專利名稱：具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的治療的制作方法
具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的治療本發(fā)明涉及具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及血友病例如A型血友病或B型血友病的治療。本發(fā)明要求PCT申請PCT/EP2009/004218的優(yōu)先權(quán)，所述申請的公開內(nèi)容完全并入本文。血友病是損害身體控制血凝或血液凝固的能力的一組遺傳性障礙，所述能力用于當(dāng)血管破裂時(shí)阻止出血。A型血友病，最常見的形式，因因子VIII的基因突變引起；B型血友病，也稱為克雷司馬斯病(Christmasdisease)，因因子IX的基因突變引起。B型血友病，與A型血友病一樣，是X染色體連鎖的并且占約12%的血友病病例。癥狀與A型血友病的癥狀相同受傷后過度出血；以及自發(fā)出血，特別地至承重關(guān)節(jié)、軟組織和粘膜內(nèi)的自發(fā)出血。至關(guān)節(jié)內(nèi)的反復(fù)出血導(dǎo)致關(guān)節(jié)積血，從而引起通常必需進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)的令人疼痛的嚴(yán)重關(guān)節(jié)病。軟組織中的血腫可導(dǎo)致包含壞死的凝固的血液的假腫瘤(pseudo tumor);它們可阻塞、擠壓或破裂至相鄰的器官內(nèi)并且可導(dǎo)致感染。一旦形成，血腫就難以治療，即使進(jìn)行手術(shù)也是如此。擠壓后神經(jīng)的恢復(fù)不佳，從而導(dǎo)致麻痹。牽涉胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或氣道/腹膜后空間的那些出血事件，如果未被檢測到的話，可導(dǎo)致死亡。顱內(nèi)出血是血友病患者的主要死亡原因。據(jù)估計(jì)，在美國有100，000例先天性血友病病例。在這些先天性血友病中，約20，000例為B型血友病病例，此類患者的血液完全缺乏因子IX或嚴(yán)重缺乏血漿因子IX組分。因此，該疾病存在不同的嚴(yán)重程度，需要每周一次至每年一次或兩次的治療。完全缺乏的病例需要每周一次的替代治療；部分缺乏的病例僅在發(fā)生出血事件時(shí)才需要治療，所述出血事件可少至每年一次。先天性部分缺乏的病例中，出血事件通常由臨時(shí)獲得的易感性而非僅由損傷造成。充足的大量新鮮血漿或等量的新鮮血液的靜脈內(nèi)注射暫時(shí)校正缺陷受試者的缺陷。有益作用通常持續(xù)2或3周，雖然通過體外測試對患者血液測量的凝血缺陷似乎僅改善了 2或3天。這樣的利用新鮮血漿或新鮮血液的療法是有效的，但其具有幾個(gè)嚴(yán)重缺點(diǎn)(1)其需要隨時(shí)可獲得大量新鮮血漿；(2)需要住院來施用血漿；(3)許多患者對重復(fù)的血液或血漿輸注變得敏感并且最終遭致致死性輸血反應(yīng)；(4)血漿充其量僅可部分緩解缺乏；以及(5)長期的治療或手術(shù)是不可能的，因?yàn)樗枰拇罅垦夯蜓獫{將引起急性和致死性水腫。改進(jìn)的療法包括，利用因子VIII或因子IX濃縮物的靜脈內(nèi)替代療法。然而，同樣地該療法也受到幾個(gè)不利方面的困擾(1)當(dāng)治療重大出血事件時(shí)，即使進(jìn)行了迅速的檢測和治療，組織損傷也仍然存在；(2)許多患者變得抗拒凝血因子并且產(chǎn)生針對凝血因子的抑制性抗體(所謂的具有抑制劑的血友病)；(3)盡管使用了改進(jìn)的病毒滅活法，但仍然存在增加的被致死性病毒例如HIV和丙型肝炎病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)(據(jù)估計(jì)，在美國超過50%的血友病群體，超過10，000人通過受感染的血液供給感染了 HIV) ；(4)分離的凝血因子，尤其是重組凝血因子非常昂貴，并且在發(fā)展中國家通常是不可獲得的。在替代療法之外來治療或預(yù)防出血是個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)檠巡〉某鲅莻€(gè)復(fù)雜的病理生理過程，該過程可歸因于三個(gè)缺陷(1)在低組織因子濃度上通過外部途徑的減少的凝血酶產(chǎn)生，(2)通過內(nèi)部途徑的減少的凝血酶產(chǎn)生的繼發(fā)性爆發(fā)，和(3)通過內(nèi)部途徑的纖維蛋白溶解系統(tǒng)的存在缺陷的下調(diào)。減少的凝血酶產(chǎn)生導(dǎo)致減少的凝血傾向，從而導(dǎo)致增加的出血風(fēng)險(xiǎn)的事實(shí)已被廣泛接受。然而，過去十年的工作顯示，纖維蛋白溶解的下調(diào)缺陷可能也在血友病中起著重要作用。因此，血友病還可被分類為具有纖溶亢進(jìn)的凝血病。最近的出版物通過體外顯示如下現(xiàn)象來支持該假設(shè)當(dāng)血塊在因子VIII耗盡并且補(bǔ)充有組織型纖溶酶原激活物tPA的血漿(FVII1-DP)中形成時(shí)，纖維蛋白溶解不能被充分下調(diào)，結(jié)果血塊過早溶解(Broze和Higuchi, Bloodl996, 88:3815-3823 ；Mosnier ；Thromb. Haemost. 2001, 86:1035-1039)。此外，已顯不，該“過早溶解”歸因于凝血酶-可激活的纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)的減少的激活或不存在所述激活(Βι ζθ和Higuchi, 1996)，并且在FVII1-DP中，包含激活的TAFI的混合物增加了血塊溶解時(shí)間。已得出結(jié)論穩(wěn)定化的TAFI可用于治療血友病(W002/099098)。TAFI在纖維蛋白溶解的下調(diào)中起著關(guān)鍵作用，其是形成穩(wěn)定的血塊所必需的。TAFI (也稱為血漿羧肽酶原B2或羧肽酶原U)是當(dāng)暴露于凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物時(shí)，通過在Arg92上的蛋白質(zhì)水解被轉(zhuǎn)化成抑制纖維蛋白溶解的基礎(chǔ)羧肽酶(bas iccarboxypeptidase) (TAFI·a或激活的TAFI)的血衆(zhòng)酶原。其通過從血纖蛋白除去C末端賴氨酸和精氨酸殘基(其對于纖溶酶原的結(jié)合和激活是非常重要的)而有效地減弱纖維蛋白溶解。如上所論述的，與凝血酶復(fù)合的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)負(fù)責(zé)TAFI激活。血栓調(diào)節(jié)蛋白為用作內(nèi)襯血管的內(nèi)皮細(xì)胞上的凝血酶受體的膜蛋白。凝血酶為凝血級聯(lián)中的中心酶，其將血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成形成基質(zhì)凝塊的血纖蛋白。首先，局部損傷導(dǎo)致從其無活性前體凝血酶原產(chǎn)生少量凝血酶。接著，凝血酶激活血小板和，接下來，某些凝血因子包括因子V和VIII。后一作用產(chǎn)生所謂的凝血酶爆發(fā)(另外的凝血酶原分子的大量激活)，這最終導(dǎo)致形成穩(wěn)定的血塊。然而，當(dāng)結(jié)合于血栓調(diào)節(jié)蛋白時(shí)，凝血酶的活性被間接改變凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的主要特征是其激活蛋白C的能力，所述蛋白C隨后通過蛋白質(zhì)水解性滅活重要的輔因子，因子Va和因子VIIIa來下調(diào)凝血級聯(lián)(Esmon等人，Ann. N. Y. Acad. Sc1.(1991)，614:30-43)，從而提供抗凝血活性。凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物也能夠激活凝血酶-可激活的纖維蛋白溶解抑制劑(TAFI)，其隨后拮抗纖維蛋白溶解(參見上文)。成熟人TM包含559個(gè)殘基的單個(gè)多肽鏈，且由5個(gè)具有下列定位的結(jié)構(gòu)域組成氨基末端“凝集素樣”結(jié)構(gòu)域、包括6個(gè)表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)的"6EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域〃、O-糖基化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(氨基酸位置如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中所示):
權(quán)利要求
1.一種血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物，其在與凝血酶結(jié)合后，與TMEM338L相比，具有減小的輔因子活性，所述類似物具有 a)根據(jù)SEQID N02的氨基酸序列，或 b)根據(jù)SEQID N03的氨基酸序列，或 c)根據(jù)SEQID N04的氨基酸序列，或 d)與根據(jù)SEQID N02, SEQ ID:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少98%的同一性的氨基酸序列，或 e)血栓調(diào)節(jié)蛋白片段，其基本上由下述組成SEQID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ IDN0:4的6個(gè)EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域(如SEQ ID NO:1中編號的氨基酸位置227至462)、SEQ IDNO: 2，SEQ ID NO: 3或SEQID NO: 4的EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域3至EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域6 (如SEQID NO:1 中編號的氨基酸位置 307 至 462)或 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQID NO:4 的EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域3的c環(huán)至EGF-樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域6 (如SEQID NO:1中編號的氨基酸位置333 至 462)， 其中位置376 (如根據(jù)SEQ ID NO 1中編號的)上的苯丙氨酸被缺失或被甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸置換。
2.權(quán)利要求1的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置387(如SEQ ID NO:1中編號的)上包括谷氨酰胺殘基的缺失或置換，其中所述置換優(yōu)選被Met、Thr、Ala、Glu、His、Arg、Ser, Val、Lys， Gly、lie、Tr、Tyr，Leu、Asn、Phe、Asp、Cys 置換。
3.權(quán)利要求1或2的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置388(如SEQ IDNO中編號的)上包含甲硫氨酸殘基的缺失或置換，其中甲硫氨酸殘基優(yōu)選被Gin、Tyr，lie、Phe、His、Arg、Pro、Val、Thr、Ser，Ala、Trp、Asn、Lys，Gly、Glu、Asp、Cys 置換。
4.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其還在位置389(如SEQ ID N0:1中編號的)上包括苯丙氨酸殘基的缺失或置換，其中苯丙氨酸優(yōu)選被Val、Glu、Thr、Ala、His、Trp、Asp、Gin、Leu、lie、Asn、Ser， Arg、Lys， Met，Tyr，Gly、Cys， Pro 置換。
5.權(quán)利要求的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白包含如表4中描述的一個(gè)或多個(gè)第一和第二氨基酸修飾。
6.權(quán)利要求的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白包含如表5中描述的一個(gè)或多個(gè)第一、第二和第三氨基酸修飾。
7.血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病，其中 a)TM類似物如上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所定義，或 b)所述TM類似物的特征在于，在治療有效劑量上顯示抗纖維蛋白溶解作用。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物顯示一個(gè)或多個(gè)下列特征 (i)與兔肺血栓調(diào)節(jié)蛋白相比，減小的對凝血酶的結(jié)合親和力，和/或kD值超過O.2nM的對凝血酶的結(jié)合親和力；和/或 (ii)與TM類似物TMEM388L的輔因子活性相比，減小的輔因子活性， (iii)與TM類似物TMeM388L相比，增加的TAFI激活活性對輔因子活性的比率。
9.權(quán)利要求7或8的用途，其中所述具有纖溶亢進(jìn)的凝血病選自如下疾病A型血友病、B型血友病、C型血友病、血管性血友病(vWD)、獲得性血管性血友病、因子X缺乏、副血友病、凝血因子1、I1、V或VII的遺傳性障礙、因循環(huán)抗凝物引起的出血障礙或獲得性凝血缺乏。
10.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于治療一個(gè)或多個(gè)選自下列的出血事件顱內(nèi)出血或其它CNS出血、關(guān)節(jié)、微毛細(xì)血管、肌肉、胃腸道、呼吸道、腹膜后空隙或軟組織中的出血。
11.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述患者具有抗-因子VIII抗體。
12.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述患者用因子VIII，優(yōu)選重組因子VIII或重組的缺失B結(jié)構(gòu)域的因子VIII分子，更優(yōu)選辛凝血素a或莫羅凝血素a來進(jìn)行治療。
13.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的用途，其特征在于將所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物與因子VIII，優(yōu)選重組因子VII1、重組的缺失B結(jié)構(gòu)域的因子VIII分子，更優(yōu)選辛凝血素a或莫羅凝血素a組合施用。
14.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述患者用因子VII1、優(yōu)選重組因子VII1、更優(yōu)選辛凝血素a來進(jìn)行治療。
15.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中在出血發(fā)作時(shí)施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
16.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中在增加的出血風(fēng)險(xiǎn)例如手術(shù)或拔牙之前施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
17.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中給難以用血液/血漿輸注或凝血因子替代療法治療的患者施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
18.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中優(yōu)選在短于I周至4周的總時(shí)間中，每天一次，每2天一次，或每3、4、5、6或7天一次，更優(yōu)選以長期施用的方式，以多個(gè)劑量施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
19.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中以胃腸外施用的方式，優(yōu)選以靜脈內(nèi)或皮下施用的方式，施用所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
20.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物為可溶性TM類似物。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物為人可溶性TM類似物。
22.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物包括選自EGF3、EGF4、EGF5、EGF6的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選包含片段EGF3-EGF6，更優(yōu)選包含EGF結(jié)構(gòu)域1_6。
23.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物由EGF結(jié)構(gòu)域EGFl至EGF6組成，更優(yōu)選由EGF結(jié)構(gòu)域EGF3至EGF6組成。
24.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有相應(yīng)于成熟血栓調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3中描述的)的氨基酸序列，并且包括下列修飾中的一個(gè)或多個(gè) a)氨基酸1-3的去除；b)M388L；c)R456G；d)H457Q； e)S474A，和在P490上的終止。
25.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有包含與SEQIDNO: 2具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性的序列的氨基酸序列。
26.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在相應(yīng)于天然序列(根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一個(gè)或多個(gè)如下位置上具有氨基酸修飾aa) 349Asp;bb) 355Asn; ac)357Glu; ad)358Tyr; ae)359Gln; af)361Gln; ag)363Leu; ah)364Asn;ai)368Iyr;aj) 371Val;ak) 374Glu;al) 376Phe; am) 384His;an) 385Arg; ba)387Gln; bb)389Phe; be) 398Asp; bd)400Asp; be)402Asn; bf)403Thr; bg)408Glu; bh)411Glu; bi)413Tyr; bj) 414Ile; bk) 415Leu; bl) 416Asp; bm) 417Asp; bn) 420Ile; bo) 423Asp; bp) 424Ile; bq) 425Asp; br) 426Glu; ca)428Glu; cb)429Asp; cc)432Phe; cd)434Ser;ce)436Val; cf)438His; eg) 439Asp; ch)440Leu; \ 443nTLci)Ihr;c j) 444Phe;ck) 445Glu;cl) 456Arg;cm) 458Ile ;或cn) 461Asp0
27.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在根據(jù)SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的位置376上具有苯丙氨酸的修飾，其優(yōu)選被脂族氨基酸置換，更優(yōu)選被甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸置換，最優(yōu)選被丙氨酸置換。
28.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物具有根據(jù)SEQIDNO:1或SEQ ID N0:3的下列氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾 a)387Gln; b)388Met; b)389Phe, 其中所述氨基酸被缺失，被一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸插入，或優(yōu)選被置換。
29.上述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的用途，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物以其氧化形式使用，優(yōu)選被氯胺T、過氧化氫或高碘酸鈉氧化。
30.權(quán)利要求19的用途，其中TM類似物內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基被氧化，優(yōu)選位置388 (根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3)上的甲硫氨酸殘基被氧化。
31.篩選適用于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物的方法，其中所述血栓調(diào)節(jié)蛋白顯示下列特征中的一個(gè)或多個(gè) (i)減小的對凝血酶的結(jié)合親和力， ( )減少的輔因子活性， (iii)增強(qiáng)的TAFI激活活性， 所述方法包括步驟 a)產(chǎn)生血栓調(diào)節(jié)蛋白序列(SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，優(yōu)選在權(quán)利要求15中所列的氨基酸位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換； b)針對下列特征中的一個(gè)或多個(gè)，將修飾的類似物與對照分子，優(yōu)選兔肺TM或可溶性人TM類似物相比較 ba)對凝血酶的結(jié)合親和力(KD值)； bb)輔因子活性; be) TAFI激活活性或TAFIa潛能； bd)TAFI激活活性與輔因子活性的比率； be)蛋白質(zhì)氧化的作用； bf)在體外測定中在時(shí)間上對血塊溶解的影響；或bg)在凝血相關(guān)動(dòng)物模型中的作用。
32.治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的方法，其包括施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
33.治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的方法，其包括施用O.75 μ g/kg至140 μ g/kg待治療的受者的體重的劑量的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
34.一種藥物組合物，其以O(shè). 75 μ g/kg至140 μ g/kg待治療的受試者的體重的劑量包含用于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病的根據(jù)權(quán)利要求1至20的任一項(xiàng)的血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物用于制備用于治療具有纖溶亢進(jìn)的凝血病例如血友病障礙的藥劑的用途。此類血栓調(diào)節(jié)蛋白類似物在治療有效劑量上顯示抗纖維蛋白溶解作用。公開了新的蛋白質(zhì)修飾和用于鑒定其的方法。
文檔編號C07K14/745GK103037893SQ201080068202
公開日2013年4月10日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月14日
發(fā)明者K-U·彼得森, M·E·內(nèi)舍姆, J·H·福萊 申請人:帕昂德國有限公司