專利名稱:一種黃曲霉毒素b1的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及從黃曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中分離純化黃曲霉毒素 Bl (AFBl)的方法。
背景技術(shù):
黃曲霉毒素(Aflatoxins)是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強(qiáng)的ー類生物毒素, 主要是由黃曲霄(Aspergillus flavus)禾ロ寄生曲霄(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,是ー類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物,均為ニ氫呋喃香豆素的衍生物。其中,毒性最強(qiáng)、危害最大的為黃曲霉毒素Bi,其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。目前,黃曲霉毒素污染食品和中藥材的問題日趨嚴(yán)重,為了保證檢測分析所需黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的供給,獲得大量、高純度的黃曲霉毒素,我們選擇了高產(chǎn)的寄生曲霉進(jìn)行大米培養(yǎng),從中分離純化出高純度的黃曲霉毒素Bi,為該真菌毒素的深入研究提供了基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供黃曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中分離純化黃曲霉毒素 Bl的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案依次包含如下方法步驟1.篩選高產(chǎn)菌株2.分離純化黃曲霉毒素Bl
具體實(shí)施例方式下面所實(shí)施例有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。1.篩選高產(chǎn)菌株根據(jù)我們前期的工作基礎(chǔ),考察培養(yǎng)條件(溫度、濕度、光照、PH值、碳源、氮源等) 對產(chǎn)毒菌株生長及產(chǎn)毒量的影響,優(yōu)化培養(yǎng)條件,篩選產(chǎn)黃曲霉毒素的高產(chǎn)菌株,通過大米培養(yǎng),得到培養(yǎng)物。2.分離純化黃曲霉毒素Bl應(yīng)用正相硅膠柱色譜技術(shù)對該培養(yǎng)物中的黃曲霉毒素進(jìn)行分離和純化,建立黃曲霉毒素Bl的制備方法。對黃曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物(4. 95kg)進(jìn)行粉碎,用80%的乙醇溶液加熱(50°C)減壓回流提取4次,每次提取時(shí)間為2小吋,合并提取液減壓濃縮至無醇味時(shí),轉(zhuǎn)入分液漏斗中,采用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取,萃取四次后,合并萃取液,減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物(50g)。對其進(jìn)行硅膠柱層折,氯仿/丙酮系統(tǒng)(100 0-0 100)洗脫,得到A G7個(gè)部分。對A部分進(jìn)行石油謎/丙酮(30 1-0 1)系統(tǒng)洗脫,得到含黃曲霉毒素Bl的粗品,經(jīng)氯仿/甲醇重結(jié)晶后,得到黃曲霉毒素Bl (10mg)。
黃曲霉毒素Bl (Aflatoxin Bi) [1’2],分子式為 C17H12O6,分子量為 312。ESI-MS m/z 335 [M+Na]+,647[2M+Na]+ ;1H NMR (CDCl3, 600ΜΗζ) δ 6. 80(1H, d, J = 7. 2Hz,H-13),6· 46 (1H, br t, J = 2. 4Hz, H-16),5· 47 (1H, t, J = 2. 4Hz, H-15),4. 76 (1H,dt, J = 7. 2,2. 4Hz, H-14),3. 95 (3H, s, H-17),3. 39 (2H, m, H_5),2. 63 (2H, m, H_4) ;13CNMR(CDCl3,150MHz) δ :201. 4 (C_3),177. 2(C_6),165. 8 (C-IO),161. 6(C_8),155. 3 (C-I),153. 1 (C-12) , 145. 4(C_16) , 117. 6 (C_2) , 113. 6(C_13) , 108. O(C-Il) , 104. 2 (C_7),102. 8 (C-15) ,91. 0 (C_9),56. 7 (C-17),48. 1 (C-14),35. 2 (C_4),29. 2 (C_5)。儀器和試劑Bruker AV-600型超導(dǎo)核磁共振儀;LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀;薄層板GF254 (青島海洋化工廠產(chǎn)品);試劑為分析純(北京化工廠)。薄層條件3展開劑石油醚/丙酮1 l(v ν);檢測波長254nm和365nm。參考文獻(xiàn)[1]M. S. Masri, W. F. Haddon, R. Ε. Lundin, D. P. H. Hsieh. Aflatoxin Q1. A newlyidentified major metaboliteof Aflatoxin Bl in monkey liver. J. Agr. Food Chem.,1974,22(3) :512-515.[2]R. H. Cox, R. J. Cole. Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Studies ofFungal Metabolites, Aflatoxins, and Sterigmatocystins. J. Org. Chem. , 1977, 42 (1)112-114.
圖i-黃曲霉毒素Bl的結(jié)構(gòu)
圖2-分離流程
圖3-黃曲霉毒素Bl的氫譜
圖4-黃曲霉毒素Bl的碳譜
權(quán)利要求
1. 一種黃霉毒素Bl的制備方法,其特征在于對黃曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物進(jìn)行粉碎,用80%的乙醇溶液加熱(50°C)減壓回流提取4次,每次提取時(shí)間為2小吋,合并提取液減壓濃縮至無醇味時(shí),轉(zhuǎn)入分液漏斗中,采用等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取,萃取四次后,合并萃取液,減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物。對其進(jìn)行硅膠柱層折,氯仿/丙酮系統(tǒng) (100 0-0 100)洗脫,得到A G7個(gè)部分。對A部分進(jìn)行石油醚/丙酮(30 1-0 1) 系統(tǒng)洗脫,得到含黃曲霉毒素Bl的粗品,經(jīng)氯仿/甲醇重結(jié)晶后,得到黃曲霉毒素Bi。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素B1的制備方法,所說黃曲霉毒素B1是從黃曲霉毒素高產(chǎn)菌株的大米培養(yǎng)物中,應(yīng)用正相硅膠柱色譜技術(shù)分離純化獲得的,該工藝簡單,收率提高,成本降低,極有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07D493/12GK102584849SQ20111000081
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者吳海峰, 楊美華, 許旭東, 高微微 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所