專利名稱：一種用硅膠柱層析法分離純化甘油磷酸膽堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用硅膠柱層析法分離純化甘油磷酸膽堿的方法，涉及到藥物化學(xué)和分離純化 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘油磷脂膽堿(L-α -Glycerophosphorylcholine, L- α -GPC)為體內(nèi)天然存在的 水溶性磷脂代謝產(chǎn)物，以及乙酰膽堿和磷脂酰膽堿合成的膽堿源，它的原子結(jié)構(gòu)示意圖如 圖1所示。L-α-GPC具有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值，能夠提高腦部認(rèn)知能力，甚至可以修復(fù)早期 老年失智癥患者已部分損傷的認(rèn)知能力，能夠保護(hù)肝組織免受有毒的四氯化碳和高脂蛋白 類食品所產(chǎn)生的脂肪酸滲透，具有抗高血脂、保護(hù)血管的作用，在青少年身體成長、提高記 憶力等方面都具有一定的功效。目前，國內(nèi)外學(xué)者分離純化L-α-GPC的方法主要有溶劑萃取法、沉淀法、重 結(jié)晶法、樹脂柱色譜法等。最早的純化方法是萃取法，直接從牛胰臟中萃取純化得到 L-α -GPC (GSchmidt，J. Biochem, 1945，161,523)，隨后出現(xiàn)了沉淀法、重結(jié)晶法、樹脂柱色 譜法，但他們在純度、旋光度、工業(yè)化方面都面臨著不同程度的問題。1%4年，美國專利 No. 2864848發(fā)明了汞鹽沉淀純化技術(shù)，主要過程是以汞鹽的形式沉淀副產(chǎn)物，過量的汞離 子通過H2S和BaCO3除去，這種方法的劣勢在于不能完全將汞離子除去，還殘留了部分未 反應(yīng)的卵磷脂，需要用鈣鹽和樹脂進(jìn)行二次純化，這樣增加了過程的復(fù)雜性，得率下降，工 業(yè)化的困難；Brockerhoff和Yukowski的重結(jié)晶法也面臨著去除催化劑的問題；為了解決 金屬離子殘留和純度的問題，Myriam Gozzoli和Cailo kolastico發(fā)明了樹脂純化分離 方法，先醇解反應(yīng)，后溶劑萃取、再離子交換樹脂吸附解析，活性炭脫色，這種方法卻面臨著 大量使用有毒的氯仿，產(chǎn)品的旋光性解決困難的問題。對于經(jīng)典的硅膠柱層析法應(yīng)用在 L- α -GPC方面的研究未見有報道，這種方法已經(jīng)被成功應(yīng)用于磷脂領(lǐng)域，如從粉末磷脂中 提取高純PE、PE和PI的研究。本發(fā)明提供一種硅膠層析柱法分離純化L-α -GPC的方法，解決了純化過程中面 臨的過程繁瑣、有毒離子殘留、純度不夠、旋光度不夠、大量伴隨物存在的難題。硅膠柱 層析分離純化的方法，具有純化工藝簡單、洗脫劑和硅膠均可以重復(fù)利用，以及產(chǎn)品的純度 高、成本低等方面的優(yōu)點，是一種方便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、可實現(xiàn)商業(yè)化規(guī)模的純化分離方法，目 前未見國內(nèi)外關(guān)于此方面的文章報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡單、可行、合理、適合工業(yè)化的L-α -GPC純化分離新 工藝，達(dá)到降低成本和提高經(jīng)濟(jì)效益的目的。采用本方法對藥物制劑L- α -GPC進(jìn)行純化， 可以保證產(chǎn)品的旋光性、純度、回收率，以及一次性將反應(yīng)液中主要成分全部進(jìn)行分離。技術(shù)方案該方法用大豆粉末磷脂為原料，通過酶水解和醇解兩種工藝路線制備反應(yīng)液，然后再用硅膠層析柱法進(jìn)行純化。對于酶反應(yīng)液，先用離子交換樹脂除去Ca2+和 Cl_，然后將水相轉(zhuǎn)化成醇相，通過硅膠層析柱將L- α -GPC和GPE、LPC及其它副產(chǎn)物分開， 活性炭脫色，真空濃縮除水，得到無色、透明的產(chǎn)品；對于醇解反應(yīng)液，直接過硅膠柱分離， 陽離子交換樹脂除Na+，活性炭脫色，真空濃縮除水，得到產(chǎn)品。主要步驟包括(1)酶解反應(yīng)液將粉末磷脂加到蒸餾水中，形成乳化態(tài)磷脂水溶液，均質(zhì)，添加 CaCl2和磷脂酶A1，水浴加熱，反應(yīng)一段時間，然后離心、過濾，得到澄清的酶反應(yīng)液。(2)醇解反應(yīng)液將粉末磷脂溶于甲醇中，室溫、添加甲醇鈉、磁力攪拌、反應(yīng)一段 時間，然后低溫結(jié)晶、分液、抽濾，得到L- α -GPC醇溶液。(3)樹脂吸附酶反應(yīng)液，用陽離子樹脂去除Ca2+，陰離子樹脂去除Cl—；醇解反應(yīng) 液，用陽離子樹脂去除Na+。(4)硅膠純化工業(yè)硅膠活化，稱量硅膠、裝柱，反應(yīng)液上柱，醇溶液洗脫，自動收 集器收集，HPLC-ELSD進(jìn)行監(jiān)控，最后得到純度比較高的L- α -GPC和GPE。(5)脫色用活性炭去除L-a-GPC溶液中的色素物質(zhì)，使最終產(chǎn)品保持無色、透明 狀態(tài)。本方法中硅膠純化的步驟，硅膠稱量、攪拌勻漿、裝柱、壓實、上樣、過柱和收集、檢 測、產(chǎn)品處理。硅膠稱量，可稱、可量，干硅膠的密度大約0.4g/mL;上樣，以硅膠重量計， 1 50 (g/g, L- α -GPC 硅膠)；收集餾分的體積，以上樣量計，1 10 (g/mL, L- α -GPC 餾分體積)；收集餾分，用HPLC-ELSD檢測，檢測GPC，GPE和雜質(zhì)，將同一類餾分合并。本發(fā)明利用硅膠層析柱法分離純化大豆粉末磷脂的酶解反應(yīng)液和醇解反應(yīng)液制 備L- α -GPC的方法，屬于開創(chuàng)性的研究。


圖IL-α -GPC的結(jié)構(gòu)示意圖其中 表示H，_表示C，著表示P，_表示0，■表示N。圖2粉末磷脂原料的HPLC-ELSD色譜圖。從圖2可以看到粉末磷脂中有很多成分，PC、ΡΕ、PI、LPC等，PC保留時間6. 073， 外標(biāo)法定量PC的純度20. 3%。圖3粉末磷脂反應(yīng)后的酶反應(yīng)液HPLC-ELSD色譜圖。從圖3可以看到，粉末磷脂經(jīng)過酶解反應(yīng)后，色譜圖中的PC幾乎消失，保留時間在 4. 517、12. 013處有大量的GPE和GPC生成。圖4硅膠分離L- α -GPC、GPE和雜質(zhì)的色譜圖。從圖4可以看出硅膠柱層析法能很好的將L- α -GPC、GPE和雜質(zhì)分離開。圖5硅膠層析柱裝備圖。從圖5可以看到，整個純化過程包含上樣、過柱、收集三個部分。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實施例所述的制 備方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實施例1所用反應(yīng)液為粉末磷脂酶解反應(yīng)制備。磷脂酶A1水解反應(yīng)50g粉末磷脂，IOOOmL去離子水，加入三孔燒瓶中，在35°C 水浴加熱，300r/min機(jī)械攪拌，均質(zhì)30min，添加CaCl2 2g，均質(zhì)，添加酶5mL，反應(yīng)3h，將 酶反應(yīng)液離心、抽濾，得到純凈的酶解反應(yīng)液；過001X7強(qiáng)陽離子交換樹脂柱(交換容量 1800mmol/L)去除Ca2+，過D311大孔型丙烯酸系弱堿陰離子交換樹脂柱O200mmol/L)去 除Cl—，離子交換樹脂可再生；60°C，減壓下，蒸干，溶于乙醇。HPLC-ELSD檢測反應(yīng)液，外標(biāo)定量L- α -GPC 2. 97g,得率90. 1%,稱量148. 5g硅 膠，溶于乙醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣、用一定比例的乙醇水溶液(1 9, ν ν) 進(jìn)行洗脫，流速2mL/min，每30mL餾分收集，HPLC-ELSD檢測每份餾分，同類餾分進(jìn)行合并， 通過硅膠柱將L- α -GPC和GPE、LPC、及其它副產(chǎn)物分開，硅膠回收，烘箱中，120°C、時間3h， 進(jìn)行硅膠再生；L-α-GPC的餾分，60°C活性炭脫色、抽濾，0°C減壓下蒸干，得到無色、透明 的2. 33g產(chǎn)品，總得率78.4%，蒸出的溶劑進(jìn)行乙醇回收。薄層檢測有少量斑點(符合美國
行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))，化學(xué)純度 99. 6%，光學(xué)純度 ee 99%, mpl42-143°C, [α] S*=-2.6° (C = 2. 6，
H2O 16%, pH = 5· 8)。實施例2所用反應(yīng)液為粉末磷脂醇解反應(yīng)液。粉末磷脂醇解反應(yīng)50g粉末磷脂溶于250mL甲醇中，室溫、磁力攪拌、均質(zhì)30min， 添加甲醇鈉5mL，反應(yīng)lh，得到醇解反應(yīng)液，進(jìn)行離心、抽濾，得到純凈的醇解反應(yīng)液。HPLC-ELSD檢測反應(yīng)液，外標(biāo)定量L- α -GPC 2. 90g,得率88. 2%，稱量145g硅膠， 溶于甲醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣、用一定比例的甲醇水溶液(1 9，v ν)進(jìn) 行洗脫，流速2mL/min，每30mL餾分進(jìn)行收集，HPLC-ELSD檢測每份餾分，同類餾分合并，硅 膠柱將L-a-GPC和GPE、LPC、其它副產(chǎn)物分開，硅膠回收，烘箱中，120°C、時間池，進(jìn)行硅 膠再生；L- α -GPC的餾分通過001X7強(qiáng)陽離子交換樹脂(交換容量1800mmol/L)去除Na+， 柱下餾分不能檢測到Na+，吸附飽和后進(jìn)行再生，60°C，凹凸棒土脫色，得到澄清水溶液，減 壓下蒸干溶劑，得到無色、透明的2. 26g產(chǎn)品，蒸出的溶劑進(jìn)行甲醇回收，重復(fù)使用，總得率 77. 9%。薄層檢測有少量斑點(符合美國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))，化學(xué)純度98. 8%，光學(xué)純度ee :99%，
mp 142-143°C，[α]孜=-2.8° (C = 2. 6，H2O 16%, pH = 5. 8)
權(quán)利要求
1.一種硅膠柱層析法分離純化甘油磷酸膽堿(L-a-GPC)的方法，其特征在于，包括如 下工藝步驟(1)純化酶解反應(yīng)液制備酶解反應(yīng)液，離心、抽濾去除固體雜質(zhì)；陽離子交換樹脂去 除Ca2+，流速0. 5 4mL/min，柱下收集液中不能檢測到Ca2+，吸附飽和后再生，再生次數(shù)大 于10次；陰離子交換樹脂去除Cl—，流速0. 5 4mL/min，柱下收集液中不能檢測到Cl—，吸 附飽和后再生，再生次數(shù)大于10次，45 75°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去水，溶于低碳鏈醇，轉(zhuǎn)化成醇相。 稱量一定量的硅膠，溶于醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣，0% 100%低碳鏈醇水溶液 (ν ν，醇水)進(jìn)行洗脫，流速0. 5 4mL/min,每10 60mL餾分進(jìn)行收集，HPLC-ELSD 檢測每份餾分，合并L- α -GPC的餾分；在50 90°C，活性炭脫色，得到澄清的水溶液，45 75°C，減壓下蒸干溶劑，得到產(chǎn)品，低碳鏈醇進(jìn)行回收，重復(fù)使用；硅膠回收，烘箱中，100 150°C、時間2 8h，硅膠可再生次數(shù)大于10。(2)純化醇解反應(yīng)液制備醇解反應(yīng)液，離心、抽濾去除固體雜質(zhì)；稱量硅膠，溶于甲 醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣，用0% 100%低碳鏈醇水溶液(ν v，醇水)進(jìn) 行洗脫，流速0. 5 4mL/min，每10 60mL餾分進(jìn)行收集，HPLC-ELSD檢測每份餾分，合并 L- α -GPC的餾分；過陽離子交換樹脂柱去除Na+，柱下收集液中不能檢測到Na+，流速0. 5 4mL/min,吸附飽和后再生，再生次數(shù)大于10次；50 90°C，活性炭脫色，得到澄清的水溶 液，45 75°C，減壓下蒸干溶劑，得到產(chǎn)品，低碳鏈醇進(jìn)行回收，重復(fù)使用；硅膠回收，烘箱 中，100 150°C、時間2 8h，硅膠可再生次數(shù)大于10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的硅膠柱硅膠用量的計算，其特征在于所述的上樣量的計算 以反應(yīng)液中L- α -GPC的量計，1 20 1 100 (g/g，L- α -GPC 硅膠)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的硅膠柱餾分收集體積，其特征在于所述的餾分收集體積的 計算以反應(yīng)液中L- α -GPC的量計，1 1 1 50 (g/mL，L- α -GPC 餾分)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的低碳鏈醇的洗脫，其特征在于所述的醇溶液洗脫時所用的 低碳鏈醇為甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、異丁醇、戊醇、己醇或戊醇和己醇的異構(gòu)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子交換樹脂去除Ca2+，其特征在于所述去除Ca2+的陽離 子交換樹脂為強(qiáng)酸性、弱酸性、大孔吸附性陽離子樹脂的Na型和H型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰離子交換樹脂去除Cl—，其特征在于所述去除Cl—的陰離子 交換樹脂為強(qiáng)堿性、弱堿性、大孔吸附性陰離子樹脂的OH型。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的陽離子交換樹脂去除Na+，其特征在于所述去除Na+的陽離子 交換樹脂為強(qiáng)酸性、弱酸性、大孔吸附性陽離子樹脂的H型。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的脫色的方法，其特征在于所述的脫色劑為活性炭、凹凸棒 土等中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用硅膠層析柱法分離純化甘油磷酸膽堿(L-α-GPC)的方法，屬于脂質(zhì)開發(fā)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。包括如下步驟酶解反應(yīng)液為原料，先用離子交換樹脂除去Ca2+和Cl-，然后將水相轉(zhuǎn)化成醇相，通過硅膠層析柱將L-α-GPC和GPE、LPC及其它副產(chǎn)物分開，活性炭脫色，真空濃縮除水，得到無色、透明的產(chǎn)品；醇解反應(yīng)液為原料，直接過硅膠柱分離，陽離子交換樹脂除Na+，活性炭脫色，真空濃縮除水，得到產(chǎn)品。產(chǎn)品的指標(biāo)檢測化學(xué)純度99.6％，光學(xué)純度ee99％，mp142-143℃，(C＝2.6，H2O含量16％，pH＝5.8)。本發(fā)明為分離純化L-α-GPC提供了一種新的思路和方法，也增加了硅膠柱層析分離純化方法在脂質(zhì)科學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號C07F9/09GK102093410SQ20111000406
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者劉元法, 周麗, 宋志華, 張康逸, 王興國, 錢祥云 申請人:江南大學(xué)