MRSA具有PBP2 ’、而MSSA沒有PBP2 ’。予以說明，MRSA及MSSA均具有4種青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)PBP1、PBP2、PBP3及PBP4。在本說明書中進行使用時，“金黃色葡萄球菌抗原”以包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原兩者的意義進行使用，具體地說，除了金黃色葡萄球菌原本具有的4種青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)PBP1、PBP2、PBP3及PBP4之外，還含有甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌所特有的蛋白質(zhì)PBP2’，優(yōu)選為PBP2及PBP2’。在本說明書中進行使用時，“甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原”是指青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)2’(PBP2’)。在本說明書中進行使用時，“甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原”是指PBP2’以外的金黃色葡萄球菌抗原，優(yōu)選為PBP2。以下對本發(fā)明的實施方式具體地進行說明。[實施方式I:金黃色葡萄球菌抗原的提取方法]本實施方式所涉及的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法的特征在于，使用含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸、且PH5.0以下的提取試劑，從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原。(提取試劑中的酸)本實施方式所涉及的提取方法中可以使用的提取試劑含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸。通過使用這些酸，可以優(yōu)異地達成本發(fā)明的目的。(提取試劑的pH)本實施方式所涉及的提取方法中可以使用的提取試劑具有5. 0以下的pH。提取試劑的PH只要是5. 0以下則無特別限定，更優(yōu)選為4. 5以下、進一步優(yōu)選為4. 0以下。另外，本發(fā)明的提取試劑優(yōu)選按照提取時的PH達到5.0以下進行調(diào)整。例如，使用MRSA的菌體懸浮液等制成試樣時，優(yōu)選混合該菌體懸浮液和本發(fā)明的提取試劑時的pH為5.0以下。另夕卜，作為提取試劑中的上述酸的濃度優(yōu)選為0. 05M 0. 5M。(提取試劑中的表面活性劑)本實施方式所涉及的提取方法中可以使用的提取試劑中還可任意地添加各種表面活性劑。由此，可以更為高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2。作為表面活性劑可以使用選自陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑及兩性離子表面活性劑中的任意表面活性劑。例如作為陰離子性表面活性劑，可舉出羧酸鹽型及磺酸鹽型(例如烷基苯羧酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基磺酸鹽、磺基琥珀酸酯鹽等)、硫酸酯鹽型(例如烷基硫酸酯鹽、聚氧化烯烷基醚硫酸酯鹽或聚氧乙烯月桂基醚硫酸鹽等)及磷酸酯鹽型(例如烷基磷酸酯鹽、聚氧 化烯烷基醚磷酸酯鹽或聚氧化烯烷基芳基醚磷酸酯鹽等)。這些物質(zhì)可以使用市售品，例如為聚氧乙烯月桂基醚硫酸鈉時，以EMAL (注冊商標)20C (花王公司制)等的商品名出售，為聚氧乙烯壬基苯基醚硫酸鈉時，以EMAL (注冊商標)NC-35 (花王公司制)的商品名出售。作為陽離子性表面活性劑，可舉出烷基胺鹽型(例如單甲基胺鹽酸鹽、二甲基胺鹽酸鹽、三甲基胺鹽酸鹽)、季銨鹽型(例如十二烷基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨、溴化十六烷基吡啶、芐基三乙基氯化銨、雙十二烷基二甲基溴化銨、芐基二甲基苯基氯化銨、四己基氯化銨、硬脂基二甲基芐基氯化銨、硬脂基三甲基氯化銨、月桂基三甲基氯化銨等)等。這些物質(zhì)可以使用市售品，例如為硬脂基三甲基氯化銨時，以QUARTAMIN (注冊商標)86W (花王公司制)等的商品名出售，為月桂基三甲基氯化銨時，以QUARTAMIN (注冊商標)24P (花王公司制)等的商品名出售。作為非離子性表面活性劑，可舉出醚型(例如聚氧乙烯烷基醚、五乙二醇單十二烷基醚、八乙二醇單十二烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯異辛基苯基醚等)、酯型(月桂酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等)、酯醚型(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯己糖醇酐脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯聚乙二醇)、烷醇酰胺型(月桂酸二乙醇酰胺、油酸二乙醇酰胺、硬脂酸二乙醇酰胺)、烷基苷型(辛基葡萄糖苷、癸基葡萄糖苷、月桂基葡萄糖苷)、葡糖酰胺型(辛?；?N-甲基-葡糖酰胺、壬?；?N-甲基-葡糖酰胺、癸?；?N-甲基-葡糖酰胺)。這些物質(zhì)可以使用市售品，例如作為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酯以tWeen20等商品名出售，作為聚氧乙烯辛基苯基醚以Triton (商標)X-100等商品名出售，作為辛?；?N-甲基-葡糖酰胺以MEGA-8等商品名出售。作為優(yōu)選的表面活性劑的例子，可舉出聚氧乙烯異辛基苯基醚類(例如TritonX-IOO等)、聚氧乙烯壬基苯基醚類(例如NP40等)、聚氧乙烯山梨糖醇酯類(例如TWeen80等)、聚氧乙烯十二燒基醚類(例如Bri j (注冊商標)58等)、聚氧乙烯硬脂基醚類(例如Brij (注冊商標)721等)、辛基葡萄糖苷等。另外，作為優(yōu)選例可舉出聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(RHE0D0L Tff-0120 :花王公司制)、異十三烷基醇乙氧基化物9摩爾加成體(LE0C0L TD-90、Lion Corp.制)、聞級燒基(例如碳數(shù)12 14的燒基等)上加成有聚環(huán)氧丙燒和聚環(huán)氧乙烷的化合物(LE0C0LSC70、Lion Corp.制)。作為兩性離子表面活性劑，可舉出烷基甜菜堿型(月桂基二甲基氨基乙酸甜菜堿、硬脂基~■甲基氣基乙酸甜菜喊、十~■燒基氣基甲基~■甲基橫丙基甜菜喊、十八燒基氣基甲基二甲基磺丙基甜菜堿)、CHAPS (3-〔3-膽酰胺丙基〕二甲基銨基)-1_丙磺酸)，CHAPSO(3-〔膽酰胺丙基〕二甲基銨基)-2-羥基-I-丙磺酸)等磺酸型、氧化胺型(月桂基二甲基胺N -氧化物、油基二甲基胺N -氧化物)等。這些物質(zhì)可以使用市售品，例如為烷基甜菜堿型時，以AMPHITOL (注冊商標)24B (花王公司制)等商品名出售，為氧化胺型時，以AMPHITOL(注冊商標)20N (花王公司制)等商品名出售。上述各種表面活性劑中，EMAL(注冊商標)NC35、MEGA-8、TritonX-100, tween20、LEOCOL SC70、LEOCO LTD90、RHE0D0L Tff-0120, Brij (注冊商標)721、QUARTAMIN (注冊商標)86W、QUARTAMIN (注冊商標)24P、CHAPS、CHAPSO, AMPHITOL (注冊商標)20N、AMPHITOL(注冊商標)24B等是優(yōu)選的表面活性劑的一例。利用其可以更為高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2。
本發(fā)明的提取試劑中所含表面活性劑的濃度通常為0.01% (w/w)以上、優(yōu)選為0. 01 5% (w/w)、更優(yōu)選為0. 05 5. 0% (w/w)、進一步優(yōu)選為0. 05 I. 0% (w/w)、更進一步優(yōu)選為0. I I. 0% (w/w)0通過使表面活性劑的濃度為0. 01% (w/w)以上，提取效果變得充分。另外，通過使表面活性劑的濃度為5.0% (w/w)以下，由于即便將濃度進一步提高也難以觀察到提取效率的進一步改善，因而很經(jīng)濟，另外由于表面活性劑不會對之后的各種測定體系造成不良影響，因此在表面活性劑的除去或稀釋等中不會發(fā)生操作變得復雜的問題，優(yōu)選。表面活性劑只要不損害本發(fā)明的目的效果，則可并用多種，還可單獨使用。本發(fā)明的提取試劑只要不損害本發(fā)明的目的效果，除了上述成分之外還可含有保存材料、緩沖劑等。(金黃色葡萄球菌抗原的提取條件)本實施方式所涉及的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法是使用上述提取試劑從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取金黃色葡萄球菌抗原。本發(fā)明的提取方法的提取條件只要是金黃色葡萄球菌抗原的提取良好進行的條件則無特別限定，設定對于良好地提取抗原合適的溫度及提取時間?？乖奶崛囟葍?yōu)選為室溫以上、具體地為25 100°C。由此可以更有效率地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2。抗原的提取時間優(yōu)選為I分鐘 60分鐘左右，根據(jù)情況也可以是更長的時間。提取溫度越高，則提取所需要的時間可以越短，例如在100°C下進行提取時，提取時間大致可以為I分鐘 3分鐘左右，在95°C下進行提取時，提取時間大致為5分鐘 10分鐘，在25 37°C左右下進行提取時，提取時間優(yōu)選為60分鐘左右。通過本實施方式所涉及的提取方法，可以高效率地從MRSA及MSSA兩者中提取抗原。進而，所提取的兩抗原在提取液中均難以被分解，在提取物中穩(wěn)定地保持PBP2’及PBP2的方面具有優(yōu)勢。[實施方式2:金黃色葡萄球菌的判定方法]本實施方式所涉及的金黃色葡萄球菌的判定方法包括以下工序使用含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸的、pH5. 0以下的提取試劑，從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原的工序；通過使用了金黃色葡萄球菌抗原的抗體的免疫測定法對所提取的金黃色葡萄球菌抗原進行檢測的工序；根據(jù)該檢測結(jié)果判定所述被檢體中的金黃色葡萄球菌是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌還是甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌的工序。通過該方法，可以更為高效地將作為MRSA所特有的抗原的PBP2’和MRSA及MSSA中共同存在的PBP2兩者提取，同時可以將兩者穩(wěn)定地保持在提取物中，因此可以在后面的免疫測定體系中對兩者進行檢測，可以可靠地判定檢測對象的菌(被檢體)是MRSA還是MSSA。(提取金黃色葡萄球菌抗原的工序)本實施方式中的提取金黃色葡萄球菌抗原的工序由于基本上具有與上述實施方式I所涉及的提取金黃色葡萄球菌抗原的方法相同的構(gòu)成及作用效果，因此對于與實施方式I相同的內(nèi)容適當?shù)厥÷哉f明。(所提取的抗原在提取試劑中的穩(wěn)定性)使用本實施方式中的提取試劑從金黃色葡萄球菌中提取金黃色葡萄球菌抗原的工序的特征在于，在高效率地從MRSA及MSSA的兩者提取抗原的同時，所提取的兩抗原在提 取液中均難以被分解。提取由于是為了利用后面的免疫測定法等實施金黃色葡萄球菌抗原的檢測而進行，因此如果所提取的抗原在提取液中立即發(fā)生分解，則對檢測造成障礙，無法正確地進行之后的MRSA/MSSA判定。通過本實施方式的提取工序，由于所提取的抗原在提取試劑中不會被分解、穩(wěn)定地存在，因而具有優(yōu)勢。當將所提取的金黃色葡萄球菌抗原供至免疫測定法時，根據(jù)需要使用適當?shù)木彌_劑或堿、優(yōu)選磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉或氫氧化鈉等對使用本發(fā)明的提取試劑提取的金黃色葡萄球菌的提取液進行中和，調(diào)整成對于免疫測定體系適合的PH條件、具體地說優(yōu)選調(diào)整至pH6. 0 8. O。另外，使用本發(fā)明的提取試劑提取金黃色葡萄球菌的抗原之后，還優(yōu)選使用任意方法將細胞殘屑或粒狀物、或其他的不溶物除去。這些除去例如可通過離心分離、過濾器過濾等進行。(提取的金黃色葡萄球菌抗原的檢測)接著，本實施方式中通過使用了金黃色葡萄球菌抗原的抗體的免疫測定法對提取的金黃色葡萄球菌抗原進行檢測。本實施方式中的“抗體”是指對特定的肽或多糖類、低分子化合物等各種分子進行識別并形成鍵合/交聯(lián)的、統(tǒng)稱為“抗體”的蛋白質(zhì)，還包含其變體、修飾體。已知有來自小鼠、兔子、山羊的各種抗體，另外還可利用培養(yǎng)細胞產(chǎn)生特定的單克隆抗體、還可使用基因重組技術在大腸菌或真核生物細胞內(nèi)產(chǎn)生特定的單克隆抗體、還包含其重組體。另外，上述各種抗體的片段也為本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為抗體的片段，可舉出F (ab’)2段、Fab’段等。另外，當抗體為單克隆抗體時，球蛋白類型并無特別限定，例如可舉出IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。另外,單克隆抗體還可以是人化抗體。作為金黃色葡萄球菌抗原的抗體可以使用抗PBP2抗體及抗PBP2’抗體，它們可分別是多克隆抗體、也可以是單克隆抗體，但更優(yōu)選單克隆抗體。抗PBP2抗體特異性識別PBP2。抗PBP2 ’抗體特異性識別PBP2 ’。抗PBP2抗體及抗PBP2 ’抗體可根據(jù)該領域中公知的方法進行制作，例如可根據(jù)專利第3638731號公報所記載的方法進行制作。另外，還可購買市售的抗體。作為免疫測定方法可以使用各種公知的免疫測定法，例如通常的免疫測定法、例如乳膠凝集法、比濁法、放射免疫測定法(例如RIA法、RIMA法)、酶免疫測定法(例如ELISA法、EIA法)、凝膠內(nèi)沉降反應、流式細胞術、免疫印跡(western blotting)法、斑點雜交法、熒光抗體法(例如FIA法、IFMA法)、免疫色譜法、抗體陣列等，但并非限定于這些。這些免疫測定方法本身在該領域中是周知的，本領域技術人員可以容易地進行。對于一般的技術方法的詳細內(nèi)容可以參照公知的總論、書籍等。另外，本實施方式中的免疫測定法中為了檢測抗體，還可使用將能夠產(chǎn)生信號的標記物質(zhì)與抗體本身相結(jié)合的標記抗體。此時，除了直接結(jié)合之外，還可使用利用親和素-生物素或鏈霉親和素-生物素體系或二次抗體將抗體與標記物質(zhì)進一步結(jié)合的物質(zhì)，包含在本發(fā)明的技術范圍內(nèi)。作為此處使用的二次抗體可以使用能夠與一次抗體相結(jié)合的抗體。作為標記使用酶時，例如可使用過氧化物酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、碳酸脫氫酶、乙酰膽堿酯酶、熒光素酶、丙二酸酯脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等作為標記。作為利用這些酶進行標記的方法，可舉出用過碘酸將酶的糖鏈氧化，使抗體或外源凝集素的氨基酸鍵合在所產(chǎn)生的醛基上的方法或者向酶中導入馬來酰亞胺基或吡啶硫基等，與存在于抗體或外源凝集素的Fab’段的巰基相鍵合的方法等。 作為標記使用酶時，將試驗試樣與標記抗體孵育后，對游離的標記抗體進行洗滌后除去，然后作用上述標記酶的底物，通過發(fā)色等測定反應，從而可以檢測標記抗體。例如用過氧化物酶進行標記時，通過作為底物的過氧化氫、作為發(fā)色試劑的二氨基聯(lián)苯胺或0-苯二胺的組合，產(chǎn)生褐色或黃色。用葡萄糖氧化酶進行標記時，作為底物可以使用例如2，2’ -連氮基-二- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)等。作為標記使用熒光色素時，例如可以使用FITC (異硫氰酸熒光素)或TRITC (四甲基羅丹明B異硫氰酸酯)等熒光色素對抗體進行標記?？贵w與熒光色素的結(jié)合可通過常規(guī)方法進行。作為標記使用顯色標記物質(zhì)時，例如可使用膠體金屬及著色乳膠等作為標記。作為膠體金屬的代表例，可舉出金膠體、銀膠體、硒膠體、碲膠體或鉬膠體等各個作為分散粒子的金屬膠體粒子。膠體金屬的粒子的大小通常優(yōu)選直徑3 60nm左右。另外，作為著色乳膠的代表例，可舉出用紅色及藍色等各個著色料進行了著色的聚苯乙烯乳膠等合成乳膠。作為乳膠可使用天然橡膠乳膠等天然乳膠。著色乳膠的大小可以從直徑數(shù)十nm 數(shù)百nm左右內(nèi)選擇。這些顯色標記物質(zhì)可直接使用市售品，還可進行加工或者利用其本身公知的方法進行制造。抗體與顯色標記物質(zhì)的結(jié)合可通過常規(guī)方法進行。例如顯色標記物質(zhì)是作為金溶膠的分散粒子的金膠體粒子時，通?？赏ㄟ^在室溫下混合抗體和金溶膠將兩者物理地結(jié)
口 o 予以說明，作為標記除上述之外還可使用放射性同位素標記(例如125I、mI、3H、14C等)等，包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(ELISA)作為本實施方式的免疫測定法，可使用酶免疫測定法(ELISA)?！懊该庖邷y定法”(ELISA)是指使用進行了酶標記的抗體定量地對抗體的抗原進行檢測的方法，定量性、簡便性、可靠性(重現(xiàn)性)優(yōu)異，在臨床檢查等中被廣泛使用。酶免疫測定法是眾所周知的技術，對于一般的技術手段的詳細情況可參照公知的總論、書籍等。作為酶免疫測定法，已知有若干種方法，其中最為廣泛使用的是被稱作夾心ELISA的使抗原結(jié)合在固定有抗體的板上、并利用其他抗體檢測所結(jié)合的抗原的方法。作為夾心ELISA法的固相用載體可舉出玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶類、天然或經(jīng)修飾的纖維素類、聚丙烯酰胺類、輝長巖(gabbros)及磁鐵礦(magnetite)。固相用載體的材料只要能夠結(jié)合抗體則可具有任何可能的結(jié)構(gòu)輪廓。例如可以是微球等球形或者如試管或微孔板的孔的內(nèi)部表面等的圓筒形。另外，上述表面可以是平坦的，例如薄片、膜、試驗片、芯片、玻片等。優(yōu)選的載體是硝基纖維素膜、用硝基纖維素進行了包被的玻片、96-孔板及聚苯乙烯或羧基微球。本領域技術人員能夠理解或者通過日常實驗能夠更加確信多數(shù)其他載體適于結(jié)合抗體或抗原。上述的酶免疫測定法(ELISA)不僅限于使用酶作為標記的ELISA，還包含使用放射性同位素作為標記的放射免疫分析法(RIA )或使用熒光物質(zhì)作為標記的熒光免疫分析(FIA)等改變法。在使用這些各個免疫化學的測定法時，必須進行格外的條件、操作等的設定，可參照公知的總論、書籍等。 作為本實施方式中的免疫測定法，可以使用ELISA法、其中可使用夾心ELISA。(免疫色譜法)作為本實施方式的免疫測定法可使用免疫色譜法。免疫色譜法是指檢體利用毛細管現(xiàn)象移動到膜上時，由檢體中的抗原和標記抗體及捕捉抗體這三者形成免疫復合體，通過目視可確認該標記物的聚集的測定方法。由于不需特別的裝置、另外也不需洗滌操作，因而可以簡單地測定。免疫色譜法是眾所周知的技術，對于一般的技術手段的詳細情況可參照公知的總論、書籍等。免疫色譜法大致上分開使用補足試劑部位和標記試劑部位。補足試劑部位中固定有用于補足抗原的抗體。作為補足試劑部位中使用的固相用載體，只要是由顯示毛管現(xiàn)象的微細多孔性物質(zhì)構(gòu)成的惰性載體且與所使用的第一試劑、標記試劑、被檢測物質(zhì)等不發(fā)生反應，則其材質(zhì)并無特別限定。具體地說可舉出聚氨酯、聚酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、尼龍、硝基纖維素或乙酸纖維素等纖維素衍生物等構(gòu)成的纖維狀或無紡纖維狀基質(zhì)、膜、濾紙、玻璃纖維濾紙、布、棉等。優(yōu)選為纖維素衍生物或尼龍的膜、濾紙、玻璃纖維濾紙等，更優(yōu)選為硝基纖維素膜、混合硝基纖維素酯(硝基纖維素與乙酸纖維素的混合物)膜、尼龍膜、濾紙。用于將抗體固相化的濃度優(yōu)選為0. I U g/ml 10mg/ml的濃度、更優(yōu)選為10 U g/ml lmg/ml的濃度。標記試劑部位包含用于檢測抗原而進行了標記的抗體。標記可以適當使用上述的標記手段。免疫層析通過組合用于提供這2個部位和檢體的玻璃濾器、吸收用濾紙等來構(gòu)建。所用介質(zhì)的形態(tài)及大小并無特別限定，只要是在實際操作方面及結(jié)果觀察的方面適當即可。為了使操作更為簡便，還可以在表面形成判定部位的層析介質(zhì)的里面設置由塑料等形成的支撐體。該支撐體的性狀并無特別限定，當通過目視判定進行測定結(jié)果的觀察時，支撐體優(yōu)選具有與標記物質(zhì)所產(chǎn)生的色彩不類似的色彩，通常優(yōu)選為無色或白色。(抗體陣列)作為本實施方式的免疫測定法可以使用抗體陣列?？贵w陣列是指將多個抗體固定在支撐體上，檢測與其相對應的反應(低分子化合物或其他蛋白質(zhì)的結(jié)合等)的方法。通過使用該抗體陣列，可以同時對含本發(fā)明的PBP2及PBP2’抗原的多個抗原或蛋白質(zhì)進行評價，可迅速進行檢測。作為抗體陣列的支撐體只要是本技術領域中通常使用的支撐體則無特別限定，例如可舉出膜(例如硝基纖維素膜、尼龍膜、PVDF (聚偏氟乙烯)膜)、玻璃(例如玻璃玻片)、塑料、芯片、針、濾器、微球、紙、膜、纖維束、凝膠、金屬(例如金薄膜)、陶瓷等，但并非限定于這些。尼龍、硝基纖維素及PVDF (聚偏氟乙烯)等的膜適于用作本發(fā)明陣列中的支撐體。利用抗體陣列的抗原的檢測隨所用抗體陣列的形態(tài)而不同，例如可通過對從試樣提取的抗原進行標記、接著使其與抗體陣列上的各抗體發(fā)生反應而進行，或者還可通過使用進行了固相化的抗體和標記抗體實施夾心分析而進行。標記可以適當使用上述的標記手段。 抗體陣列可以利用本技術領域中周知的方法將抗體固定在支撐體上來制作。作為將抗體固定在支撐體上的方法，可舉出例如利用共價鍵進行固定的方法；利用非共價相互作用(例如離子鍵、疏水性相互作用、氫鍵、范德華力、偶極子-偶極子鍵合)進行固定的方法；利用靜電結(jié)合進行固定的方法，但考慮到實驗的重現(xiàn)性，優(yōu)選利用共價鍵進行固定的方法。另外，當支撐體為玻璃、塑料、金薄膜等時，還可通過使抗體所含氨基酸的官能團與支撐體表面上的官能團發(fā)生反應/鍵合，將抗體固定在支撐體上。本實施方式中的抗體陣列可使用為了制造蛋白質(zhì)或核酸陣列所使用的任意方法進行制作。例如可以使用作為具備開叉針或噴墨打印機的機器人打印機的微型點樣機將抗體點樣在陣列上。作為點樣的抗體濃度優(yōu)選為0. I ii g/ml 10mg/ml的濃度、更優(yōu)選為IOii g/ml lmg/ml的濃度。點的大小優(yōu)選半徑0. Olmm以上且IOmm以下、更優(yōu)選半徑
0.05mm以上且2mm以下。作為抗體陣列的制造方法例如記載于日本特表2010-533842中。利用抗體陣列的檢測當使用與底物反應并發(fā)光的酶作為標記物質(zhì)時，例如可以用CCD (Charge Coupled Devices)相機等對整個陣列區(qū)域進行圖像拍攝,將發(fā)光量作為亮度值進行測光。作為這種抗體陣列的測定裝置可舉出熒光影像分析儀LAS 300 (FUJIFIIi^Av司制)?？乖贵w反應及檢測工序的反應條件、反應所用的試劑成分等可以在達成本發(fā)明目的的范圍內(nèi)最佳化。本發(fā)明的PBP2及PBP2’抗原這兩抗原的檢測可單獨進行、也可依次進行、還可同時進行。當選擇例如免疫色譜法或抗體陣列那樣，同時使用多個抗體、可同時檢測各個抗原的存在的檢測體系時，則檢測操作變得更為簡單、可進行效率良好的檢測和判定。(使用了提取物的MRSA/MSSA的判定)本實施方式所涉及的金黃色葡萄球菌的判定方法的特征在于，在上述提取工序、檢測工序之后，根據(jù)其檢測結(jié)果，判定所述被檢體中的金黃色葡萄球菌是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌還是甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌。進行使用上述各種抗原檢測方法檢測PBP2’及PBP2的工序的結(jié)果判定，提取物中檢測到PBP2’的檢體是“MRSA”。此外，檢測到PBP2、但未檢測到PBP2’的檢體是“MSSA”。另一方面，對于未檢測到PBP2’且也未檢測到PBP2的檢體而言，則暗示該菌不是金黃色葡萄球菌，或者雖然是金黃色葡萄球菌(MRSA或MSSA)，但檢體量過少或者是在有任何錯誤操作等不適當?shù)臋z測條件下進行的試驗。本發(fā)明的方法在這種情況下可以立即進行再測定或者重新修改測定順序，在此方面也較僅檢測PBP2’的方法的可靠性更為優(yōu)異。[實施方式3:用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑]本實施方式所涉及的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑是含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸且PH為5. 0以下的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑。通過該試劑可以同時且高效地從金黃色葡萄球菌中提取PBP2’及PBP2。本實施方式所涉及的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑基本上具有與實施方式I中具體說明過的提取試劑相同的構(gòu)成及作用效果。因而，對于與實施方式I相同的內(nèi)容適當省略說明。本實施方式所涉及的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑可以組合上述各成分進行調(diào)制。另外，本實施方式所涉及的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑根據(jù)需要含有選自陰離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑及兩性離子表面活性劑中的I種以上的表面活性劑。 本發(fā)明的提取試劑只要不損害本發(fā)明的目的效果，則除了上述成分之外還可含有保存材料、緩沖劑等。另外，本發(fā)明的提取試劑還可以以將全部構(gòu)成成分混合的狀態(tài)裝在I個容器內(nèi)，或者也可以分成兩種成分以上收納在多個容器內(nèi)、在使用時進行混合調(diào)制。[實施方式4:用于檢測金黃色葡萄球菌抗原的免疫測定試劑盒]本實施方式所涉及的用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒是包含上述用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑的用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒。通過該試劑盒，可以根據(jù)所得提取物中的抗原的檢測結(jié)果，更為可靠地判定試驗菌株是MRSA還是MSSA。本實施方式所涉及的用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒還可根據(jù)需要包含收納上述提取試劑的容器、抗原檢測手段、測定方法的說明書和根據(jù)需要的被檢物質(zhì)(抗原)的標準品等。例如作為含有抗原的免疫測定手段作為抗原檢測手段的用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒是本實施方式所涉及的免疫測定試劑盒的優(yōu)選一例。實施例以下示出實施例更為具體地說明本發(fā)明，但以下所記載的內(nèi)容并不限定本發(fā)明的技術范圍。予以說明，只要沒有特別限定，則實施例中的“％”及“份”是指重量％及重量份。(實施例I)葡萄球菌抗原提取試劑的調(diào)制和從MRSA的金黃色葡萄球菌抗原的提取I. MRSA檢體的調(diào)制將3. 7g 的 Brain Heart Broth (Merck 公司產(chǎn)品編號 110493)溶解于 IOOml 的水中，進行121°C、20分鐘的高壓釜滅菌后制成培養(yǎng)基。向該培養(yǎng)基中接種MRSA的臨床分離株，在37°C下培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離將菌體回收，溶解于IOml的2OmM磷酸緩沖液(PH7. 2)中。接著，將溶解的MRSA菌體液(50 ill)分注入微管中，通過離心分離將
上清除去。2.使用了金黃色葡萄球菌抗原提取試劑的從MRSA中的抗原提取調(diào)制由0. IM HCl構(gòu)成的葡萄球菌抗原提取試劑以及由0. IM HCl及2. 0%(w/w)各種表面活性劑構(gòu)成的葡萄球菌抗原提取試劑(均是PH5.0以下)。表面活性劑使用作為陰離子性表面活性劑的EMAL NC35 (花王公司制)；作為非離子性表面活性劑的MEGA-8 (同仁化學公司制)、TritonX-100 (和光純藥工業(yè)公司制)、Tween20 (和光純藥工業(yè)公司制)、Brij721(SIGMA公司制)；作為陽離子性表面活性劑的QUARTAMIN86W (花王公司制)、作為兩性離子表面活性劑的CHAPS (同仁化學公司制)、AMPHITOL 20N (花王公司制)。在所述I.中記載的上清除去后的MRSA菌體中分別添加上述各種提取試劑及作為對照的0. IM氫氧化鈉溶液或0. IM亞硝酸溶液(200 u I)進行懸浮。在沸水中將該菌懸浮液煮沸2分鐘進行提取。在冰上將提取工序后的菌懸浮液冷卻后，將0. IMNaOH (200u I)和IOOmM磷酸緩沖液(pH8.0、20iil)添加至菌懸浮液中，中和至pH6. 0 8. O。之后，以1500 Xg離心分離5分鐘，獲得上清，接著獲得用于免疫抗體測定法的檢體。3.抗PBP2抗體及抗PBP2’抗體的制作及固相化特異性檢測PBP2及PBP2’的抗體(抗PBP2抗體及抗PBP2 ’抗體)可根據(jù)公知的方法制作(例如根據(jù)專利第3638731號公報所記載的方法)。從所得的單克隆抗體中利用公知的挑選方法發(fā)現(xiàn)在夾心ELISA法中可優(yōu)選使用的“固相用抗體”和“標記用抗體”的組合。予以說明，標記用抗體中通過使用公知方法(例如根據(jù)P. TIJSSEN Enzyme Immunoassay,東京化學同人，216-241所記載的方法)的化學修飾來結(jié)合生物素。使用0. IM PBS (pH7. 5)稀釋上述“固相用”的抗PBP2抗體及抗PBP2 ’抗體至達到2 u g/ml的濃度，以每孔50iU分注到板中，在25°C下反應I小時，從而將抗體固相化。之后，每孔用 200 u I ^ 0. 05% 的 Tween20、150mM 的氯化鈉的 50mM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 2)(TB S-T)洗滌3次。接著每孔添加200 ill含2%B SA的TBS緩沖液(pH7. 0)，使其反應I小時，進行封閉。然后使用TBS-T洗滌3次。4.使用了固相化抗PBP2抗體及抗PBP2’抗體的免疫測定向固相化有抗體的微孔板中每孔分注50ul用稀釋液(1%BSA TBS-Tween 0. 1%)稀釋了 10倍的檢體，在25°C下進行抗原抗體反應I小時。之后，每孔用200ul TBS-TCTween20濃度為0. 1%)洗滌3次。然后，將結(jié)合有生物素的標記用抗PBP2抗體及抗PBP2’抗體用稀釋液(1%BSA TBS-Tween 0. 1%)稀釋至I. Oug/ml,以每孔50ul分注至板中，在25°C下進行抗原抗體反應I小時。每孔用200ul TBS-T (Tween20濃度為0. 1%)洗滌3次后，將使用稀釋液(1%BSATBS-Tween 0. 1%)調(diào)制成lug/ml的鏈霉親和素鍵合過氧化物酶(Thermo公司產(chǎn)品編號21126)以每孔50ul分注至板中，在25°C下使其反應30分鐘。每孔用200 U I TBS-TC Tween20濃度為0. 1%)洗滌3次后，每孔添加100 加入有O-苯二胺lmg/ml、過氧化氫0. 5 u 1/ml的25mM朽1檬酸緩沖液(pH5. 0),進行發(fā)色反應10分鐘后，每孔添加30ul用純水稀釋至90倍的濃硫酸溶液,停止反應。使用酶標儀(MolecularDevices公司制SPECTRAmax)測定波長490nm的吸光度。將結(jié)果不于表I。(結(jié)果及討論)關于使用PBP2’、PBP2各自的抗體進行測定的結(jié)果，將代替檢體使用放入了稀釋液(TBS-T)進行測定的吸光度作為空白，把將該空白減去后的結(jié)果示于表中。如表I所示，對使用含鹽酸的提取試劑或含鹽酸及表面活性劑的提取試劑進行了提取的檢體而言，PBP2’及PBP2兩者的測定值均明顯高于空白，能夠檢測PBP2’及PBP2兩者。另外確認，根據(jù)表面活性劑的種類，提取效率中可見差異，在與鹽酸組合使用QUARTAMIN 86W、AMPHITOL20N、Bri j721等時，獲得特別高的吸光度。予以說明，使用鹽酸以外的其他酸(乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸)時也獲得相同的結(jié)果。
另一方面，當使用利用氫氧化鈉的堿性提取試劑時，對于PBP2’可以測定，但測定PBP2時的吸光度變?yōu)镺、無法進行檢測。這說明具有以下的可能在堿性條件下利用氫氧化鈉不能良好地提取PBP2，或者即便被提取、之后PBP2在提取液中被分解、無法作為測定值進行檢測。而且，使用了亞硝酸的方法中，無法同時檢測PBP2、PBP2’。其原因雖不清楚，但推測是非專利文獻5所公開的使用了亞硝酸的抗原提取法是為了提取糖鏈等碳水化合物性的抗原而使用的，對于提取PBP2、PBP2’等蛋白性抗原的目的沒有效果。表I
權利要求
1.ー種金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，其特征在于使用含有選自鹽酸、こ酸、朽1檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸的、PH5. O以下的提取試劑從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原。
2.根據(jù)權利要求I所述的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，所述提取試劑含有選自陰離子性表面活性剤、兩性離子表面活性剤、陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑中的I種以上的表面活性剤。
3.根據(jù)權利要求2所述的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，所述表面活性劑為選自EMAL NC35、MEGA-8、TritonX-100、Tween20、LEOCOL SC70、LEOCOL TD90、RHE0D0L Tff-OI20,Brij721、QUARTAMIN 86W、QUARTAMIN24P、CHAPS、CHAPS0、AMPHIT0L 20N及 AMPHITOL 24B 中的I種以上。
4.根據(jù)權利要求Γ3任一項所述的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原是青霉素結(jié)合蛋白2’，甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原是青霉素結(jié)合蛋白2。
5.根據(jù)權利要求1 4任一項所述的金黃色葡萄球菌抗原的提取方法,在25 100°C下進行抗原的提取。
6.—種金黃色葡萄球菌的判定方法，其包括以下エ序使用含有選自鹽酸、こ酸、朽1檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸的、PH5. O以下的提取試劑，從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原的エ序；通過使用了金黃色葡萄球菌抗原的抗體的免疫測定法對所提取的金黃色葡萄球菌抗原進行檢測的エ序；根據(jù)其檢測結(jié)果判定所述被檢體中的金黃色葡萄球菌是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌還是甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌的エ序。
7.根據(jù)權利要求6所述的金黃色葡萄球菌的判定方法，所述免疫測定法選自由乳膠凝集法、比濁法、放射免疫測定法、酶免疫測定法、凝膠內(nèi)沉降反應、流式細胞術、免疫印跡法、斑點雜交法、突光抗體法、免疫色譜法及抗體陣列組成的組。
8.一種用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑，其含有選自鹽酸、こ酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的I種以上的酸且PH為5. O以下。
9.根據(jù)權利要求8所述的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑，其含有選自陰離子性表面活性剤、非離子性表面活性剤、陽離子性表面活性劑及兩性離子表面活性劑中的I種以上的表面活性剤。
10.一種用于檢測金黃色葡萄球菌的免疫測定試劑盒，其含有權利要求8或9所述的用于提取金黃色葡萄球菌抗原的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種金黃色葡萄球菌抗原的提取方法，其特征在于，使用含有選自鹽酸、乙酸、檸檬酸、磷酸、硫酸及硝酸中的1種以上的酸的、pH5.0以下的提取試劑從被檢體中的金黃色葡萄球菌中提取包含甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌抗原及/或甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌抗原的金黃色葡萄球菌抗原。本發(fā)明還提供一種金黃色葡萄球菌的判定方法。
文檔編號C07K14/31GK102695718SQ20108005980
公開日2012年9月26日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權日2009年12月28日
發(fā)明者志賀一樹 申請人:龜甲萬株式會社