專利名稱：一種抗血管內(nèi)皮生長因子的單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體工程和醫(yī)學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及獲得識別人血管內(nèi)皮生長因子(hVEGF)表位的鼠單克隆抗體。
背景技術(shù)：
癌癥是影響人類健康的重大疾病，死亡率高。1971年Folkman首先觀察到當腫瘤體積超過1 2mm3，需要形成新血管才能繼續(xù)生長，從而提出通過調(diào)控血管生成控制腫瘤生長的假說。目前研究表明通過阻斷腫瘤血管生成生長因子信號傳導通路能夠抑制實體腫瘤發(fā)展過程的新血管生成，可以特異地干預(yù)腫瘤發(fā)展進程。新血管生成的過程需要多種刺激因子參與，其中包括血管內(nèi)皮生長因子VEGF(vascular endothelia growth factor)。 Genentech公司生產(chǎn)針對VEGF的人源化單抗阿瓦斯汀(Bevacizumab，Avastin)是重組的人源化單克隆抗體，于2004年2月26日獲得FDA的批準，是第一個獲得批準上市的抑制腫瘤血管生成的藥物。Bevacizumab已被批準用于一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，與某些化療方案聯(lián)合治療晚期非小細胞肺癌以及乳腺癌。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成重要調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育及出生后的血管發(fā)程中均起著極為重要的調(diào)節(jié)作用，主要參與新生血管的形成VEGF有至少五種不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206個氨基酸等，其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受體包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。VEGF與內(nèi)皮細胞膜上內(nèi)皮生長因子受體(VGFR)結(jié)合后，使VEGFR二聚體化，受體酪氨酸激酶活性被激活，由受體自身磷酸化后啟動下游信號通路如PKC信號通路。VEGF在腫瘤細胞中表達水平顯著升高。高表達的VEGF 除了能夠使血管內(nèi)皮細胞分化增殖和遷移，促進血管的構(gòu)建及生長，還能夠提高血管的通透性、增加血漿蛋白溶酶激活物(PA)及血漿纖溶酶原激活物抑制劑-I(PAI-I)的表達，促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。由于VEGF和其受體的多樣性，不同抗原表位或者親和力不同的VEGF抗體對腫瘤生長抑制的效果可能是不同的。VEGF抗體藥物的升級需要獲得和研究針對VEGF不同表位的CDR。不同的CDR序列免疫原性是不同的，通過CDR移植制備的人源化抗體被機體的耐受速度及產(chǎn)生的毒性是有差異的，直接影響藥物的療效?？贵w的療效還受抗體血漿半衰期和血管穿透能力等因素的影響。因此研究不同VEGF抗體將有助于獲得療效更好的治療性人源化抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種特異性抗人血管內(nèi)皮生長因子(hVEGF)的單克隆抗體，能夠特異識別人VEGF。本發(fā)明提供了一種針對hVEGF的免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結(jié)合于人血管內(nèi)皮生長因子(hVEGF)。所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白是鼠單克隆抗體IgG。
所述的鼠單克隆抗體，其特征在于，所述的鼠單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤細胞株，它是小鼠雜交瘤細胞系18-5。本發(fā)明提供了一種抗人VEGF單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種分離的核苷酸，編碼抗人VEGF單克隆抗體重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 1)核苷酸序列具有表1所示的堿基序列，編碼抗人VEGF單克隆抗體輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 2)核苷酸序列具有表2所示的堿基序列。本發(fā)明還提供了抗人VEGF單克隆抗體在免疫學檢測中的用途。


圖1 鼠單克隆抗體18-5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO 1)。圖2 鼠單克隆抗體18-5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3 鼠單克隆抗體18-5用于Western-blot檢測VEGF。Ll 陰性對照，L2 pLenti7. 3/V5_VEGF165轉(zhuǎn)染細胞裂解物，L3 :pLenti7. 3/V5_VEGF165轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清圖4 鼠單克隆抗體18-5用于VEGF的免疫熒光檢測。A 轉(zhuǎn)染pLenti7. 3/V5-T0P0 空載體EGFP熒光，B 轉(zhuǎn)染pLenti7. 3/V5-T0P0空載體對照，C 轉(zhuǎn)染pLenti7. 3/V5_VEGF165EGFP 熒光，D 轉(zhuǎn)染 pLenti7. 3/V5-VEGF165 (CY3 標記二抗)實施方式具體實施例1小鼠單克隆抗體的制備和篩選(1)抗原的制備將人血管內(nèi)皮生長因子 VEGF165(Human Vascular endothelial growth factor, hVEGF165)基因通過PCR從人基因轉(zhuǎn)錄組中擴增獲得，上游引物為5’ -CGCGGATCCGCACCCAT GGCAGAAGGAGG-3，；下游引物為5，-CTCCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACATC-3，。利用 BamH I和Xho I雙酶切，將基因片段連入原核表達載體pET32a(+)，PCR和雙酶切鑒定陽性克隆后測序，序列測定正確后，提取質(zhì)粒。原核表達載體pET32a_VEGF165轉(zhuǎn)化Rosetta菌株，在 IOOmlLB培養(yǎng)基中，OD6tltl達到約0.5時，ImM IPTG誘導表達4h，VEGF165蛋白形成包涵體。超聲破菌后，用IXSDS上樣緩沖液溶解包涵體，測定靶蛋白的表達量。將制備好的VEGF165蛋白進行SDS-PAGE電泳，割膠純化蛋白。(2)小鼠的免疫將純化后的VEGF165蛋白溶解在1 XPBS，取適量的蛋白溶液與弗氏完全佐劑 (Sigma)混勻乳化，取8周齡的BALB/c雌鼠，皮下多點注射抗原。2周后，取適量的蛋白溶液與弗氏不完全佐劑(Sigma)混勻乳化，在小鼠的皮下，進行第二次免疫。以后每隔3周， 進行第三、四次免疫。第四次免疫后3天，取脾臟進行細胞融合。(3)細胞融合和陽性克隆的篩選引頸處死小鼠，用70%酒精消毒其體表。無菌條件下取出脾臟，在滅菌不銹鋼網(wǎng)中，用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次獲得細胞懸液，將細胞懸液注入50ml離心管中，加入20ml無血清培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，1000rpm/min離心。用無血清培養(yǎng)液將細胞重懸，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0以適當比例輕輕混勻，在37°C水浴鍋中加入 PEG1400，水浴1. 5min。加入無血清培養(yǎng)液35ml，離心。沉淀用含有20% FCS的RPM1-1640重懸，每孔200 μ 1均分到96孔細胞培養(yǎng)板，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，加入選擇培養(yǎng)液HAT，每3天換一次新鮮培養(yǎng)液。14天后，取細胞培養(yǎng)上清，ELISA鑒定出陽性克隆。多次進行亞克隆鑒定陽性克隆細胞成系，繼續(xù)體外培養(yǎng)6個月。選出5株高效表達細胞株，分別命名為18-1，18-2，18-3， 18-4，18-5。(4)單克隆抗體的鑒定血清1 1000-1 50000 稀釋，IOOngVEGF165 蛋白上樣，進行 Western Blot 分析抗體的特異性。將VEGF165基因通過TOPO克隆方法連入表達載體pLenti7. 3/V5-T0P0,真核表達載體 pLenti7. 3/V5_VEGF165 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)介導瞬時轉(zhuǎn)染 293T細胞，血清1 100稀釋，進行免疫熒光鑒定抗體。測定可知，18-5細胞株的抗體特異性最好，且能識別細胞內(nèi)源表達的抗原。(4)單克隆抗體可變區(qū)序列的獲得利用Trizol (Invitrogen)法提取雜交瘤細胞株18-5的總RNA，然后用oligo-dT 弓I物禾口 superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)小鼠抗體重鏈和輕鏈的FRl區(qū)氨基酸序列，合成兼并的寡核苷酸引物，用作正向引物。反向引物根據(jù)小鼠抗體的恒定區(qū)設(shè)計，可將全部的可變區(qū)擴增得到。PCR反應(yīng)完成后，分別將抗體重鏈和輕鏈的DNA片段連于TA克隆載體，挑取克隆進行測序。具體實施例2小鼠單克隆抗體的Western-blot和免疫熒光檢測 將VEGF165基因通過TOPO克隆方法連入表達載體pLenti7. 3/V5-T0P0,真核表達載體pLenti7. 3/V5_VEGF165 利用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)介導瞬時轉(zhuǎn)染 293T 細胞， 血清1 100稀釋，進行免疫熒光鑒定抗體。測定可知，18-5細胞株的抗體特異性最好，且能識別細胞內(nèi)源表達的抗原。取培養(yǎng)細胞或細胞上清，加入3XLoading buffer煮沸5分鐘上樣，westem-blot檢測。結(jié)果顯示陽性蛋白條帶的分子量與VEGF165 —致。
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白IgG，其特征在于，它能夠特異性地結(jié)合人VEGF。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它具有的重鏈可變區(qū)具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的核酸分子，其特征在于，該分子含有SEQ ID NO :1所示的編碼所述單克隆抗體重鏈的核苷酸序列，以及SEQ ID NO :2所示的編碼所述單克隆抗體輕鏈的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白。
6.一種檢測VEGF免疫學檢測試劑，它含有權(quán)利要求1所述的免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠結(jié)合人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的特異單克隆抗體。該單克隆抗體具有與人VEGF特異結(jié)合的特性。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體在科學研究及免疫學檢測方面的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/22GK102212135SQ20111000735
公開日2011年10月12日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者馮杰, 邵長君, 高靜 申請人:中國科學院北京基因組研究所