專利名稱：修飾的cry1ca殺蟲cry蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的Cry殺蟲蛋白及其用于控制害蟲的用途。
背景技術：
秋粘蟲[Fallarmy worm, FAW ;草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)]引起對玉米和其他作物例如大豆和棉花的嚴重損害。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, B. t.)是一種土壤媒介的細菌,它產生殺蟲晶體蛋白，后者被稱為δ內毒素或Cry蛋白。Cry蛋白是口毒性的,其通過對易感昆蟲的中腸細胞起作用而發(fā)揮功能。在該網站維護并規(guī)律地更新大量S內毒素的列表lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro, html。 表達編碼Cry蛋白的基因的轉基因玉米，特別是CrylF，提供了商業(yè)化水平的抗FAW效果。盡管FAW抗性轉基因玉米獲得成功，抗性昆蟲種群發(fā)展的可能性仍威脅著Cry蛋白在FAW控制中的長期耐用性，并帶來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展新的Cry蛋白以控制FAW和其它昆蟲的需求。對B. t. Cry蛋白有抗性的昆蟲能通過數(shù)種機制而發(fā)展(Heckel et al. , 2007,Pigott和Ellar，2007)。已經在昆蟲中鑒別出Cry蛋白的多種受體蛋白類別，而每種受體類別中存在多種實例。對流行的Cry蛋白的抗性可能通過受體蛋白的鈣粘蛋白結構域的毒素結合部分的突變而發(fā)展?？剐缘倪M一步的方法是通過原毒素處理蛋白酶來介導。因而，鱗翅目的物種中對Cry毒素的抗性具有復雜的遺傳學基礎，具有至少4種不同的，主要的抗性基因。對Cry蛋白抗性的鱗翅目昆蟲已經在以下范圍發(fā)展起來小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik, et al. , 1994),粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) (Janmaat and Myers 2003,2005),和玉米夜蛾(Helicoverpa zeae) (Tabashnik et al. , 2008) 發(fā)展新的高潛力 Cry蛋白將提供管理FAW和其它害蟲的額外工具。在轉基因玉米中聯(lián)合產生的具有不同類型作用的Cry蛋白將限制FAW昆蟲抗性的發(fā)展，并保護B. t.技術在害蟲控制中的長期效用。發(fā)明概述本發(fā)明提供了殺蟲B. t. Cry蛋白，包括本文指定為DIG-109和DIG-152的蛋白，以及DIG-109和DIG-152的變體，編碼這些蛋白的核酸，用這些蛋白控制害蟲的方法，在轉基因宿主細胞中產生這些蛋白的方法，以及生產這些蛋白的轉基因植物。如實施例I所述，DIG-109和DIG-152蛋白包含由B. t. CrylCa核心毒素片段和CrylAb原毒素片段組成的嵌合肽。也描述了 DIG-109和DIG-152蛋白的殺蟲活性變體。本文報告的一個驚人的發(fā)現(xiàn)是DIG-109和DIG-152蛋白對CrylF抗性的秋粘蟲幼蟲和甘蔗螟蟲幼蟲種群具有活性。從而，DIG-109和DIG-152蛋白是用于控制鱗翅目害蟲的理想候選者。該蛋白可以單獨或與其它Cry蛋白例如CrylF, CrylAb,和CrylAc聯(lián)合使用，以控制抗性昆蟲種群的發(fā)展。對于這些害蟲的討論，參見例如Tabashnik，PNAS (2008)，vol.105 no.49，19029-19030。DIG-109和DIG-152的殺蟲活性片段，以及編碼這些片段的核苷酸，是本發(fā)明的另
一個方面。
在一個實施方式里本發(fā)明提供了分離的DIG-109蛋白多肽，包含選自以下的核心毒素片段包含SEQ ID NO: I的28-619殘基的氨基酸序列的多肽；包含具有與SEQ ID NO: I的28-619殘基的氨基酸序列至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；包含SEQ ID NO: I的28-619殘基的氨基酸序列并具有最多20個氨基酸的取代、刪除或改變且不反向影響SEQ ID NO: I編碼的蛋白的表達或活性的多肽。在另一個實施方式里本發(fā)明提供了分離的DIG-109毒素蛋白，包含選自以下的核心毒素片段 包含SEQ ID NO: I的1-619殘基的氨基酸序列的多肽；包含具有與SEQ ID NO: I的1_619殘基的氨基酸序列至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；包含SEQ ID NO: I的1-619殘基的氨基酸序列并具有最多20個氨基酸的取代、刪除或改變且不反向影響SEQ ID NO: I編碼的蛋白的表達或活性的多肽。在另一個實施方式里本發(fā)明提供了包含DIG-109蛋白的植物。在另一個實施方式里本發(fā)明提供了控制害蟲種群的方法，包括使所述種群與殺蟲有效量的DIG-109蛋白接觸。在另一個實施方式里本發(fā)明提供了編碼DIG-109蛋白的分離的核酸。在另一個實施方式里本發(fā)明提供了 DNA構建體，其包含編碼DIG-109蛋白的核苷酸序列可操作地連接至啟動子，其中所述啟動子不源自蘇云金芽孢桿菌并能夠在植物中驅動表達。本發(fā)明也提供了包含該DNA構建體穩(wěn)定整合進其基因組的轉基因植物，以及保護植物免于蟲害的方法，包括將該構建體引入所述植物中。序列概述SEQ ID NO: I CrylCa 核心毒素片段；619aaSEQ ID NO:2 第一 CrylAb 原毒素片段；545aaSEQ ID NO: 3 DIG-152 嵌合蛋白;1164aa(Pf 版本)SEQ ID NO:4 第二 CrylAb 原毒素片段；545aaSEQ ID NO:5 DIG-IO9 嵌合蛋白；IIMaa(玉米版本)SEQ ID NO:6 CrylCa436 多肽；IOaaSEQ ID NO:7 CrylCa591 多肽；10aaSEQ ID NO:8 編碼 DIG-109 的玉米-優(yōu)化的 CDS ；3492bpSEQ ID NO:9 26卩35寡核苷酸；21社SEQ ID NO: 10 ZGP3A 寡核苷酸；21ntSEQ ID NO: 11 TQZGP3 寡核苷酸；23ntSEQ ID NO: 12 DSM2S 寡核苷酸；17ntSEQ ID NO: 13 DSM2A 寡核苷酸；19ntSEQ ID NO: 14 DSM2FQ 寡核苷酸；20ntSEQ ID NO: 15 CRYlCaS 寡核苷酸；ISntSEQ ID NO: 16 CRYlCaA 寡核苷酸；18nt
SEQ ID NO: 17 CrylCa 寡核苷酸；23ntSEQ ID NO: 18 AADlS 寡核苷酸；20ntSEQ ID NO: 19 AADlA 寡核苷酸；22ntSEQ ID NO:20 AADl 寡核苷酸；24ntSEQ ID N0:21 YlCAS 寡核苷酸；18ntSEQ ID NO:22 YlCAR 寡核苷酸；18ntSEQ ID NO :23 F6Y1CA 寡核苷酸；23nt·
SEQ ID NO :24 IVF-Taq 寡核苷酸；18ntSEQ ID NO :25 IVR-TAQ 寡核苷酸；19ntSEQ ID NO :26 IV-Probe 寡核苷酸；26ntSEQ ID NO:27 DIG-110 ；1079aaSEQ ID NO:28 玉米-優(yōu)化的 DIG-110 編碼區(qū)域；3237bpSEQ ID NO:29 DIG-111 ；543aaSEQ ID NO:30 玉米-優(yōu)化的 DIG-111 編碼區(qū)域；1629bpSEQ ID N0:31 DIG-112 ;1044aaSEQ ID NO:32 玉米-優(yōu)化的 DIG-112 編碼區(qū)域；3132bpSEQ ID NO:33 DIG-113 ;508aaSEQ ID NO:34 玉米-優(yōu)化的 DIG-113 編碼區(qū)域；1524bpSEQ ID NO:35 DIG-114 ;582aaSEQ ID NO:36 玉米-優(yōu)化的 DIG-114 編碼區(qū)域；1746bp發(fā)明詳述DIG-109和DIG-152蛋白，及其殺蟲活件變體。除了全長的SEQ ID N0:5的DIG-109蛋白和SEQ ID N0:3的DIG-152蛋白之外，本發(fā)明包含殺蟲活性變體。對于術語“變體”，申請人想要包括片段，某些刪除或插入的突變體，及某些融合蛋白。DIG-109和DIG-152的CrylCa核心毒素片段是經典的三結構域Cry蛋白(classic three-domain Cry protein)。作為描述包括在本發(fā)明內的DIG-109和DIG-152蛋白變體的前言，有必要簡要地回顧通常的和特別是DIG-109和DIG-152蛋白毒素的三結構域Cry蛋白的結構。大部分的蘇云金芽孢桿菌δ內毒素晶體蛋白分子由兩個功能性片段組成。蛋白酶抗性核心毒素是第一片段并對應于所述蛋白分子的約前一半。全長約130kDa的原毒素分子在昆蟲腸道內被通過蛋白酶快速加工為抗性核心片段。在該過程中被刪除的片段在本文中被稱為“原毒素片段”。原毒素片段被認為參與毒素晶體形成(Arvidson et al.，(1989))。原毒素片段從而可能通過減少毒素分子的蛋白酶加工(Haider et al. , (1986))或降低毒素可溶性(Aronson et al.，(1991))來限制核心到昆蟲的接近從而傳達部分昆蟲特異性。B.t.毒素，即使在某個類中，也在其長度和從核心毒素片段向原毒素片段轉變的精確定位上有所不同。核心毒素片段向原毒素片段的轉變典型地發(fā)生在毒素全長的約50%至約60%之間。SEQ ID N0:3公開了 DIG-152多肽全長的1164個氨基酸的序列，其中N-端619個氨基酸包含以SEQ ID NO: I公開的CrylCa核心毒素。SEQ ID NO:5公開了 DIG-109多肽全長的1164個氨基酸的序列，其中N-端619個氨基酸包含CrylCa核心毒素。已經確定了CrylAal, Cry2Aal, Cry3Aal, Cry3Bbl, Cry4Aa, Cry4Ba 和 Cry8Eal 的三維晶體結構。這些核心毒素的結構非常相似并由三個具有下文所述特征的不同結構域組成(綜述于 de Maagd et al. , 2003)。結構域I是七α -螺旋束，其中螺旋5被6個兩性螺旋所包圍。該結構域涉及孔的形成并與其它孔形成蛋白包括溶血素和大腸桿菌素具有同源性。CrylCa核心毒素蛋白的結構域I包含SEQ ID NO: I的36-254位氨基酸殘基。[應當理解DIG-109和DIG-152嵌合蛋白包含CrylCa核心毒素片段，從而分配給如SEQ ID NO: I中公開的CrylCa核心毒素片段的氨基酸序列的等同物也適用于SEQ ID Ν0:5中公開的DIG-109嵌合蛋白的氨基酸序列和SEQ ID NO:3中公開的DIG-152嵌合蛋白的氨基酸序列。]結構域II由3個反平行β折疊組裝在一個β三棱柱而形成。該結構域的環(huán)在結合昆蟲中腸受體中扮演重要角色。在CrylA蛋白中，在結構域II β折疊頂端暴露環(huán)的表面涉及結合鱗翅目鈣粘蛋白受體。Cry3Aa結構域II環(huán)以類似的方式結合馬鈴薯 甲蟲(Leptinotarsa decemlineata,也稱為科羅拉多馬鈴薯甲蟲)的膜相關金屬蛋白酶(Ochoa-Campuzano et al. ,2007)。結構域II與某些碳水化合物結合蛋白包括卵黃和jacaline具有同源性。CrylCa核心毒素蛋白包含SEQ ID NO: I的262-458位氨基酸殘基。結構域III是2個反平行β折疊的β三明治結構。結構上該結構域與蛋白質例如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等的碳水化合物結合結構域有關。結構域III結合受體蛋白的某些類并可能參與與第二個類的受體作用的寡聚毒素前核的插入，其實例是在CrylA蛋白的情況下的氨基肽酶和堿性磷酸酶(Pigott and Ellar, 2007)。類似的Cry結構域III受體也在鞘翅目中鑒別出來。保守的B.t.序列塊2和3分別位于結構域II的N-端和C-端附近。因此，這些保守序列塊2和3是3個功能性結構域之間大致的邊界區(qū)域。這些保守DNA的區(qū)域和蛋白同源性已經被用于開發(fā)工程性重組B.t.毒素(US PatentNo. 6090931, WO 1991/01087, WO 1995/06730, WO 1998/022595)。CrylCa 蛋白的結構域 III包含SEQ ID NO: I的468-617位氨基酸殘基。已經報道結構域I的α-螺旋I被移除之后受體結合。Aronson et al. (1999)證明了結合至BBMV的CrylAc被保護免受蛋白酶K從殘基59開始的切斷，即正好在α -螺旋I之后；類似的結果也被CrylAb所引用。Gomez et al.，(2002)發(fā)現(xiàn)在BBMV受體結合上形成的CrylAb寡聚體缺乏結構域I的α -螺旋I部分。同樣，Soberon et al. , (2007)已經展示了 CrylAb和CrylAc的缺少在Cry三維結構上包含α -螺旋I的約60個氨基酸的N-端缺失突變體能夠將分子量約60kDa的單體組裝進前核心，在鈣粘蛋白結合缺失的情況下。這些N-端缺失突變體被報道對Cry抗性昆蟲幼蟲有活性。進一步，Diaz-Mendozaet al.，(2007)描述了 43kDa和46kDa的CrylAb片段，其保留對地中海玉米螟(蛀莖夜蛾，Sesamia nonagrioides)的活性。這些片段被證實包括氨基酸殘基116-423 ;然而其精確的氨基酸序列并未被闡明，而這些蛋白水解片段的活性機理也是未知的。Gomez et al.，(2002), Soberon et al. , 2007 和 Diaz-Mendoza et al.，(2007)的結果與 Hofte et al.，(1986)的形成對照，后者報道了缺失CrylAb的N-端36個氨基酸會導致殺蟲活性的丟失。由于其結構已知，通過比較CrylCa氨基酸序列和Cry8Eal的氨基酸序列，我們已經推論出CrylCa核心毒素的結構域I中的螺旋1，2A，2B, 3和4的起始和結束點，以及他們之間的空隙(spacer)區(qū)域的位置。這些位置描述于表I。表I. CrylCa核心毒素蛋白的計劃的α -螺旋的氨基酸坐標。
DIG-109和DIG-152的氨基末端缺失突變體。在一個方面本發(fā)明提供了 DIG-109和DIG-152的突變體，其中α -螺旋1，2Α和2Β的全部或部分被刪除以改進殺蟲活性并避免昆蟲發(fā)展抗性。這些改變用于提供具有改進的性能的DIG-109和DIG-152的突變體，例如改進的目標昆蟲型譜，潛力，和昆蟲抗性管理。在本發(fā)明的一些實施方式里，對象的改變可能影響原毒素活性的效果和核心形成，導致昆蟲中毒。更特別地，為了提供具有改進的性能的DIG-109和DIG-152的突變體，描述了逐步刪除以去除編碼N-端的基因的部分。該刪除去除了結構域I中α -螺旋I的全部和α -螺旋2的全部或部分，同時保留α _螺旋3至7的結構完整性。該發(fā)明方案從而部分涉及通過操作結構域I的α-螺旋組分以改進Cry蛋白效果，為了更有效的核心形成。更特別地，該發(fā)明的方案部分涉及改進的DIG-109和DIG-152蛋白，其設計為具有N-端缺失，該區(qū)域具有推定的與Cryl蛋白的結構域I中α -螺旋I和2 二級結構的同源性。為改進DIG-109和DIG-152毒素的殺蟲特性的刪除可以在預測的α -螺旋2Α起始點之前開始，并可以在α-螺旋2Β的末端之后結束，但是優(yōu)選不延伸至α-螺旋3。在設計N-端缺失突變體的編碼序列時，將一個編碼蛋氨酸的ATG起始密碼子插入設計為表達所述缺失突變體的核苷酸序列的5’端。對于設計為用于轉基因植物中的序列，最好根據(jù)Varshavsky (1997)的“N-端法則”來粘合。其教導某些氨基酸當其作為蛋白質的N-端殘基時可以為蛋白在真核細胞中的不穩(wěn)定性和降解做出貢獻。例如，由酵母和哺乳動物細胞收集的數(shù)據(jù)顯示N-端不穩(wěn)定氨基酸殘基是F，L，W，Y，R，K，H，I，N, Q，D，E和可能的P。盡管特定蛋白的降解機制可以在物種之間有所不同，上文所述的N-端不穩(wěn)定氨基酸的同一'I"生的保守性暗示了類似的機制可能在植物細胞中起作用。例如，Worley et al.,(1998)發(fā)現(xiàn)在植物中，N-端法則包括堿性和芳香殘基。很可能在B.t.殺蟲蛋白對象的α -螺旋3的起始點附近植物蛋白酶的蛋白水解切斷可以暴露不穩(wěn)定N-端氨基酸。這樣的過程可以導致切斷的蛋白質的快速衰變并限制B.t.殺蟲蛋白積累至足以有效控制昆蟲的水平。從而，對于由一個不穩(wěn)定氨基酸起始的N-端缺失突變體，申請人優(yōu)選在翻譯起始的蛋氨酸和不穩(wěn)定氨基酸之間增加指定G (甘氨酸)氨基酸的密碼子。實施例13和14給出了依照本發(fā)明的DIG-109和DIG-152的氨基端缺失突變體的特定實例。其它有用的片段可以通過全長可溶性晶體蛋白經胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化獲得的片段的昆蟲生物鑒定來鑒別，以確定哪個片段保留毒性，或者可以通過確定由Cry蛋白編碼區(qū)域的DNA片段編碼的毒蛋白片段來鑒別。該蛋白將主要地具有短的N-端和長的C-端截斷，相比于原毒素。最小毒素片段的N末端通過本領域已知的技術經胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶處理的可溶性晶體蛋白的N-端氨基酸序列測定來確定。嵌合毒素。已經報道的嵌合蛋白利用一個Cry毒素的核心毒素與另一個Cry毒素的原毒素片段融合。DIG-109和DIG-152變體包括這樣的毒素，其包含一個CrylCa毒素的N-端毒素核心片段(其可以是全長或具有上文所述的N-端缺失)融合于一個異種的原毒素片段，在該核心毒素片段末端之后的某個位點上。向所述異種原毒素片段的轉變可以發(fā)生在大約核心毒素/原毒素結合點，或者可選地，自身原毒素的部分(延伸超過核心毒素片段)可以被保留，而向異種原毒素的轉變則發(fā)生在下游。例如，本發(fā)明的嵌合毒素具有CrylCa的全長核心毒素片段(氨基酸1_619)和異種原毒素(氨基酸620-C末端)。在優(yōu)選實施方式里，原毒素的異種片段源自CrylAb δ內毒素，如SEQ ID Ν0:2和SEQ ID NO:4所示。蛋白酶敏感性變體。昆蟲腸道蛋白酶典型地起作用于幫助昆蟲從食物蛋白中獲得需要的氨基酸。研究最為透徹的昆蟲消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其以最常見的類型出現(xiàn)(Englemann and Geraerts, 1980),尤其是在鱗翅目物種中。鞘翅目昆蟲具有比鱗翅目腸道更中性至酸性的腸道。鞘翅目幼蟲和成蟲的主要成員，例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲，具有微酸性中腸，半胱氨酸蛋白酶提供了主要的蛋白水解活性(Wolfson and Murdock, 1990)。更精確地，Thie和Houseman(1990)分離并表征了科羅拉多馬鈴薯甲蟲中的半胱氨酸蛋白酶,組織蛋白酶B樣和組織蛋白酶H樣，和天冬酰胺蛋白酶，組織蛋白酶D樣。Gillikin et al.，
(1992)表征了西部玉米根蟲腸道中的蛋白水解活性，并發(fā)現(xiàn)了主要的半胱氨酸蛋白酶。US 專利號7230167公開了絲氨酸蛋白酶，組織蛋白酶G，存在于西部玉米根蟲中。昆蟲腸道蛋白酶的多樣性和不同活性可以影響昆蟲對特定的B. t.毒素的敏感性。在本發(fā)明的另一個實施方式里，蛋白酶切割位點可以加工在確定的位點上以影響特定昆蟲害蟲的易感幼蟲的中腸中的蛋白質處理(Walters et al. ,2008) 這些蛋白酶切割位點可以通過例如化學基因合成或剪接重疊PCROtorton et al.，1989)等方法來引入。例如，絲氨酸蛋白酶識別序列，可以可選地插入Cry蛋白結構的特定位點以影響易感幼蟲的中腸內蛋白在確定的刪除位點上的處理?？梢杂蛇@種方式開發(fā)的絲氨酸蛋白酶包括鱗翅目中腸絲氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶，等等(Christeller et al. , 1992)。進一步,通過未分級幼蟲中腸蛋白酶處理而產生的Cry蛋白消化產物的測序或者通過結合至刷狀緣膜載體而經驗性鑒定的刪除位點可以被加工以影響蛋白活性。通過基因刪除或通過引入蛋白酶切割位點而產生的改變的Cry蛋白具有對鱗翅目害蟲改進的活性，包括歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis),西南玉米桿草螟(Diatraea grandiosella)，棉鈴蟲(Helicoverpa zea)，小地老虎(Agrotis ipsilon),草地夜蛾(Spodoptera frugiperda),甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),小鹿螟(Diatraeasaccharalis), Loxagrotis albicosta,和其它革巴標害蟲。鞘翅目絲氨酸蛋白酶例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和組織蛋白酶G樣蛋白酶，鞘翅目半胱氨酸蛋白酶例如組織蛋白酶(B樣，L樣，O樣，和K樣蛋白酶)(Koiwa et al.，(2000)和 Bown et al.， (2004))，銷翅目金屬蛋白酶例如 ADAMlO (Ochoa-Campuzanoet al.，(2007))，和鞘翅目天冬氨酸蛋白酶例如組織蛋白酶D樣和E樣，胃蛋白酶，plasmepsin,和凝乳酶可以進一步通過在確定的處理位點加工合適的識別序列以影響Cry蛋白在特定昆蟲害蟲的易感幼蟲的中腸內的處理。引入這樣的蛋白酶切割位點的一個優(yōu)選位置是α -螺旋2Β和α -螺旋3之間的“空隙”區(qū)域，例如CrylCa核心毒素蛋白(SEQ ID NO: I和表I)的氨基酸85-90之內。通過基因缺失或通過引入蛋白酶切割位點而改變的Cry蛋白具有對昆蟲害蟲改進的活性，包括但不限于秋粘蟲，甘蔗螟蟲等等。
存在多種技術可以測定包含多肽的N-端或C-端殘基的氨基酸的序列。例如，自動Edman降解方法學可以用于測序方法以測定N-端氨基酸序列至30個氨基酸殘基并具有每個殘基98%的準確性。進一步，測定包含多肽的羧基端的氨基酸的序列也是可能的(Baileyet al.，(1992) ；US Patent No. 6046053)。因此，在一些實施方式里，已經被通過蛋白水解處理的方法，例如，通過昆蟲腸道制備的蛋白酶，所激活的B. t. Cry蛋白，可以被表征，并且鑒別所述激活的毒素片段的N-端或C端氨基酸。通過在編碼序列的合適位置引入或消除蛋白酶處理位點以允許或消除昆蟲、植物或微生物蛋白酶的更大變體蛋白的蛋白水解切割的DIG-109和DIG-152變體也在本發(fā)明的范圍之內。這樣的操作的最終結果被理解為是產生具有與完整(全長)毒素蛋白相同或更好活性的活性毒素片段分子。DIG-109和DIG-152毒素的結構域。在DIG-109和DIG-152毒素中例舉的CrylCa核心毒素片段的分離的結構域，(以及與這些結構域有90%，95%或97%同一性的變體)被期望用于與來自其它Cry毒素的結構域結合以提供具有增加的害蟲毒性譜型、改進的潛力或增加的蛋白穩(wěn)定性的新毒素。CrylCa核心毒素蛋白的結構域I由SEQ ID NO: I的36-254位氨基酸組成。CrylCa核心毒素蛋白的結構域II由SEQ ID NO: I的262-458位 氨基酸組成。CrylCa核心毒素蛋白的結構域III由SEQ ID NO: I的468-617位氨基酸組成。結構域交換或移動是產生可變的S-內毒素蛋白的機制。結構域II和III可以在δ-內毒素蛋白之間交換，導致產生具有改進的殺蟲活性或目標譜的雜合或嵌合毒素。結構域II涉及受體結合。結構域III結合某些類的受體蛋白并可能在寡聚毒素前核心的插入中起作用。其它毒素中的一些結構域III取代物已經顯示出產生針對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的超級活性(de Maagd et al. , (1996))并且存在設計Cry毒素結構域交換的啟示(Knightet al.，(2004))。產生重組蛋白和檢測其殺蟲活性的方法是本領域公知的(參見，例如，Naimov etal.，(2001),de Maagd et al.，(1996),Ge et al.，(1991),Schnepf et al.，(1990), Ranget al. , (1999))。已經研究了 CrylA和Cry3A蛋白的結構域I的插入和在膜中形成孔的能力。結構域I的α -螺旋4和5在膜插入和孔形成中起著關鍵作用(Walters et al.,1993, Gazit et al. , 1998 ；Nunez-Valdez et al. , 2001),而其它螺旋推測接觸膜的表面,就像傘的肋骨那樣(Bravo et al.，(2007) ；Gazit et al.，(1998))。通過少數(shù)氨基酸缺失、取代或添加而創(chuàng)津的DIG-109和DIG-152變體。SEQ IDNO: I的CrylCa核心毒素片段的氨基酸序列的氨基酸缺失、取代或添加可以通過序列方式而容易地進行，這些突變體的殺蟲活性的效果可以通過生物分析來檢測。如果改變的數(shù)目是少數(shù)，這樣的檢測不會包含過度的實驗。本發(fā)明包括核心毒素(SEQ ID NO: I的1-619位氨基酸)的殺蟲活性變體，其中具有最多10個，最多15個，或最多20個獨立的氨基酸的添力口，缺失或取代。本發(fā)明包括DIG-109和DIG-152變體，其具有與SEQ ID NO: I的1-619位氨基酸90%, 95%或97%同一性的核心毒素片段。變體可以通過隨機突變產生，或者可以設計變體。在設計的突變的情況下，具有很高可能性產生具有與本體毒素相似活性的變體，如果在毒素的重要區(qū)域保持氨基酸同一性，所述重要區(qū)域對生物學活性起作用或者涉及三維構象的確定，其最終也為生物活性服務。氨基酸可以位于下列類別中非極性；不帶電極性，堿性，和酸性。保守性取代，即其中一類的一個氨基酸替換為同樣類型的另一個氨基酸，具有基本上改變所述變體的生物學活性的最低可能性。表2提供了屬于每個類的氨基酸的實例的列表。表 2.
氨基酸類別氨基酸實例
非極性側鏈Ala, Val, Leu, He Pro, Met* Phe，
Trp
不帶電樣側鏈Giy，Ser，Thr, Cys, Tyr, Asn，Gln
酸性倒鏈Asp, Glu
堿性倒鏈Lys，Arg, His
P-支鏈側鏈Thr，Val, Ile
芳香側鏈Tyi*, Plie, Trp, His
在一些實例中，也可以進行非保守取代。一個重要事實是這些取代不應該顯著地損害毒素的生物學活性。變體包括由于突變而在氨基酸序列上有所不同的多肽。本發(fā)明包含的變體蛋白是生物學活性的，即它們繼續(xù)擁有本體蛋白的生物學活性，即，保留殺蟲活性。變體蛋白也可以設計為在序列水平上不同但是保持了相同或類似的總體上基本的三維結構，表面電荷分布，等等。參見例如US專利號7058515 ;Larson et al.，(2002)；Stemmer(1994a, 1994b,1995);和 Crameri et al.，(1996a,1996b,1997)。核酸。編碼DIG-109毒素或編碼DIG152毒素的分離的核酸是本發(fā)明的一個方面。這包括編碼SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5的核酸，及其互補物，以及編碼SEQID N0:1,SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5的殺蟲變體的其它核酸。用“分離的”申請人意指該核酸分子已經從其本來的環(huán)境中移出并用人手將其置于不同的環(huán)境中。由于遺傳密碼子的冗余性，多種不同的DNA序列可以編碼本文公開的氨基酸序列。本領域技術人員很容易建立編碼同樣的或基本同樣的毒素的可選DNA序列?；蚝铣?。編碼本文描述的改進的Cry蛋白的基因可以通過多種本領域公知的方法來制作。例如，合成基因片段和合成基因可以通過亞磷酸三酯和亞磷酸胺化學來制作(Caruthers et al，1987)，并且允許通過商業(yè)供應商來根據(jù)需求進行基因合成。全長基因可以通過多種途徑來裝配，包括例如，通過連接限制性片段或聚合酶鏈式反應裝配重疊的寡核苷酸(Stewart and Burgin, 2005)。進一步,末端基因缺失可以通過使用位點特異性末端寡核苷酸的PCR擴增來實現(xiàn)。編碼DIG-109毒素或DIG-152毒素的核酸可以通過例如多個商業(yè)供應商的任何一個提供的方法來合成性構建。(參見例如，US Patent No. 7482119B2)。這些基因，或其部分或變體，也可以通過例如使用基因合成和指定的方法例如US Patent No. 5380831來合成性構建?？蛇x地，合成的或自然存在的基因的變體可以用制造點突變的標準分子生物學技術方便地構建。這些基因的片段也可以用商業(yè)上允許的外切核酸酶或內切核酸酶根據(jù)標準過程來制備。例如，酶例如Bal3I或點定向突變可以用于從這些基因的末端系統(tǒng)地切斷核苷酸。另外，編碼活性毒素片段的基因片段可以用多種限制性酶來獲得。已知DIG-109毒素或DIG-152毒素的氨基酸序列，可以通過以下方法來設計編碼 序列，即用目標宿主優(yōu)選的密碼子反翻譯該蛋白質序列，然后用可選(冗余)密碼子來修正序列以移除可能引起問題的序列。進一步，定期終止密碼子可以加工進非編碼閱讀框以消除長的、無意的開放閱讀框。定暈序列同一性。為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，以最佳比較目的對該序列進行比對。兩個序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位點的數(shù)目的函數(shù)(即，百分比同一性=相同位點數(shù)/總位點數(shù)(例如，重疊位點)X100)。在一個實施方式里，這兩個序列是同樣長度的。兩個序列之間的百分比同一性可以用下文描述的類似的技術來確定，包含或不包含允許間隙。在計算百分比同一性時，典型地計算精確配對。兩個序列之間的百分比同一性的確定可以使用數(shù)學算法來完成。這種算法的一個非限制性實例是BLAST(Altschul et al. , 1990,和Karlin and Altschul, 1990),由Karlinand Altschul (1993)所修改，并并入BLASTN和BLASTX程序。BLAST搜索可以方便地用于在核酸或蛋白質數(shù)據(jù)庫中鑒別與查詢序列同源(相似)的序列。BLASTN搜索可以進行，(得 分=100，字長=12)用于鑒別與本發(fā)明要求的核酸分子具有同源性的核苷酸序列。BLASTX搜索可以進行，(得分=50，字長=3)用于鑒別與本發(fā)明要求的殺蟲蛋白分子具有同源性的氨基酸序列。間隙BLAST (Altschul et al.，(1997))可以用于獲得比較目的的間隙比對?？蛇x地，PSI-Blast可以用于進行重復搜索，其探測兩個分子之間較遠的關系(Altschul etal.，(ibid·))。當使用BLAST，Gapped BLAST，和PSI-Blast程序時，可以使用各自程序的默認參數(shù)° 參見 www. ncbi. nlm. nih. gov。用于比較序列的數(shù)學算法的一個非限制性實例是ClustalW算法(Thompson etal.，1994)。ClustalW比較序列并比對氨基酸或DNA序列的整體，因而能夠提供關于整體氨基酸序列或核苷酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于多種商業(yè)允許的DNA/氨基酸分析軟件包，例如 Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc.，Carlsbad, CA)的ALIGNX模塊。當用ALIGNX比對氨基酸序列時，可以方便地使用默認設置，包括間隙開放罰分10分，間隙延伸罰分0. I分和blOSum63mt2比較矩陣以評估兩個序列之間的百分比氨基酸相似性(一致性)或同一性。當用ALIGNX比對DNA序列時，可以方便地使用默認設置，包括間隙開放罰分15分，間隙延伸罰分6. 6分和swgapdnamt比較矩陣以評估兩個序列之間的百分比同一性。用于序列對比的數(shù)學算法的另一個非限制性實例是Myers and Miller (1988)的。這樣的算法被并入wSTRETCHER程序，這是wEMBOSS序列比對軟件包的一部分(允許從http://emboss, sourceforge. net/獲得)。wSTRETCHER使用線性空間的經典動態(tài)程序算法的修改算法來計算兩個序列的最優(yōu)全球比對?？梢灾付ㄓ糜谟嬎惚葘Φ奶鎿Q矩陣、間隙插入罰分和間隙延伸罰分。當使用wSTRETCHER程序來比較核苷酸序列時，可以使用間隙開放罰分16分和間隙延伸罰分4分以及得分矩陣文件EDNAFULL。當用于比較氨基酸序列時，可以使用間隙開放罰分12分和間隙延伸罰分2分以及得分矩陣文件EBL0SUM62。用于對比序列的數(shù)學算法的進一步的非限制性實例是Needleman andWunsch(1970)的，其并入序列比對軟件包 GAP Version 10 和 wNEEDLE(http://emboss.sourceforge.net/)。GAP Version 10可以用于確定序列同一性或相似性，使用下列參數(shù)對于核苷酸序列，%同一性和％相似性使用GAP Weight為50和Length Weight為3，和nwsgapdna. cmp得分矩陣。對于氨基酸序列，%同一性和％相似性使用GAP Weight為8和Length Weight 為 2，和 BL0SUM62 得分矩陣。wNEEDLE閱讀兩個輸入序列，找到沿著整個序列的最優(yōu)比對(包括間隙)，并寫出其最優(yōu)全球序列比對并提交。該算法使用所有可能的比對并選擇最好的，使用包含每個可能的殘基或核苷酸配對的數(shù)值的矩陣。wNEEDLE找到具有最大可能的得分的比對，其中一個比對的得分等于來自得分矩陣的配對的總和，減去在比對序列中開放和延伸間隙得到的罰分。取代矩陣和間隙開放和延伸罰分可以用戶指定。當比較氨基酸序列時，默認間隙開放罰分為10分，間隙延伸罰分為O. 5分，并使用EBL0SUM62比較矩陣。當使用wNEEDLE比較DNA序列時，默認間隙開放罰分為10分，間隙延伸罰分為O. 5分，并使用EDNAFULL比較矩陣。也可以使用等效程序?！暗刃С绦颉笔侵溉魏涡蛄袑Ρ瘸绦?，其對任何兩個對象序列，產生具有相同核苷酸或氨基酸殘基配對的比對和相同百分比序列同一性，相比于由 ALIGNX, wNEEDLE或wSTRETCHER產生的對應的比對。％同一性是兩個序列之間的相同配對相對報告的比對區(qū)域的百分比(包括在長度上的任何間隙)而％相似性是兩個序列之間的配對相對報告的比對區(qū)域的百分比(包括在長度上的任何間隙)。比對也可以通過人工檢查來進行。重組宿主。本發(fā)明的毒素編碼基因可以引入多種微生物或植物宿主。毒素基因的表達直接或間接導致細胞內產生和保持殺蟲蛋白。對于合適的微生物宿主，例如假單胞菌，微生物可提供于害蟲的環(huán)境，其中它們將增殖和被攝入。其結果是控制了害蟲?？蛇x地，含有毒素基因的微生物可以在一定條件下處理，該條件能延長毒素活性和穩(wěn)定細胞。處理的細胞，其保留毒素活性，隨后可以提供于目標害蟲的環(huán)境。當B.t.毒素基因被通過合適的載體引入微生物宿主，并且所述宿主以生活狀態(tài)提供于環(huán)境，有必要使用特定的微生物。選擇被認為占有一或多種感興趣的作物的“植物圈 phytosphere” (葉面 phylloplane,葉圈 phyllosphere,根圈 rhizosphere,和 / 或根面rhizoplane)的微生物宿主。選擇這些微生物以能夠在特定的環(huán)境(作物和其它昆蟲居住地)與野生本土微生物競爭獲勝，以提供穩(wěn)定維持和表達的編碼多肽殺蟲劑的基因，并且，期望地，提供殺蟲劑免受環(huán)境降解和失活的改進保護。已知大量的微生物存在于多種重要作物的葉面(植物葉的表面)和/或根圈(植物根周圍的土壤)。這些微生物包括細菌，藻類，和真菌。特別吸引人的是微生物，例如細菌，例如以下屬假單胞菌屬Pseudomonas,歐文氏菌屬Erwinia,沙雷氏菌屬Serratia,克雷伯氏菌屬Klebsiella,黃單胞菌屬Xanthomonas,鏈霉菌屬Streptomyces,根瘤菌屬Rhizobium,中華根瘤菌屬Sinorhizobium,紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas, Methylophilius, 土壤桿菌屬 Agrobacterium,醋酸菌屬 Acetobacter,乳酸菌屬Lactobacillus,節(jié)桿菌屬Arthrobacter,固氮菌屬Azotobacter,明串珠菌屬Leuconostoc,和產堿菌屬Alcaligenes ;真菌，尤其是酵母，例如下列屬釀酒酵母屬Saccharomyces,隱球菌屬Cryptococcus,克魯維酵母屬Kluyveromyces,擲抱酵母屬Sporobolomyces,薔薇色酵母屬Rhodotorula,和短梗霉屬Aureobasidium。特別感興趣的是這些植物圈細菌種例如丁香假單胞菌Pseudomonas syringae,突光假單胞菌Pseudomonasf Iuorescens,粘質沙雷菌 Serratia marcescens,木醋酸菌 Acetobacter xylinum,根瘤農桿菌 Agrobacterium tumefaciens,放身寸性農桿菌 Agrobacterium radiobacter,球形紅假單胞菌 Rhodopseudomonas spheroides,野油菜黃單胞菌 Xanthomonas campestris,苜猜中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti (原來的苜猜根瘤菌Rhizobium meliloti),真養(yǎng)產喊桿菌Alcaligenes eutrophus,和掠色固氮菌Azotobacter vinelandii ;和植物圈酵母種例如深紅酵母Rhodotorula rubra,粘紅酵母R. glutinis,牧草紅酵母R. marina,澄紅酵母 R. aurantiaca,淺白隱球酵母 Cryptococcus albidus, C. diffluens,羅倫隱球酵母 C. Iaurentii,羅氏酵母 Saccharomyces rosei,有抱圓酵母 S. pretoriensis,釀酒酵母S. cerevisiae,擲抱酵母Sporobolomyces roseus,香氣擲抱酵母S. odorus, Kluyveromycesveronae,和Aureobasidium pollulans。特別感興趣的是有顏色的微生物。
_6] 控制昆蟲害蟲的方法當昆蟲接觸經轉基因植物表達、配方的蛋白質組合物、噴霧蛋白質組合物、誘餌基 質或其它遞送系統(tǒng)遞送的有效量的毒素時，結果是昆蟲的顯著的死亡，或者害蟲不再進食其來源，這使得毒素對昆蟲不適用。對象蛋白質毒素可以通過多種途徑而“應用”或提供于接觸目標昆蟲。例如，可以使用轉基因植物(其中蛋白由植物產生并存在于植物中)，這是本領域公知的。毒素基因的表達也可以實現(xiàn)選擇性地在植物的特定組織中，例如根，葉，等等。這可以通過使用例如組織特異性啟動子來實現(xiàn)。噴灑應用是另一個實例并且也是本領域公知的。對象蛋白可以根據(jù)需要的最終用途而方便地配方，然后噴灑(或其它方式提供)在要保護的植物上和/或在植物周圍/或植物附近——在害蟲被發(fā)現(xiàn)前，目標昆蟲被發(fā)現(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)前和發(fā)現(xiàn)后，等等。例如，誘餌顆粒，也可以使用并且是本領域公知的。轉基因棺物對象蛋白質可以用于保護幾乎任何類型的植物免受鱗翅目昆蟲的傷害。這樣的植物的實例包括玉米，向日葵，大豆，棉花，油菜，水稻，高粱，煙草，小麥，大麥，蔬菜，觀賞植物，胡椒(包括辣椒)，甜菜，水果和草皮，除了一小部分。轉化植物的方法是本領域公知的，說明性的轉化方法描述于實施例中。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式是用編碼對象殺蟲蛋白或其變體的基因轉化植物。由于在轉化的植物的細胞中存在控制量的對象殺蟲蛋白或其變體，轉化的植物對昆蟲目標害蟲的侵襲是有抗性的。通過將編碼B.t.殺蟲毒素的殺蟲特性的遺傳材料整合進入植物基因組，所述植物被特定的昆蟲害蟲吃下，則成蟲或幼蟲將在消耗食物植物之后死亡。單子葉植物和雙子葉植物分類的多種成員可以被轉化。轉基因農作物以及水果和蔬菜具有商業(yè)吸引力。這樣的作物包括但不限于玉米，水稻，大豆，油菜，向日葵，苜蓿，高粱，小麥，棉花，花生，番茄，馬鈴薯，等等。存在多種技術將外源遺傳材料引入植物細胞，以及獲得穩(wěn)定維持并表達所引入的基因的植物。這些技術包括遺傳材料包被為微顆粒后加速直接進入細胞(US專利號4945050和US專利號5141131)?？梢允褂棉r桿菌技術轉化植物，參見US專利號5177010, US專利號5104310，歐洲專利申請No. 0131624B1，歐洲專利申請No. 120516，歐洲專利申請No. 159418B1，歐洲專利申請No. 176112，US專利號5149645，US專利號5469976，US專利號5464763，US專利號4940838，US專利號4693976，歐洲專利申請No. 116718，歐洲專利申請No. 290799，歐洲專利申請No. 320500，歐洲專利申請No. 604662,歐洲專利申請No. 627752，歐洲專利申請No. 0267159，歐洲專利申請No. 0292435，US專利號5231019，US專利號5463174，US專利號4762785，US專利號5004863，和US專利號5159135。其它轉化技術包括WHISKERS 技術，參見US專利號5302523和US專利號5464765。電穿孔技術也被用于轉化植物，參見 WO 1987/06614，US 專利號 5472869，US 專利號 5384253，WO 1992/09696，和WO 1993/21335。所有這些轉化專利和公開并入本文作為參考。除了轉化植物的多種技術之外，與外源基因接觸的組織的類型也可以不同。這樣的組織可以包括但不限于胚胎發(fā)生組織，愈傷組織類型I和II，胚軸，分裂組織，等等。幾乎所有植物組織都可以在反分化期間使用本領域技術人員范圍內合適的技術來進行轉化。編碼DIG-109和DIG-152毒素或其變體的基因可以通過使用如上文公開的本領域公知的多種技術而插入植物細胞。例如，包含用于允許篩選轉化的微生物細胞的標簽和在大腸桿菌有功能的復制系統(tǒng)的大量克隆載體可以用于制備和修改外源基因以插入高等植物中。這樣的操作可以包括，例如，插入突變，截斷，添加，或取代，根據(jù)需要的用途來進行。所述載體包括，例如，pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184,等等。從而，編碼 Cry蛋白或其變體的序列可以插入載體中的合適的限制性位點。獲得的質粒用于轉化大腸桿菌，其細胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基下培養(yǎng)，然后收獲并溶解以回收得到可用量的質粒。序列分析，限制性片段分析，電泳，和其它生物化學-分子生物學方法作為分析方法常規(guī)地進行。 在每次操作之后，可以切斷DNA序列并加入下一個DNA序列。每個操作的DNA序列可以在相同或另外質粒中克隆。含T-DNA載體用于植物細胞的轉化已經得到深入研究并充分地描述于歐洲專利申請 No. 120516 ；Lee and Gelvin (2008), Fraley et al. , (1986),和 An et al. , (1985)，
并已經在該領域建立完善。一旦插入DNA被整合進入植物基因組，其就會在后代中相對穩(wěn)定。用于轉化植物細胞的載體通常含有一個選擇標簽基因，其編碼使得所轉化的植物細胞對一種除草劑或抗生素有抗性的蛋白，例如雙丙氨膦，卡那霉素，G418，博來霉素，或潮霉素，等等。從而個體性擁有的選擇標簽基因可以允許篩選轉化的細胞，而不含有插入基因的細胞的生長將被篩選化合物所抑制。多種技術可用于將DNA插入宿主植物細胞。這些技術包括用通過根瘤農桿菌或發(fā)根農桿菌作為轉化試劑遞送的T-DNA進行轉化。此外，植物原生質與包含需要遞送的DNA的脂質體的融合，DNA的直接注射，生物槍轉化(微顆粒轟擊)，或電穿孔，以及其它可能的方法，都可以使用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式里，植物被用基因所轉化，其中所述基因中蛋白編碼區(qū)域的密碼子使用被向植物方向優(yōu)化。參見，例如，US專利號5380831，其在此并入作為參考。另外，方便地，可以使用編碼截短的毒素的植物。截短的毒素典型地編碼約55%至約80%的全長毒素。建立用于植物的合成性B. t.基因的方法是本領域已知的(Stewart2007)。不限于轉化技術，基因優(yōu)選整合進入適合在植物細胞中表達B.t.殺蟲毒素基因或其變體的穿梭載體，該載體中包含植物啟動子。除了植物啟動子，來自多種來源的啟動子也可以有效用于植物細胞中表達外源基因。例如，可以使用細菌來源的啟動子，例如章魚堿合成酶啟動子，胭脂堿合成酶啟動子，甘露堿合成酶啟動子；植物病毒來源的啟動子，例如花椰菜花葉病毒的35S和19S啟動子，等等。植物啟動子包括，但不限于核酮糖-1，6- 二磷酸(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)，β-伴大豆球蛋白啟動子，菜豆球蛋白啟動子，ADH(乙醇脫氫酶)啟動子，熱激啟動子，ADF(肌動蛋白解聚因子)啟動子，和組織特異性啟動子。啟動子也可以包含某些增強子序列元件，其促進轉錄效率。典型的增強子包括但不限于ADHl-內含子I和ADHl-內含子6?？梢允褂脴嫵尚詥幼印嫵尚詥幼釉趲缀跛屑毎愋椭泻蛶缀跛袝r間里引導持續(xù)的基因表達(例如，肌動蛋白，泛素，CaMV 35S)。組織特異性啟動子在特定的細胞或組織中形成基因表達，例如葉和種子(例如，玉米蛋白，油脂蛋白，油菜種子儲藏蛋白(napin)，ACP(?；\轉蛋白))，可以使用這些啟動子。也可以使用在植物發(fā)育過程的某些階段期間以及在特定植物組織和器官中有活性的啟動子。這樣的啟動子的實例包括但不限于根特異性、花粉特異性、胚芽特異性、玉米穗絲特異性、棉花纖維特異性、種子胚乳特異性、韌皮部特異性的啟動子等等。在特定的環(huán)境下可以使用合適的誘導性啟動子。誘導型啟動子響應特定信號并從而引起表達，所述信號例如物理刺激(例如熱激基因)；光(例如RUBP羧化酶)，激素(例如糖皮質激素)；抗生素(例如四環(huán)素)；代謝物；以及壓力(例如干旱)。還可以使用其它 在植物中起功能的需要的轉錄和翻譯元件例如5’不翻譯前導序列，RNA轉錄終止序列和聚腺苷添加信號序列。多種植物特異性基因穿梭載體是本領域已知的。含有抗蟲(IR)特性的轉基因作物在玉米和棉花等植物中很普遍并遍及北美，并且這些特性的使用正在全球擴張。多家種子公司已經發(fā)展了結合IR和耐除草劑(HT)特性的商業(yè)化轉基因作物。這包括通過B.t.殺蟲蛋白賦予的IR特性和HT特性的結合，所述HT特性例如對乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑耐受例如磺酰脲類，咪唑啉酮，三唑嘧啶，磺酰替苯胺，等等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制劑如雙丙氨膦，草銨膦，等等；4_羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)抑制劑如甲基磺草酮，異惡唑草酮，等等；5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制劑如草甘膦等等；和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑如蓋草能，禾草靈，精喹禾靈等等。已知的其它實例中轉基因提供的蛋白給植物提供了對除草劑的耐受性，所述除草劑的化學種類例如苯氧基酸除草劑和吡啶氧乙酸生長素除草劑(參見WO2007/053482A2)，或苯氧基酸除草劑和芳氧苯氧丙酸酯除草劑(參見WO 2005107437A2,A3)。通過IR特性控制多種害蟲問題的能力是一種商業(yè)上有價值的概念，而且這種產品的便利性將得到增強，如果昆蟲控制特性和雜草控制特性結合在同樣的植物中。此外，可以通過單獨的植物結合B.t.殺蟲蛋白例如本發(fā)明的方案提供的IR特性和一或多種額外的HT特性例如上文所提及的，并加入一或多種額外的輸入特性(例如，由B.t.延伸物或其它殺蟲蛋白提供的昆蟲抗性，像RNAi等機制提供的昆蟲抗性，B. t.延伸物或其它殺線蟲蛋白提供的線蟲抗性，像RNAi等機制提供的線蟲抗性，疾病抗性，壓力耐受性，改進的營養(yǎng)利用，等等)，或者輸出特性(例如，高油含量，健康油組分，營養(yǎng)改進，等等)，從而獲得進一步的價值。這樣的結合可以通過傳統(tǒng)的飼養(yǎng)(飼養(yǎng)堆，breeding stack)或作為新的轉化事件加入，包括多種基因(分子堆)的同時引入。好處包括能夠在作物植物中管理昆蟲害蟲和促進雜草控制并提供向生產者和/或消費者第二好處。從而，本發(fā)明也可以用于與其它特性的結合以提供具有改進的作物品質的完整的農學包，其能夠靈活地和成本有效地控制任何數(shù)量的農學事件。目標害蟲本發(fā)明的DIG-109毒素和DIG-152毒素尤其適合于控制鱗翅目昆蟲。鱗翅目是一類重要的農業(yè)、園藝和家庭害蟲，其每年引起非常大量傷害。該昆蟲目包含葉-和根-進食的幼蟲和成蟲。鱗翅目昆蟲包括，但不限于Achoroia grisella，Acleris gloverana, Acleris variana，Adoxophyes orana，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Alabama argillacea， Alsophila pometaria， Amyelois transitella， Anagastakuehniella， Anarsia lineatella， Anisota senatoria， Antheraea pernyi， Anticarsiagemmatalis， Archips sp. ， Argyrotaenia sp. ， Athetis mindara， Bombyx mori，Bucculatrix thurberiella， Cadra cautella， Choristoneura sp. ， Cochylls hospes，Colias eurytheme, Corcyra cephalonica， Cydia latiferreanus， Cydia pomonella，Datana integerrima，Dendrolimus sibericus，Desmia feneralis，Diaphania hyalinata，Diaphania nitidalis，Diatrae a grandiosella(西南玉米螟)，Diatraea saccharalis (甘鹿螟)，Ennomos subsignaria， Eoreuma loftini， Esphestia elutella， Erannistilaria， Estigmene acrea， Eulia salubricola， Eupocoellia ambiguella， Eupoeciliaambiguella， Euproctis chrysorrhoea， Euxoa messoria， Galleria mellonella，Grapholita molesta,Harrisina americana，Helicoverpa subflexa,Helicoverpa zea(棉鈴蟲)，Heliothis virescens， Hemileuca oliviae， Homoeosoma electellum， Hyphantiacunea， Keiferia lycopersicella， Lambdina fiscellaria fiscellaria， Lambdinafiscellaria lugubrosa,Leucoma salicis，Lobesia botrana，Loxagrotis albicosta(西方顯夜蛾)，Loxostege sticticalis, Lymantria dispar,Macalla thyrisalis,Malacosomasp. ， Mamestra brassicae， Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata， Manducasexta， Maruca testulalis， Melanchra picta， Operophtera brumata， Orgyia sp.，Ostrinia nubilalis (歐洲玉米螟)，Paleacrita vernata，Papiapema nebris (常見的鉆心蟲)，Papilio cresphontes，Pectinophora gossypiella，Phryganidia californica，Phyllonorycter blancardella， Pieris napi， Pieris rapae， Plathypena scabra，Platynota flouendana， Platynota stultana， Platyptilia carduidactyla， Plodiainterpunctella， Plutella xylostella(小菜蛾)，Pontia protodice, Pseudaletiaunipuncta(行軍 蟲)，Pseudoplasia includens， Sabulodes aegrotata， Schizuraconcinna，Sitotroga cerealella，Spilonta ocellana，Spodoptera frugiperda(秋粘蟲)，Spodoptera exigua (舌甘菜夜蛾)，Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella，Trichoplusiani，Udea rubigalis, Xylomyges curiails，和 Yponomeuta padella。使用DIG-109毒素和DIG-152毒素及其變體以控制作物植物的鞘翅目害蟲也在預期之中。在一些實施方式里，Cry蛋白可以經濟地配置于昆蟲害蟲的控制，包括但不限于，例如，根蟲例如 Diabrotica undecimpunctata howardi (南方玉米根蟲)，Diabroticalongicornis barberi (北方玉米根蟲)，和Diabrotica virgifera(西方玉米根蟲)，以及蛆蟲例如 Cyclocephala borealis (北蒙面金龜子)，Cyclocephala immaculate (南蒙面金龜子)，和Popillia japonica(日本甲蟲)的幼蟲·DIG-109和DIG-152毒素的抗體檢測抗毒素抗體。本文公開的針對B. t.毒素的抗體，或針對等效毒素，或這些毒素的片段的，可以通過本領域的標準過程來容易地制備，例如由Coligan et al.，2007的教導及其更新。這樣的抗體對檢測DIG-109毒素、DIG-152毒素及其變體的存在是很有用的。
一旦B.t.殺蟲毒素被分離，對毒素特異的抗體就可以通過本領域公知的傳統(tǒng)方法來獲取。向選擇的宿主重復注射持續(xù)數(shù)周或數(shù)月的時間將引起免疫反應并導致顯著的抗-B.t.毒素血清滴度。優(yōu)選的宿主是哺乳動物物種，更優(yōu)選的物種是兔，山羊，綿羊和小鼠。從這些免疫的動物中取得的血液可以通過現(xiàn)成方法處理以獲得能與B. t.殺蟲毒素反應的抗血清(多克隆抗體)。抗血清可以然后根據(jù)本領域已知的技術通過吸附至毒素而進行親和力純化。親和力純化的抗血清可以通過使用本領域已知的方法分離抗血清中的免疫球蛋白部分來進一步純化。獲得的材料是與B.t.殺蟲蛋白反應的免疫球蛋白的異源種群。抗-B.t.毒素抗體可以通過制備由B. t.殺蟲毒素的合成性肽片段與免疫原載體綴合而形成的半合成免疫原而產生。制作肽片段的多種方案和手段都是本領域公知的。很多合適的免疫原載體例如牛血清白蛋白或Keyhole Limpet血藍蛋白也是本領域公知的，以及耦合免疫原和載體蛋白的技術。一旦半合成免疫原被構建，制作對B.t.殺蟲毒素片段特 異性的抗體的方法與用于制作與天然B. t.毒素反應的抗體的技術是相同的?？?B. t.毒素單克隆抗體(MAbs)可以使用純化的B. t.殺蟲毒素而容易地制備。產生MAb的方法已經實踐了超過15年并對本領域技術人員而言是公知的。純化的B.t.殺蟲毒素在佐劑中重復腹腔內或皮下注射將在大多數(shù)動物中引起免疫反應。從動物中移出超免疫B-淋巴細胞并與能夠無限培養(yǎng)的合適的融合伴侶細胞系融合。優(yōu)選的動物即B-淋巴細胞能被超免疫并用于產生MAb的是哺乳動物。更優(yōu)選的動物是大鼠和小鼠以及最優(yōu)選的是BALB/c小鼠株。多種哺乳動物細胞系都是產生雜交瘤的合適融合伴侶。很多這樣的細胞系都可以從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC，Manassas，VA)和商業(yè)供應者獲得。優(yōu)選的融合伴侶細胞系是源自小鼠的骨髓瘤，而HL-i Friendly myeloma-653細胞系(Ventrex, Portland,ME)是最優(yōu)選的。一旦融合后，獲得的雜交瘤在選擇性生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)一到兩周?？梢允褂脙蓚€公知的篩選體系來從混合雜交瘤培養(yǎng)液中排除未融合的骨髓瘤細胞，或骨髓瘤細胞之間的融合。篩選體系的選擇取決于免疫的小鼠的株和使用的骨髓瘤融合伴侶?？梢允褂糜?Taggart and Samloff, (1983)描述的 aaT 篩選體系；然而，由 Littlefield (1964)描述的HAT (次黃嘌呤氨蝶呤，胸苷)篩選體系是優(yōu)選的，因為與上文描述的優(yōu)選的小鼠株和融合伴侶更為兼容。用過的生長培養(yǎng)基隨后篩選免疫特異性MAb分泌。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法對該目的是最合適的；盡管如此，適合大體積篩選的放射免疫分析也是可以接受的?？梢赃M行設計為連續(xù)減少可觀數(shù)目的無關的或更低需要的培養(yǎng)物的多重篩選。分泌與B. t.殺蟲毒素反應的MAb的培養(yǎng)物可以通過與已知的B. t.殺蟲毒素的交叉反應來篩選。優(yōu)先結合至優(yōu)選的B.t.殺蟲毒素的MAb可以用商業(yè)上可獲得的分析方法來確定類型。優(yōu)選的MAb是IgG類，更優(yōu)選的MAb是IgG1和IgG2a亞型。分泌優(yōu)選的MAb的雜交瘤培養(yǎng)物可以亞克隆多次以建立單克隆性和穩(wěn)定性。亞克隆真核細胞，非粘附細胞培養(yǎng)的公知方法包括限制性稀釋，軟瓊脂糖和熒光活化的細胞揀選技術。每次亞克隆后，獲得的培養(yǎng)物優(yōu)選再分析抗體分泌和類型以確定已經建立穩(wěn)定的優(yōu)選的MAb分泌培養(yǎng)物?？?B.t.毒素抗體可用于檢測本發(fā)明要求的B. t.殺蟲毒素、其變體和片段的多種方法。已知用一個報告組分標記的抗體可以用于鑒別各種環(huán)境中抗原的存在。放射性同位素標記的抗體已經用于放射免疫分析數(shù)十年了，其用于分析各種生物環(huán)境中抗原的存在并具有很高的精確性和靈敏性。近來，酶標記的抗體已經被作為放射標記抗體的替代用于ELISA檢測中。進一步，對本發(fā)明的B. t.殺蟲毒素免疫反應的抗體可以結合至固定化基質例如聚苯乙烯孔或顆粒并用于免疫分析以確定B. t.毒素是否存在于一個測試樣品中。檢測所用的探針鑒別本發(fā)明的毒素和基因的進一步的方法是使用寡核苷酸探針。這些探針是可探測核苷酸序列。這些序列可以通過依靠合適的放射性標記或可以通過固有的熒光來實現(xiàn)可探測性，描述于US專利號6268132。本領域公知，如果探針分子和核酸樣品通過形成兩個分子間強烈的堿基配對鍵而雜交，則可以推定該探針和樣品具有基本的序列同源性。優(yōu)選地，雜交是在嚴緊條件下通過本領域公知的技術來進行，描述與例如Keller and Manak
(1993)。探針的檢測提供了用已知方式確定雜交是否發(fā)生的方法。這樣的探針分析提供了鑒別本發(fā)明的毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明的用作探針的核苷酸片段可以使用DNA合成器和標準過程來合成。這些核苷酸序列也可以用做PCR弓丨物以擴增本發(fā)明的基因。
雜交分子生物學領域眾所周知，兩個核酸的相似性可以通過它們雜交的傾向性來表征。如本文所用術語“嚴緊條件”或“嚴緊雜交條件”是指這樣的條件，在此條件下探針將與其靶序列雜交(退火)至相比于其它序列可探測的更高程度(例如，至少超過背景2倍)。嚴緊條件是序列依賴性的并在不同環(huán)境下是不同的。通過控制雜交和/或沖洗條件的嚴緊性，可以鑒別出與探針100%互補的靶序列(同源探測)?？蛇x地，嚴緊條件可以改變以允許序列中的一些錯配，從而可以檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針是少于1000核苷酸的長度,優(yōu)選少于500核苷酸的長度。典型地，嚴緊條件是指其中鹽濃度低于I. 5M Na離子，典型地約O. 01-1. OM Na離子濃度(或其它鹽)在pH 7. O至pH 8. 3并且溫度為對短探針(例如10-50核苷酸)至少約30°C和對長探針(例如大于50核苷酸)至少約60°C。嚴緊條件也可以通過添加減穩(wěn)定試劑例如甲酰胺。示例性的低嚴緊條件包括用以下條件雜交緩沖溶液為30%-35%甲酰胺，IM NaCl，1%SDS (十二烷基硫酸鈉)在 37°C下，并用 IX 至 2X SSC (20X SSC=3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)在50°C _55°C下洗滌。示例性的中等嚴緊條件包括用以下條件雜交緩沖溶液為40%-45%甲酰胺，I. OM NaCl，1%SDS (十二烷基硫酸鈉)在37°C下，并用O. 5X至IX SSC在55°C _60°C下洗滌。示例性的高嚴緊條件包括用以下條件雜交緩沖溶液為50%甲酰胺，IM NaCl，1%SDS (十二烷基硫酸鈉)在37°C下，并用O. IX SSC在60°C -65°C下洗滌?？蛇x地，洗滌緩沖液可以包含約O. 1%至約1%的SDS。雜交時間一般小于約24小時，通常約4-12小時。特異性典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，其最重要的因子是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對DNA/DNA雜交，其熱力學熔點(Tm)是50%的互補靶序列雜交于完美匹配的探針的溫度(在確定的離子強度和PH下)。每錯配1%，T1Jf降低約1°C;因此，Tm，雜交條件，和/或洗滌條件可以調整為有利于指定同一性的序列的退火。例如，如果要搜索>90%同一性的序列，^可以降低10°C。通常，嚴緊條件選為比特定序列和其互補體在確定的離子強度和PH下的^低約5°C。然而，高嚴緊條件能使用低于Tm 1°C，2°C，3°C，或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴緊條件能使用低于Tm 6°C，7°C，8°C，9°C或10°C的雜交和/或洗滌；而低嚴緊條件能使用低于Tm ire，12°C，13°C，14°C，15°C，或16°C的雜交和/或洗滌。
Tm(以。C計)可以通過實驗確定或者近似地計算。對于DNA-DNA雜交，Tm可以從Meinkoth and Wahl方程式(1984)來近似地計算T111CC )=81. 50C +16. 6 (log Μ) +0. 41 (%GC) -O. 61(% 甲酰胺)_500/L ；其中M是單價離子的摩爾濃度，%GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L是雜交以堿基對計的長度?？蛇x地，Tm由下式描述(Beltz et al. , 1983)。T111CC )=81. 50C +16. 6 (log[Na+])+0. 41 (%GC)-O. 61(% 甲酰胺)_600/L其中[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L是雜交以堿基對計的長度。
使用這些方程式，雜交和洗滌組合物，以及需要的Tm，本領域普通技術人員將理解雜交和/或洗滌溶液的嚴緊性的變化被本質地描述。如果需要的錯配程度導致Tm低于45攝氏度(水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以可以使用更高的溫度。對核酸的雜交的廣泛的教導參見Tijssen(1993)和Ausubel et al. , 1995及其更新。也參見Sambrook et al.，(1989)及其更新。固定化DNA在DNA印跡上與放射性標記的基因特異性探針的雜交可以通過標準技術(Sambrook et al. , supra.)來進行。用于標記多核苷酸探針的放射性同位素可以包括32P，33P，14C，或3H。放射性同位素整合進入多核苷酸探針分子可以由分子生物學領域技術人員公知的多種方法的任意來完成(參見，例如，Sambrook et al. , supra.)。通常，雜交和后續(xù)的洗滌可以在這樣的嚴緊條件下進行，其允許檢測到與要求的毒素的編碼基因具有同源性的靶序列。對雙鏈DNA基因探針，雜交可以在低于DNA雜交的Tm 20-25°C下進行過夜，其中的 Tni 是在 6X SSPE，5X Denhardt's 溶液，O. 1%SDS, O. lmg/mL 變性 DNA 下 DNA雜交的 TJ20X SSPE 是 3M NaCl, O. 2M NaHPO4,和 O. 02MEDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)；100XDenhardt’s溶液是20gm/L聚乙烯批咯燒酮，20gm/L聚鹿糖400(Ficoll type 400)和20gm/L牛血清白蛋白(片段V)]。洗滌典型地如下進行2次在室溫下15分鐘在IX SSPE，O. 1%SDS中進行(低嚴緊洗滌)。I次在Tm-20°CT 15分鐘在O. 2X SSPE，O. 1%SDS中進行(高嚴緊洗滌)。對寡核苷酸探針，雜交可以在低于雜交的Tm 10_20°C下進行過夜，其中的Tm是在6X SSPE, 5X Denhardt's溶液，O. 1%SDS, O. lmg/mL變性DNA下雜交的Tm0寡核苷酸探針的Tm可以通過下式來確定(Suggs et al. , 1981) Tm (°C ) =2 (T/Α堿基對的數(shù)目)+4 (G/C堿基對的數(shù)目)洗滌典型地如下進行2次在室溫下15分鐘在IX SSPE，O. 1%SDS中進行(低嚴緊洗滌)。I次在雜交溫度下15分鐘在IX SSPE，O. 1%SDS中進行(更高嚴緊洗滌)鹽濃度和溫度的結合的一些實例如下(為了增加嚴緊性)2X SSPE或SSC在室溫下；IX SSPE 或 SSC 在 42 °C 下；O. IX SSPE 或 SSC 在 42 °C 下；O. IXSSPE 或 SSC 在 65 °C 下。雜交的探針分子和探針與目標分子之間形成的雜交分子可以呈現(xiàn)放射性標記之外的方式的可檢測性。這樣的可選方法也試圖在本發(fā)明的范圍之內。應當理解本文描述的實施例和實施方式是僅僅出于示范性目的，而其各種修改或改變將由本領域技術人員所建議并且包含在本申請的精神和范圍之內和所附的權利要求的范圍之內。除非特別指明或暗示，本文使用的術語“一 (a) ”，“一個(an) ”和“這些(the) ”意指“至少一個”。下面是說明本發(fā)明的實踐方式的實施例。這些實例不應當被解釋為限制性。所有百分比是以重量計的，所有溶液混合物比例是以體積計，除非另外聲明。所有溫度是攝氏溫度。實施例I設計嵌合的CrylCa核心毒素與CrylAb原毒素
嵌合毒素。用一個Cry毒素的核心毒素結構域與另一個Cry毒素的原毒素片段融合的嵌合蛋白質在之前已經被報道，例如US專利號5593881和US專利號5932209。一個CrylCa3 δ外毒素蛋白序列存放在GenBank登記號ΑΑΑ22343，在一個叫CryIC (b)的舊名稱下。本發(fā)明的CyrlCa嵌合蛋白變體包括這樣的毒素，其包含源自CrylCa3殺蟲毒素的N-端核心毒素片段與一個異源δ外毒素原毒素片段在所述核心毒素片段的末端之后幾個點后的位置融合。從核心毒素向異源原毒素片段的轉變可以發(fā)生在大約自身的核心毒素/原毒素連接或者，可選地，自身原毒素的部分(延伸過核心毒素片段)可以被保留，而向異源原毒素的轉變發(fā)生在下游。在變體類型中，核心毒素和原毒素片段可以精確地包含其來源的自身毒素的氨基酸序列，或者可以包括氨基酸添加，刪除，或取代，其不會減少，或者可能增強所述片段的生物學功能，當其與另一個融合的時候。例如，本發(fā)明的嵌合蛋白包含源自CrylCa3的核心毒素片段和異源原毒素。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式里，源自CrylCa3的核心毒素片段，如SEQ ID N0:l(619個氨基酸)中作為CrylCa核心毒素片段公開的，與包含源自CrylAb δ -外毒素的原毒素片段的異源片段融合。SEQ ID NO: 2公開了源自CrylAb的一個原毒素片段的545氨基酸序列并用于本發(fā)明的CrylCa變體。注意SEQ ID NO: 2的這個原毒素片段的最后約100-150個氨基酸，將其包括在本發(fā)明的嵌合毒素的之內是很重要的。從而，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式包含這樣的嵌合蛋白，其中SEQ ID NO: I公開的CrylCa核心毒素片段結合于SEQ ID NO: 2公開的源自CrylAb的原毒素片段。這個嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文稱為DIG-152，在SEQID Ν0:3中公開(pMYC2547版本)。本發(fā)明的第二優(yōu)選的實施方式包含這樣的嵌合蛋白，其中SEQ ID NO: I公開的CrylCa核心毒素片段結合于SEQ ID NO:4顯示的的源自CrylAb的第二個545氨基酸的原毒素片段。注意這個原毒素片段的最后約100-150個氨基酸，將其包括在本發(fā)明的嵌合毒素的之內是很重要的。這第二個嵌合蛋白的1164氨基酸序列，本文稱為DIG-109，在SEQ ID NO: 5中公開(玉米優(yōu)化的版本)。應當理解包含CrylCa核心毒素變體和源自CrylAb的原毒素的其它嵌合融合體也在本發(fā)明的范圍之內。注意SEQ ID Ν0:2和SEQ ID Ν0:4展示的源自CrylAb的原毒素片段相互之間基本上是功能等同物，序列上的不同僅在于一個(第一個)位置。實施例2構建編碼嵌合CrylCa核心/CrylAb原毒素蛋白的表達質粒并在假單胞菌中表達標準克隆技術[例如描述于Sambrook et al. , (1989)和 Ausubel et al.,(1995),及其更新]被用于構建突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens, Pf)表達構建體pMYC2547，該構建體加工為產生包含CrylCa核心融合于CrylAb原毒素的全長嵌合蛋白(DIG-152 ；SEQ ID N0:3)。在熒光假單胞菌菌株MB214(菌株MBlOl的衍生株；熒光假單胞菌生物變型I)中進行，該菌株具有插入的修改的Iac操縱子，如US專利號5169760中所公開?；究寺〔呗园▽⒕幋aDIG-152的DNA片段亞克隆進質粒載體，其中其置于來自pKK223_3 質粒(PL Pharmacia,Milwaukee, WI)的 Ptac 啟動子和 rrnBTlTl 終止子的控制之下。一個這樣的質粒被命名為PMYC2547，而篩選的具有該質粒的MB214被命名為Dpf 108。搖瓶中的生長和表達分析用于表征和昆蟲生物分析的DIG-152的生產通過搖瓶生長的熒光假單胞菌菌株Dpf 108來完成。Ptac啟動子驅動的DIG-152蛋白的生產如先前的US專利號5527883描述的那樣來操作。搖瓶30°C起始培養(yǎng)24小時后通過加入異丙基-β-D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導表達。培養(yǎng)物在誘導時和誘導后不同的時間取樣。通過在600nm的光密度(0D600)來測量細胞密度。搖瓶樣品的細胞分離和SDS-PAGE分析在每個取樣時間，樣品的細胞密度調節(jié)至 0D600=20, ImL的部分在14000xg下離心5分鐘。細胞小塊在-80°下冷凍。使用EasyLyse 細菌蛋白提取溶液(ΚΡ Γ_ _:Ν_ 'Κ丨沖生物技術，Madison，WI)來產生來自冷凍的搖瓶細胞小塊樣品的可溶和不溶部分。每個細胞小塊重懸于EasyLyse 溶液并在溶菌緩沖液中進一步以1:4稀釋，并在室溫下振蕩孵育30分鐘。溶菌液在HOOOrpm下4°離心20分鐘，回收上清液作為可溶部分。顆粒(不溶部分)然后重懸于等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS ；
11.9mM Na2HPO4,137mM NaCl，2· 7mM KCl，ρΗ7· 4)。樣品與包含β-巰基乙醇的2Χ Laemmli樣品緩沖液(Sambrook et al. , supra.)以I: I混合并煮沸5分鐘之后上樣于Criterion XT Bis-Tris 12%凝膠(Bio-Rad Inc.,Hercules, CA)。在推薦的XT MOPS緩沖液中進行電泳。凝膠用Bio-Safe Coomassie Stain根據(jù)生產商(Bio-Rad)的步驟來染色并用Alpha Innotech成像系統(tǒng)(San Leandro, CA)照相。包涵體制備。DIG-152蛋白包涵體(IB)的制備在生產可溶性B. t.殺蟲蛋白的熒光假單胞菌發(fā)酵的細胞上進行，并通過SDS-PAGE和MALDI-MS (基質輔助激光解吸/電離質譜)來驗證。熒光假單胞菌發(fā)酵菌體在37°水浴中解凍。細胞以25%w/v重懸于溶菌緩沖液[50mM Tris,pH 7. 5,200mM NaCl,20mM EDTA二鈉鹽(乙二胺四乙酸)，l%Triton X-100，和5mM 二硫蘇糖醇(DTT) ;5mL/L的細菌蛋白酶抑制劑混合物(編號#P8465 ;Sigma-Aldrich，St. Louis,MO)在使用前加入]。細胞用手持式均化器在最低設置下懸浮(Tissue Tearor,BioSpec Products, Inc. ,Bartlesville,OK) 溶菌酶(25mg 的 Sigma L7651,來自雞蛋白)通過金屬勺加入細胞懸浮液，懸浮液在室溫下孵育I小時。懸浮液在冰上冷卻15分鐘，然后用Branson Sonifier 250 (兩次I-分鐘過程，在50%負載循環(huán)，30%輸出下)超聲破碎。細胞溶菌液用顯微鏡檢查。如果需要的話加入額外的25mg溶菌酶，重復孵育和超聲破碎過程。通過顯微鏡確認細胞溶菌之后，溶菌液在11500xg下離心14分鐘(4° )以形成IB小塊，棄去上清液。IB小塊用IOOmL溶菌緩沖液重懸，用手持式混合器均勻化并離心如前所述。IB小塊重復用重懸液洗滌(在50mL溶菌緩沖液中)，均勻化，超聲，然后離心直到上清液變得無色而IB小塊變得穩(wěn)定并發(fā)白的顏色。最后的洗滌后，IB小塊重懸于包含2mM EDTA的無菌過濾(O. 22 μ m)的蒸懼水,并離心。最后的小塊重懸于包含2mM EDTA的無菌過濾的蒸餾水，并以ImL的分量在-80°下儲存。IB制備中蛋白質的SDS-PAGE分析與定量通過解凍ImL分量的IB小塊并用無菌過濾的蒸餾水以1:20稀釋來進行。稀釋的樣品隨后用4X還原樣品緩沖液[250mM Tris,ρΗ6· 8，40% 甘油(ν/ν)，O. 4% 溴酚藍(w/v)，8%SDS (w/v)和 8% β -巰基乙醇(ν/ν)]煮沸并上樣于Novex 4_20%Tris-甘氨酸，12+2孔凝膠(Invitrogen)用IX Tris/甘氨酸/SDS(BioRad)跑膠。在200伏特下跑膠60分鐘然后用考馬斯藍(50%G_250/50%R-250在45%甲醇，10%乙酸中)染色，然后用7%乙酸，5%甲醇的蒸餾水溶液脫色。目標條帶的定量通過對比該條帶與在同樣的凝膠上跑的牛血清白蛋白(BSA)標準條帶的密度值以產生標準曲線。包涵體的溶解。6mL來自Pf克隆DPf 108的DIG-152包涵體懸浮物在Eppendorfmodel 5415C微離心的最高速設置(約14000xg)下離心以使包涵體成小塊。移除儲存緩沖液上清液并用25mL的pHll的IOOmM碳酸鈉緩沖液代替，在50mL錐形管中。包涵體用移液管重懸并渦旋以充分混合。試管置于輕柔搖晃的平臺上在4°下過夜以萃取目標蛋白。萃 取物在30000xg下4°離心30分鐘,獲得的上清液用Amicon Ultra-15再生纖維素離心過濾設備(30，000分子量切斷；微孔)濃縮5倍。樣品緩沖液然后改變?yōu)镮OmM CAPS [3-(環(huán)己胺)1_ 丙橫酸]pH 10 用可置換的 F1D-IO 柱(GE Healthcare, Piscataway, NJ)。包涵體蛋白的溶解和胰蛋白酶活化。在某些實例中，來自Pf克隆DPfl08的DIG-152包涵體懸浮液在Eppendorf model 5415C微離心的最高速設置(約14000xg)下離心以使包涵體成小塊。移除儲存緩沖液上清液并用PHll的IOOmM CAPS代替以提供蛋白質濃度為約50mg/mL。試管在室溫下?lián)u動3小時以充分溶解蛋白質。胰蛋白酶以等于5%-10%(W:W，基于IB粉末的初始重量)的量加入并通過孵育同時搖動在4°下過夜或在室溫下?lián)u動90-120分鐘來完成消化。通過IOOOOxg下離心15分鐘來移除不溶物質，上清液用于MonoQ離子交換柱(IOmm乘IOcm)?；罨腄IG-152蛋白用0%至100%的IM NaCl梯度經25個柱體積來洗脫。合并包含活化蛋白的部分，并且需要的話，用如前所述的AmiconUltra-15重生纖維素離心過濾設備濃縮至少于10mL。材料然后通過Superdex 200柱(16mm乘60cm)，所用緩沖液包含 IOOmM NaCl. 10%甘油，0. 5%Tween_20和 ImM EDTA。通過SDS-PAGE分析確定了活化的(酶截短的)蛋白洗脫液為65-70mL。合并包含活化蛋白的部分并用上文所述的離心濃縮器濃縮。凝膠電泳。濃縮的蛋白制備物通過用NuRVH' LDS樣品緩沖液(Invitrogen)以1:50稀釋后用于電泳，所述緩沖液含5mM DTT作為還原試劑并加熱至95° 4分鐘。樣品上樣于4-12%NuPAGl·:·卩凝膠的雙倍泳道上，旁邊是5個BSA標準，從0. 2μ g至2μ g/泳道的范圍(用于制作標準曲線)。提供200V的電壓并用MOPS SDS跑膠緩沖液(Invitrogen)直到示蹤染料到達凝膠底部。凝膠用0. 2%考馬斯藍G-250的45%甲醇和10%乙酸的溶液染色，并脫色，第一次簡單地用45%甲醇，10%乙酸，然后長時間用7%乙酸，5%甲醇直到背景被清除。脫色之后，凝膠用BioRad Fluor-S MultiImager掃描。該儀器的Quantity OneSoftware v. 4. 5. 2用于獲得染色蛋白條帶的去背景的體積并產生BSA標準曲線，其用于計算儲存的溶液中嵌合DIG-152蛋白的濃度。實施例3熒光假單胞菌中牛產的DIG-152的殺蟲活件
DIG-152蛋白的殺蟲活性在鱗翅目物種上驗證，包括歐洲玉米螟(ECB ；0strinianubilalis (Hiibner)), crylF-抗性 ECB (rECB),棉鈴蟲(CEff ；Helicoverpa zea (Boddie)),小地老虎(BCW ;Agrotis ipsilon (Hufnagel)),秋粘蟲(FAW, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)), CrylF-抗性 FAW(rFAW),和西南玉米螟(SWCB, Diatraea grandiosella)。樣品制備與生物分析。包涵體制備物(自身全長蛋白或胰蛋白酶活化的蛋白)通過交換方法例如透析或ro-ΙΟ柱轉入IOmM CAPS pHIO緩沖液中。然后樣品適當?shù)叵♂層贗OmM CAPS pHIO中，所有的生物分析包含一個該緩沖液組成的對照處理，其作為死亡率或生長抑制的背景對照。生物分析緩沖液的蛋白濃度通過凝膠電泳用BSA制作對凝膠密度的標準曲線來評估，用上文所述的BioRad成像系統(tǒng)來測量。凝膠基體中的蛋白質用基于考馬斯藍的染料染色并在讀取前脫色。純化的蛋白在生物測量中測試殺蟲活性，通過初生鱗翅目幼蟲在人工昆蟲食物 上進行。ECB，CEff, BCff, FAWdPSWCB的幼蟲由商業(yè)昆蟲飼養(yǎng)所(Benzon Research Inc.，Carlisle, PA)保持的克隆得到的卵所孵化。rECB和rFAW的幼蟲由個人擁有的克隆(DowAgroSciences, Indianapolis, IN)收獲的卵所孵化。生物分析在特別設計為昆蟲生物分析的128孔塑料盤(C-D International,Pitman, NJ)上進行。每個孔含I. OmL的多物種鱗翅目食物(Southland Products, LakeVillage, AR)。40 μ L分量的蛋白樣品用移液器遞送至每孔的I. 5cm2食物表面(即，26. 7 μ L/cm2)。食物濃度計算為孔中每平方厘米表面面積的DIG-152蛋白的量(ng)。處理過的盤保持在通風櫥中直到食物表面的液體蒸發(fā)或被吸收進入食物。羽化數(shù)小時之后，用濕潤的駝毛刷撿起單個的幼蟲并堆放在處理過的食物上，每孔一只幼蟲。侵染的孔用干凈塑料的粘性薄膜密封，并開通風口以允許氣體交換(C-DInternational)。生物分析盤保持在控制的環(huán)境條件下[28° ,約40%相對濕度(RH), 16小時8小時(光暗)]保持5天，到時間后所有昆蟲暴露于每種蛋白樣品，記錄死亡昆蟲數(shù)量，和存活昆蟲的重量。計算每個處理的百分比死亡率和百分比生長抑制。百分比生長抑制(GI)用下式計算%GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)JxlOO其中TWIT是該處理中昆蟲總重量(Jotal Weight of Insects in theTreatment)；TNIT 是該處理中昆蟲總數(shù)(Jotal Number of Xnsects in the Treatment)；TWIBC是背景檢測(緩沖液對照)中昆蟲總重量(lotal Weight of Insects inthe Background ￡heck),而TNIBC是背景檢測(緩沖液對照)中昆蟲總數(shù)(lotal Numberof Insects in the Background Check)。GI50確定為％GI值為50時食物中嵌合DIG-152蛋白的濃度。LC5tl (50%死亡濃度)記錄為50%的測試昆蟲被殺死時食物中DIG-152蛋白的濃度。統(tǒng)計學分析(One-way AN0VA)用 JMP 軟件(SAS，Cary，NC)進行。表3展示了 DIG-152蛋白對7中類型的測試昆蟲幼蟲的攝取生物分析。表3. GI50和LC5tl值(ng/cm2)，從頂部加載DIG-152蛋白的昆蟲食物計算。
權利要求
1.一種具有殺蟲活性的CrylCa變體蛋白，其中相應于野生型CyrlCa的N-端α -螺旋1，2Α，和/或2Β的所有或部分被刪除。
2.權利要求I的變體蛋白，其中的刪除移除了結構域I中α-螺旋I的全部和α -螺旋2的全部或部分，所述蛋白包含α -螺旋3至7。
3.權利要求I的變體蛋白，其中所述刪除改進了殺蟲蛋白DIG-109的殺蟲活性，其中所述刪除起始于α-螺旋2Α起始點之前并終止于α-螺旋2Β終點之后但是不延伸至α-螺旋3內。
4.權利要求I的變體蛋白，其中所述刪除改進了殺蟲蛋白DIG-152的殺蟲活性，其中所述刪除起始于α -螺旋2Α起始點之前并終止于α -螺旋2Β終點之后但是不延伸至α -螺旋3內。
5.權利要求I的變體蛋白，其中N-端刪除以至少一個不穩(wěn)定氨基酸開始，并且所述蛋白包含添加的密碼子，該密碼子在翻譯起始的蛋氨酸和所述不穩(wěn)定氨基酸之間指定編碼(specify)甘氨酸。
6.權利要求I的變體蛋白，其中所述蛋白缺少C-端原毒素序列。
7.修飾的CrylCa蛋白，包含在α-螺旋2B和α -螺旋3之間的間隔區(qū)內引入的蛋白酶切割位點。
8.權利要求7的修飾的蛋白，其中所述蛋白酶切割位點引入在SEQID NO: I的CrylCa核心毒素蛋白的氨基酸85-90內。
9.權利要求I或7的蛋白，其中所述蛋白具有改進的針對昆蟲的活性。
10.權利要求9的蛋白，其中所述昆蟲選自秋粘蟲和甘鹿螟(sugarcaneborer)。
11.修飾的CyrlCa蛋白，包含交換的或重排的/改組的選自結構域II和結構域III的結構域。
12.權利要求I的蛋白，包含核心毒素片段，該片段包含SEQID NO: I的氨基酸1-619，其中具有多至10個，多至15個，或多至20個氨基酸的添加，刪除或取代。
13.一種融合的殺蟲蛋白，包含源自CrylCa殺蟲蛋白的N-端核心毒素片段，其與異源δ內毒素原毒素片段在所述核心毒素片段之后的位點融合。
14.權利要求12的蛋白，所述蛋白包含SEQID NO: I的殘基28-619的氨基酸序列，并具有多至20個氨基酸的取代，刪除或修飾。
15.權利要求12的蛋白，所述蛋白包含SEQID NO: I的殘基1-619，并具有至多20個氨基酸的取代，刪除或修飾。
16.分離的蛋白，其與選自SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:29，SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:35，和 SEQ IDNO:1 的序列具有至少 90% 的同一性。
17.權利要求16的蛋白，其中所述蛋白包含選自SEQID NO: 3, SEQ IDNO: 5, SEQ IDNO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQID N0:35 JPSEQ ID NO: I 的序列。
18.分離的多核苷酸，其編碼權利要求16的蛋白。
19.權利要求18的多核苷酸，其中所述多核苷酸與選自SEQID NO:4, SEQ ID N0:8,SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:32，SEQ IDN0:34，SEQ ID NO:36，和 SEQ ID NO:2的序列具有至少90%的同一性。
20.控制鱗翅目昆蟲的方法，所述方法包括使所述昆蟲接觸權利要求16的蛋白。
21.產生權利要求16的蛋白的植物細胞。
22.包含權利要求18的多核苷酸的微生物細胞。
23.包含多個權利要求21的細胞的植物。
全文摘要
本發(fā)明包括修飾的殺蟲B.t.Cyr1Ca蛋白，包括本發(fā)明稱為DIG-109和DIG-152的蛋白，以及DIG-109和DIG-152的變體，編碼這些蛋白的核酸，用這些蛋白控制害蟲的方法，在轉基因宿主細胞中生產這些蛋白的方法，以及生產這些蛋白的轉基因植物。DIG-109和DIG-152蛋白包含由B.t.Cry1Ca的核心毒素片段和Cry1Ab原毒素片段組成的嵌合肽。也描述了DIG-109和DIG-152蛋白的殺蟲活性變體。
文檔編號C07K14/325GK102762096SQ201080064011
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權日2009年12月16日
發(fā)明者A.T.伍斯利, I.拉里努阿, K.納瓦, S.L.伯頓, T.海伊, T.米德 申請人:陶氏益農公司