專利名稱：分泌異源多肽的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及用于從細(xì)菌中分泌異源多肽的信號序列。本發(fā)明也涉及通過原核生物生產(chǎn)的重組多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
將異源多肽分泌到大腸桿菌和其它原核生物的周質(zhì)間隙或分泌到它們的培養(yǎng)基 中受多種因素影響。一般，對用于分泌目的多肽的載體進行改造，以將編碼分泌信號序列的DNA置于編碼目的多肽的DNA的5’端。近年來,使用異源多肽(例如抗體)作為各種失調(diào)和疾病的診斷和治療藥劑的前景越來越好。許多研究和臨床應(yīng)用需要大量的功能性多肽，因此需要用于多肽生產(chǎn)的擴大的、但是經(jīng)濟的系統(tǒng)。特別有用的是,使用各種表達宿主,從例如大腸桿菌(E. coli)或枯草芽孢桿菌(B. subtilis)等原核生物到酵母、植物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞，通過重組體生產(chǎn)抗體。Kipriyanov 和 Little (1999)Mol. Biotech. 12:173-201。與其它多肽生產(chǎn)體系相比,細(xì)菌，特別是大腸桿菌,具有許多獨特的優(yōu)點。所用的原材料(即細(xì)菌細(xì)胞)便宜且易于生長,因此降低了產(chǎn)品的成本。原核宿主比例如哺乳動物細(xì)胞生長更快，這使得可以對遺傳操作進行更快的分析。較短的增代時間和易于擴大規(guī)模也使細(xì)菌發(fā)酵成為用于蛋白質(zhì)大量生產(chǎn)的更具有吸引力的手段。包括大腸桿菌在內(nèi)的許多細(xì)菌物種的基因組結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性已經(jīng)得到充分研究,且可獲得廣范的合適載體,這使得表達期望的抗體更加方便。與真核生物相比,該生產(chǎn)過程涉及較少的步驟,這些步驟包括重組基因的操作、將多個拷貝穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到宿主中、表達的誘導(dǎo)和產(chǎn)物的表征。Pluckthun和 Pack (1997) Tinniunotech 3:83-105。各種方法已被用來在細(xì)菌中產(chǎn)生重組多肽?？梢酝ㄟ^胞質(zhì)中表達的包涵體的再折疊,或通過表達后分泌到細(xì)菌周質(zhì)中，來從細(xì)菌獲得重組蛋白。在分泌和再折疊之間的選擇一般基于幾種因素。分泌通常是用于生產(chǎn)抗體的更快和更普遍使用的策略。Kipriyanov和Little (1999)，同上。在原核系統(tǒng)中表達抗體可以在不同規(guī)模上進行。搖瓶培養(yǎng)(在2-5升范圍內(nèi))一般產(chǎn)生小于5mg/升的產(chǎn)物。Carter等(1992)Bio/TechnologylO: 12-16發(fā)展了高細(xì)胞密度發(fā)酵系統(tǒng)，其中獲得了高水平表達(多達2g/升)的抗體片段。Carter等獲得的Fab’的該克/升滴度在很大程度上可以歸因于，比簡單的搖瓶更為精確地控制的發(fā)酵罐環(huán)境導(dǎo)致了較高的細(xì)胞密度。該系統(tǒng)包含設(shè)計來共表達輕鏈和重鏈片段的雙順反子操縱子。該雙順反子操縱子處于單個的大腸桿菌磷酸饑餓誘導(dǎo)型PhoA啟動子的控制之下。每個抗體鏈之前具有大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素II(StII)信號序列，以指導(dǎo)分泌到周質(zhì)空間中。對于在大腸桿菌中生產(chǎn)抗體的綜述，見Pluckthun和Pack (1997) Immunotech3:83-105;Pluckthun 等(1996)，于 ANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL APPROACH,第203-252 頁(Oxford 出版社)中；Pluckthun (1994)，于 HANDBOOK OF EXP PHARMCOL 卷3: THE PIiARMCOL OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第 269-315 頁(M. Rosenberg 和 G. P. Moore編輯；Springer-Verlag, Berlin)中。許多生物學(xué)測定(例如X射線晶體學(xué))和臨床應(yīng)用(例如蛋白質(zhì)療法)需要大量的蛋白質(zhì)。因此，需要用于產(chǎn)生正確組裝的、可溶的和功能性異源多肽(例如抗體)的高產(chǎn)而簡單的系統(tǒng)。本文引用的所有參考文獻,包括專利申請和出版,均以引用的方式就其全部內(nèi)容并入到本文中。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于增加異源蛋白生產(chǎn)的新的手段，所述手段包括使用新的翻譯起始區(qū)(TIR)變體,包括包含共翻譯分泌信號肽(以共翻譯方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)移的信號肽)的TIR變體和/或包含翻譯后分泌信號肽(以翻譯后方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)移的信號肽)的TIR變體。此夕卜，本文公開了使用載體增加抗體生產(chǎn)，所述載體包含與包含共翻譯或翻譯后分泌信號肽的TIR有效連接的抗體輕鏈，和與包含共翻譯分泌信號肽的TIR有效連接的抗體重鏈,用于峰值表達。本文也提供了新的TIR變體。在^-個方面,本發(fā)明提供了變體翻譯起始區(qū)。在一些實施方案中，變體包括變體翻譯起始區(qū)(在一些實施方案中，原核翻譯后分泌信號序列或原核共翻譯分泌信號序列)。在一些實施方案中，變體包括分泌信號序列(例如PhoA、MalE、DsbA或STII)的核酸變體。在一些實施方案中，變體還包含MlaI、BSSHII、或XbaI限制性位點。在一些實施方案中，變體包括包含表3中所示序列的翻譯起始區(qū)變體。在一·"Iv方面,本發(fā)明提供了變體分泌信號序列。在一些實施方案中，分泌信號序列是原核翻譯后分泌信號序列或原核共翻譯分泌信號序列。在一些實施方案中，分泌信號序列是真核翻譯后分泌信號序列或真核共翻譯分泌信號序列。在一些實施方案中,變體是PhoA, MalE, DsbA或STII分泌信號序列的核酸變體。在一些實施方案中，變體包含表3中所示的分泌信號序列。本發(fā)明的變體分泌信號序列適用于例如本文公開的任何方法中。在另一個方面,本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的翻譯起始區(qū)的多核苷酸。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含表3中所示的序列(例如，SEQ ID NOs I-42之一)。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs. 1-14、16-24、26-39、41-42之一。該多核苷酸適用于例如本文公開的任何方法中。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分泌信號序列的多核苷酸。在一些實施方案中，分泌信號序列包含表3中所不的序列(例如，SEQ ID NOs I-42之一)。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs. 1-14、16-24、26-39、41-42之一。該多核苷酸適用于例如本文公開的任何方法中。在另一個方面,本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的翻譯起始區(qū)的多核苷酸，所述翻譯起始區(qū)與編碼異源多肽的多核苷酸有效連接，借以在宿主細(xì)胞(例如，原核宿主細(xì)胞,例如，大腸桿菌宿主細(xì)胞)中表達異源多肽時,異源多肽折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的異源多肽。本文還公開了異源多肽的實例。在一些實施方案中,異源多肽是抗體重鏈。在一些實施方案中，異源多肽是抗體輕鏈。在一些實施方案中，異源多肽是Fe多肽。在一些實施方案中，異源多肽是多聚體多肽。在一些實施方案中，異源多肽是異源多聚體。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)是本文中公開的任何翻譯起始區(qū)，例如包含表3中所示序列的翻譯起始區(qū)。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs 1-42之一的序列。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs I-14、36-39、41-42之一的序列。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包含變體STII、DsbI、PhoA或MalE信號序列。在另一個方面,本發(fā)明提供了多核苷酸,其包括(I)與編碼第一異源多肽的多核苷酸有效連接的第一翻譯起始區(qū)(TIR)，其中TIR包含共翻譯原核分泌信號序列；和(2)與編碼第二異源多肽的多核苷酸有效連接的第二 TIR,其中第二 TIR包含共翻譯或翻譯后原核分泌信號序列，借以在宿主細(xì)胞中表達抗體時，第一和第二異源多肽折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的多肽復(fù)合物。在另一個方面,本發(fā)明提供了編碼抗體的多核苷酸,所述多核苷酸包括(1)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的本發(fā)明的第一翻譯起始區(qū)；和(2)與編碼抗體輕鏈的多核苷酸有效連接的第二翻譯起始區(qū)，借以在宿主細(xì)胞(例如,原核宿主細(xì)胞，例 如,大腸桿菌宿主細(xì)胞)中表達抗體時，重鏈和輕鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含共翻譯原核分泌信號序列(例如,通過信號識別肽指導(dǎo)翻譯的信號序列)。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含STI I或DsbA信號序列。在^-些實施方案中,第--翻譯起始區(qū)包含DsbA信號序列。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含PhoA或MalE信號序列。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs: 1-10和36-42之一的序列。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含SEQ IDNOs: I-10、36-29、41和42之一的序列。在一些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含SEQ IDN0s:l-42之…-的序列。在…-些實施方案中，第一翻譯起始區(qū)包含SEQ ID Nos. 1-14、16-24、26-39,41-42 之一的序列。在一些實施方案中，第二翻譯起始區(qū)包含(i)共翻譯原核分泌信號序列或翻譯后原核分泌信號序列(例如,通過sec途徑指導(dǎo)翻譯的信號序列)。在一些實施方案中，第二翻譯起始區(qū)包含STII、DsbA、MalE或PhoA信號序列。在一些實施方案中，第二翻譯起始區(qū)包含PhoA或MalE信號序列。在一些實施方案中，第二翻譯起始區(qū)包含SEQ ID NOs 1-42之一的序列。在一些實施方案中，第二翻譯起始區(qū)包含SEQ ID N0sl-14、16-24、26-39、41-42之一的序列。在一些實施方案中,編碼抗體的多核苷酸還包括⑶與編碼Fe多肽的多核苷酸有效連接的第三翻譯起始區(qū)。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含STII,PhoA或DsbA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含DsbA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含PhoA信號序列。在另一個方面,本發(fā)明提供了多核苷酸,其包括(1)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的第一翻譯起始區(qū)(TIR)，其中TIR包含共翻譯原核分泌信號序列；和(2)與編碼抗體輕鏈的多核苷酸有效連接的第二 TIR,其中第二 TIR包含共翻譯或翻譯后原核分泌信號序列,借以在宿主細(xì)胞中表達抗體時,重鏈和輕鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。在另--個方面,本發(fā)明提供了編碼抗體片段(例如單價抗體片段)的多核苷酸,所述多核苷酸包括(1)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的本發(fā)明的第一翻譯起始區(qū)；(2)與編碼抗體輕鏈的多核苷酸有效連接的第二翻譯起始區(qū)；和(3)與編碼Fe多肽的多核苷酸有效連接的第三翻譯起始區(qū)，借以在宿主細(xì)胞(例如,原核宿主細(xì)胞)中表達抗體時，重鏈、輕鏈和Fe多肽折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體(例如單臂抗體)。在一些實施方案中,第三翻譯起始區(qū)包含共翻譯原核分泌信號序列或翻譯后原核分泌信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含STII、PhoA, MaIE或DsbA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含DsbA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含PhoA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含SEQ ID Nos 1-42之一的序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含SEQ ID Nos. I-14、16-24、26-39、41-42之一的序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼抗體的多核苷酸,所述多核苷酸包括(I)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的第一翻譯起始區(qū)，其中第一翻譯起始區(qū)包含STII或DsbA信號序列；和(2)與編碼抗體輕鏈有效連接的第二翻譯起始區(qū)，其中第二翻譯起始區(qū)包含STII、DsbA、MalE或PhoA信號序列，借以在宿主細(xì)胞(例如,原核宿主細(xì)胞)中表達抗體時，重鏈和輕鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。在一些實施方案中,第一翻譯起始區(qū)包含DsbA信號序列,第二翻譯起始區(qū)包含MalE或PhoA信號序列。在一些實施方案中，編碼抗體的多核苷酸還包括(3)與編碼Fe多肽的多核苷酸有效連接的第三翻譯起始區(qū)。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含STIU PhoA或DsbA信號序列。在一些實施方案中，·第三翻譯起始區(qū)包含PhoA信號序列。在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū)包含DsbA信號序列。在一些實施方案中，所述變體翻譯起始區(qū)的翻譯強度低于野生型翻譯起始區(qū)的翻譯強度。在一些實施方案中,所述變體翻譯起始區(qū)的翻譯強度高于野生型翻譯起始區(qū)的翻譯強度。在一些實施方案中，與野生型氨基酸序列相比，翻譯起始變體的氨基酸序列沒有改變。在一些實施方案中，與野生型氨基酸序列相比,翻譯起始變體的氨基酸序列是改變的。在一些實施方案中，翻譯起始區(qū)包括原核分泌信號序列。在一些實施方案中，第一和第二翻譯起始區(qū)(以及在一些實施方案中，第三翻譯起始區(qū))提供近似相等的翻譯強度。在一些實施方案中，相對翻譯強度是約I或2。在一些實施方案中，相對翻譯強度是約I。在一些實施方案中，相對翻譯強度是約2。在一些實施方案中，相對翻譯強度是I和/或2。在一些實施方案中，相對翻譯強度是約3或約4。在一些實施方案中，相對翻譯強度選自I或大于1、2、3、4、5或更高(例如6或7或更高)。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸還包括與異源多肽有效連接的啟動子。在一些實施方案中，啟動子是原核啟動子，其選自phoA、tac、lpp、lac_lpp、lac、ara、trp和T7啟動子。在一些實施方案中，啟動子是phoA啟動子。在一些涉及抗體重鏈和輕鏈表達的實施方案中，多核苷酸還包括(a)第一啟動子,其中第一啟動子與輕鏈有效連接；和(b)第二啟動子,其中第二啟動子與重鏈有效連接。在一些實施方案中，第一和第二啟動子都是phoA啟動子。在一些涉及抗體重鏈、輕鏈和Fe多肽表達的實施方案中，多核苷酸還包括(c)第三啟動子，其中第三啟動子與Fe多肽有效連接。在一些實施方案中，第三啟動子是Fe多肽。當(dāng)表達包含一個以上多肽的多肽(例如,包含重鏈和輕鏈的抗體)時，用于表達多肽的多核苷酸可以是多順反子多核苷酸(即,包含和表達在單個啟動子調(diào)節(jié)控制下的多個順反子的單個多核苷酸)。多順反子載體的常見例子是包含和表達在一個啟動子控制下的兩個不同多肽的“雙順反子”載體。當(dāng)雙順反子或多順反子載體表達時，多個編碼區(qū)(例如，基因)首先轉(zhuǎn)錄為單個轉(zhuǎn)錄單元，然后分開進行翻譯。順反子指遺傳元件，其基本上等同于包含編碼多肽鏈的核酸序列和鄰近的控制區(qū)(包括，例如TIR)的翻譯單元。在其它實施方案中，多核苷酸可以包括分順反子,所述分順反子指包含至少兩個分開的啟動子-順反子對的單個多核苷酸，其中每個順反子在其自身的啟動子的控制下。當(dāng)分順反子表達載體表達時,不同基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程都是分開和獨立的。在另一個實施方案中，多核苷酸可以包括多順反子部分和分順反子(separate cistron)部分。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。在一些實施方案中，載體是表達載體。在另外的方面，本發(fā)明提供了包含一個或多個本發(fā)明的多核苷酸以及載體(carrier)的組合物。在一個實施方案中，載體是在藥學(xué)上可接受的。在一個方面,本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。在一些實 施方案中,宿主細(xì)胞包含編碼抗體(在一些實施方案中,雙特異性或單臂載體)的本發(fā)明多核苷酸。宿主細(xì)胞可以包含一個或多個共同編碼抗體的多核苷酸。載體可以是任何類型的，例如，重組載體,例如表達載體。可以使用各種宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一些實施方案中，大腸桿菌是內(nèi)源蛋白酶活性缺陷型菌株。在一些實施方案中，大腸桿菌的基因型缺乏degP和prc基因并包含突變的spr基因。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞還包含編碼原核伴侶蛋白，例如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、FkpA和/或DsbG)的多核苷酸。在一些實施方案中，伴侶蛋白在宿主細(xì)胞中過量表達。在一些實施方案中，伴侶蛋白是Dsb A和/或DsbC。在一個方面,宿主細(xì)胞包含一個或多個共同編碼單臂抗體的多核苷酸。在一個實施方案中，單個多核苷酸編碼(a)單臂抗體的輕鏈和重鏈組分，以及(b)Fc多肽。在一個實施方案中，單個多核苷酸編碼單臂抗體的輕鏈和Fe多肽組分，而分開的多核苷酸編碼重鏈多肽。在一個實施方案中，單個多核苷酸編碼單臂抗體的重鏈和Fe多肽組分，而分開的多核苷酸編碼單臂抗體的輕鏈組分。在一個實施方案中，由分開的多核苷酸分別編碼單臂抗體的輕鏈組分、單臂抗體的重鏈組分和Fe多肽。本文描述了異源多肽。在一些實施方案中，異源多肽是抗體。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它實施方案中,抗體是多克隆抗體。在一些實施方案中，抗體選自嵌合抗體、親和力成熟的抗體、人源化抗體和人抗體。在某些實施方案中，抗體是雙特異性抗體。在某些實施方案中,抗體是抗體片段。在一些實施方案中,抗體是單價抗體。在一些實施方案中，抗體是Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2或scFv。在一些實施方案中,抗體是包含F(xiàn)e區(qū)的單臂抗體(即，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)形成單個抗原結(jié)合臂)，其中Fe區(qū)包含第一和第二 Fe多肽，其中第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物形式存在，形成，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比,增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)。在一些實施方案中,抗體結(jié)合(在一些實施方案中,特異性結(jié)合)c_met。在一些實施方案中，抗c-met抗體包括(a)第一多肽,其包含具有如下序列的重鏈可變區(qū)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :43)，CHl序列和第一 Fe多肽；
(b)第二多肽,其包含具有如下序列的輕鏈可變區(qū)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO: 44) JPCLl 序列；以及(c)包含第二 Fe多肽的第三多肽,其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以復(fù)合物的形式存在，形成單個抗原結(jié)合臂，其中第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物的形式存在,并形成,與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)。在一些實施方案中，第一多肽包含圖7中描述的Fe序列(SEQ ID NO:68),第二多肽包含圖8中描述的Fe序列(SEQ ID NO: 47)。在一些實施方案中，第一多肽包含圖8中描述的Fe序列(SEQ ID NO: 47),第二多肽包含圖7中描述的Fe序列(SEQ ID NO:68)。在一些實施方案中，抗c-met抗體包括(a)包含重鏈可變區(qū)的第一多肽,所述多肽包含序列EVQLVESGGGLVQPCiGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSKSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKKQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO 45)；(b)包含輕鏈可變區(qū)的第二多肽,所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTrTCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:46);以及包含F(xiàn)e多肽的第三多肽，所述多肽包含序列0Κ Τ0ΡΡ0ΡΑΡΕΙ .6(；Ρ8νΡ ΡΡΡΚΡΚ )ΤΙ,ΜΙ8Κ ΡΕνΤ0ννν )ν8ΗΕΙ)ΡΕνΚΡΝ￥Υν )6νΕ\ ΝΑΚΤKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :47)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以復(fù)合物的形式存在,形成單個抗原結(jié)合臂，其中第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物的形式存在,并形成,與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比，增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)?！?br> 在一個實施方案中,抗c-met抗體包含重鏈可變區(qū),所述重鏈可變區(qū)包含圖7中描述的 CDR1-HC、CDR2-HC 和 CDR3-HC 序列(SEQ ID NO: 52-53 和 66)之一或多個。在一些實施方案中，抗體包含輕鏈可變區(qū),所述輕鏈可變區(qū)包含圖7中描述的CDR1-LC、CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NOs:49-51)之一或多個。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包含圖7中描述的 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC 和 FR4-HC 序列(SEQ ID NOs: 62-65)。在一些實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含圖7中描述的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和FM-LC序列(SEQ ID N():57-60)。在一些實施方案中，抗體包括至少一個促進抗體片段中Fe序列的異源二聚化而將同源二聚化降到最低的特性。這樣的特性提高通過如本文中描述的本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白群體的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個實施方案中，第一 Fe多肽和第二 Fe多肽在界面相遇/相互作用。在一些其中第一和第二 Fe多肽在界面相遇的實施方案中，第二 Fe多肽(序列)的界面包含突起(也稱為“結(jié)”(knob))，其可位于第一 Fe多肽(序列)的界面的腔(也稱為“洞”)中。在一個實施方案中，抗體包含F(xiàn)e突變,構(gòu)成如W02005/063816中描述的“結(jié)”和“洞”。例如，洞突變可以是Fe多肽中的T366A、L368A和/或Y407V之一或多個,結(jié)突變可以是T366W。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的變體TIR和信號序列的方法。應(yīng)理解的是，本文中公開的任何變體TIR、信號序列和多核苷酸都適用于例如本文中公開的本發(fā)明的方法中。在另外的方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的異源多肽的方法。例如，本發(fā)明提供了制備異源多肽(例如抗體,其如在本文中所定義的包括全長抗體及其片段)的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含本發(fā)明的多核苷酸(例如，包含翻譯起始區(qū)的多核苷酸)的宿主細(xì)胞，以表達多核苷酸,借以在宿主細(xì)胞(例如,原核宿主細(xì)胞)中表達所述多核苷酸，將異源多肽折疊形成具生物學(xué)活性的異源多肽。在涉及表達抗體的實施方案中，當(dāng)所述多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達時,輕鏈和重鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。在一些實施方案中，方法還包括從 宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收異源多肽(例如，抗體)。在一些實施方案中，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中回收異源多肽。在一些實施方案中，方法還包括將所回收的異源多肽(例如，抗體)與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或載體組合，以制備包含異源多肽(例如，抗體)的藥學(xué)制劑。在一個方面,本發(fā)明提供了從細(xì)胞中分泌目的異源多肽的方法,所述方法包括培養(yǎng)包含本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞，以表達多核苷酸和分泌異源多肽。在一個方面，本發(fā)明提供了從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(translocate)目的異源多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)包含本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞，以表達多核苷酸和轉(zhuǎn)移異源多肽。在另一個方面,本發(fā)明提供了優(yōu)化細(xì)胞中目的異源多肽分泌的方法,包括比較在一組翻譯起始區(qū)的多核苷酸變體控制下的多肽的表達水平，其中該組變體代表一系列翻譯強度，以及確定用于產(chǎn)生成熟多肽的最優(yōu)翻譯強度。在一些實施方案中，最優(yōu)翻譯強度低于野生型翻譯起始區(qū)的翻譯強度。在一些實施方案中,最優(yōu)翻譯強度高于野生型翻譯起始區(qū)的翻譯強度。在一些實施方案中,變體包含分泌信號序列的多核苷酸變體。在^-些實施方案中，變體分泌信號序列是sec途徑信號序列和/或SRP途徑信號序列。在一些實施方案中，變體分泌信號序列是PhoA、MalE、DsbA或STII變體信號序列。在一些實施方案中，變體是表3中所示的一個或多個變體。在一些實施方案中，變體包含SEQ ID Nos I-14、36-39、41-42之一的序列。在一個方面，本發(fā)明提供了通過如本文中描述的本發(fā)明的方法獲得的異源多肽。在一些實施方案中，異源多肽是抗體。在一個方面,本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的異源多肽的用途,用于制備治療和/或預(yù)防疾病的藥物,所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病、和/或免疫(例如自身免疫)疾病等。異源多肽可以是本文中描述的任何形式，包括抗體、抗體片段、多肽(例如,寡肽)，或它們的組合。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的多核苷酸在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病和/或免疫(例如自身免疫)疾病等。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的表達載體在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病和/或免疫(例如自身免疫)疾病等。在一個方面,本發(fā)明提供了本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病和/或免疫(例如自身免疫)疾病等。在一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的制品在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病、免疫(例如自身免疫)疾病和/或血管發(fā)生相關(guān)疾病(傷口愈合)等。在^-個方面,本發(fā)明提供了本發(fā)明的試劑盒在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病例如癌癥、腫瘤、細(xì)胞增生性疾病和/或免疫(例如自身免疫)疾病
絕·寸ο


圖I :所示信號肽穿過細(xì)菌內(nèi)膜的轉(zhuǎn)移。麥芽糖結(jié)合周質(zhì)蛋白(MalE)和堿性磷酸酶(PhoA)信號肽借助分子馬達(molecular motor) SecA,以翻譯后的方式指導(dǎo)從細(xì)胞質(zhì)向周質(zhì)的轉(zhuǎn)移。熱穩(wěn)定腸毒素II(StII)和巰基-二硫鍵互換蛋白(DsbA)信號肽借助信號識另ij顆粒(SRP),以共翻譯的方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)移。圖2 :信號肽變體的相對轉(zhuǎn)移起始區(qū)強度。攜帶載體的27C7細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)堿性磷酸酶活性，所述載體具有在STII、MalE、PhoA或DsbA信號肽和大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)基因的成熟結(jié)構(gòu)域之間的融合。每個條代表與發(fā)色底物PNPP —起孵育的單個培養(yǎng)物，酶活性測定為培養(yǎng)物在410nm處的吸收值減去攜帶空載體(pBR322)的培養(yǎng)物的吸收值。相對于攜帶質(zhì)粒pPho41的27C7細(xì)胞的基礎(chǔ)活性，將活性標(biāo)準(zhǔn)化。白色條代表在相對于起始密碼子的第一堿基對而言的-9位上具有BssHII限制性位點的信號肽變體。灰色或條紋條分別代表在-9位上具有MluI或XbaI:位點。所有的活性是7至1.0個重復(fù)實驗的平均值。誤差線報告為95%置信限的平均值不確定性。相鄰條之間相對TIR強度的差異均是統(tǒng)計上顯著的(P 0. 001)。這些條代表克隆SHI. 2、SH2. 4USH3. 38、SH4. 60、SH5. 34、SH6. 52、SH8. 36、SLL 2、SL2. 74、SL3. 72、Mill. 92、MH2. 100、MLl. 97、ML2. 123、MXl. wt、MX2. 15、:Μ:Χ3· 12、:Μ:Χ5· 37、:Μ:Χ6· 4、:ΜΧ7· 25、:Μ:Χ8· 13、ΜΧ11· 34,PHI. 70、ΡΗ2· 64、ΡΗ3. wt、PH4. 67、ΡΗ5. 71、ΡΗ6· 77、PLL 104、ΡΧ2. 41、ΡΧ3. wt、PX5. 53、ΡΧ6· 15、ΡΧ8· 24、ΡΧ10. 23、DHl. 48、DH2.wt、DH3. 79、DH7. 72、DLL wt、DL2. 3、DL3. 37 (按順序從左至右)。圖3 :利用重鏈信號肽操作，監(jiān)測不同種類的抗體的組裝。將64B4細(xì)胞在25mL的C. R. A. P.憐fe限制性培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，制備可溶性級分以及總蛋曰沉淀,通過光密度(OD)進行標(biāo)準(zhǔn)化，用于SDS-PAGE分析。(A)通過SDS-PAGE凝膠電泳分離來自攜帶質(zhì)粒 pBR-SS-5D5-l. I (SS I. I)、pBR-MS-5D5_l· I (MS I. I)、pBR-DS-5D5_l· I (DS I. I)或pBR-PS-5D5-l. I (PSI. I)的細(xì)胞的樣品(以kDa表不的質(zhì)量標(biāo)不在左側(cè))，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，以α-Fe特異性抗體作為探針檢測包含重鏈的抗體物的存在?？扇苄詷悠?頂部印跡)包括經(jīng)推定的條帶,對應(yīng)于(從頂部到底部)全長抗體、重鏈-重鏈-輕鏈(HHL)、重鏈-輕鏈(HL)或游離重鏈(重鏈單體)。以O(shè). 2Μ DTT還原經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的總蛋白樣品(底部印跡)，以破壞二硫鍵結(jié)構(gòu)，每條泳道都遷移為表觀質(zhì)量約49kDa的單個條帶。(B)將來自(A)的樣品在分開的SDS-PAGE凝膠上進行電泳(以kDa表示的質(zhì)量標(biāo)示在右側(cè))，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素—t，以《-K Lc特異性抗體作為探針檢測包含輕鏈的復(fù)合物。可溶性樣品(頂部印跡)包括經(jīng)推定的條帶，對應(yīng)于(從頂部到底部)全長抗體、IIL、輕鏈-輕鏈(LL) 二聚體或游離輕鏈(輕鏈單體)。以O(shè). 2Μ DTT還原經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的總蛋白樣品(底部印跡)，每條泳道遷移為表觀質(zhì)量約25kDa的單個條帶?？s寫S=信號序列STII, M=信號序列MalE,D=信號序列DsbA5P =信號序列PhoA。XX#. # (例如DSl. I)指在實驗中使用的重鏈信號序列、輕鏈信號序列、重鏈TIR、輕鏈TIR0圖4 :利用輕鏈信號肽操作，監(jiān)測不同種類抗體的組裝。將64B4細(xì)胞在25mL的C. R. A. P.磷酸限制性培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時,制備可溶性級分以及總蛋白沉淀，通過光密度(OD)進行標(biāo)準(zhǔn)化，用于SDS-PAGE分析。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離來自攜帶質(zhì)粒 pBR-DS-5D5-1. I (OSI. I)、pBR-DS-5D5-1. 2 (DSL 2)、pBR-DM-5D5-1. I (DM1. I)、pBR-DM-5D5-1. 2 (DM1. 2)、pBR-DD-5D5-1· I (DDL I)、pBR-DD-5D 5-1· 2 (I)Dl. 2)、pBR-DP-505-1. I (DPI. I)或pBR-DP_5D5-l· 2的細(xì)胞的樣品(以kDa表示的質(zhì)量標(biāo)示在左側(cè))，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，如沿圖像的右側(cè)所示，分別以a -Fe或α -K Lc特異性抗體作為探針檢測包含重鏈或輕鏈的抗體的存在?？扇苄詷悠?頂部印跡)包括經(jīng)推定的條帶，對應(yīng)于(從頂部到底部)全長抗體、重鏈-重鏈-輕鏈(HHL)、重鏈—輕鏈(HL) 二聚體或游離重鏈。以O(shè). 2Μ DTT還原經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的總蛋白樣品(中部印跡、底部)，以破壞二硫鍵結(jié)構(gòu)，當(dāng)以α-Fe抗體作為探針進行檢測時,每條泳道遷移為表觀質(zhì)量約49kDa的單個條帶。當(dāng)以α-κ Lc特異性抗體作為探針進行檢測時,所有泳道遷移為表觀質(zhì)量約25kDa的單條帶，或約27kDa和約25kDa的雙條帶?？s寫S=信號序列STILM=信號序列MaIE,!)=信號序列DsbA, P=信號序列PhoA。XX#.#(例如DSl. I)指在實驗中使用的重鏈信號序列、輕鏈信號序列、重鏈TIR、輕鏈TIR。圖5 :從10-L的發(fā)酵，監(jiān)測抗體物隨著時間的組裝。將64B4細(xì)胞在10-L的發(fā)酵中培養(yǎng)3天至高細(xì)胞密度，以規(guī)律的時間間隔取樣(每條泳道上的取樣時間以接種后的小時表示)，從中制備可溶性級分以及總蛋白沉淀,通過光密度(OD)進行標(biāo)準(zhǔn)化,用于SDS-PAGE分析。通過SDS-PAGE凝膠電泳分離來自攜帶質(zhì)粒pBR-SS-5D5-l. I和共表達的帶伴侶的質(zhì)粒 pJJ247(SSl. 1+ 伴侶)、pBR-DD-5D5-1. I 和 pJJ247(DDl. 1+ 伴侶)、pBR-DS-5D5-1. I和 pJJ247 (DMl· 1+ 伴侶)、或 pBR-DP-5D5-1. I 和 pjj247 (DPI. 1+ 伴侶)的細(xì)胞的樣品(以kDa表示的質(zhì)量標(biāo)示在左側(cè))’轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上,如沿圖像的右側(cè)所示,分別以α -Fe或α-κ Lc特異性抗體作為探針檢測包含重鏈或輕鏈的抗體物的存在?？扇苄詷悠?頂部印跡)包括經(jīng)推定的條帶,對應(yīng)于(從頂部到底部)全長抗體、重鏈-重鏈-輕鏈(IIHL)、重鏈-輕鏈(HL) 二聚體、輕鏈-輕鏈(LL) 二聚體或游離輕鏈。以O(shè). 2Μ DTT還原經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的總蛋白樣品(中部印跡、底部)，以破壞二硫鍵結(jié)構(gòu)，當(dāng)以α-Fe抗體作為探針進行檢測時，每條泳道遷移為表觀質(zhì)量約49kDa的單個條帶。當(dāng)以α-κ Lc特異性抗體作為探針進行檢測時,所有泳道遷移為表觀質(zhì)量約25kDa的單條帶?？s寫S=信號序列STII，M=信號序列MalE, D=信號序列DsbA, P=信號序列PhoA0 XX#. # (例如DSl. I)指在實驗中使用的重鏈信號序列、輕鏈信號序列、重鏈TIR、輕鏈TIR。圖6 :在誘導(dǎo)條件F的成熟PhoA的積累。將27C7細(xì)胞在25mL的C. R. A. P.磷酸限制性培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時,通過光密度(OD)標(biāo)準(zhǔn)化可溶性級分，預(yù)備用于SDS-PAGE分析。將大腸桿菌PhoA基因的成熟區(qū)與所示的DsbA或STII (底部)TIR變體(頂部)融合。通過考馬斯亮藍染色顯現(xiàn)凝膠上蛋白質(zhì)的存在。對應(yīng)于PhoA(Sa)的成熟區(qū)的推定條帶出現(xiàn)在質(zhì)量為約47kDa處(質(zhì)量標(biāo)示在左側(cè))。圖7 :描述了 MetMAb (0A5D5v2)的構(gòu)架區(qū)(FR)、CDR、第一恒定區(qū)(CL 或 CHl)和 Fe區(qū)(Fe)的氨基酸序列。圖公開了按出現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NOS 57_60、49_51和61的輕鏈序列，和按出現(xiàn)的順序分別為SEQ ID NOS 62-65、52-53和66-68所示的重鏈序列。所描述的Fe序列包含如WO 2005/063816中描述的“洞”(腔)突變T366S、L368A和Y407V。圖8 :描述了 Fe多肽(SEQ ID NO: 47)的序列,所述Fe多肽包含如緊)2005/068816中描述的“結(jié)”(突起)突變T366W。在一個實施方案中,包含該序列的Fe多肽與包含圖7的Fe序列的Fe多肽形成復(fù)合物，以產(chǎn)生Fe區(qū)。 發(fā)明描述常規(guī)技術(shù)本文中描述或參考引用的技術(shù)和程序為本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍充分理解,并通過使用常規(guī)方法而普遍使用,例如描述于如下文獻中的廣泛使用的方法=Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第三版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory 出版社，Cold Spring Harbor, N. Y. ；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBI0L0GY(F. EAusubel 等編輯(2003)) ；METHODS IN ENZYM0L0GY 系列(Academic 出版社公司)PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 編輯(1995)) ;IIarlow 和 Lane 編輯(I9SS) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUALjPANIMAL CELLCULTURE (R. I. Freshney 編輯(1987))。定義如本文中使用的術(shù)語“載體”，旨在指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)?！?，其指環(huán)形雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片段可以連接到其中。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們所引入到的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在被引入到宿主細(xì)胞中時，可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們有效連接的基因的表達。這樣的載體在本文中被稱為“重組表達載體”(或,簡單地，“重組載體”)。-一般，在重組DNA技術(shù)中使用的表達載體通常是以質(zhì)粒的形式存在。在本說明書中，由于質(zhì)粒是載體的最常用的形式，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用。如本文中使用的，術(shù)語“順反子”旨在指遺傳元件,其一般地等同于包含編碼多肽鏈的核苷酸序列和鄰近控制區(qū)域的翻譯單元?！班徑刂茀^(qū)域”包括,例如翻譯起始區(qū)(TIR ;如下文中定義的)和終止區(qū)域?！岸囗樂醋印北磉_載體指包含和表達在單個啟動子調(diào)節(jié)控制下的多個順反子的單個載體。多順反子載體的一個常見例子是“雙順反子”載體，其包含和表達在一個啟動子控制下的兩個不同多肽。當(dāng)雙順反子或多順反子載體表達時，多個基因首先被轉(zhuǎn)錄為單個轉(zhuǎn)錄單元，然后分開進行翻譯。根據(jù)本發(fā)明的“分順反子”(separate cistron)表達載體指包含至少兩個分開的啟動子-順反子對的單個載體，其中每個順反子各自在其自己的啟動子的控制下。當(dāng)分順反子表達載體表達時，不同基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程是分開的和獨立的。如本文中使用的，“翻譯起始區(qū)”或TIR或翻譯的起始區(qū)域或翻譯的起始序列指，提供目的基因的有效翻譯起始的核酸區(qū)域。通常，一個具體順反子中的TIR包括核糖體結(jié)合部位(RBS)和RBS的5’和3’序列。RBS定義為最低程度地包含Shine-Dalgarno區(qū)域和起始密碼子(AUG)。因此，TIR也可以包括待翻譯的核酸序列的至少一部分。優(yōu)選地,本發(fā)明的TIR包括編碼信號肽的分泌信號序列，所述分泌信號序列位于順反子中輕鏈和重鏈的編碼序列之前。TIR變體包括在TIR區(qū)域中改變了該TIR的特性，例如其下文中定義的翻譯強度，的序列變體(特別是取代)。優(yōu)選地，本發(fā)明的TIR變體在位于順反子中輕鏈或重鏈編碼序列之前的分泌信號序列的前2至約14個、優(yōu)選約4至12個、更優(yōu)選約6個密碼子中包含序列取代。如本文中使用的,術(shù)語“翻譯強度”是指,在一個對照系統(tǒng)中對分泌的多肽進行的度量,其中TIR的^-個或多個變體被用于指導(dǎo)多肽的分泌,并將結(jié)果與在相同培養(yǎng)和測定 條件下的野生型TIR或一些其它對照進行比較。不限于任何一個理論,如本文中使用的“翻譯強度”可以包括，例如對mRNA穩(wěn)定性、核糖體與核糖體結(jié)合部位結(jié)合的效率、和穿膜轉(zhuǎn)移方式的衡量?！胺置谛盘栃蛄小被颉靶盘栃蛄小敝妇幋a短信號肽的核酸序列,所述信號肽能夠用來指導(dǎo)新合成的目的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜，通常是原核生物的內(nèi)膜或內(nèi)膜和外膜兩者。由此，將目的蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白輕鏈或重鏈多肽分泌到原核宿主細(xì)胞的周質(zhì)中或培養(yǎng)基中。由分泌信號序列編碼的信號肽可以是宿主細(xì)胞內(nèi)源的，或它們可以是外源的,包括待表達多肽天然的信號肽。分泌信號序列^-般存在于待表達多肽的氨基末端，并通常在多肽的生物合成和從細(xì)胞質(zhì)分泌之間被酶促去除。因此，信號肽通常不存在于成熟的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中?！坝行нB接”指兩個或多個組分的并置,其中所述組分處于允許它們以其預(yù)期方式起作用的關(guān)系中。例如,如果啟動子以順式的方式起作用來控制或調(diào)節(jié)所連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄,則其與編碼序列有效連接。通常但不一定,“有效連接的”DNA序列是連續(xù)的，以及當(dāng)需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)或就分泌引導(dǎo)序列來說，是連續(xù)的和符合閱讀框的。然而，盡管有效連接的啟動子一般位于編碼序列的上游，其不必與編碼序列連續(xù)。有效連接的增強子可以位于編碼序列的上游、內(nèi)部或下游、以及在離啟動子很遠的位置。連接可以通過本領(lǐng)域已知的方法來實現(xiàn),例如使用PCR方法、通過退火、或通過在合適的限制性位點處進行連接。如果不存在合適的限制性位點，可以按照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭或銜接物。如本文中使用的調(diào)控元件”指以順式方式存在的、為編碼異源多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽所必需的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常包含待表達基因序列5’的啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止位點、和多腺苷酸化信號序列。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄起始位點”指構(gòu)建體中的核酸，其對應(yīng)于整合到初級轉(zhuǎn)錄本(即,mRNA前體)中的第一個核酸；轉(zhuǎn)錄起始位點可以與啟動子序列重疊?！皢幼印敝缚刂婆c其有效連接的基因或序列轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。啟動子包括用于RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號。所使用的啟動子將在旨在表達所選序列的宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中起作用。本領(lǐng)域熟知(并在例如GenBank等數(shù)據(jù)庫中標(biāo)識)大量的啟動子，包括來自多種不同來源的組成型、誘導(dǎo)型和阻遏型啟動子,它們可以作為克隆的多核苷酸或從克隆的多核苷酸(來自例如ATCC等保藏機構(gòu)以及其它商業(yè)或私人來源)中獲得。利用誘導(dǎo)型啟動子，啟動子的活性對信號作出反應(yīng)而增加或降低。如本文中使用的，術(shù)語“宿主細(xì)胞”(或“重組宿主細(xì)胞”)旨在指，已經(jīng)經(jīng)過遺傳改變、或能夠通過引入外源多核苷酸(例如重組質(zhì)?；蜉d體)來進行遺傳改變的細(xì)胞。應(yīng)理解的是,這樣的術(shù)語旨在不僅指特定的主題細(xì)胞,還指這樣的細(xì)胞的后代。因為在繼代中由于突變或環(huán)境影響而可能發(fā)生某些改變，事實上，這樣的后代可能與親本不相同，但其仍然包括在如本文中使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。“分離的”多肽(例如,抗體)是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中被鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染物組分是干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì),其可以包括酶、激素、以及其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽將被純化至(I)通過Lowry方法測量,大于95%重量的多肽，最優(yōu)選大于99%重量；(2)足以通過使用旋杯式序列分析儀獲得至少15個殘基的N末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度；或(3)通過在還原或非還原條件下的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、使用考馬斯亮藍或 優(yōu)選銀染、確定的同質(zhì)性。分離的多肽包括在重組細(xì)胞中的原位多肽，這是因為在重組細(xì)胞中多肽的天然環(huán)境的至少一個組分將不存在。然而，通常通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽?！胺蛛x的”核酸分子是從污染物核酸分子中鑒定和分離的核酸分子,其中在該核酸分子的天然來源中所述污染物核酸分子通常與該核酸分子相伴。分離的核酸分子可以以非其天然存在的形式、或在非其天然存在的環(huán)境中存在。因此，分離的核酸分子不同于其在天然細(xì)胞中時的核酸分子。然而，分尚的核酸分子可以包括包含在通常表達該核酸(例如，編碼核酸的抗體)的細(xì)胞中的核酸分子,在該細(xì)胞中，例如,核酸分子的染色體位置可以不同于天然細(xì)胞中的染色體位置。如在本文中可互換使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸的多聚體，其包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基，和/或它們的類似物,或任何能夠通過DNA或RNA聚合酶、或通過合成反應(yīng)整合到多聚體中的底物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在多聚體組裝之前或之后進行。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分打斷?？梢栽诤铣珊笤賹Χ嗪塑账徇M行修飾，例如與標(biāo)記物綴合。其它類型的修飾包括，例如加帽”(“caps”)；以類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸；核苷酸間的修飾，例如，具有不帶電荷的鍵(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、和具有帶電荷的鍵(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，包含懸垂部分，例如蛋白質(zhì)(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、Ply-L-賴氨酸等)，具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)，包含螯合劑(例如,金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等),包含烷化劑,具有經(jīng)修飾的鍵(例如，α端基異構(gòu)核酸等)；以及多核苷酸的未經(jīng)修飾的形式。此外，通常存在于糖中的任何羥基都可以被例如膦酸酯基團、磷酸基團取代，被標(biāo)準(zhǔn)保護基團保護,或被激活以制備與另外的核苷酸的其它連接,或可以與固體或半固體支持物綴合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或以胺或I至20個碳原子的有機封端基團部分進行替代。其它羥基也可以被衍生為標(biāo)準(zhǔn)保護基團。多核苷酸也可以包含在本領(lǐng)域通常所知的核糖體或脫氧核糖的類似物形式,包括，例如2’ -O-甲基-、2’ -O-烯丙基-、2’ -氟代-或2’ -疊氮基-核糖,碳環(huán)糖類似物，α端基異構(gòu)糖,差向異構(gòu)糖,例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物和基本核苷類似物，例如甲基核糖苷?？梢杂脗溥x連接基團替代一個或多個磷酸二酯鍵。這些備選連接基團包括在但不限于實施方案，其中磷酸被P(O)S( “硫代酯”)、P(S)S( “二硫代酯”)、(())NR2 ( “酰胺酯”)、P(0)R、P(0)0R’、C0 或 CH2( “亞甲基縮醛(formacetal)，，)替代,其中每個R或R’獨立地是H或被取代的或未取代的烷基(1-20C),所述烷基任選地包括醚(-0-)鍵、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。多核苷酸中不是所有的鍵都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。如本文中使用的，“寡核苷酸”一般指短的、通常是單鏈的、通常是合成的多核苷酸,其通常但不一定在長度上小于約200個核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”不互相排斥。上文對核苷酸的描述等同地和完全地適用于寡核苷酸。如本文中使用的，“多肽”一般指來自任何細(xì)胞來源、具有多于約10個氨基酸的肽
和蛋白質(zhì)。“異源”多肽是對所利用的宿主細(xì)胞而言外來的多肽，例如由大腸桿菌產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)。盡管異源多肽可以是原核的或真核的’優(yōu)選其是真核的,更優(yōu)選是哺乳動物的’最優(yōu)選人的。優(yōu)選地，其通過重組產(chǎn)生，或是重組多肽?！爱愒础倍嚯氖菍λ玫乃拗骷?xì)胞而言外來的多肽，例如由大腸桿菌產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)。盡管異源多肽可以是原核的或真核的，優(yōu)選其是真核的,更優(yōu)選是哺乳動物的,最優(yōu)選人的。優(yōu)選地,其通過重組產(chǎn)生,或是重組多肽。哺乳動物多肽的例子包括這樣的分子,例如腎素；生長激素，包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白抗胰蛋白酶J夷島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促血小板生成素；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子,例如VIIIC因子、IX因子、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白C ;心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)及其變體,例如Retevasetj^p tnkase ;鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β #[ErbB2結(jié)構(gòu)域的抗體,例如2C4(ff0 01/00245 ;雜交瘤ATCC HB-12697),其與ErbB2的胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域(例如，ErbB2的約第22位至約第584位殘基(含第22位和第584位殘基)的區(qū)域中任何一個或多個殘基)結(jié)合；腦啡肽；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶；Ι)ΝΑ酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)素-3、-4、-5或-6 (ΝΤ-3、NT-4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)，或神經(jīng)生長因子，例如NGF ;心肌營養(yǎng)素(心肌肥大因子)，例如心肌營養(yǎng)素-I (CH);血小板源生長因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長因子，例如aFGF和bFGF ;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),例如TGF-α和TGF-β ,包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4 或 TGF-5 ;胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-1 和 IGF-II) ；des (1-3) -IGF-I (腦IGF-I),胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19 ;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白0BMP);干擾素,例如干擾素- α、-β、和-Y ；血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA);集落刺激因子(CSFs),例如M-CSF,GM-CSF 和 G-CSF ;白細(xì)胞介素(ILs)，例如 IL-1 至 IL-10 ;抗 HER-2 抗體；Αρο2 配體；超氧化物歧化酶；Τ細(xì)胞受體；表面膜蛋白；促衰變因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；抗體；以及任何以上所列多肽的片段。本文中優(yōu)選的多肽包括人血清白蛋白(HSA) ；2C4 ;組織因子；抗組織因子；抗CD20 -M HER-2 ；heregulin ;抗 IgE ;抗 CDlla ;抗 CD18 ；VEGF 及其受體和抗體，例如 rhuFabV2和AVASTIN ;生長激素及其變體,例如hGH ;生長激素受體；生長激素釋放蛋白(GHKP)；LIV-I (EP I, 263，780) ;TRAIL ；腫瘤壞死因子(TNF)及其抗體；TNF受體和相關(guān)抗體；TNF-受體-IgG ；TNF受體相關(guān)因子(TRAFs)及其抑制劑；因子VIII ;因子VIII B結(jié)構(gòu)域；干擾素，例如干擾素-Y ;轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs) jWHTGF-P ;抗TGF，例如抗TGF-β ;活化素；抑制素；抗活化素；抗抑制素；組織纖溶酶原激活物及其變體,例如t-PA、RETEPLASE 和TNKase ;抗Fas抗體；Apo_2配體；Apo_2配體抑制劑；Apo_2受體;Apo_3 ;凋亡因子；Ced-4 ；DcR3 ;死亡受體和激動劑抗體(DR4、DR5);淋巴毒素(LT);催乳素；催乳素受體；S0B·蛋白；WISP(wnt誘導(dǎo)的分泌蛋白)；神經(jīng)毒素-3(NT-3);神經(jīng)生長因子(NGF)和抗NGF;DNA酶；肝炎抗原；單純皰疹抗原；瘦蛋白；胰島素樣生長因子(IGFs),例如IGF-1和IGF-2及其結(jié)合蛋白和受體,例如IGFBP-I至IGFBP-6 ;胰島素；成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs),例如FGF-17 ；Toll蛋白；ΤΙΕ配體；OT40和抗CD40 ;免疫粘附素；枯草桿菌蛋白酶；肝細(xì)胞生長因子(HGF);促血小板生成素(TPO);白細(xì)胞介素，例如IL-2、IL-12、IL-17、IL-22、IL-8、IL-9及其抗體；以及前列腺特異性癌抗原(PSCA)。特別優(yōu)選的多肽是重組多肽,更優(yōu)選抗體,其包括單克隆抗體和人源化抗體。這樣的抗體可以是全長抗體或抗體片段。更優(yōu)選地，這些抗體是人或人源化抗體。更優(yōu)選地，抗體是抗C-met、抗IgE、抗CD18、抗VEGF、抗組織因子、2C4、抗Her-2、抗CD20、抗CD40或抗CDlla抗體。涵蓋在多肽的定義中的抗體片段優(yōu)選包括輕鏈,更優(yōu)選K輕鏈。這樣的優(yōu)選片段包括,例如Fab、FaY , F(abi ) 2或F (ab' ) 2_亮氨酸拉鏈(LZ)融合體，以及單臂抗體。蛋白J頁“表達”指基因中編碼的 目息向 目使RNA(mRNA)和然后向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化?！懊庖呔Y合物”(可互換稱為“抗體-藥物綴合物”或“ADC”)意指和一個或多個細(xì)胞毒素劑綴合的抗體,所述細(xì)胞毒素劑例如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如,蛋白質(zhì)毒素，細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即，放射性綴合物)。“阻斷性”抗體或抗體“拮抗劑”是指，抑制或降低其結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性。在--些實施方案中，阻斷性抗體或拮抗劑抗體完全抑制了抗原的生物學(xué)活性。如本文中使用的,“激動劑抗體”是模擬目的多肽(例如，HGF)的至少一種功能活性的抗體?！敖Y(jié)合親和力”一般指分子(例如，抗體)的單個結(jié)合位點與其結(jié)合伙伴(例如，抗原)之間非共價相互作用的總計的強度。除非另有說明，如在本文中使用的結(jié)合親和力”指內(nèi)在的結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對(例如，抗體和抗原)成員之間1:1的相互作用。分子X對其伙伴Y的親和力一般可以通過解離常數(shù)(Kd)來表示。理想地，Kd為IxlO'lxlO 8、5Χ1(Γ8、1Χ1(Γ9、3Χ1(Γ9、5Χ1(Γ9或甚至1x10,或更強?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的常見方法,包括本文中描述的方法，來測量親和力。低親和力抗體一般結(jié)合抗原較慢并趨向容易解離,而高親和力抗體一般結(jié)合抗原較快并趨向更久地保持結(jié)合。本領(lǐng)域已知多種測量結(jié)合親和力的方法，其任何一種都可以用于本發(fā)明目的。下面描述了特定的舉例說明性實施方案。
在一個實施方案中，以目的抗體的Fab形式及其抗原，通過放射性標(biāo)記的抗原結(jié)合測定試驗(RIA)，測量根據(jù)本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”，如下面試驗所描述的通過在存在滴定系列的未標(biāo)記抗原時，以最低濃度的(125I)-標(biāo)記的抗原平衡Fab,然后以抗Fab抗體包被的平板捕獲結(jié)合的抗原，測量Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen等，(1999)J. Mol. Biol. 293:865-881)。為了建立用于測定試驗的條件，以于50mM碳酸鈉(ρΗ9· 6)中的5 μ g/ml的捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后以于PBS中的2%(wyV)的牛血清白蛋白，在室溫(約23 )封閉2至5小時。在非吸附性平板(Nunc#269620)上，將IOOpM或26p:M:[125I]-抗原與目的Fab (例如，與評估抗VEGF抗體相符，F(xiàn)ab-12, Presta 等，(1997)Cancer Res. 57:4593-4599 中)的系列稀釋液混合。然后將目的Fab孵育過夜；然而,可以使孵育持續(xù)更長時間(例如,65小時)，以保證達到了平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移到捕獲平板上，在室溫下孵育(例如，I小時)。然后，去掉溶液，以于PBS中的O. 1%吐溫20洗滌平板8次。平板干燥后，每孔加入150 μ I的閃爍劑(MicroScint-20; Packard),在 Topcount Y 計數(shù)器(Packard)上對平板計數(shù) 10 分鐘。對于每個Fab，選擇給出小于或等于20%最大結(jié)合的濃度，用于競爭性結(jié)合測定。根據(jù)另一個 實施方案,通過使用表面等離子共振測定,測量Kd或Kd值,該測定可以使用BIAcore -2000或 BIAcore -3000 (BIAcore 公司，Piscataway, NJ),在 25°C下，用固定化抗原 CM5 芯片，以約10個響應(yīng)單位(RU)進行。簡言之，以N-乙基-N’ -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),按照供應(yīng)商的操作說明，活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5, BIAcore公司)。以IOmM乙酸鈉(pH 4. 8)將抗原稀釋至5 μ g/ml (約O. 2 μ Μ)，然后以5 μ I/分鐘的流速注入，以實現(xiàn)偶聯(lián)蛋白質(zhì)達到約10個響應(yīng)單位(RU)。在注入抗原后,注入IM乙醇胺來封閉未反應(yīng)的基團。為了進行動力學(xué)測量,將Fab的2倍系列稀釋液(O. 78ηΜ至500ηΜ),在含O. 05%吐溫20的PBS (PBST)中，于25°C以約25 μ I/分鐘的流速注入。在一些實施方案中，以下更改用于表面等離子共振測定方法將抗體固定到CM5生物傳感器芯片上至達到約400R[j,為了進行動力學(xué)測量,將目標(biāo)蛋白的2倍系列稀釋液在TOST緩沖液中于25V以約30 μ I/分鐘的流速注入。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，使用簡單一對一 Langmuir結(jié)合模型(BIAcore評估軟件,第3. 2版)計算結(jié)合速率(kj和解離速率(U。平衡解離常數(shù)(Kd)計算為比率km/k-見例如，Chen, Y.等，(I 999) J. Mo I. B i ο L 293:865-881。如果通過表面等離子共振測定的結(jié)合速率超過IO6MhS-1,則使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率,該技術(shù)在分光光度計,例如帶停流裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌紅色杯的8000-系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中，在存在遞增濃度的抗原時,測量于PBS (pH 7. 2)中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C的突光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm，16nm帶通)的增加或降低。根據(jù)本發(fā)明的“結(jié)合速率”或“結(jié)合的速率”或“kon”也可以用....t述同樣的表面等離子共振技術(shù)進行測定，所述測定使用BIAcore -2000或BIAcore1M-3000 (BIAcore公司，Piscataway, NJ)，在25°C，用固定的抗原CM5芯片，以約10個響應(yīng)單位(RU)進行。簡言之，以N-乙基-N’ -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，按照供應(yīng)商的操作說明，活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片(CM5，BIAcore公司)。以IOmM乙酸鈉(pH 4. 8)將抗原稀釋至5 μ g/ml (約O. 2 μ Μ),然后以5 μ I/分鐘的流速注入，以實現(xiàn)偶聯(lián)蛋白質(zhì)達到約10個響應(yīng)單位(RU)。在注入抗原后,注入IM乙醇胺來封閉未反應(yīng)的基團。為了進行動力學(xué)測量，將Fab的2倍系列稀釋液(O. 78nM至500nM),在含O. 05%吐溫20的PBS (PBST)中，于25°C以約25 μ I/分鐘的流速注入。在一些實施方案中，以下更改用于表面等離子共振測定方法將抗體固定到CM5生物傳感器芯片上至達到約400RU,為了進行動力學(xué)測量,將目標(biāo)蛋白的2倍系列稀釋液在PBST緩沖液中于25°C以約30 μ I/分鐘的流速注入。通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖，使用簡單一對一 Langmuir結(jié)合模型(BIAcore評估軟件，第3. 2版)計算結(jié)合速率(kj和解離速率(kf)。平衡解離常數(shù)(Kd)計算為比率見例如，Chen, Y.等，(1999) JJoL Biol. 293:865-881。如果通過表面等離子共振測定的結(jié)合速率超過IO6M-1S-1,則優(yōu)選使用熒光淬滅技術(shù)來測定結(jié)合速率,該技術(shù)在分光光度計,例 如帶停流裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌紅色杯的8000-系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中，在存在遞增濃度的抗原時，測量于PBS (pH 7. 2)中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25° C的熒光發(fā)射強度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的增加或降低?！奥懵兜目贵w”是沒有與異源分子(例如細(xì)胞毒素部分或放射性標(biāo)記)綴合的抗體。具有指定抗體的“生物學(xué)特征”的抗體，是擁有該指定抗體的一個或多個生物學(xué)特征的抗體，其中所述生物學(xué)特征使所述指定抗體與結(jié)合同樣抗原的其它抗體區(qū)分開來。為了篩選與目的抗體所結(jié)合的抗原上的表位結(jié)合的抗體,可以進行例如《抗體，實驗手冊》(Antibodies, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow和David Lane編輯(1.988)中描述的常規(guī)交叉封閉測定。為了增加包含本發(fā)明的氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期,可以將補救受體結(jié)合表位(salvage receptor binding epitope)附到抗體(特別是抗體片段)上，如例如美國專利5，739，277中描述的。例如，可以將編碼補救受體結(jié)合表位的核酸分子在閱讀框內(nèi)與編碼本發(fā)明的多肽序列的核酸連接，由此該改造的核酸分子表達的融合蛋白包含補救受體結(jié)合表位和本發(fā)明的多肽序列。如本文中使用的補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如，gGpIgG2、IgG；^ IgG4)的Fe區(qū)中負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位(例如Ghetie等，Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000),表I)。在其Fe區(qū)包含取代和具有增加的血清半衰期的抗體也描述于 W000/42072，WO 02/060919; Shields 等，j. BioL Chera. 276:6591-6604(2001) ;Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216(2004))中。在另一個實施方案中，也可以例如通過連接其它的多肽序列來增加血清半衰期。例如，可以在可用于本發(fā)明方法的抗體或其它多肽上連接與FcRn受體結(jié)合的血清白蛋白或血清白蛋白部分、或連接血清白蛋白結(jié)合肽以使血清白蛋白與抗體或多肽結(jié)合,例如W001/45746中公開的多肽序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，待連接的血清白蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:48)。在另一個實施方案中，通過這些方法增加了 Fab的半衰期。關(guān)于血清白蛋白結(jié)合肽的序列，也見 Dennis 等，· J. Biol. Chem. 277:35035-35043(2002)?！捌巍币庵付嚯幕蚝怂岱肿拥囊徊糠?其優(yōu)選包含參照核酸分子或多肽全長的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更長。片段可以包含 10、20、30、40、50、60、70、80、90、或 100、200、300、400、500、600 或更多個核苷酸，或 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200 或更多個氨基酸。
術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”可以從最廣泛意義上互換使用，其包括單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要其表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，和也可以包括某些抗體片段(如在本文中更詳細(xì)地描述的)。抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的抗體。術(shù)語“可變的”指,可變區(qū)的某些部分在抗體之間在序列上廣泛不同，這些部分在每個特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性中使用。然而，可變性在抗體的整個可變區(qū)中不是均勻分布的。其集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱為互補決定區(qū)(CDRs)或超變區(qū)的片段中。可變區(qū)中較為高度保守的部分稱為構(gòu)架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR區(qū),其一般采取β折疊構(gòu)象，通過3個CDRs連接,該CDRs形成環(huán)連接,在某些情況下組成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。通過FR區(qū)，每條鏈中的⑶Rs、以及與來自另一鏈的⑶Rs、緊靠在一起，導(dǎo)致形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5版，National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出各種效應(yīng)子功能，例如抗體依賴性細(xì)胞毒性中抗體的參與。 抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化,產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段,稱為“Fab”片段,每個片段具有單個抗原結(jié)合位點；以及剩余的“Fe”片段，其名稱反映了其容易結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段,所述片段具有兩個抗原結(jié)合位點，并仍然具有交聯(lián)抗原的能力。“Fv”是最小抗體片段，其包含完全的抗原識別和結(jié)合位點。在兩條鏈的Fv種類中，該區(qū)域由緊密地、非共價結(jié)合的一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單條鏈的Fv種類中r-條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)可以通過柔性肽接頭共價連接，以使輕鏈和重鏈可以在類似于兩條鏈的Fv種類的“二聚體”結(jié)構(gòu)中結(jié)合。正是在這種構(gòu)象中，每個可變區(qū)的3個CDRs相互作用，在VH-VL 二聚體的表面上界定抗原結(jié)合位點。6個CDRs共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使單個可變區(qū)(或Fv的一半，其僅包含3個對抗原特異的CDRs)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管其親和力比完整的結(jié)合位點低。Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHl)。Fab’片段不同于Fab片段，差異在于其在重鏈CHl區(qū)的羧基端添加了幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對Fab’的命名，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶游離的巰基基團。F(ab’)2抗體片段起初作為一對Fab’片段產(chǎn)生,它們之間具有鉸鏈半胱氨酸。也已知抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。基于抗體恒定區(qū)的氨基酸序列，可以將來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”分為兩個顯著不同的類型,稱為K和λ。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列,可以將免疫球蛋白分為不同的類別。有5個主要類別的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,它們其中幾個可以被進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1UgG2UgG3UgG4UgA1和IgA2。對應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y和μ。已公知不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象?！翱贵w片段”包含完整抗體的僅^-部分，其中該部分優(yōu)選保留了至少一個,優(yōu)選大多數(shù)或所有，通常與該部分存在于完整抗體中時相關(guān)的功能?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(aiy )2和Fv片段；雙抗體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。在一個實施方案中,抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點，由此保留了結(jié)合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)e區(qū)的抗體片段，保留了至少一個通常與該Fe區(qū)存在于完整抗體中時相關(guān)的生物學(xué)功能,例如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)節(jié)、ADCC功能和補體結(jié)合。在一個實施方案中，抗體片段是單價抗體，其具有與完整抗體基本相似的體內(nèi)半衰期。這樣的抗體片段可以包含與Fe序列連接的一個抗原結(jié)合臂,所述Fe序列能夠賦予該片段體內(nèi)穩(wěn)定性。當(dāng)在本文中使用時,術(shù)語“超變區(qū)”、“HVR”或“IIV”指抗體可變區(qū)的區(qū)域，其在序列上是超變的和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)。通常,抗體包含6個超變區(qū)；3個在VH(H1、H2、H3)中，3個在VL(L1、L2、L3)中。有多種超變區(qū)劃界在使用中，并涵蓋在本發(fā)明中。Kabat互補決定區(qū)(⑶Rs)基于序列可變性，是最普遍使用的(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第 5 片反，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 則涉及結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia 和 Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917(1987))。AbM超變區(qū)是Kabat CDRs和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折中，其被用于Oxford Molecular’s AbM抗體建模軟件?！敖佑|”超變區(qū)以可得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)。來自這些超變區(qū)之每個的殘基注解如下。
環(huán),Kabat AbM Chofhia 接觸
LI L24-L34 L24-L34 L26-L32L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96L89-L96 Hl H31-H35B H20-1I35!·} i 120-1132 Π30-Η35Β (Kabat 編號)
HI H31-H35 H26-H35 H26-H32H30-H35 (Chothia:編號)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101H93-H101超變區(qū)可以包含如下“延伸的超變區(qū)” VL中的24-36或24-34 (LI)、46-56或50-56(L2)和 89-97(L3) ；VH 中的 26-35 (Hl)、50-65 或 49-65(112)和 93-102、94-102 或95-102(H3)。針對這些定義之每一個，這些可變區(qū)殘基按照Kabat等同上引文進行編號?！皹?gòu)架”或“FR”殘基是除了如本文中定義的超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。非人(例如，鼠)抗體的“人源化”形式是包含來自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的超變區(qū)的殘基被來自例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長目動物等非人物種(供體抗體)的具有期望的特異性、親和力和能力的超變區(qū)的殘基取代。在某些情況下,人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包含受體抗體或供體抗體中沒有的殘基。進行這些改變以進一步完善抗體的性能。通常,人源化抗體將包含至少一個，典型地兩個，可變區(qū)的基本____t所有，其中所有或基本上所有超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的超變環(huán),所有或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。人源化抗體可選地也將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)(典型地人免疫球蛋白恒定區(qū))的至少一部分。更多詳細(xì)信息見 Jones 等，Nature 321:522-525 (1986);Riechmann 等,Nature 332:323-329(1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。也見本文中引用的下列綜述文章和參考文獻Vaswani 和 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol. 1:105-115(1998);Harri s, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle 和 Gross, Curr.Op.Biotech. 5:428-433(1994)?！扒逗稀笨贵w(免疫球蛋白)具有重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與來自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這樣的抗體的 片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利號4, 816, 567;和Morrison等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984))。如本文中使用的人源化抗體是嵌合抗體的子集。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL區(qū)，其中這些區(qū)域存在于單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含VH和VL區(qū)之間的多肽接頭,所述多肽接頭使scFv形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述,見Pluckthun,于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer-Verlag, NewYork,第 269-315 頁(1994)中?！翱乖笔穷A(yù)先確定的抗原,抗體可以選擇性與其結(jié)合。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。優(yōu)選地，靶抗原是多肽。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小的抗體片段,該片段包含于相同多肽鏈中彼此連接的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH) (VH-VL)。通過使用太短而不允許相同鏈上的兩個區(qū)域發(fā)生配對的接頭，這些區(qū)域被迫與另一條鏈的互補區(qū)配對,產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更詳細(xì)地描述于例如EP 404, 097; WO 93/11161;和Hollinger等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中?！叭丝贵w”是擁有對應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體,和/或使用如本文中公開的用于制備人抗體的任何技術(shù)已經(jīng)制備的抗體。人抗體的該定義特別地不包括包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體?！坝H和力成熟的”抗體是在其一個或多個CDRs中具有一個或多個改變的抗體，所述改變導(dǎo)致與不擁有這些改變的親本抗體相比，該抗體對抗原的親和力提高。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將對靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體通過本領(lǐng)域已知的程序產(chǎn)生。Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通過VH和VL區(qū)改組進行的親和力成熟。Barbas 等,Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994) ; Schier等,Gene 169:147-1.55 (1995) ; Yelton 等，J. Iramunol. 1.55:1994-2004 (1995) ; Jackson等，J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995);和 Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)描述了 CDR和/或構(gòu)架殘基的隨機誘變。“Fe受體”或“FcR”描述與抗體的Fe區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外,優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR( Y受體)，其包括受體FcyRI, FcyRII和FcyRIII亞類，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接的形式。FcyRII受體包括Fe Y RIIA (“激活性受體”)和Fe yRIIB(“抑制性受體”)，它們具有類似的氨基酸序列，主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上不同。激活性受體Fe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含基于免疫受體酪氨酸的
抑制基序(ΓΠΜ)。(見綜述M. in DaerO 11, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1.997)) FcRs綜述于 Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991) ; Capel 等，Immunomethods4:25-34(1994);和 de Haas 等，J. Lab. Cl in. Med. 126:330-41 (1995)中。其它 FcRs,包括那些今后將被鑒定出的FcRs,均被本文中的術(shù)語“FcR”涵蓋。該術(shù)語也包括新生兒受體FcRn,其負(fù)責(zé)將母親的IgGs轉(zhuǎn)移到胎兒(Guyer等，J. Immunol. 117:587 (1976)和Kim等，J.Immunol. 24:249 (1994)),并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。WO 00/42072 (Presta)描述了具有與FcRs提高的和降低的結(jié)合力的抗體變體。通過引用的方式特地將該專利公布的內(nèi)容并入本文。也見 Shields 等，J. Biol. Chem. 9 (2) :6591-6604(2001)。
已知測量與FcRn結(jié)合的方法(見例如，Ghetie 1997，Hinton 2004)?？梢岳缭诒磉_人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或在以Fe變體多肽給藥的靈長目動物中，測定體內(nèi)與人FcRn的結(jié)合以及人FcRn高親和性結(jié)合多肽的血清半衰期。具有改變的Fe區(qū)氨基酸序列和增加的或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體描述于美國專利號6，194，55IBI和WO 99/51642中。通過引用的方式特地將這些專利公布的內(nèi)容并入本文。也見 Idusogie 等，J. Immunol. 164:4178-4184(2000)。如本文中使用的,術(shù)語“Fe區(qū)”一般指包含免疫球蛋白重鏈的C末端多肽序列的二聚體復(fù)合物，其中該C末端多肽序列可通過完整抗體的木瓜蛋白酶消化得到。Fe區(qū)可以包含天然的或變異的Fe序列。盡管免疫球蛋白重鏈的Fe序列的邊界可以變化,人IgG重鏈Fe序列通常定義為從約Cys226位，或從約Pro230位的氨基酸殘基，延伸到Fe序列的羧基端的片段。免疫球蛋白的Fe序列通常包含兩個恒定區(qū),CH2區(qū)和CH3區(qū)，和可選地包含CH4區(qū)。本文中“Fe多肽”意指組成Fe區(qū)的多肽之一。Fe多肽可以獲自任何合適的免疫球蛋白，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類、IgA、IgE, IgD或IgM0在一些實施方案中，F(xiàn)e多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列(通常在其N端)。在一些實施方案中，F(xiàn)e多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。如本文中使用的,“抗體突變體”或“抗體變體”指抗體的氨基酸序列變體,其中該物種依賴性抗體的一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被改變。這樣的突變體必定與物種依賴性抗體具有小于100%的序列同一"性:或相似性。在一個實施方案中，抗體突變體具有與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列有至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)地至少95%的氨基酸序列同^-性或相似性的氨基酸序列。關(guān)于該序列的同一性或相似性在本文中定義為，在比對序列和如果需要的話，引入空位以獲得最大的百分比序列同一,注后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基同一(即，相同的殘基)或相似(即，來自基于共同側(cè)鏈特性的相同組的氨基酸殘基，見下文)的氨基酸殘基的百分比。在可變區(qū)以外的抗體序列中N末端、C末端或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入都不應(yīng)被視為影響序列同一,注和相似性?！安“Y”或“疾病”是將受益于以本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法進行的治療的任何狀況。它包括慢性的和急性的病癥或疾病,包括那些使哺乳動物易患所述疾病的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限定性例子包括惡性和良性腫瘤；癌、胚細(xì)胞瘤和肉瘤?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防止性措施。需要治療的對象包括那些已經(jīng)患有良性的、癌前的或非轉(zhuǎn)移性的腫瘤以及那些需防止癌癥發(fā)生或復(fù)發(fā)的對象。術(shù)語“治療有效量”指治療或預(yù)防哺乳動物中疾病或病癥的藥劑的量。就癌癥而言，藥劑的治療有效量可以減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減小原發(fā)腫瘤的大??；抑制(即，在一定程度上減慢和優(yōu)選終止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即，在一定程度上減慢和優(yōu)選終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上緩解與疾病相關(guān)的一個或多個癥狀。就藥物達到阻止已存在的癌細(xì)胞的生長和/或?qū)⑵錃⑺赖某潭?其可以是抑制細(xì)胞的和/或細(xì)胞毒性的。對于癌癥治療，可以例如通過評估存活時間、至疾病進展的時間(TTP)、反應(yīng)率(RR)、反應(yīng)持續(xù)時間和/或生活質(zhì)量來度量體內(nèi)功效。本文中的“自身免疫病”是產(chǎn)生于并針對于個體自身組織的非惡性疾病或病癥。本文中的自身免疫病特地不包括惡性或癌性疾病或狀況,特別不包括B細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、毛細(xì)胞白血病和慢性成髓細(xì)胞性白血病。自身免疫疾病或病癥的例子包括但不限于，炎癥反應(yīng)，例如炎癥性皮膚病，包括牛皮癬和皮炎(例如,特應(yīng)性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；和炎性腸病相關(guān)的反應(yīng)(例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合征；ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎；結(jié)腸炎；腎小球性腎炎；過敏性疾病，例如濕疹和哮喘和其它涉及T細(xì)胞浸潤以及慢性炎癥反應(yīng)的疾??；動脈粥樣硬化；白細(xì)胞粘著缺陷；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾綜合征；自身免疫性甲狀腺炎；變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；修格蘭氏癥候群；幼年發(fā)病型糖尿??；與由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫反應(yīng)，典型地見于結(jié)核病、肉樣瘤病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；涉及白細(xì)胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或Coombs陽性貧血);重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾??；抗腎小球基底膜疾??；抗磷脂綜合癥；過敏性神經(jīng)炎；格雷夫斯病；蘭伯特-伊頓肌無力綜合癥；大皰性類天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺??；萊特爾氏病；僵人綜合癥；白塞??；巨細(xì)胞性動脈炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎??；IgM多神經(jīng)?。幻庖咝匝“鍦p少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。術(shù)語“癌”和“癌的”指或描述哺乳動物中具有不受控制的細(xì)胞生長的典型特征的生理狀況。該定義包括良性和惡性癌癥?！霸缙诎┌Y”或“早期腫瘤”意指非侵入或轉(zhuǎn)移的或分類為0、I或II:期的癌癥。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴癌、胚細(xì)胞瘤(包括成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括類癌瘤，胃泌素瘤和胰島細(xì)胞癌)、間皮瘤、施旺細(xì)胞瘤(包括聽神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。這樣的癌癥的更多具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如,鱗狀上皮細(xì)胞癌)；肺癌,包括小細(xì)胞肺癌(SCLC),非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌；腹膜癌；肝細(xì)胞癌；胃部或胃癌，包括胃腸癌；胰腺癌；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝細(xì)胞瘤；乳癌(包括轉(zhuǎn)移性乳癌)；結(jié)腸癌；直腸癌；結(jié)腸直腸癌；子宮內(nèi)膜或子宮癌；唾腺癌；腎或腎臟癌；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肝癌；肛門癌；陰莖癌；睪丸癌；食道癌；膽道腫瘤；以及頭頸癌和多發(fā)性骨髓瘤。術(shù)語“癌前的”指典型地先于癌癥或發(fā)展成癌癥的狀況或生長。癌前生長具有以異常的細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、或分化為特征的細(xì)胞，這可以通過細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖或分化的標(biāo)記物來確定。“發(fā)育異?！币庵附M織、器官或細(xì)胞的任何異常生長或發(fā)育。優(yōu)選地,發(fā)育異常是高級別的或癌前的?！稗D(zhuǎn)移”指癌從其原發(fā)位置擴散到身體中其它位置。癌細(xì)胞可以脫離原發(fā)腫瘤，滲透入淋巴管和血管中，通過血流進行循環(huán)，并在身體其它位置在正常組織中在遠處病灶中生長(轉(zhuǎn)移)。轉(zhuǎn)移可以是局部的或遠距離的。轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)的過程,取決于腫瘤細(xì)胞自原發(fā)腫瘤脫離，通過血流進行移動，停止在遠距離位置。在新的位置上，這些細(xì)胞建立血供，并可以生長形成威脅生命的團塊。腫瘤細(xì)胞中的刺激性和抑制性分子途徑都調(diào)節(jié)這種行為,腫瘤細(xì)胞和在遠距離位置中的宿主細(xì)胞之間的相互作用也是有意義的?！胺寝D(zhuǎn)移的”意指癌癥是良性的或保留在原發(fā)位置,其尚未滲透入淋巴管或血管系統(tǒng)或除了原發(fā)位置的組織中。通常，非轉(zhuǎn)移性癌癥是處于O、I或II期,和偶爾處于III期的癌癥?！霸l(fā)腫瘤”或“原發(fā)癌”意指起始的癌,而非位于對象身體中的另一個組織、器官或位置上的轉(zhuǎn)移性損傷?！傲夹阅[瘤”或“良性癌”意指仍局限在起源位置并且不具有浸潤、侵入或轉(zhuǎn)移到遠距離位置能力的腫瘤。“腫瘤負(fù)荷”意指身體中癌細(xì)胞的數(shù)量,腫瘤的大小,或癌的數(shù)量。腫瘤負(fù)荷也被稱為腫瘤負(fù)擔(dān)?！澳[瘤數(shù)量”意指腫瘤的數(shù)量?！笆茉囌摺币庵覆溉閯游?，包括但不限于人或非人哺乳動物,例如牛、馬、犬、綿羊或貓。優(yōu)選地，受試者是人。術(shù)語“抗癌療法”指用于治療癌癥的療法?？拱┲委焺┑睦影ǖ幌抻?，例如化療劑，生長抑制劑，細(xì)胞毒素藥物，用于放射治療的藥物，抗血管生成藥物，凋亡劑，抗微管蛋白藥物和治療癌癥的其它藥物，抗CD20抗體,血小板衍生生長因子抑制劑(例如，Gleevec (Imatinib Mesylate)), C0X-2 抑制劑(例如，塞來昔布(celecoxib)),干擾素類，細(xì)胞因子，與下列靶標(biāo) ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體、TRAIL/Apo2之一或多個結(jié)合的拮抗劑(例如，中和抗體)，以及其它生物活性的或有機化學(xué)的藥物等。本發(fā)明也包括它們的組合。如本文中使用的,術(shù)語“細(xì)胞毒素藥物”指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或?qū)е录?xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素(例如，I131、I125、Y90和Re186)，化療劑，以及毒素，例如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或它們的片段?！盎焺笔怯糜诎┌Y治療的化合物?；焺┑睦影ㄓ糜谥委煱┌Y的化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎缛妨蛄?thiotepa)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide);燒基磺酸酯類，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(impiOsulfan)和哌泊舒凡(pipos_ul_fan);氮丙卩定類(aziridines),例·如 benzodopa、卡巴醌(carboquone)、meturedopa 和 uredopa ；乙烯亞胺類和甲基三聚氰胺類(methyIamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯亞胺三嗪(triethylenemelamine)、三乙撐憐酉先胺(trietyIenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酉先胺(triethiyIenethiophosphoraraide)和三輕甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；acetogenins (特別是 bullatacin 和 bullatacinone);喜樹喊(camptothecin)(包括合成的類似物拓?fù)涮婵?topotecan));苔蘚抑制素(bryostatin) ；callystatin ；CO1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizeIesin)合成類似物)；cryptophycins (特別是 cryptophycin I 和 cryptophycin8) ；dolastatin ；duocarmycin(包括合成類似物 KW-2189 和 CB1-TM1);艾榴塞洛M (eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ；氣芥類，例女口苯丁酸氣芥(chlorambucil)、蔡氣芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、雌氣芥(estramustine)、異環(huán)鱗酉先胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechIoretharaine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩、比興(novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿P密咹氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲類，例如卡莫司 汀(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和ranimnustine ;抗生素，例如烯二炔類抗生素(例如，加利車霉素(calicheamicin)，特別是加利車霉素Y II和加利車霉素ωΠ(見例如，Agnewj Chem Intl. Ed. Engl.，33:183-186(1994));達內(nèi)霉素(dynemicin)，包括達內(nèi)霉素A ; 二膦酸鹽，例如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)的色素蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)；aclacinomysins,放線菌素(actinomycin)，安曲霉素(authramycin)，重氮絲氨酸(azaserine)，博來霉素(bleomycins)，放線菌素 C (cactinomycin)，carabicin，洋紅霉素(carminomycin) carzinophiIin chromomycinis,放線菌素D(dactinomycin) 道諾霉素 daunorubicin，地托比星(detorubicin)，6_ 重氮基 _5_ 氧代-L-正亮氨，ADRIAMYCIN 阿霉素(doxorubicin)(包括嗎啉代阿霉素(morpholino-doxorubicin)、氰基嗎啉代阿霉素(cyanomorpholino-doxorubicin)、2- B比略啉并阿霉素(2-pyrrolino-doxorubicin)和脫氧阿霉素 deoxydoxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，麻西羅霉素(marcelIomycin)，絲裂霉素(mitomycins)，例如絲裂霉素 C，菌酷酸(mycophenolicacid),諾加霉素(nogalamycin),橄欖霉素(olivomycins),培洛霉素(peplomycin)，potf iromycin, 口票呤霉素(puroraycin) quelaraycin,羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin)，鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁 (zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟尿卩密咹(5-fIuorouracil) (5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤(methotrexate),蝶羅呤(pteropterin),三甲曲沙(trimetrexate);卩票呤類似物，例如氟達拉濱(f Iudarabine)，6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)，thiamiprine，硫鳥嘌呤(thioguanine)；卩密卩定類似物，例如環(huán)胞苷(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine)，6-阿扎胞苷(6-azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，二脫氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷(doxifIuridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷(fIoxuridine);雄激素類，例如二甲睪酮(calusterone)，屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄焼(mepitiostane)，睪內(nèi)脂(testolactone);抗腎上腺素，例如氨魯米特(aminoglutethimide),米托坦(mitotane) 曲洛司坦(trilostane);葉酸補充物，例如 frolinic acid;醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);乙塊尿口密咹(eni I uracil);安Π丫 P定(amsacrine) ；bestrabuciI ;比生群(bisantrene) ；edatraxate ；defofamine ；地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依氟鳥氨酸(elfornithine);依利醋銨(elliptinium acetate);埃博霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵(gallium nitrate);輕基脈(hydroxyurea);蘑燕多糖(Ientinan) ;lonidainine ;類美登素化合物(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocins)；米托月瓜 J3宗(mitoguazone);米托 M 酉昆(mitoxantrone) ；mopidanmol ；nitraerine ；噴 ρΓ]他 J (pentostatin) ;phenamet ;卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone)； podophyllinic acid ;2-乙基酉先胼(2-ethyIhydrazide)；普魯節(jié)胼(procarbazine)；PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products Eugene OR);雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺酉昆(triaziquone) ;2，2’，2〃_ 三氣三乙基月安(2，2’，2〃_trichlorotriethylamine);單端抱霉烯(trichothecenes)(特別是 T-2 毒素，verracurin A,桿孢菌素(roridin A)和 anguidine);尿焼(urethan);長春地辛(vindesine);氮烯咪胺(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ;gacytosine ;阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C，，);環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa);紫杉院類化合物(taxoids)，例如 TAXOL 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton，N. J.) ABRAXANE 不含Cremophor，白蛋白-改造的紫杉醇納米制劑(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和 ΤΑΧΟΤΕΚΕ 紫杉 15
(doxetaxel) (Rhone- Poulenc Rorer Antony,法國)；chloranbucil
吉西他濱(gemcitabine) ;6_ 硫鳥卩票呤(6-thioguanine);疏基p票呤(mercaptopurine)；甲胺碟呤(methotrexate);鈾類似物，例如順鈾(cisplatin)和卡鈾(carboplatin);長春花堿(vinblastine);鉬；依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone);長春新堿(vincristine) ； NAVELlBINJE 長春瑞濱(vinorelbine) ； 二經(jīng)基蒽醌(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依達曲沙(edatrexate);柔紅霉素(daunomycin);氨基碟呤(aminopterin);希羅達(xeloda)；伊班勝酸(ibandronate);伊立替康(irinotecan) (Camptosar CPT-11)(包括伊立替康(irinotecan)與5-FU和甲酰四氫葉酸(Ieucovorin)的治療方案)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑 RFS 2000 ；difluorometlhylornithine (DMFO);類視色素，例如視黃酸(retinoicacid)；卡培他濱(capecitabine);考布他汀(combretastatin) ；VELCADE 砸替佐米(bortezomib) ;REVLIMID 來那度胺(Ienalidomide);甲酸四氫葉酸(Ieucovorin) (LV);奧沙利鉬(oxaliplatin)，包括奧沙利鋁(oxaliplatin)治療方案(FOLFOX);減少細(xì)胞增殖的PKC-a、Raf、H-Ras、EGFR(例如埃羅替尼(erlotinib) (Tarceva ))和 VEGF-A 的抑制劑，以及以上任何的藥用可接受的鹽、酸或衍生物。該定義也包括抗激素藥物，其起調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用，例如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs),包括，例如它莫西芬(taraoxi fen)(包括NCXLVADEX 它莫西芬)，雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene),4_ 輕基他莫肯芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018,奧那司酮(onapristone)，和FAREST0N托瑞米芬(toremifene);抑制芳香酶的芳香酶抑制劑,其調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素的產(chǎn)生,例如4(5)-咪唑類,氨魯米特(aminoglutethimide),MEGASE 甲地孕酮(megestrol acetate), AROMASIN 依西美坦(exemestane)，formestanie,法倔唑(fadrozole) , RTV1SOR 伏氯唑(vorozole)，F(xiàn)EMARA 來曲唑(Ietrozole),和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素類，例如氟他胺(flutarai.de),尼魯米特(nilutarai.de),比卡魯胺(bicalutamide) 亮丙瑞林(Ieuprolide),和戈舍瑞林(goserelin)；以及 t.roxacitabine (I, 3- 二氧戊環(huán)胞嘧啶核苷類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及異常細(xì)胞增殖的信號途徑中基因，例如PKC- a , Raf和II-Ras，表達的反義寡核苷酸；核酶，例如VEGF表達 抑制劑(例如，ANGIOZYlViED核酶)和HER2表達抑制劑；疫苗，例如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗，LEUVECTIN 疫苗，和VAXID 疫苗；PROLEUKIN riL-2 ;[υΚΤΟΤΕ€ΑΝ 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑；ABAREUX rmRH ;長春瑞濱(Vinorelbine)和Esperamicins (見美國專利號4，675，187),以及以上任何的藥用可接受的鹽、酸或衍生物。如在本申請中使用的,“前體藥物”指藥用活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，與親本藥物相比，其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，能夠被酶催化激活或轉(zhuǎn)化為更活躍的親本形式。見例如，Wilman,《癌癥化療中的前體藥物》(“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”)Biochemical Society Transactions, 14,第 375-382 頁，615th Meeting Belfast (1986)和Stella等，《前體藥物祀向給藥的化學(xué)方法》(“Prodrugs:A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery,，，)Directed Drug Delivet'y，Borchardt 等編輯，第 247-267頁，Humana出版社(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽前體藥物，含硫代磷酸鹽前體藥物,含硫酸鹽前體藥物,含肽前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物,糖基化的前體藥物,含β -內(nèi)酰胺的前體藥物,含任選取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或含任選取代的苯乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶以及可以被轉(zhuǎn)化為更活躍的無細(xì)胞毒性藥物的其它5-氟尿苷前體藥物?？梢员谎苌鸀橛糜诒景l(fā)明的前體藥物的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上述那些化療劑?！胺派渲委煛币庵甘褂弥苯拥腨射線或β射線來誘導(dǎo)對細(xì)胞足夠的損傷，以限制其正常起作用的能力或完全破壞細(xì)胞。應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域已知許多確定治療劑量和持續(xù)時間的手段。典型的治療是作為一次施用來給予的，典型的劑量為每天10至200個單位(Grays)?！吧飳W(xué)活性”或“功能性”多肽(例如異源多肽)是能夠在結(jié)構(gòu)的、調(diào)控的、生物化學(xué)的或生物物理的事件中施行一個或多個其天然活性的多肽?！吧飳W(xué)活性”或“功能性”抗體是能夠在結(jié)構(gòu)的、調(diào)控的、生物化學(xué)的或生物物理的事件中施行^-個或多個其天然活性的抗體。例如,生物學(xué)活性抗體可以具有特異地結(jié)合抗原的能力，該結(jié)合又可以引發(fā)或改變例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或酶活性等細(xì)胞或分子事件。生物學(xué)活性抗體也可以阻斷受體的配體活化或充當(dāng)激動劑抗體。抗體施行一個或多個其天然活性的能力依賴于幾個因素,包括多肽鏈的正確折疊和組裝。如本文中使用的，由本公開的方法產(chǎn)生的生物學(xué)活性抗體典型地包括異源四聚體,所述異源四聚體具有兩個相同的L鏈和兩個相同的H鏈，這些鏈通過多個二硫鍵相連接并正確地折疊。本發(fā)明的組合物及其使用方法在一個方面,本發(fā)明提供了 TIR變體。因此,對于一個給定的TIR,可以產(chǎn)生具有各種翻譯強度的-一系列氨基酸或核酸序列變體，由此提供了一種可以調(diào)節(jié)該因子用于許多不同多肽最優(yōu)分泌的方便手段。通過使用在這些變體，例如PhoA,控制F表達的報告基因，提供了對不同翻譯起始區(qū)的相對翻譯強度進行定量的方法?？梢栽谫|(zhì)粒載體背景下提供變體或突變體TIRs,由此提供一組質(zhì)粒,在這些質(zhì)粒中可以插入目的基因，并可以測量目的基因的表達，以建立用于成熟多肽最大表達的最佳翻譯強度范圍。
可以通過常規(guī)技術(shù)進行TIR的誘變，導(dǎo)致密碼子改變,盡管優(yōu)選核苷酸序列中的沉默改變，但這些密碼子改變也可以改變氨基酸序列。TIR中的改變可以包括，例如與信號序列中的改變組合，Shine-Dalgarno序列的數(shù)量和間距上的改變。用于產(chǎn)生突變體信號序列的一個方法是在編碼序列開始處產(chǎn)生“密碼子庫”,其不改變信號序列的氨基酸序列(即，改變是沉默的)。這可以通過改變每個密碼子的第三位核苷酸來實現(xiàn)；此夕卜，一些氨基酸，例如亮氨酸、絲氨酸和精氨酸，具有多個第一和第二位，這給制備庫增添了復(fù)雜性。該誘變方法詳細(xì)描述于Yansura等(METHODS:A Companion to Methods inEnzymoI. 4:151-158(1992))中?；旧?，編碼信號序列的DNA片段和成熟多肽的開端是合成的，由此前6至12個密碼子每個的第三位(和可能地,第一和第二位，如____t所述)是改變的。這些密碼子下游的另外的核苷酸提供用于互補引物結(jié)合的位點,所述互補引物用于產(chǎn)生底端鏈。以DNA聚合酶I (Klem)W)處理頂端編碼鏈和底端鏈引物,將導(dǎo)致一組包含隨機化密碼子的雙股DNA片段。設(shè)計引物以包含有用的克隆位點，所述克隆位點可以用于將該DNA片段插入合適的載體中，由此允許擴增密碼子庫。備選方法包括，例如以隨機核苷酸替代整個rbs (Wilson等，BioTechniquesl7:944-952 (1994)),以及使用噬菌體展不文庫(見例如，Barbas 等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89:4457-4461 (1992) ;Garrard等，Genel28:103-109(1993))ο細(xì)菌Sec移位酶利于原核生物中蛋白質(zhì)輸出。分泌蛋白質(zhì)可以通過兩種不同機制被靶向到Sec移位酶，即共翻譯和翻譯后靶向。在后者中,包含信號序列的分泌蛋白以其合成完成的狀態(tài)從核糖體中釋放出來并被引導(dǎo)到Sec移位酶。在各種革蘭氏陰性菌中，分泌蛋白通過分泌特異性分子伴侶SecB被引導(dǎo)到Sec移位酶,所述分泌特異性分子伴侶SecB維持這些蛋白質(zhì)處于能夠轉(zhuǎn)運的、非折疊狀態(tài)。在共翻譯靶向中，在分泌蛋白的信號序列從核糖體中露出時信號識別顆粒(SRP)與其結(jié)合，整個SRP/核糖體/新生分泌蛋白鏈的三元復(fù)合物被靶向到Sec移位酶。例如，麥芽糖結(jié)合周質(zhì)蛋白(MalE)和堿性磷酸酶(PhoA)信號肽借助分子馬達SecA，以翻譯后方式指導(dǎo)從細(xì)胞質(zhì)到周質(zhì)的轉(zhuǎn)運。以翻譯后方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)運的其它示例性信號肽有dsbC、lolA、ompA、lamb和lpp。熱穩(wěn)定腸毒素II (stll)和巰基-二硫鍵互換蛋白(dsbA)信號肽借助信號識別顆粒(SRP),以共翻譯方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)運。以共翻譯方式指導(dǎo)轉(zhuǎn)運的其它示例性信號肽有yral、tort、tolB、sfmC、nikA和sfmC。也見Natale等對于Sec-和Tat-介導(dǎo)的跨細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)分泌的綜述。(Natale等(2008)Biochemicaet Biophysica Acta 1778:1735-56)。我們開發(fā)了針對信號肽的新的變體翻譯起始區(qū)(TIR)信號肽文庫(圖2、表2)，代表用于在大腸桿菌中跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運的兩類主要的分泌途徑sec (PhoA，MalE)和SRP (DsbA, STII)。每個文庫包括一組包含不同翻譯強度的變體TIR的載體，從而提供了一種可以容易地調(diào)節(jié)給定目的蛋白翻譯水平的手段。一般,在質(zhì)粒載體中提供TIR變體,所述質(zhì)粒載體具有用于目的基因表達的合適元件。例如，典型的構(gòu)建體將包含于信號序列5’的啟動子、用于插入目的基因或報告基因的于信號序列3，的限制性酶識別位點、和選擇標(biāo)記，例如藥物抗性標(biāo)記,用于選擇和/或維持轉(zhuǎn)化了所得質(zhì)粒的細(xì)菌。本文對質(zhì)粒載體另外進行了討論和例示。在本領(lǐng)域中已知適合于原核生物宿主使用的啟動子,本文對其中一些進行了例示和描述。 可以使用能以某種方式進行定量的任何報告基因。由此，例如，可以定量堿性磷酸酶的產(chǎn)生,作為對PhoA基因產(chǎn)物分泌水平的量度。其它的例子包括，例如β內(nèi)酰胺酶基因。通常，可以產(chǎn)生一組載體,對于載體的每個順反子具有各種TIR強度。該有限的組使得可以比較在各種TIR強度組合下每條鏈的表達水平以及全長產(chǎn)物產(chǎn)量。TIR強度可以通過定量報告基因的表達水平來測定，如詳細(xì)描述于Simmons等，美國專利號5，840，523中。為了本發(fā)明目的，以(N-輕鏈，M-重鏈)表示載體中特定TIRs對的翻譯強度組合,其中N是輕鏈的相對TIR強度，M是重鏈的相對TIR強度。例如，(3-輕鏈，7-重鏈)意思是載體對于輕鏈表達提供約3的相對TIR強度,對于重鏈表達提供約7的相對TIR強度?；诜g強度比較，選擇待在本發(fā)明表達載體構(gòu)建體中組合的單個期望TIRs。這樣構(gòu)建的載體可以用來轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。?yōu)選地，宿主是原核生物宿主。更優(yōu)選地，宿主是大腸桿菌。
可以例如通過目的多肽的功能性測定試驗(如果可得的話),放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫測定(ELISA),或通過PAGE和目的多肽正確分子量的可視化,測量多肽的分泌水平。用于測分泌多肽的水平的方法在本領(lǐng)域公知，本文對其中一些進行了例示?？贵w本發(fā)明的抗體優(yōu)選為單克隆抗體。本文中提供的抗體的Fab、Fab’、Fab’ -SH和F(ab’)2片段也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)中。這些抗體片段可以通過傳統(tǒng)手段產(chǎn)生,例如酶消化，或可以通過重組技術(shù)產(chǎn)生。這樣的抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段可以用于下述診斷和治療目的。因此，在一些實施方案中，抗c-met抗體是包含F(xiàn)e區(qū)的單臂抗體(即，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)形成單個抗原結(jié)合臂)，其中Fe區(qū)包括第一和第二 Fe多肽,其中第一和第二Fe多肽以復(fù)合物形式存在，形成，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比較,增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)域。當(dāng)病理學(xué)疾病的治療需要拮抗功能且抗體的雙價性導(dǎo)致不需要的激動劑效應(yīng)時,單臂抗體的單價特性(即，包含單個抗原結(jié)合臂的抗體)將導(dǎo)致和/或保證抗體與靶標(biāo)分子結(jié)合后的拮抗作用。此外,包含F(xiàn)e區(qū)的單臂抗體,與具有類似/基本相同的抗原結(jié)合特性的Fab形式相比較，具有較優(yōu)的藥物動力學(xué)屬性(例如增加的半衰期和/或降低的體內(nèi)清除率)，由此克服了常規(guī)單價Fab抗體使用中的主要缺陷。單臂抗體公開于例如 W02005/063816 !Martens 等，Clin Cancer Res (2006)，12:6144 中。在一些實施方案中，單臂抗體是單價抗體片段,其中該抗體片段包括包含輕鏈可變區(qū)的第一多肽、包含重鏈可變區(qū)和所述第一 Fe多肽的第二多肽，以及包含所述第二 Fe多肽的第三多肽，由此重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)形成單個抗原結(jié)合臂，并由此第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物形式存在，形成Fe區(qū)域,與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比較,該Fe區(qū)域增加所述抗體片段的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，抗體結(jié)合(在一些實施方案中，特異性結(jié)合)c-met。在一些實施方案中，抗C-met抗體包括(a)第一多肽，其包含具有如下序列的重鏈可變區(qū)、CHl序列和第一 Fe多肽EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 43), (b)第二多肽,其包含具有如下序列的輕鏈可變區(qū)、和CLl序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO :44),以及(c)包含第二 Fe多肽的第三多肽,其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以復(fù)合物的形式存在，形成單個抗原結(jié)合臂,其中第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物的形式存在，形成Fe區(qū)，與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比,該Fe區(qū)增加所述抗體片段的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，第一多肽包含圖7中描述的Fe序列(SEQ ID NO:68),第二多肽包含圖8中描述的Fe序列(SEQ ID N0:47)。在一些實施方案中，第一多肽包含圖8中描述的Fe序列(SEQ IDNO:47),第二多肽包含圖7中描述的Fe序列(SEQ ID NO:68)。在一些實施方案中，抗c-met抗體包括(a)包含重鏈可變區(qū)的第一多肽,所述多肽包含序列 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYffLIWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO 45)；(b)包含輕鏈可變區(qū)的第二多肽,所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTI/riSSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 46)；以及包含F(xiàn)e多肽的第三多肽，所述多肽包含序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 47),
其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以復(fù)合物的形式存在,形成單個抗原結(jié)合臂,其中第一和第二 Fe多肽以復(fù)合物的形式存在,形成與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)。在一個方面，抗c-met抗體包含(a)至少1、2、3、4或5個超變區(qū)(CDR)序列,所述超變區(qū)序列選自⑴包含序列 A1-A17 的 CDR-Ll,其中 A1-A17 為 KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ IDNO:49)(ii)包含序列 BI-B7 的 CDR-L2,其中 BI-B7 為 WASTRES(SEQ ID NO:50)(iii)包含序列 C1-C9 的 CDR-L3,其中 C1-C9 為 QQYYAYPffT(SEQ ID NO:51)(iv)包含序列 Dl-DlO 的 CDR-H1,其中 Dl-DlO 為 GYTFTSYffLH(SEQ ID NO:52)(V)包含序列 El-E18 的 CDR-H2,其中 El-E18 為 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ IDNO:53)和(vi)包含序列 Fl-Fll 的 CDR-H3,其中 Fl-Fll 為 T/SYGSYVSPLDY(SE Q IDNO:54)；和(b)至少一個變體⑶R,其中該變體CDR序列包含(i)-(vi)中所描述序列的至少一個殘基的修飾。在一些實施方案中，CDR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:55)。在一些實施方案中，CDR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQ ID N0:56)。在一些實施方案中，包含這些序列(按如本文中描述的組合)的本發(fā)明的抗體是人源化的或人的。在一個實施方案中，抗c-me t抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含圖7中描述的 CDR1-HC、CDR2-HC 和 CDR3-HC 序列(SEQ ID NO: 52-53 和 66)之一或多個。在一些實施方案中，抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含圖7中描述的CDR1-LC、CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NOs:49-51)之一或多個。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包含圖7中描述的 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC 和 FR4-IIC 序列(SEQ ID NOs: 62-65)。在一些實施方案中，輕鏈可變區(qū)包含圖7中描述的卜$1-1,(、卜12-1.￡、卜1 -1丄和卜'[^4-1,(序列(SEQ ID NO: 57-60)。本發(fā)明的抗c-met抗體中的變體HVRs可以在HVR中具有一個或多個殘基的修飾。在一個實施方案中，HVR-L2變體在F列位置的任何組合中包含1_5(1、2、3、4或5)個取代BI (M 或 U、B2 (P、T、G 或 S)、B3 (N、G、R 或 T)、B4 (I、N 或 F)、B5 (P、I、L 或 G)、B6 (A、D、T或V)和B7 (R、I、M或G)。在一個實施方案中，HVR-Hl變體在下列位置的任何組合中包含1-5 (1、2、3、4 或 5)個取代D3 (N、P、L、S、A、I)、D5 (I、S 或 Y)、D6 (G、D、T、K、R)、D7 (F、H、R、S、T或V)和D9 (M或V)。在一個實施方案中，HVR-H2變體在下列位置的任何組合中包含I-4 (I、2、3 或 4)個取代E7 (Y)、E9 (I)、ElO (I)、E14 (T 或 Q)、E15 (D、K、S、T 或 V)、E16 (L)、El7 (E、H、N或D)和E18 (Y、E或H)。在一個實施方案中，HVR-H3變體在下列位置的任何組合中包含 1-5 (I、2、3、4 或 5)個取代F1 (T、S)、F3 (R、S、H、T、A、K)、F4 (G)、F6 (R、F、Μ、Τ、Ε、K、A、L、ff)、F7 (L、I、Τ、R、K、V)、F8 (S、A)、FlO (Y、N)和 Fl I (Q、S、H、F)。每個位置后括號中的字母表示示例性取代(即，替換)氨基酸；如本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是,可以使用本領(lǐng)域已知和/或本文中描述的技術(shù)，對其它氨基酸作為在本文中描述的背景中的取代氨基酸的合適性進行常規(guī)評估。在^-個實施方案中，HVR-Ll包含SEQ ID NO:49的序列。在一個實施方案中，變體HVR-H3中的Π是Τ。在一個實施方案中，變體HVR-H3中的Π是S。在一個實施方案中，變體HVR-II3中的F3是R。在一個實施方案中，變體IiVR-113中的F3是S。在一個實施方案中,變體HVR-H3中的F7是T。在一個實施方案中,本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H3,其中Π是T或S, F3是R或S, F7是T。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗C-met抗體包含變體IIVR-113,其中Π是T，F(xiàn)3是R,和F7是T。在一個實施方案中,本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H3,其中Fl是S。在一個實施方案中,本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H3,其中Π是T, F3是R。在一個實施方案中,本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H3,其中Π是S,F3是R，和F7是T。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含變體HVR-113，其中Fl是T，F(xiàn)3是S, F7是T和F8是S。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H3，其中Fl是T, F3是S, F7是T和F8是在一些實施方案中，所述變體HVR-H3抗體還包含HVR-LI、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H和HVR-H2，其中按順序每一個分別包含SEQ ID N0s:49、50、51、52和53中描述的序列。在一些實施方案中，這些抗體還包含人亞類III重鏈構(gòu)架共有序列。在這些抗體的一個實施方案中，構(gòu)架共有序列在第71、73和/或78位包含取代。在這些抗體的一個實施方案中，第71位是A,第73位是T,和/或第78位是A。在這些抗體的一個實施方案中,這些抗體還包含人K I輕鏈構(gòu)架共有序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗c-met抗體包含變體HVR-L2，其中B6是V。在一 些實施方案中，所述變體HVR-L2抗體還包含HVR-LI、HVR-L’3、HVR-III、HVR-H2和HVR-H3,其中按順序每一個分別包含SEQ ID N()s:49、51、52、53、54中描述的序列。在一些實施方案中，所述變體HVR-L2抗體還包含HVR-Ll、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,其中按順序每一個分別包含SEQ ID N0s:49、51、52、53、55中描述的序列。在一些實施方案中,所述變體HVR-L2抗體還包含HVR-LI、HVR-L’3、HVR-III、HVR-II2和IIVR-113,其中按順序每一個分別包含SEQ ID NOs:49、51、52、53、56中描述的序列。在一些實施方案中，這些抗體還包含人亞類III重鏈構(gòu)架共有序列。在這些抗體的^-個實施方案中，構(gòu)架共有序列在第71、73和/或78位包含取代。在這些抗體的一個實施方案中,第71位是A,第73位是T,和/或第78位是A。在這些抗體的一個實施方案中，這些抗體還包含人K I輕鏈構(gòu)架共有序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗c-met抗體包含變體HVR-H2,其中E14是T、E15是K、和E17是E。在一個實施方案中,本發(fā)明的抗體包含變體HVR-H2,其中E17是E。在一些實施方案中，所述變體HVR-H2抗體還包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl和HVR-H3,其中按順序每一個分別包含SEQ ID N0s:49、50、51、52、54中描述的序列。在一些實施方案中，所述變體HVR-H2抗體還包含HVR-LUHVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl和HVR-H3,其中按順序每…-個分別包含SEQ ID N0s:49、50、51、52、55中描述的序列。在一些實施方案中，所述變體HVR-H2抗體還包含HVR-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-Hl和HVR-H3,其中按順序每一個分別包含SEQ ID N0s:49、50、51、52、55中描述的序列。在一些實施方案中，這些抗體還包含人亞類I:]:]:重鏈構(gòu)架共有序列。在這些抗體的一個實施方案中，構(gòu)架共有序列在第71、73和/或78位包含取代。在這些抗體的一個實施方案中,第71位是A,第73位是T,和/或第78位是A。在這些抗體的一個實施方案中，這些抗體還包含人K I輕鏈構(gòu)架共有序列。適合用于本發(fā)明方法的其它抗c-met抗體在本領(lǐng)域中已知。在一個方面，抗ciiet抗體包含至少一個促進抗體片段中Fe序列的異源二聚體化，而使其同源二聚體化降到最低的特征。這樣的特征提高免疫球蛋白群體的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個實施方案中，抗體包含F(xiàn)e突變，所述Fe突變構(gòu)成如W02005/063816中描述的“結(jié)”和“洞”。例如，洞突變可以是Fe多肽中T366A、L368A和/或Y407V之--或多個,結(jié)突變可以是T366W。本文中另外描述了結(jié)和洞Fe突變。從基本....t同質(zhì)的抗體的群體(即除了可能以較低數(shù)量存在的可能天然突變以外，組成群體的各個抗體是相同的)中獲得單克隆抗體。因此,修飾語“單克隆的”表示抗體的特征——該抗體不是無關(guān)抗體的混合物?？梢允褂肒ohler等，Nature, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤方法,或通過重組DNA方法(美國專利號4，816，567)，制備本發(fā)明的單克隆抗體。在雜交瘤方法中，對小鼠或其它合適的宿主動物(例如倉鼠)進行免疫，以誘發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞,該抗體將與用于免疫的蛋白質(zhì)特異結(jié)合?？梢酝ㄟ^多次皮下(SC)或腹腔(ip)注射抗原和免疫佐劑來在動物中刺激生成抗抗原的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法制備抗原，本文中進一步描述了其中的一些。例如，下文描述了重組產(chǎn)生人和小鼠抗原。在一個實施方案中，以與免疫球蛋白重鏈的Fe部分融合的抗原免疫動物。在優(yōu)選的實施方案中，以抗原-IgGl融合蛋白免疫動物。通常用抗原與單磷酰脂A(MPL)/海藻 糖 dicrynomycolate (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc. , Hamilton, MT)的免疫原綴合物或衍生物對動物進行免疫，將溶液在多個位點進行皮內(nèi)注射。兩周后，對動物進行加強。7至14天后,對動物進行采血,將血清進行抗體滴度測定。對動物進行加強直到滴度達平臺。備選地，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑(例如，聚乙二醇)，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，MonoclonalAntibodies !Principles and Practice,等 59-103 頁(Academic 出片反社，1986))。將這樣制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中鋪種和生長,所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含一種或多種抑制未融合的、親本骨髓瘤細(xì)胞生長或生存的物質(zhì)。例如,如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些有效融合、支持所選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞穩(wěn)定高水平產(chǎn)生抗體的、并對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。在它們中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，例如來自M0PC-21和MPC-II小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞系(可JA Salk Institute Cell Distribution Center, Scin Diego, California USA 獲得)，和SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心Atneri can Type Cu I tureCollection, Rockville, Maryland USA獲得)。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor, J. Immunol. , 133:3001 (1984) ;Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987))。測定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地,通過免疫沉淀反應(yīng)，或通過體外結(jié)合測定，例如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),測定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性?？梢岳缤ㄟ^Munson 等,Anal. Biochem.，107:220 (1980)的 Scatchard 分析，測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。鑒定出產(chǎn)生期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可以通過有限稀釋程序?qū)寺∵M行亞克隆和通過標(biāo)準(zhǔn)的方法進行培養(yǎng)(Goding, MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,第 59-103 貝(Academic 出版社，1986))。用于此目的合適的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可以在動物中作為腹水腫瘤，在體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序,例如蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜，從培養(yǎng)基、腹水液或血清中合適地分離由亞克隆分泌的單克隆抗體?？梢酝ㄟ^使用組合文庫篩選具有期望活性(一種或多種)的合成的抗體克隆，以制備本發(fā)明的抗體。原則上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成的抗體克隆，所述文庫包含展示有與噬菌體外殼蛋白融合的各種抗體可變區(qū)(Fv)片段的噬菌體。通過親和力色譜,針對期望的抗原，淘選這樣的噬菌體文庫。表達能夠與期望抗原結(jié)合的Fv片段的克隆被吸附到抗原上，因此與文庫中非結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫F來，可以通過另外的抗原吸附/洗脫循環(huán)來進一步富集?？梢酝ㄟ^設(shè)計合適的抗原篩選程序，選擇目的噬菌體克隆,其后使用來自目的噬菌體克隆的Fv序列和描述于Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIH Publication 91-3242, Bethe sdaMD(1991)，卷1-3中的合適的恒定區(qū)(Fe)序列構(gòu)建抗體克隆，以獲得本發(fā)明的任何抗體。實施例中公開了產(chǎn)生抗體的示例性方法。抗體的抗原結(jié)合區(qū)由兩個約110個氨基酸的可變(V)區(qū)組成,其中一個可變區(qū)來自輕鏈(VL),—個來自重鏈(VH),兩者都存在3個超變環(huán)或互補決定區(qū)(CDRs)?？勺儏^(qū)可以在噬菌體上被功能性展示，或作為單鏈Fv (scFv)片段(其中VH和VL通過短的、柔性肽共價連接),或作為Fab片段(其中VII和VL每一個與恒定區(qū)連接并非共價相互作用,如Winter等，Ann. Rev. ImmunoI. , 12:433-455(1994)中描述)。如本文中使用的，編碼scFv的噬菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆被統(tǒng)一稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”?？梢酝ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別克隆VH和VL基因的庫，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后搜索抗原結(jié)合克隆，如Winter等,Ann. Rev. Immunol. , 12:433-455(1994)中描述。來自免疫來源的文庫提供了針對免疫原的高親和力抗體，而不需要構(gòu)建雜交瘤。備選地,將天然庫克隆，以提供具有針對廣泛的非自體和自體抗原的人抗體的單-一來源，而不需要任何免疫，如GrifTiths等，EMBO J, 12:725-734(1993)描述。最后，也可以通過從干細(xì)胞克隆未重排的V基因片段，使用包含隨機序列的PCR引物,編碼高度可變的CDR3區(qū)和完成體外重排，從而合成制備天然文庫，如Hoogenboom和Winter, j. Mol.Biol. , 227:381-388(1992)描述。使用絲狀噬菌體，通過與次要外殼蛋白pill融合，可以展示抗體片段?？贵w片段可以作為單鏈Fv片段來展示,其中VL和VL區(qū)通過柔性多肽間隔子連接在相同的多肽鏈上，例如，如Marks等，J. Mol. BioL，222:581-597 (1991)所描述；或可以作為Fab片段來展示,其中一條鏈與PlII融合，另--條分泌到細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在那里組裝為Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過置換一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面，例如，如Hoogenboom et.til. , Nucl. Acids Res.，19:4133-4137 (1991)中描述。通常,從收獲自人或動物的免疫細(xì)胞,獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果期望文庫偏向于靶向特定抗原的克隆,可以以抗原免疫個體以產(chǎn)生抗體反應(yīng)，回收脾細(xì)胞和/或循環(huán)B細(xì)胞和其它外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)用于文庫構(gòu)建。在優(yōu)選的實施方案中，通過在攜帶一系列功能性人免疫球蛋白基因(和缺乏功能性內(nèi)源抗體產(chǎn)生系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗體反應(yīng)，由此獲得偏向于抗原反應(yīng)性克隆的人抗體基因片段文庫,其中在這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠中抗原免疫將導(dǎo)致產(chǎn)生抗抗原的人抗體的B細(xì)胞。產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生描述如下?？梢酝ㄟ^使用合適的篩選程序分離表達抗原特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，例如通過以抗原親和力色譜分離細(xì)胞,或通過將細(xì)胞吸附到熒光染料標(biāo)記的抗原上隨后進行流式激活細(xì)胞分選(FACS),額外地富集抗原反應(yīng)性細(xì)胞群體。備選地,可以使用來自未免疫的供體的脾細(xì)胞和/或B細(xì)胞或其它PBLs,更好地代表該可能的抗體庫,這也允許使用其中抗原不具有抗原性的任何動物(人或非人)物種構(gòu)建抗體文庫。為了構(gòu)建體外整合抗體基因的文庫,可以從個體收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因片段的核酸。可以從各種動物物種，例如人、小鼠、大鼠、兔、Iuprine、犬、貓、豬、牛、馬、和鳥類物種等中獲得目的免疫細(xì)胞。從目的細(xì)胞中回收編碼抗體可變基因片段(包括VH和VL片段)的核酸并進行擴增。在經(jīng)重排的VH和VL基因文庫的情況下,可以通過從淋巴細(xì)胞中分離基因組DNA或 mRNA,如 Orlandi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86:3833-3837 (1989)中描述，隨后以與重排的VH和VL基因的5’和3’末端匹配的引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),獲得期望的DNA,由此產(chǎn)生多樣V基因庫用于表達?？梢杂迷诰幋a成熟V區(qū)的外顯子的5’端的反向引物和基于J片段的正向引物,從cDNA和基因組DNA中擴增V基因，如OrIandi等(I989)和Ward等，Nature, 341:544-546 (1989)中描述。然而，對于從cDNA進行的擴增，反向引物也可以基于前導(dǎo)外顯子，如Jones等,Biotechnol. ,9:88-89 (1991)中描述,正向引物基于恒定區(qū),如Sastry 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86:5728-5732 (1989)中描述。為了使互補最大化，可以在引物中整合簡并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)中描述。優(yōu)選地,通過使用靶向每個V基因家族的PCR引物，使文庫的多樣性最大化，以擴增存在于免疫細(xì)胞核酸樣品中的所有可得的VH和VL排列，例如，如Marks等,J. Mol. Biol. , 222:581-597 (1991)的方法中描述，或如Orum等,Nucleic Acids Res. , 21:4491-4498 (1993)的方法中描述。為了將擴增的DNA克隆到表達載體中，可以在PCR引物中引入稀有的限制性位點作為在一端的尾，如Orlandi等(1989)中描述，或以加尾的引物進行進一步PCR擴增，如Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)中描述。合成的重排V基因的庫可以在體外來源于V基因片段。大多數(shù)人VH基因片段已經(jīng)被克隆和測序(報告于Tomlinson等，J. Mol. Biol.，227:776-798(1992)中)，和作圖定位(報告于Matsuda等，Nature Genet'·，3:88-94(1993)中)；以編碼多樣序列和長度的H3環(huán)的PCR引物,這些克隆的片段(包括IIl和H2環(huán)的所有主要構(gòu)象)可用來產(chǎn)生多樣VH 基因庫，如 Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227:381-388(1992)中描述。也可以利用集中于單一長度的長 !3環(huán)中的所有序列多樣性,產(chǎn)生VH庫，如Barbas等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 89:4457-4461 (1992)中描述。人Vk和νλ片段已經(jīng)被克隆和測序(報告于 Williams 和 Winter, Eur. J. Immunol. , 23:1456-1461 (1993)中)，其可用于產(chǎn)生合成的輕鏈庫?；谝幌盗蠽H和VL折疊以及L3和H3長度，合成的V基因庫將編碼具有相當(dāng)多的結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。在擴增V基因編碼DNA后,可以根據(jù)Hoogenboom和Winter, J. Mol.Biol.，227:381-388(1992)的方法，對種系V基因片段進行體外重排?？梢酝ㄟ^以幾種方式將VII和VL基因庫組合在一起，構(gòu)建抗體片段庫?？梢詫⒚總€庫構(gòu)建在不同的載體中，在體外對這些載體進行重組，例如，如Hogrefe等，Gene, 128:119-126(1993)中描述，或通過組合感染進行體內(nèi)重組，例如描述于Waterhouse 等，Nucl. Acids Res.，21:2265-2266(1993)中的 IoxP 系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈特性來克服由大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率帶來的文庫大小的限制。對天然VH和VL庫分別克隆,一個克隆到噬菌粒中，另一個克隆到噬菌體載體中。然后通過對包含噬菌粒的細(xì)菌進行噬菌體感染，組合這兩個文庫，以使每個細(xì)胞包含不同的組合和使文庫的大小僅受所存在的細(xì)胞的數(shù)量(約IO12個克隆)的限制。兩個載體均包含體內(nèi)重組信號，以使VH和VL基因重組到單個復(fù)制子上并共包裝到噬菌體病毒粒中。這些巨型文庫提供了大量的具有良好親和力(約IO-8M的K廣)的多樣抗體。備選地，可以將庫相繼克隆到相同的載體中，例如，如Barbas等，Proc. NatI.Acad. Sci. USA, 88:7978-7982(1991)中描述，或通過PCR組裝到一起,然后進行克隆,例如，如 Clackson 等，Nature, 352:624-628 (1991)中描述。PCR 組裝也可以用于將 VH和 VL DNAs 與編碼柔性多肽間隔子的DNA連接，以形成單鏈Fv(scFv)庫。在另一項技術(shù)中，使用“細(xì)胞內(nèi)PCR組裝”，通過PCR組合淋巴細(xì)胞中的VH和VL基因,然后克隆所連接的基因的庫，如Embleton 等，Nucl. Acids Res.，20:3831-3837 (1992)中描述。由天然庫(自然或合成的)產(chǎn)生的抗體可以具有中度親和力(約IO6至Κ Γ1的Kd"1),但也可以通過構(gòu)建第二文庫和從中重新選擇來體外模擬親和力成熟,如Winter等(1994)，同上引文中描述。例如,可以在 Hawkins 等，J. Mol. Biol. ,226:889-896(1992)的方法中或在 Gram 等，Pioc. Natl. Acad. Sci USA, 89:3576-3580(1992)的方法中,通過使用易錯聚合酶(報告于Leung等，Technique, 1: 11-15 (1.989)中),體外隨機引入突變。此外，可以在選擇的各單個Fv克隆中隨機突變一個或多個CDRs (例如用跨目的CDR的攜帶隨機序列的引物進行PCR),并篩選較高親和力的克隆，進行親和力成熟。WO 96/07754(1996年3月14日公布)描述了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補決定區(qū)中誘導(dǎo)突變來構(gòu)建輕鏈基因文庫的方法。另一個有效的方法是，將通過噬菌體展示方法選擇的VH或VL區(qū)，與獲自未免疫供體的天然存在的V區(qū)變體的庫,進行重新組合,并在幾輪鏈改組中篩選較高親和力，如Marks等，Biotechnol.，10:779-783(1992)中描述。該技術(shù)允許產(chǎn)生具有IiT9M范圍親和力的抗體和抗體片段。可以使用抗原的期望區(qū)域的氨基酸序列，設(shè)計編碼期望靶抗原的核酸序列。可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法,制備編碼靶抗原的核酸。這些方法包括但不限于通過 Engels 等，Agnew. Chem. Int. Ed. Engl.，28:716-734 (1989)中描述的任何方法進行的化學(xué)合成，例如三酯、亞磷酸酯、亞磷酰胺和H-膦酸酯方法。在一個實施方案中，在抗原編碼DNA的設(shè)計中使用了表達宿主細(xì)胞偏好的密碼子。備選地,可以從基因組或cDNA文庫中分離編碼抗原的DNA。在構(gòu)建編碼抗原的DNA分子后，將DNA分子與表達載體(例如質(zhì)粒)中的表達控制序列有效連接，其中控制序列被載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞識別。通常，質(zhì)粒載體包含來自與宿主細(xì)胞相容的物種的復(fù)制和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點以及能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的編碼序列。用于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達的合適的載體在本領(lǐng)域已知，本文進一步描述了一些?？梢允褂谜婧松?，例如酵母，或來自多細(xì)胞生物(例如哺乳動物)的細(xì)胞。
可選地,將編碼抗原的DNA與分泌引導(dǎo)序列有效連接,所述分泌引導(dǎo)序列導(dǎo)致表達產(chǎn)物被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。分泌引導(dǎo)序列的例子包括stll、ecotin、lamB、皰瘆GD、lpp、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶和α因子。蛋白A的36個氨基酸的引導(dǎo)序列(Abrahmsen等，EMBO j. ,4:3901 (1985))也適用于本文。以本發(fā)明的上述表達或克隆載體轉(zhuǎn)染和優(yōu)選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基酌情改良用于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼期望序列的基因。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝取表達載體，而不管任何編碼序列實際上是否表達。技術(shù)人員已知許多轉(zhuǎn)染的方法,例如CaPO4沉淀和電穿孔。通常，當(dāng)宿主細(xì)胞中存在該載體活動的任何跡象時,轉(zhuǎn)染被認(rèn)為是成功的。用于轉(zhuǎn)染的方法在本領(lǐng)域公知,本文進^-步描述了一些。轉(zhuǎn)化意指將DNA導(dǎo)入到生物體中，以使DNA作為染色體外元件或通過染色體整合而可以復(fù)制。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞，使用適用于該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的方法在本領(lǐng)域公知，本文進一步描述了一些。·
可以如Sambrook等，同上引文中的一般描述,培養(yǎng)用來產(chǎn)生抗原的原核宿主細(xì)胞?？梢栽诟鞣N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用來產(chǎn)生抗原的哺乳動物宿主細(xì)胞,所述培養(yǎng)基在本領(lǐng)域公知,本文描述了其中一些。在本公開中提及的宿主細(xì)胞涵蓋體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及處于宿主動物中的細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公認(rèn)的方法進行抗原的純化，本文描述了其中一些?？梢詫⒓兓目乖街胶线m的基質(zhì)上，所述基質(zhì)例如瓊脂糖球、丙烯酰胺球、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚體、羥基甲基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚體、尼龍、中性和離子載體等等，用于嗤菌體展示克隆的親和力色譜分離?？梢酝ㄟ^Methodsin Enzymology,卷44(1976)中描述的方法,將抗原蛋白質(zhì)附著到基質(zhì)上。用于將蛋白質(zhì)配體附著到多糖基質(zhì)(例如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素)上的一個普遍使用的技術(shù)涉及以鹵化氰活化載體，隨后將肽配體的脂肪族或芳族伯胺與活化的基質(zhì)偶聯(lián)。備選地,可以使用抗原包被吸附平板的孔,在附于吸附平板上的宿主細(xì)胞上表達、或用于細(xì)胞分選，或與生物素綴合用于以鏈霉親和素包被珠進行捕獲、或用于任何其它本領(lǐng)域已知的用于噬菌體展示文庫淘選的方法。在適于至少一部分噬菌體顆粒與吸附劑結(jié)合的條件下，將固定的抗原與噬菌體文庫樣品接觸。通常，選擇包括pH、離子強度、溫度等條件以模擬生理條件。洗滌結(jié)合在固相上的噬菌體，然后以酸洗脫，例如，如Barbas等，Proc. NatLAcad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991)中描述，或以堿洗脫,例如，如 Marks 等,J.Mo!. BioL，222:581-597 (1991)中描述，或通過抗原競爭洗脫，例如，以與Clackson等，Nature，352:624-628(1991)的抗原競爭方法類似的程序。在單輪選擇中，可以將噬菌體富集20-1，000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)基上生長和對其再進行選擇循環(huán)。選擇的效率取決于許多因素,包括洗滌期間解離的動力學(xué)，以及單個噬菌體上的多個抗體片段是否能夠同時與抗原結(jié)合?？梢酝ㄟ^采用短時間的洗滌、多價噬菌體展示、和固相中抗原的高包被密度，保留具有快解離動力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體。高密度不僅可以通過多價相互作用穩(wěn)定噬菌體,而且利于已解離的噬菌體的再結(jié)合?？梢酝ㄟ^使用長時間洗絳和單價嗤菌體展示(如Bass等，Proteins, 8:309-314(1990)和WO 92/09690中描述)，和抗原的低包被密度(如Marks等，Biotechnol.，10:779-783(1992)中描述),
促進具有慢的解離動力學(xué)(和良好結(jié)合親和力)的抗體的選擇。可以在針對抗原具有不同親和力，甚至具有微小差異親和力，的噬菌體抗體之間進行選擇。然而,所選擇的抗體的隨機突變(例如，如在一些上述親和力成熟技術(shù)中進行的)可能導(dǎo)致許多突變體，其大多數(shù)與抗原結(jié)合，少數(shù)具有更高的親和力。使用有限的抗原,可以將非常高親和力的噬菌體競爭出來。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素化抗原進行孵育，但其中該生物素化抗原的摩爾濃度低于針對抗原的目標(biāo)摩爾親和力常數(shù)。然后,可以用鏈霉親和素包被的順磁珠捕獲高親和力結(jié)合的噬菌體。這樣的“平衡捕獲”允許根據(jù)抗體的結(jié)合親和力來選擇抗體，該方法的靈敏性允許從大大過量的較低親和力噬菌體中分離出親和力高少至2倍的突變體克隆。也可以操縱用于洗滌結(jié) 合到固相上的噬菌體的條件，以根據(jù)解離動力學(xué)來進行區(qū)分?？梢詫贵w克隆進行活性選擇?？梢酝ㄟ^下列方式選擇對應(yīng)于這樣的抗體的Fv克隆(1)從如上所述的噬菌體文庫中分離抗體克隆，任選地通過在合適的細(xì)菌宿主中擴大該分離的噬菌體克隆群體，而擴增該群體；(2)選擇抗原和第二蛋白質(zhì)，其中針對該抗原和第二蛋白質(zhì),分別期望獲得阻斷活性和非阻斷活性；(3)將抗原結(jié)合性噬菌體克隆吸附到固定的抗原上；(4)使用過量的第二蛋白質(zhì)洗脫任何不需要的克隆,所述克隆識別與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇重疊或相同的抗原決定簇；和(5)洗脫步驟(4)后保持吸附的克隆?？蛇x地，可以通過將此處描述的選擇程序重復(fù)一次或多次來進一步富集具有期望的阻斷/非阻斷特性的克隆。編碼本發(fā)明的雜交瘤來源的單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA,可以使用常規(guī)程序容易地分離和測序(例如，通過使用設(shè)計以從雜交瘤或噬菌體DNA模板中特異擴增目的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離后，可以將DNA置于表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)染到原本不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中合成期望的單克隆抗體。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中重組表達的綜述文章包括Skerra等，Curr. Opinion inTmmunol·, 5:256(1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs, 130:151(1992)?？梢詫⒈景l(fā)明的編碼Fv克隆的DNA與已知的編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的DNA序列(例如,可以從Kabat.等，同上引文中得到的合適的DNA序列)組合，以形成編碼全長或部分長度重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)理解的是，可以將任何同種型的恒定區(qū)(包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)用于該目的，并且這樣的恒定區(qū)可以來自任何人或動物物種?？梢詫碜砸环N動物(例如人)物種的可變區(qū)DNA的Fv克隆與另一種動物物種的恒定區(qū)DNA融合,形成“雜種”全長重鏈和/或輕鏈的編碼序列,這包括在如本文中使用的定義“嵌合的”和“雜種”抗體中。在優(yōu)選的實施方案中，將來自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合,形成全人的、全長或部分長度的重鏈和/或輕鏈的編碼序列。也可以例如,通過以人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替代來自雜交瘤克隆的同源鼠序列(例如，如 Morrison 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)的方法中)，對編碼來自本發(fā)明雜交瘤的抗體的DNA進行修飾。對于編碼雜交瘤或Fv克隆來源的抗體或片段的DNA，還可以通過將該免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接,進行另外的修飾。通過該方式,可以制備具有本發(fā)明的Fv克隆或雜交瘤克隆來源的抗體的結(jié)合特異性的“嵌合的”或“雜種”抗體?？乖禺愋员景l(fā)明適用于具有任何合適抗原結(jié)合特異性的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體對抗原特異,所述抗原是生物學(xué)重要的多肽。更優(yōu)選地,本發(fā)明的抗體可以用于在動物中治療或診斷疾病或病癥。治療性抗體的非限定性例子包括抗VEGF、抗c-met、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗⑶40、抗組織因子(TF)、抗ffiiR2和抗TrkC抗體。也涉及針對非多肽抗原(例如腫瘤相關(guān)糖脂抗原)的抗體。當(dāng)抗原是多肽時,其可以是跨膜分子(例如,受體,例如受體酪氨酸激酶)，或是配體，例如生長因子。示例性抗原包括分子,例如腎素；生長激素,包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -I-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，例如VIIIC因子、IX因子、組織因子(TF)和von Willebrands因子；抗凝血因子,例如蛋白C ; 心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β ;腦啡肽；MNTES(受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達和分泌的因子)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒氏(Muellerian)抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ;細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA),例如CTLA-4 ;抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白A或D ;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如骨源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),神經(jīng)營養(yǎng)素_3、-4、-5或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6),或神經(jīng)生長因子,例如NGF β ;血小板源生長因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長因子，例如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),例如 TGF- α 和 TGF- β ,包括 TGF- β I、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4 或 TGF- β 5 ;胰島素樣生長因子-I和-I I (IGF-1和IGF-11) ；des (1-3) -IGF-1 (腦IGF-1),胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8、CD-19、CD20和CD40 ;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP) rf 擾素，例如千擾素-α、_β、和-Y ;集落刺激因子(CSFs)，例如Μ-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白細(xì)胞介素(ILs)，例如IL-1至IL-10 ;超氧化物歧化酶；1'細(xì)胞受體；表面膜蛋白；促衰變因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；整聯(lián)蛋白，例如CDlla, CDllb, CDllc, CD18、I CM, VLA-4和VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原,例如HER2、HER3或HER4受體；以及任何以上所列多肽的片段。本發(fā)明包括的抗體的示例性抗原包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD46 ；ErbB受體家族的成員，例如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細(xì)胞粘著分子,例如 LFA-UMacUplSO. 95、VLA_4、ICAM-UVCAM、α 4/β 7 整聯(lián)蛋白，和 α ν/ β 3 整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞基(例如，抗CDlla、抗CD18或抗OHlb抗體);生長因子,例如VEGF ;組織因子(TF) JGF-β α干擾素(α-IFN);白細(xì)胞介素,例如IL-8 ；IgE ;血型抗原Apo2 ；死亡受體；flk2/fl.t3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ;蛋白C等。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合(在一些實施方案中,特異性結(jié)合)c-met。抗體片段本發(fā)明涵蓋抗體片段。在某種情況下，使用抗體片段而不是整個抗體是具有優(yōu)勢的。較小的片段大小允許快速清除，和可以導(dǎo)致更好地接近實體瘤。已開發(fā)出各種用于產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段源于完整抗體的蛋白7_K角軍消化(見例如，Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992);和 Brennan 等，Science, 229:81 (1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生。Fab、Fv和ScFv抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并從中分泌，由此允許容易地產(chǎn)生大量的這些片段?？梢詮囊陨嫌懻摰目贵w噬菌體文庫中分離抗體片段?？蛇x地,可以從大腸桿菌中直接回收Fab’ -SH片段并進行化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab’ )2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據(jù)另一種方法,可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab’)2片段。包含挽救受體結(jié)合表位殘基的具有增加的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab’)2片段描述于美國專利號5，869，046中。用于產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)對技術(shù)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)(見例如，WO 93/16185;美國專利號5，571，894和5，587，458)。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點
但缺乏恒定區(qū)的抗體種類；因此,它們適合于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？梢詷?gòu)建sFv融合蛋白，產(chǎn)生效應(yīng)子蛋白在sFv的氨基或羧基端的融合。見《抗體工程》(AntibodyEngineering)，Borrebaeck編輯，同上?？贵w片段也可以是“線性抗體”，例如，如例如美國專利號5，641，870中描述的。這樣的線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。因此,在一些實施方案中，抗c-met抗體是包含F(xiàn)e區(qū)的單臂抗體(即，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)形成單個抗原結(jié)合臂)，其中Fe區(qū)包含第一和第二 Fe多肽，其中第一和第二Fe多肽以復(fù)合物形式存在,形成與包含所述抗原結(jié)合臂的Fab分子相比較增加所述抗體片段穩(wěn)定性的Fe區(qū)。本文中進一步描述了單臂抗體。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域已知用于人源化非人抗體的各種方法。例如，人源化抗體可以具有從非人來源引入到其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其一般取自“輸入”可變區(qū)。可以基本上按照Winter及其同事的方法(Jones 等(1986)Nature321:522-525;Riechmann 等(1988)Nature332:323-327; Verhoeyen 等(1988) Science 239:1534-1536)，通過用超變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列來進行人源化。因此，這樣的“人源化的”抗體是嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中顯著不足完整的人可變區(qū)已經(jīng)被來自非人物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體一般是人抗體,其中一些超變區(qū)殘基和可能一些FR殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。選擇人可變區(qū)(輕鏈和重鏈)用于制備人源化抗體,對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最佳配合”(best-Ht)方法,將嚙齒類動物抗體的可變區(qū)的序列，相對于已知的人可變區(qū)序列的文庫進行篩選。然后將與嚙齒類動物最接近的人序列接受為用于人源化抗體的人構(gòu)架(Sims 等，(1993) J. Immunol. 151:2296;Chothia 等,(1987).J. Mol.Biol. 196:901)。另一個方法使用特定的構(gòu)架,所述構(gòu)架來自特定輕鏈或重鏈亞類的所有人抗體的共有序列。該相同的構(gòu)架可以用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，(1992) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta 等，(1993) J. Immunol. , 151:2623)。另外重要的是,人源化抗體保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)該目標(biāo)，根據(jù)一種方法，對親本序列和各種人源化概念產(chǎn)物，使用該親本和人源化序列的三維模型進行分析，由此制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是通?？傻玫?，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉?？梢缘玫接糜诿枋龊驼故舅x的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過檢查這些展示,可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析能夠影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過這種方式,可以選擇FR殘基,將其與受體和輸入序列組合，以獲得期望的抗體特性,例如對靶標(biāo)抗原(一種或多種)的增加的親和力。通常，超變區(qū)殘基直接和最顯著地參與影響抗原結(jié)合。人抗體可以通過將選自人源噬菌體展示文庫的Fv克隆可變區(qū)序列與上述已知的人恒定區(qū)序列結(jié)合，構(gòu)建本發(fā)明的人抗體。可選地,可以通過雜交瘤方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜種雜交瘤(heteromyloma)細(xì)胞系已由例如Kozbor J. Immunol. , 133:3001 (1984) ; Brodeur 等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987);和 Boerner 等,J. Immunol. , 147:86 (1991)描述?，F(xiàn)在可以產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)，其經(jīng)免疫后能夠在不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生完整的人抗體庫。例如，已有描述,嵌合和胚系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失將導(dǎo)致內(nèi)源抗體廣生被完全抑制。在這樣的胚系突變體小鼠中轉(zhuǎn)移人胚系免疫球蛋白基因系列，將導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。見例如，Jakobovits 等,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551(1993);Jakobovits 等,Nature,362:255 (1993) ; Bruggermann 等，Year in Immunol. , 7:3’3 (1993) 0也可以使用基因改組,從非人(例如,嚙齒類動物)抗體衍生出人抗體，其中人抗體具有與初始非人抗體類似的親和力和特異性。根據(jù)該方法(其也被稱為“表位印記”)，以人V區(qū)基因的庫取代通過如上所述的噬菌體展示技術(shù)獲得的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū),創(chuàng)建非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合體的群體。以抗原進行選擇，導(dǎo)致分離非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab,其中人鏈恢復(fù)了在最初噬菌體展示克隆中對應(yīng)的非人鏈移去后被破壞的抗原結(jié)合位點，即表位控制(印記)人鏈伙伴的選擇。當(dāng)重復(fù)該過程以取代剩下的非人鏈后,獲得人抗體(見PCT WO 93/06213,公布于1993年4月I日)。與傳統(tǒng)的通過CDR嫁接進行的非人抗體的人源化不同，該技術(shù)提供完全的人抗體，其沒有非人來源的FR或CDR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體是具有對至少兩個不同抗原的結(jié)合特異性的單克隆、優(yōu)選人或人源化、抗體。在該情況中，一個結(jié)合特異性可以針對抗原，另一個可以針對任何其它抗原。不例性的雙特異性抗體可以結(jié)合抗原的兩個不同的表位。雙特異性抗體也可以用于將細(xì)胞毒性劑定位至表達抗原的細(xì)胞。這些抗體擁有抗原結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒素藥物(例如,皂草毒蛋白、抗千擾素α、長春花生物堿、蓖麻蛋白A鏈、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab’)2雙特異性抗體)來制備。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域已知。傳統(tǒng)上，重組產(chǎn)生雙特異性抗體是基于共表達兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈,其中兩個重鏈具有不同的特異性(Milstein和Cuello, Nature, 305:537 (1983))。因為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生潛在的10種不同抗體分子的混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化(通常通過親和力色譜步驟)相當(dāng)困難，產(chǎn)物產(chǎn)率低。類似的程序公開于 WO 93/08829 (1993 年 5 月 13 日公布)，和于 Traunecker 等，EMBO J. , 10:3655(1991)中。根據(jù)一種不同的更優(yōu)選的方法,將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選于至少一個融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體和,如果期望的話，免疫球蛋白輕鏈的DNA,插入到分開的表達載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。對于在構(gòu)建中使用不等比率的3種多肽鏈提供最優(yōu)產(chǎn)量的實施方案,這使得可以極大靈活性地調(diào)整3種多肽片段的相互比例。然而，當(dāng)以相等比率表達至少兩種多肽鏈可以導(dǎo)致高產(chǎn)，或當(dāng)比率不是特別重要時，可以在一個表達載體中插入兩種或所有3種多肽鏈的編碼序列。在該方法的優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由在一個臂中的具有第一結(jié)合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈和在另一個臂中的雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。已發(fā)現(xiàn)，該不對稱結(jié)構(gòu)利于期望的雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈 組合中分離，這是因為免疫球蛋白輕鏈在雙特異性分子的僅一半中存在，這提供了一種便利的分罔方式。該方法公開于WO 94/04690中。產(chǎn)生雙特異性抗體的更詳細(xì)說明，見例如Suresh 等，Methods in Enzymology, 121:210(1986)。根據(jù)另一種方法,可以對一對抗體分子之間的界面進行改造，以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比達到最大。優(yōu)選的界面包含抗體恒定區(qū)的至少一部分ChS結(jié)構(gòu)域。在該方法中，以較大的側(cè)鏈(例如,酪氨酸或色氨酸)(結(jié)或突起)取代來自第^-抗體分子的界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈。在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與該大的側(cè)鏈具有相同或相似大小的互補性“腔”(洞)，方式是以較小的氨基酸(例如，丙氨酸或蘇氨酸)取代大的氨基酸側(cè)鏈。這提供了用于增加異源二聚體產(chǎn)量、使之超過例如同源二聚體等其它不需要的終產(chǎn)物的機制。本文中進一步描述了結(jié)和洞。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“雜綴合”抗體。例如,雜綴合體中的抗體之一可以與親和素蛋白偶聯(lián)，另一個與生物素連接。這樣的抗體已經(jīng)例如被建議用來將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(美國專利號4, 676, 980)，和用于治療HIV感染(W0 91/00360、WO92/00373和EP 03089)?？梢允褂萌魏畏奖愕慕宦?lián)方法制備雜綴合體抗體。合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域公知,其與許多交聯(lián)技術(shù)一同公開于美國專利號4，676，980中。用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已在文獻中得到描述。例如,可以使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，Science, 229:81 (1985)描述了其中將完整抗體進行蛋白酶水解切割以產(chǎn)生F(ab’)2片段的程序。以二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉將這些片段還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇和防止分子間二硫化物形成。然后,將所產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通過以巰基乙胺進行還原,將Fab’-TNB衍生物之一再轉(zhuǎn)化為Fab’ -巰基化合物，并與等摩爾量的另一 Fab’ -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可以用作選擇性固定化酶的試劑。最近的進展使從大腸桿菌中直接回收Fab，-SH片段變得容易，可以對所述片段進行化學(xué)偶聯(lián)，以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175:217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F (ab’)2分子的產(chǎn)生。每個Fab’片段分別從大腸桿菌中分泌，對其進行直接的體外化學(xué)偶聯(lián)，以形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠與過量表達HER2受體的細(xì)胞和正常的人T細(xì)胞結(jié)合，以及引發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞對人乳房瘤靶標(biāo)的溶解活性。用于制備和直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已被描述。例如，已使用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148 (5) : 1547-1553 (1992)。通過基因融合,將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩個不同抗體的Fab’部分連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體同源二聚體以形成單體,然后重現(xiàn)氧化以形成抗體異源二聚體。該方法也可以用于產(chǎn)生抗體同源二聚體。由Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)描述的“雙抗體” (diabody)技術(shù)提供了可以用于制備雙特異性抗體片段的一個備選機制。該片段包含通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VII),所述接頭太短而不允許在相同鏈上的這兩個區(qū)域配對。因此，一個片段的VH和VL區(qū)被迫與另一個片段的互補VL和VH區(qū)配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。通過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另--個策略也已被報道。見 Gruber 等,J. Immunol. , 152:5368 (1994)。也可以考慮具有兩個以上效價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。Tutt等，J.ImmunoI. 147:60 (1991)。多價抗體多價抗體可以比雙價抗體更快地被表達抗體所結(jié)合的抗原的細(xì)胞內(nèi)化(和/或分解代謝)。本發(fā)明的抗體可以是具有3個或更多抗原結(jié)合位點的多價抗體(其非IgM類)(例如，四價抗體)，其可以通過重組表達編碼抗體的多肽鏈的核酸來容易地產(chǎn)生。多價抗體可以包含二聚化區(qū)和3個或多個抗原結(jié)合位點。優(yōu)選的二聚化區(qū)包括Fe區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由其組成)。在該情況下，抗體將包含F(xiàn)e區(qū)和位于Fe區(qū)氨基末端的3個或更多個抗原結(jié)合位點。本文中優(yōu)選的多價抗體包含3個至約8個，但優(yōu)選4個抗原結(jié)合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(優(yōu)選兩個多肽鏈)，其中該(一個或多個)多肽鏈包含兩個或更多個可變區(qū)。例如，多肽鏈(一個或多個)可以包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VDl是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)e是Fe區(qū)的一個多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，η為O或I。例如，多肽鏈(一個或多個)可以包括VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHl-VH-CHl-Fe區(qū)鏈。本文中多價抗體優(yōu)選還包含至少兩個(優(yōu)選4個)輕鏈可變區(qū)多肽。本文中的多價抗體可以，例如包含約2至約8個輕鏈可變區(qū)多肽。這里涉及的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)和任選地還包含CL區(qū)。抗體變體在一些實施方案中，涉及本文中描述的抗體的氨基酸序列修飾。例如,可能期望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖円氲娇贵w核酸中，或通過肽合成，可以制備抗體的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如在抗體的氨基酸序列中刪除、和/或插入,和/或取代殘基?？梢赃M行任何組合的刪除、插入和取代，以獲得最終構(gòu)建體,條件是最終構(gòu)建體擁有期望的特性?？梢栽诋a(chǎn)生序列時在對象抗體氨基酸序列中引入氨基酸改變。用于鑒定抗體中可以作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種有用方法,稱為·“丙氨酸掃描誘變”，如由 Cunningham 和 Wells (1989) Science, 244:1081-1085 所描述。在此，鑒定一個目標(biāo)殘基或一組目標(biāo)殘基(例如，帶電荷殘基,例如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并以中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)進行取代，以影響這些氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在取代位點或針對取代位點引入另外的或其它變體，精細(xì)化顯示出對取代具有功能敏感性的那些氨基酸位置。因此,盡管預(yù)先確定用于引入氨基酸序列變化的位點，但突變的性質(zhì)本身不需要預(yù)先確定。例如,為了分析給定位點上突變的性能，在目標(biāo)密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描或隨機誘變,對表達的免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合(其長度范圍從一個殘基到包含一百或更多個殘基的多肽)，以及序列內(nèi)部單個或多個 氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酸殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括抗體的N或C末端與酶(例如，對于ADEPT)或增加抗體的血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。N-連接的指將糖部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。二肽序列天冬酰胺_X_絲氨酸和天冬酰胺_X_蘇氨酸(具中X是除Γ脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于糖部分酶促附加到天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列之任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一連接到羥基氨基酸上，最通常地是絲氨酸或蘇氨酸上,盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。通過改變氨基酸序列以使其包含一個或多個上述三肽序列，可以方便地實現(xiàn)對抗體添加糖基化位點(用于N-連接的糖基化位點)。也可以通過在原抗體的序列中添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(或以其進行取代)，進行改變(對于O 連接的糖基化位點)。在抗體包含F(xiàn)e區(qū)時，可以改變與其連接的糖。例如，美國專利申請?zhí)?003/0157108 (Presta, L.)中描述了具有成熟糖結(jié)構(gòu)并且在抗體的Fe區(qū)缺乏巖藻糖附著的抗體。也見 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。WO2003/011878，Jean-Mairet等，和美國專利號6，602，684，Umana等中提及了在連接于抗體的Fe區(qū)的糖中具有平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。在連接到抗體的Fe區(qū)的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體報告于WO 1997/30087，Patel等中。關(guān)于具有改變的連接到 Fe 區(qū)的糖的抗體，也見 WO 1998/58964 (Raju, S.)和 WO 1999/22764 (Raju, S.)。關(guān)于具有修飾的糖基化的抗原結(jié)合分子，也見US 2005/0123546 (Umana等)。本文中優(yōu)選的糖基化變體包含F(xiàn)e區(qū)，其中連接到Fe區(qū)的糖結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。這樣的變體具有改良的ADCC功能?？蛇x地，在Fe區(qū)中還包含進一步提高ADCC的一個或多個氨基酸取代，所述取代例如，在Fe區(qū)的第298、333和/或334位(Eu殘基編號)的取代。關(guān)于“去巖藻糖的”或“巖藻糖缺乏的”抗體的出版物的例子包括US 2003/0157108 ;W02000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US200 2/016 43 28;US2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;W02005/035778;W02005/053742;Okazaki等，J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004);Yamane^Ohnuki等，Biotech. Bioeng. 87:614(2004)。產(chǎn)生去巖藻糖的抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖基化缺陷型 Lecl3 CHO 細(xì)胞(Ripka 等,Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);美國專利申請?zhí)?US 2003/0157108 Al, Presta, L;和 WO 2004/056312 Al, Adams 等，特別是于實施例11中)，以及敲除細(xì)胞系,例如Cl -I, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8敲除CHO細(xì)胞(Yamane-Ohnuki 等，Biotech. Bioeng. 87:614(2004))。在一個方面，本發(fā)明提供了這樣的抗體片段,其包括至少一個促進抗體片段中Fe序列的異源二聚化而將同源二聚化降到最低的特性。這樣的特性提高通過如本文中描述的本發(fā)明方法可獲得的免疫球蛋白群體的產(chǎn)量和/或純度和/或同質(zhì)性。在一個實施方案中，第一 Fe多肽和第二 Fe多肽在界面相遇/相互作用。在一些其中第一和第二 Fe多肽在界面相遇的實施方案中，第二 Fe多肽(序列)的界面包含突起(也稱為“結(jié)”)，所述突起可置于第一 Fe多肽(序列)的界面中的腔(也稱為“洞”)中。在一個實施方案中，第一 Fe多肽已從模板!原始多肽改變?yōu)榫幋a腔,或第二 Fe多肽已從模板!原始多肽改變?yōu)榫幋a突起，或兩者都發(fā)生。在一個實施方案中，第一 Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a腔，且第二 Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a突起。在一個實施方案中，第二 Fe多肽的界面包含突起,所述突起可置于第一 Fe多肽的界面中的腔中，其中腔或突起或兩者是已經(jīng)被引入到第^-和第二 Fe多肽的界面中的。在^-些其中第一和第二 Fe多肽在界面相遇的實施方案中，第一 Fe多肽(序列)的界面包含突起,所述突起可置于第二 Fe多肽(序列)的界·面中的腔中。在一個實施方案中，第二 Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a腔，或第一Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a突起,或兩者都發(fā)生。在一個實施方案中,第二 Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a腔,且第一 Fe多肽已從模板/原始多肽改變?yōu)榫幋a突起。在一個實施方案中，第一 Fe多肽的界面包含突起，所述突起可置于第二 Fe多肽的界面中的腔中，其中該腔或突起或兩者是已經(jīng)被引入到第一和第二 Fe多肽的界面中的。在一個實施方案中，突起和腔各包含天然存在的氨基酸殘基。在一個實施方案中，通過以比原始?xì)埢哂懈髠?cè)鏈體積的輸入殘基,取代來自模板/原始多肽的界面的原始?xì)埢?，產(chǎn)生包含突起的Fe多肽。在一個實施方案中,通過包括如下步驟的方法來產(chǎn)生包含突起的Fe多肽，在所述步驟中，以比原始?xì)埢哂懈髠?cè)鏈體積的輸入殘基的編碼多核苷酸，取代來自所述多肽的界面的原始?xì)埢木幋a多核苷酸。在一個實施方案中，原始?xì)埢翘K氨酸。在一個實施方案中，原始?xì)埢荰366。在^-個實施方案中,輸入殘基是精氨酸(R)。在一"Iv實施方案中，輸入殘基是苯丙氨酸(F)。在一個實施方案中，輸入殘基是酪氨酸(Y)。在一個實施方案中，輸入殘基是色氨酸(W)。在一個實施方案中，輸入殘基是R、F、Y或W。在一個實施方案中，通過取代模板/原始多肽中兩個或更多個殘基來產(chǎn)生突起。在一個實施方案中，包含突起的Fe多肽包含以色氨酸取代第366位蘇氨酸,氨基酸編號按照Kabat等(第 688-696 頁，于 Sequences of proteins of immunological interest,第 5版，卷I (1991 ;NIH, Bethesda, MD)中)的 EU 編號方案進行。在一些實施方案中，通過以比原始?xì)埢哂休^小側(cè)鏈體積的輸入殘基,取代模板/原始多肽的界面中的原始?xì)埢?產(chǎn)生包含腔的Fe多肽。例如,通過包括如下步驟的方法來產(chǎn)生包含腔的Fe多肽,在所述步驟中，以比原始?xì)埢哂休^小側(cè)鏈體積的輸入殘基的編碼多核苷酸，取代來自所述多肽的界面的原始?xì)埢木幋a多核苷酸。在一個實施方案中，原始?xì)埢翘K氨酸。在一個實施方案中，原始?xì)埢橇涟彼?。在一個實施方案中，原始?xì)埢抢野彼?。在一個實施方案中，輸入殘基不是半胱氨酸(C)。在一個實施方案中,輸入殘基是丙氨酸(A)。在一·"Iv實施方案中,輸入殘基是絲氨酸(S)。在一·"Iv實施方案中,輸入殘基是蘇氨酸(T)。在一個實施方案中，輸入殘基是纈氨酸(V)。可以通過取代模板/原始多肽中一個或多個原始?xì)埢鶃懋a(chǎn)生腔。例如,在一個實施方案中,包含腔的Fe多肽包含對兩個或多個選自絲氨酸、亮氨酸和酪氨酸的原始氨基酸的取代。在一個實施方案中，包含腔的Fe多肽包含兩個或多個選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和繳氨酸的輸入殘基。在一些實施方案中，包含腔的Fe多肽包含對兩個或更多個原始氨基酸的取代，所述原始氨基酸選自蘇氨酸、亮氨酸和酪氨酸,且其中以選自丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸的輸入殘基取代所述原始氨基酸。在一些實施方案中，被取代的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一個實施方案中，包含腔的Fe多肽包含以絲氨酸對第366位的蘇氨酸進行的取代，氨基酸編號按照Kabat等，同上的EU編號方案。在一個實施方案中,包含腔的Fe多肽包含以丙氨酸對第368位的亮氨酸進行的取代，氨基酸編號按照Kabat等，同上的EU編號方案進行。在^-個實施方案中，包含腔的Fe多肽包含以纈氨酸對第407位的酪氨酸進行的取代，氨基酸編號按照Kabat等，同上的EU編號方案進行。在一個實施方案中，包含腔的Fe多肽包含兩個或更多個氨基酸取代,所述取代選自T366S、L368A和Y407V,氨基酸編號按照Kabat等，同上的EU編號方案進行。在這些抗體片段的一些實施方案中,包含突起的Fe多肽包含以色氨酸對第366位的蘇氨酸進行的取代，氨基酸編號按照Kabat等，同上的EU編號方案進行。
在一個實施方案中，抗體包含F(xiàn)e突變,所述Fe突變構(gòu)成如W02005/063816中描述的“結(jié)”和“洞”。例如,洞突變可以是Fe多肽中T366A、L368A和/或Y407V之一或多個,結(jié)突變可以是T366W。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸(至少2個、至少3個、至少4個或更多個)殘基被不同的殘基取代。對于取代誘變最有意義的位點包括超變區(qū)，但也可以考慮FR改變。保守取代示于表A中“優(yōu)選取代”的標(biāo)題下。如果這樣的取代導(dǎo)致生物學(xué)活性改變,則可以引入更實質(zhì)性的改變(在表A中稱為“示例性取代”，或如以F在提交氨基酸類別時進一步描述的)，并篩選產(chǎn)物。表A
權(quán)利要求
1.制備抗體的方法,所述方法包括培養(yǎng)包含多核苷酸的宿主細(xì)胞,所述多核苷酸包括(I)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的第一翻譯起始區(qū)(TIR),其中該TIR包含共翻譯原核分泌信號序列；和(2)與編碼抗體輕鏈的多核苷酸有效連接的第二 TIR,其中該第二TIR包含共翻譯或翻譯后原核分泌信號序列，由此抗體在宿主細(xì)胞中表達后,重鏈和輕鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。
2.權(quán)利要求I的方法,其中第^-TIR包含STII或DsbA變體信號序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中第一翻譯起始區(qū)包含DsbA變體信號序列。
4.權(quán)利要求2的方法,其中第一翻譯起始區(qū)包含SEQID NOs: 1-10、36-39、41和42之一的序列。
5.權(quán)利要求1-4之任一的方法,其中第二翻譯起始區(qū)包含STII、DsbA、MalE或PhoA變體信號序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中第二翻譯起始區(qū)包含編碼PhoA或MalE變體信號序列的多核苷酸。
7.權(quán)利要求5的方法,其中第二翻譯起始區(qū)包含SEQID NOs. 1-14、16-24、26-39和41-42之一的序列。
8.權(quán)利要求1-7之任一的方法，其中宿主細(xì)胞還包含(3)與編碼Fe多肽的多核苷酸有效連接的第三翻譯起始區(qū)。
9.權(quán)利要求8的方法,其中第三翻譯起始區(qū)包含STII、PhoI或DsbA變體信號序列。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第三翻譯起始區(qū)包含PhoI或DsbA變體信號序列。
11.權(quán)利要求8的方法,其中第三翻譯起始區(qū)包含SEQID NOs: 23、24、26_39、41和42之一的序列。
12.權(quán)利要求1-11之任一的方法,其中第一和第二翻譯起始區(qū)提供大約相等的翻譯強度。
13.權(quán)利要求12的方法，其中相對翻譯強度為大約I或2。
14.權(quán)利要求8-10之任一的方法,其中第一、第二和第三翻譯起始區(qū)提供大約相等的翻譯強度。
15.權(quán)利要求14的方法，其中相對翻譯強度為大約I或2。
16.權(quán)利要求1-15之任一的方法,其中在宿主細(xì)胞中該多核苷酸還包含啟動子。
17.權(quán)利要求1.6的方法,其中啟動子是原核啟動子,其選自phoA、tac、Ipp、lac~~lpp、lac、ara和T7啟動子。
18.權(quán)利要求1-17之任一的方法,其中宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中原核細(xì)胞是大腸桿菌。
20.權(quán)利要求19的方法,其中大腸桿菌是內(nèi)源蛋白酶活性缺陷型菌株。
21.權(quán)利要求19或20的方法,其中大腸桿菌的基因型缺失degP和prc基因，并攜帶突變的spr基因。
22.權(quán)利要求1-21之任一的方法,其中宿主細(xì)胞還包含編碼至少一個原核多肽的多核苷酸，所述原核多肽選自DsbA、DsbC, DsbG和FkpA。
23.權(quán)利要求22的方法,其中多核苷酸編碼DsbA和DsbC0
24.權(quán)利要求1-23之任一的方法,其中宿主細(xì)胞包含共同編碼抗體的一個或多個多核苷酸。
25.權(quán)利要求1-24之任一的方法,其中方法還包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中回收抗體。
27.權(quán)利要求25或26的方法,其中方法還包括將所回收的抗體與藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或載體組合，以制備包含抗體的藥物制劑。
28.權(quán)利要求25或26的方法,其中所形成的免疫球蛋白多肽復(fù)合物的至少50%為抗體。
29.權(quán)利要求28的方法,其中所形成的免疫球蛋白多肽復(fù)合物的至少70%為抗體。
30.權(quán)利要求1-29之任一的方法,其中抗體是單克隆抗體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中抗體是嵌合抗體、親和力成熟抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、抗體片段或人抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中抗體片段是單臂抗體。
33.權(quán)利要求32的方法,其中抗體結(jié)合c-met.。
34.權(quán)利要求30的方法，其中抗體是雙特異性抗體。
35.包含變體翻譯起始區(qū)(TIR)的多核苷酸，其中變體TIR包含PhoA、MalE、DsbA或ST11分泌信號區(qū)的核酸變體。
36.權(quán)利要求35的多核苷酸,其中變體TIR包含SEQID NOs. 1-14、16-24、26_39、41_42之一的序列。
37.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所述變體翻譯起始區(qū)的翻譯強度小于野生型翻譯起始區(qū)的翻譯強度。
38.權(quán)利要求35-37之任一的多核苷酸,與編碼異源多肽的多核苷酸有效連接，由此異源多肽在宿主細(xì)胞中表達時，異源多肽折疊和組裝形成具有生物學(xué)活性的異源多肽。
39.權(quán)利要求38的多核苷酸,其中異源多肽選自抗體重鏈和抗體輕鏈。
40.權(quán)利要求39的多核苷酸,其中異源多肽包括(a)抗體重鏈和(b)抗體輕鏈。
41.權(quán)利要求30的多核苷酸,其中異源多肽還包括(C)Fc多肽。
42.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中異源多肽是抗體，其中多核苷酸包括(I)與編碼抗體重鏈的多核苷酸有效連接的第一 TIR,其中該TIR包含共翻譯原核分泌信號序列;和(2)與編碼抗體輕鏈的多核苷酸有效連接的第二 TIR,其中第二 TIR包含共翻譯或翻譯后原核分泌信號序列，由此抗體在宿主細(xì)胞中表達時,重鏈和輕鏈折疊和組裝形成具生物學(xué)活性的抗體。
43.權(quán)利要求42的多核苷酸,還包含(3)與編碼Fe多肽的多核苷酸有效連接的第三TIR。
44.權(quán)利要求35-43之任^-的多核苷酸,其還包含啟動子。
45.權(quán)利要求44的多核苷酸，其中啟動子是原核啟動子，其選自phoA、tac、Ipp、lac-lpp、lac、ara 和 T7 啟動子
46.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中異源多肽是蛋白酶、免疫粘附素、或受體的胞外結(jié)構(gòu)域。
47.權(quán)利要求42-45之任一的多核苷酸,其中抗體是單克隆抗體。
48.權(quán)利要求42-45之任一的多核苷酸，其中抗體是嵌合抗體、親和力成熟抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、抗體片段或人抗體。
49.權(quán)利要求48的多核苷酸，其中抗體片段是單臂抗體。
50.權(quán)利要求49的多核苷酸，其中抗體結(jié)合c-met。
51.權(quán)利要求48的多核苷酸,其中抗體是雙特異性抗體。
52.權(quán)利要求49或51的多核苷酸,其中抗體重鏈包含突變T366A、L368A、Y407V和/或T366W中的一個或多個。
53.權(quán)利要求49的多核苷酸,其中Fe多肽包含突變T366A、L368A、Y407V和/或T366W中的一個或多個。
54.通過權(quán)利要求1-34之任一的方法獲得的抗體。
55.包含權(quán)利要求54的抗體的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于從細(xì)菌分泌異源多肽的信號序列。本發(fā)明還涉及重組多肽及其應(yīng)用。
文檔編號C07K16/00GK102933600SQ201080060730
公開日2013年2月13日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者M·馬里基, D·E·萊利 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司