專利名稱：鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨疫里氏桿菌(RA)病，又稱鴨傳染性漿膜炎，是目前對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害最嚴(yán)重的傳染病之一，多見于1-8周齡雛鴨，尤以2-3周齡雛鴨最易感，死亡率一般在5% -75%之間，環(huán)境惡劣或混合感染其他疫病時(shí)死亡率可達(dá)90%以上，RA血清型復(fù)雜，而且各血清型間缺乏交叉保護(hù)作用，據(jù)目前調(diào)查，RAl型和RA2型占分離菌株的74%以上，為我國(guó)當(dāng)前主要流行的血清型。鑒于常規(guī)的藥物易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)RA的控制效果并不理想以及不同的血清型菌株之間基本沒有交叉免疫保護(hù)作用，因此研制針對(duì)主要流行血清型菌株的疫苗以控制本病是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。鴨疫里氏桿菌的外膜蛋白OMPs (Outer Membrane Proteins, OMPs)能誘導(dǎo)特異性的體液和細(xì)胞毒性反應(yīng)，而且還能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉提呈，具有潛在的免疫載體功能，可以提高機(jī)體的免疫應(yīng)答，具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，是一種潛在的共同保護(hù)性抗原。禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起的各種日齡鴨的急性敗血性細(xì)菌病，以心包炎、氣囊炎、肝周炎、腹膜炎為主要特征，在鴨群中大腸桿菌與鴨疫里氏桿菌病并發(fā)，大腸桿菌血清亞型眾多，主要的血清型有OpOpO2等，其中尤以O(shè)re更為常見。疫苗的免疫預(yù)防是目前控制大腸桿菌病的重要手段，但是目前常用的單價(jià)血清型滅活苗僅對(duì)同型致病性菌株有抵抗力，多價(jià)滅活苗為不同血清型的代表株相加而成，但在抗原含量與保護(hù)力上難以兩全。大腸桿菌外膜蛋白不但與大腸桿菌的致病機(jī)理相關(guān)，而且具有良好的免疫原性，可加快巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的提呈作用，激活淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，而且更為重要的是不同血清型菌株間具有交叉保護(hù)作用，能抵抗同源和異源菌株的攻擊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)RAU RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌O78(Avian pathogenic Escherichia coli APECO78)外膜蛋白組合制成的二聯(lián)疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗的免疫安全性好，免疫效果明顯，在動(dòng)物體內(nèi)可產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，能夠有效抵御同型鴨疫里氏桿菌和多種血清型大腸桿菌的攻擊，可作為防預(yù)鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌的疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供該二聯(lián)疫苗的制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗，它包括抗原和油佐劑，其特征在于抗原與油佐劑以體積比1 1 1 5的比例乳化配制而成，抗原為鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白。本發(fā)明的二聯(lián)疫苗，鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白和大腸桿菌O78外膜蛋白的體積比為1 1 1或1 1，即抗原為鴨疫里氏桿菌 RAl型外膜蛋白禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白=1 1，抗原為鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白=1 1，抗原為鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白 鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白=1 1 1。其中，本發(fā)明的油佐劑由94%的白油(ν/ν)、6%&3*-80(ν/ν)和2%的硬脂酸鋁(g/v)組成。本發(fā)明還提供了該鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)外膜蛋白基因的擴(kuò)增及克隆根據(jù)鴨疫里氏桿菌外膜蛋白OMPA基因、大腸桿菌外膜蛋白OMPA基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl基因、RA2型外膜蛋白0MPA2基因和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3基因片段，將0MPA1、0MPA2及0MPA3分別克隆到載體 pMD-18-T 上，得到質(zhì)粒 pMD-18-T-0MPAl、pMD-18-T-0MPA2 和 pMD-18-T_0MPA3，進(jìn)行測(cè)序；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建陽性質(zhì)粒 pMD-18-T-OMPAl、pMD-18-T_0MPA2 和 pMD-18-T_0MPA3 以限制性內(nèi)切酶雙酶切后，將三個(gè)外膜蛋白基因分別克隆到質(zhì)粒載體pET48a(+)上，得到重組陽性質(zhì)粒 pET-28a(+)-OMPAl、pET_28a (+)-0MPA2 和 pET_28a(+)-0MPA3 ；(3)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a (+) -OMPAl、pET_28a (+) -0MPA2 和 pET_28a (+) -0MPA3 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，然后抗性篩選陽性表達(dá)菌株，通過誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)；(4)表達(dá)蛋白的純化表達(dá)后的鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白0MPA1、鴨疫里氏桿菌RA2外膜蛋白 0MPA2、禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白0MPA3通過Ni-NTA His. BindResin純化柱純化目的蛋白，然后大量表達(dá)得到足量的外膜蛋白保存于-20°C備用；(5)以純化后的外膜蛋白溶液為原料，制備疫苗將純化后的鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白0MPA2和禽致病性大腸桿菌Ore外膜蛋白0MPA3溶液調(diào)整到適當(dāng)?shù)臐舛龋饕呙缰型饽さ鞍椎捏w積比均相同，含量均為30 50μ g/mL，按比例混合，加入油佐劑乳化后分裝即可。其中，PCR擴(kuò)增中用的特異性引物，是根據(jù)Genebank中鴨疫里氏桿菌ATCC11845株 (登錄號(hào)AF104937)和大腸桿菌K12W3110株(登錄號(hào)AP009048)的OMPA基因序列設(shè)計(jì)，上游引物引入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Β ο I酶切位點(diǎn)；鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型外膜蛋白OMPA基因引物序列如下RA-OMPA-F GCTGGATCCATGGGTAAAGAATTTATGRA-OMPA-R :AGTCTCGAGTCTTACAAGAAGAGGACGCTT禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA基因引物序列如下E-OMPA-F :ATGGATCCGCTCCGAAAGATAACE-OMPA-R ATACTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT。
本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗可以用于制備防治鴨疫里氏桿菌、禽大腸桿菌病的制劑。本發(fā)明PCR擴(kuò)增的模板分別為鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型、禽致病性大腸桿菌O78 的基因組，鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型、禽致病性大腸桿菌O78可為當(dāng)前國(guó)內(nèi)公開的任何相應(yīng)毒株，不影響本發(fā)明的實(shí)施，且其基因序列已在Genebank中公開，本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型菌株來源于福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，禽致病性大腸桿菌O78來源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；擴(kuò)增得到的三個(gè)外膜蛋白基因片段0MPA1、0MPA2及0MPA3大小分別為1164bp、1164bp、975bp ；表達(dá)所得的外膜蛋白0MPA1、0MPA2及0MPA3大小分別為42KD、 42KD,37KD0其中，本發(fā)明油佐劑可按如下方法配制配油相時(shí)先取少量注射用白油與硬脂酸鋁混合，加熱溶化，再與全量司本-80及剩余的注射用白油混合均勻，116°C滅菌30分鐘，冷至室溫即得本發(fā)明的油佐劑。本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗及其制備方法的有益效果1)生物安全性高，本發(fā)明疫苗的抗原成分均為外膜蛋白，所以接種動(dòng)物后不存在疫苗散毒的潛在危險(xiǎn)；2)本發(fā)明疫苗一苗多防，且防御效果好，本發(fā)明是利用鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白高度保守性和強(qiáng)的免疫原性，首次將鴨疫里氏桿菌RA1、RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白進(jìn)行不同組合制備而成的二聯(lián)疫苗，而且不同血清型的大腸桿菌外膜蛋白具有廣泛的交叉保護(hù)作用，所以本疫苗可以同時(shí)防治同型鴨疫里氏桿菌和多血清型的大腸桿菌；3)本發(fā)明生產(chǎn)成本低，本發(fā)明所提供的三種外膜蛋白抗原是通過原核表達(dá)的方法制備的，而且?guī)в袠?biāo)簽，方便純化，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。


圖1擴(kuò)增的鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl片段電泳2擴(kuò)增的鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白0MPA2片段電泳3擴(kuò)增的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3片段電泳4原核表達(dá)質(zhì)粒pET_28a (+) -OMPAl構(gòu)建圖譜圖5原核表達(dá)質(zhì)粒pET_28a⑴-0MPA2構(gòu)建圖譜圖6原核表達(dá)質(zhì)粒pET_28a⑴-0MPA3構(gòu)建圖譜
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1鴨疫里氏桿菌RA1、RA2型外膜蛋白原核表達(dá)菌株的構(gòu)建(1)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank中鴨疫里氏桿菌ATCCl 1845株(登錄號(hào)AF104937)的OMPA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物引入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物引入Bio I酶切位點(diǎn)。其引物序列如下
RA-OMPA-F GCTGGATCCATGGGTAAAGAATTTATGRA-OMPA-R :AGTCTCGAGTCTTACAAGAAGAGGACGCTT(2)基因組的提取A、將鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型菌株菌種劃線接種于含2%新生牛血清的胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板上，于37°C溫箱中培養(yǎng)Mh ；B、挑取單菌落接種于馬丁肉湯液體培養(yǎng)基，37°C搖床振搖培養(yǎng)過夜；C、將菌液轉(zhuǎn)移至1. 5mL印pendorf管中，8000r/min轉(zhuǎn)離心aiiin，棄上清，加入 500 μ L TE buffer (pH 8. 0)重懸復(fù)溶；D、加入 30 μ L 10% SDS、3yL 蛋白酶 lU20mg/mL)，55°C水浴過夜；E、加入 200 μ L 3M 氯化鈉，65°C水浴 IOmin ；F、以等體積的酚氯仿抽提，12000r/min離心5min取上清；G、重復(fù)步驟F;H、加入10 %體積的3M醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，冰上放置30min ；I、用槍頭將絮狀沉淀勾出，并以70%乙醇洗滌一次；J、加入 30 50 μ L 的 TE Rnase 溶解。(3)外膜蛋白的克隆分別以鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型基因組為模板擴(kuò)增鴨疫里氏桿菌的外膜蛋白， 在PCR反應(yīng)管中加入5μ L 10XPCR Buffer,4y L 2. 5mmol dNTP，上下游引物各2 μ L，模板 DNA 5 μ L，去離子水 50 μ L，PCR 反應(yīng)條件95°C IOmin 后，95°C 40s, 50°C 40s, 72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)后，再72°C延伸lOmin。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收得鴨疫里氏桿菌外膜蛋白OMPAl和0MPA2。(4)克隆質(zhì)粒 pMDlOT-OMPAl、pMDl8T-0MPA2 的構(gòu)建通過TA連接的方法分別將片段0MPA1、0MPA2連接到pMD18T克隆載體上。具體的步驟先將回收產(chǎn)物加A反應(yīng)體系回收PCR產(chǎn)物30 μ L，dATPl μ L，10Xbuffer3. 5 μ L， TaqDNA聚合酶0. 5 μ L。將所有的物質(zhì)混勻后放于PCR反應(yīng)儀中72°C作用15min。然后進(jìn)行凝膠電泳，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收。然后連接構(gòu)建T載體克隆質(zhì)粒，反應(yīng)體系為加A后回收的產(chǎn)物 4. 5yL，pMD-18T 載體 0. 5yL，Solution I 5 μ L, Total 10 μ L。輕輕混勻后，于 16°C 連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選得到陽性質(zhì)粒即為所構(gòu)建成功的克隆質(zhì)粒 pMD18T-0MPAl、pMD18T-0MPA2，進(jìn)行測(cè)序。(5)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原核表達(dá)載體pET48a(+)以BamH I, Xho I雙酶切，測(cè)序鑒定正確的 pMD 18T-0MPA1,pMD 18T-0MPA2分別以BamH I,Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切后將目的片段OMPAl、 0MPA2同載體進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下酶切后的載體pET18a(+) 1 μ L，酶切后的目的片段 2 μ L,10Xbuffer IyL, Τ4連接酶0. 5 μ L，去離子水5. 5 μ L，于16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素抗性篩選得到陽性質(zhì)粒。(6)原核表達(dá)菌株的構(gòu)建篩選到的重組陽性質(zhì)粒pET48a(+)-OMPAl、pET_28a(+)-0MPA2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達(dá)菌株。實(shí)施例2禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白原核表達(dá)菌株的構(gòu)建
(1)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)Genebank中大腸桿菌K12W3110株(登錄號(hào)AP009048)的OMPA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物引入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物引入SioI酶切位點(diǎn)。其引物序列如下E-OMPA-F :ATGGATCCGCTCCGAAAGATAACE-OMPA-R :ATACTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT(2)基因組的提取A、將禽致病性大腸桿菌O78菌株菌種劃線接種于MB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)36h ；B、挑取單菌落接種于MB液體培養(yǎng)基，37°C搖床振搖培養(yǎng)過夜；C、將菌液轉(zhuǎn)移至1. 5mL印pendorf管中，8000r/min轉(zhuǎn)離心aiiin，棄上清，加入 500 μ L TE buffer (pH 8. 0)重懸復(fù)溶；D、加入 30 μ L 10% SDS、3yL 蛋白酶 lU20mg/mL)，55°C水浴過夜；E、加入 200 μ L 3M 氯化鈉，65°C水浴 IOmin ；F、以等體積的酚氯仿抽提，12000r/min離心5min取上清；G、重復(fù)步驟F;H、加入10 %體積的3M醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，冰上放置30min ；I、用槍頭將絮狀沉淀勾出，并以70%乙醇洗滌一次；J、加入 30 50 μ L 的 TE Rnase 溶解。(3)外膜蛋白的克隆以禽致病性大腸桿菌標(biāo)O78的基因組為模板擴(kuò)增大腸桿菌的外膜蛋白，在PCR反應(yīng)管中加入 5yL 10XPCR Buffer, 4 μ L2. 5mmol dNTP，上下游引物各 2 μ L，模板 DNA5 μ L，去離子水 50 μ L，PCR 反應(yīng)條件95°C 5min 后，94°C 40s, 58°C 40s, 72°C 2min,30 個(gè)循環(huán)后，再 72°C延伸lOmin。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收大腸桿菌外膜蛋白0MPA3。(4)克隆質(zhì)粒pMD18T-0MPA3的構(gòu)建通過TA連接的方法將克隆片段0MPA3連接到pMD18T克隆載體上。具體的步驟 先進(jìn)行回收產(chǎn)物加A反應(yīng)體系回收PCR產(chǎn)物30 μ L，dATPl μ L，10Xbuffer3. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶0.5yL。將所有的物質(zhì)混勻后放于PCR反應(yīng)儀中72°C作用15min。然后進(jìn)行凝膠電泳，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收。然后連接構(gòu)建T載體克隆質(zhì)粒，反應(yīng)體系為加A后回收的產(chǎn)物 4. 5μ L，PMD-18T 載體 0. 5μ L，Solution I 5 μ L, Total 10 μ L。輕輕混勻后，于 16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選得到陽性質(zhì)粒即為所構(gòu)建成功的克隆質(zhì)粒 PMD18T-0MPA3，進(jìn)行測(cè)序。(5)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原核表達(dá)載體pET48a(+)以BamH I, Xho I雙酶切，測(cè)序鑒定正確的 PMD18T-0MPA3以BamH I, Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切后將目的片段0MPA3同載體進(jìn)行連接， 反應(yīng)體系如下酶切后的載體pET48a(+) 1 μ L，酶切后的目的片段0MPA32 μ L，IOXbuffer 1 μ L, Τ4連接酶0. 5 μ L，去離子水5. 5 μ L，于16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素抗性篩選得到陽性質(zhì)粒。(6)原核表達(dá)菌株的構(gòu)建
篩選到的重組陽性質(zhì)粒pET_28a(+) -0MPA3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，通過抗性篩選陽性表達(dá)菌株。實(shí)施例3鴨疫里氏桿菌RA1、RA2外膜蛋白原核表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及大量生產(chǎn)(1)篩選出的鴨疫里氏桿菌RA1、RA2外膜蛋白原核表達(dá)陽性菌誘導(dǎo)表達(dá)將保存的菌液按體積比為1 1000的比例接種加有Kan抗性的5mL LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對(duì)照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作為對(duì)照。37°C過夜培養(yǎng)至OD6tltlnm值約為0. 4時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對(duì)照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對(duì)照不加，于37°C培養(yǎng)4h后每隔半小時(shí)從每管取出ImL菌液于1. 5mL 印pendorf管中，標(biāo)記好，12000rpm離心，棄去上清得到沉淀，然后每管中加入100 μ L的PBS 洗滌一次，最后加入300 μ LPBS和100yL4X蛋白上樣buffer，充分混勻，冰上作用15min， 100°C煮沸:3min后于12000rpm離心lOmin，取離心后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)每個(gè)菌的誘導(dǎo)能力。比較表達(dá)的目的蛋白的大小及表達(dá)的蛋白條帶的寬度來判斷每個(gè)菌的表達(dá)能力。每個(gè)蛋白挑選表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白表達(dá)。(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定按照常規(guī)的SDS-Page方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。(3)表達(dá)產(chǎn)物的純化用Ni-NTA His. Bind Resin 純化柱純化蛋白。方法將 lmL50% 的 Ni-NTAHis. Bind Resin填充材料于4mLl XNi-NTA Bind Buffer輕輕混勻。在重力作用下使樹脂堆積，然后用槍頭除去4mL的上清液。然后加入4mL的溶解物(表達(dá)的上清液)與填料混勻，在4°C搖床上混勻作用lh。然后將填料加到層析柱中，填料沉積下來后，打開柱子底下的帽，打開蛋白純化儀進(jìn)行純化，收集流出的液體，留作SDS-PAGE。然后用2 X 4mLl X Ni-NTA wash buffer 洗柱子，收集洗出的液體，留作305^^^，接著用4\0. 5mLl XNi-NTA Elution Buffer洗脫下來蛋白，收集洗脫液，留作SDS-PAGE。(4)表達(dá)產(chǎn)物的大量表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的濃度的定量根據(jù)上述步驟大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，同樣對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度分別為 420mg/L、386mg/L。實(shí)施例4禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白原核表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及大量生產(chǎn)(1)篩選出的禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白原核表達(dá)陽性菌進(jìn)行誘導(dǎo)篩選將保存的菌液按體積比為1 1000的比例接種加有Kan抗性的5mL LB培養(yǎng)基中，每個(gè)菌接種兩管，一管用于誘導(dǎo)，另一管用于非誘導(dǎo)對(duì)照，同時(shí)要接種一管空質(zhì)粒菌作為對(duì)照。37°C過夜培養(yǎng)至OD6tltlnm值約為0. 5時(shí)，誘導(dǎo)管和空質(zhì)粒對(duì)照管加入IPTG至終濃度為lmmol/L，非誘導(dǎo)對(duì)照不加，于37°C培養(yǎng)4h后每隔半小時(shí)從每管取出ImL菌液于1. 5mL 印pendorf管中，標(biāo)記好，12000rpm離心，棄去上清得到沉淀，然后每管中加入100 μ L的 PBS洗滌一次，最后加入300 μ L PBS和IOOyL 4Χ蛋白上樣buffer，充分混勻，冰上作用 15min, 100°C煮沸5min后于12000rpm離心lOmin，取離心后的上清液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)每個(gè)菌的誘導(dǎo)能力。比較表達(dá)的目的蛋白的大小及表達(dá)的蛋白條帶的寬度來判斷每個(gè)菌的表達(dá)能力。每個(gè)蛋白挑選表達(dá)能力高的兩個(gè)菌，用于大量的蛋白的表達(dá)。(2)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定按照常規(guī)的SDS-Page方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
(3)表達(dá)產(chǎn)物的純化用Ni-NTA His. Bind Resin 純化柱純化蛋白。方法將 lmL50% 的 Ni-NTAHis. Bind Resin填充材料于4mLl XNi-NTA Bind Buffer輕輕混勻。在重力作用下使樹脂堆積，然后用槍頭除去4mL的上清液。然后加入4mL的溶解物(表達(dá)的上清液)與填料混勻，在4°C搖床上混勻作用lh。然后將填料加到層析柱中，填料沉積下來后，打開柱子底下的帽，打開蛋白純化儀進(jìn)行純化，收集流出的液體，留作SDS-PAGE。然后用2 X 4mLl X Ni-NTA wash buffer 洗柱子，收集洗出的液體，留作305^^^，接著用4ズ0. 5mLl XNi-NTA Elution Buffer洗脫下來蛋白，收集洗脫液，留作SDS-PAGE。(4)表達(dá)產(chǎn)物的大量表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的濃度定量根據(jù)上述步驟大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，同樣對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度為 440mg/L。實(shí)施例5鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白ニ聯(lián)疫苗的制備取上述實(shí)施例中純化后稀釋至30 μ g/mL的相同濃度的鴨疫里氏桿菌RA1、RA2外膜蛋白OMPAl、0MPA2和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3以相同的體積比進(jìn)行以下三種組合0MPA1+0MPA3、0MPA2+0MPA3、0MPA1+0MPA2+0MPA3，混合均勻，然后再以抗原油佐劑為1 1的比例加入油佐劑，乳化得到疫苗。制備的疫苗物理性狀檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效カ檢驗(yàn)等均合格。所制備疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)①性狀外觀乳白色乳剤。劑型為油包水型。取一個(gè)清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。穩(wěn)定性取疫苗IOmL加入離心管中，以3000rpm離心15min，應(yīng)不分層，管底析出的水相應(yīng)不大于0. 5mL。粘度用ImL吸管(下ロ的內(nèi)徑1.2mm，上ロ內(nèi)徑2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗1 mL,令其垂直自然流出，記錄流出0. 4mL所需的時(shí)間，應(yīng)在8秒以內(nèi)。②無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。③安全檢驗(yàn)選取5-10日齡雛鴨70羽，隨機(jī)分四組，按表1進(jìn)行試驗(yàn)。表1疫苗安全性檢驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗，包括抗原和油佐劑，其特征在于抗原與油佐劑以體積比1 1 1 5的比例乳化配制而成，抗原為鴨疫里氏桿菌 (Riemerella anatipestifer) RAl型外膜蛋白和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌 O78(Avian pathogenic Escherichia coli APEC O78)外膜蛋白。
2.權(quán)1所述的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗，其特征在于鴨疫里氏桿菌 RAl型外膜蛋白和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白的體積比為1 1 1或1 1。
3.權(quán)1所述的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗，其特征在于油佐劑由94% 的白油(乂八)、6%的司本-80&八)和2%的硬脂酸鋁(g/v)組成。
4.如權(quán)1-3任一項(xiàng)所述的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)外膜蛋白基因的擴(kuò)增及克隆根據(jù)鴨疫里氏桿菌外膜蛋白OMPA基因、大腸桿菌外膜蛋白OMPA基因序列設(shè)計(jì)引物， PCR擴(kuò)增鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl基因、RA2型外膜蛋白0MPA2基因和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3基因片段，將OMPAl、0MPA2及0MPA3分別克隆到載體pMD_18_T 上，得到質(zhì)粒 pMD-18-T-OMPAl、pMD-18-T-0MPA2 和 pMD-18-T_0MPA3，進(jìn)行測(cè)序；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建陽性質(zhì)粒 pMD-18-T-OMPAl、pMD-18-T_0MPA2 和 pMD-18-T_0MPA3 以限制性內(nèi)切酶雙酶切后，將三個(gè)外膜蛋白基因分別克隆到質(zhì)粒載體pET48a(+)上，得到重組陽性質(zhì)粒 pET-28a(+)-OMPAl、pET_28a (+)-0MPA2 和 pET_28a(+)-0MPA3 ；(3)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-28a (+) -OMPAl、pET_28a (+) -0MPA2 和 pET_28a (+) -0MPA3 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，然后抗性篩選陽性表達(dá)菌株，通過誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)；(4)表達(dá)蛋白的純化表達(dá)后的鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl、鴨疫里氏桿菌RA2外膜蛋白0MPA2、禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3通過Ni-NTA His. BindResin純化柱純化目的蛋白，然后大量表達(dá)得到足量的外膜蛋白保存于_20°C備用；(5)以純化后的外膜蛋白溶液為原料，制備疫苗將純化后的鴨疫里氏桿菌RAl型外膜蛋白OMPAl和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白 0MPA2和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白0MPA3溶液調(diào)整到適當(dāng)?shù)臐舛?，按比例混合，加入油佐劑乳化后分裝即可。
5.權(quán)4所述的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于鴨疫里氏桿菌RAl型、RA2型外膜蛋白OMPA基因引物序列如下RA-OMPA-F :GCTGGATCCATGGGTAAAGAATTTATGRA-OMPA-R :AGTCTCGAGTCTTACAAGAAGAGGACGCTT禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白OMPA基因引物序列如下E-OMPA-F :ATGGATCCGCTCCGAAAGATAACE-OMPA-R :ATACTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT。
6.鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗在制備防治鴨疫里氏桿菌、禽大腸桿菌病的制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗及其制備方法。本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌和大腸桿菌外膜蛋白二聯(lián)疫苗是抗原與油佐劑以體積比1∶1～1∶5的比例乳化配制而成，抗原為鴨疫里氏桿菌RA1型外膜蛋白和/或鴨疫里氏桿菌RA2型外膜蛋白和禽致病性大腸桿菌O78外膜蛋白，動(dòng)物試驗(yàn)表明，采用本方法制備的疫苗免疫動(dòng)物后，疫苗的安全性好，免疫效果明顯，動(dòng)物體內(nèi)能產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，可以抵御同型鴨疫里氏桿菌和多種血清型大腸桿菌的攻擊。
文檔編號(hào)C07K14/245GK102580074SQ201110002469
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者傅光華, 盧會(huì)英, 施少華, 杜金玲, 牟巍, 王勇鶼, 程龍飛, 趙亞榮, 郭書豪, 陳紅梅, 黃瑜 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所