專利名稱：一種高含量三葉豆苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以羅布麻葉為原料制備三葉豆苷的方法。
背景技術(shù)：
羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻Apocynum venetum L.的干燥葉,夏季采收,除去雜質(zhì)，干燥。羅布麻葉性涼，味甘、苦，歸肝經(jīng)。據(jù)藥典記載，其有平肝安神，清熱利水的作用， 可用于肝陽眩暈，心悸失眠，浮腫尿少；高血壓，神經(jīng)衰弱，腎炎浮腫等癥?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，羅布麻葉提取物具有調(diào)節(jié)血壓、降低血脂的作用，其黃酮有效部位對大鼠早期實驗性動脈粥樣硬化有抑制作用。三葉丑苷(Trifolin)是羅布麻葉的黃酮類成分，分子式C21H2(l0n,分子量 448. 39，黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯及堿性水溶液，難溶于中性、酸性水溶液。三葉豆苷具有降低血清膽固醇和升高血清高密度蛋白的效果，專利“三葉豆苷的用途”(專利號201010223716. X)，該專利采用三葉豆苷作為唯一活性成分用于治療高血脂疾病，取得了顯著效果，該發(fā)明研究明確了三葉豆苷用于高血脂疾病的優(yōu)勢，且其在應(yīng)用于急性高血脂疾病具有同樣顯著的效果。近年來，隨著人們的生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的變化，人們的血脂水平總體在逐年升高。據(jù)統(tǒng)計，我國20世紀90年代初期比80年代的人群血脂水平明顯增加，估計約有30% 40%的人患有不同程度的高血脂。三葉豆苷以其良好的降低血清膽固醇和升高血清高密度蛋白的效果，而具有廣闊的研究前景。目前羅布麻葉有效成分的研究主要停留在羅布麻葉總黃酮的提取分離上，單一黃酮類成分的提取分離較少，大多是對羅布麻葉中黃酮類成分進行化學結(jié)構(gòu)鑒定的微量分析。程秀麗等公開的“羅布麻葉中黃酮類化合物研究”，該文獻采用水提，大孔樹脂、聚酰胺樹脂、凝膠樹脂反復(fù)上柱分離純化得到三葉豆苷，該法制得三葉豆苷量少，損失大。 如張語遲等采用70%乙醇回流提取，大孔樹脂分離純化得總黃酮苷，再采用HPLC-MS進行結(jié)構(gòu)鑒定?，F(xiàn)有專利“羅布麻屬植物羅布麻葉總黃酮提取物、其制備及應(yīng)用”(專利號 200510123187. 5)，該專利采用乙醇回流提取，濃縮，沸水溶解除雜，上聚酰胺樹脂柱，通過不同濃度乙醇洗脫得到羅布麻葉總黃酮，該方法未得到單一三葉豆苷成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，提供一種高含量三葉豆苷的制備方法。該工藝采用膜濃縮結(jié)合酸堿除雜的方法得到羅布麻葉總黃酮，再通過加壓硅膠柱層析得到高純度的三葉豆苷。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于包含以下步驟
I)提取將羅布麻葉藥材粉碎，加入3 12倍量30 60%低碳醇提取2 4次， 過濾，得提取液；2)膜濃縮將上述提取液加入超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加堿調(diào)至pH8 9. 5，再經(jīng)納濾膜濃縮，得濃縮液；3)酸堿除雜將上述濃縮液用酸調(diào)節(jié)至pH4 6沉淀，用pH8 10的堿液溶解， 再加酸調(diào)節(jié)至pH4 6,濾出沉淀加水洗漆,得沉淀物；4)柱層析將上述沉淀物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保溫50 80°C脫色，過濾， 濾液采用ODS中壓柱層析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶劑系統(tǒng)洗脫，采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收溶劑至小體積，放置結(jié)晶即得產(chǎn)品。所述步驟I)中低碳醇選用甲醇或乙醇，提取方法可采用回流提取，冷浸提取，超聲提取中的一種。所述步驟2)中的超濾膜是截留分子量4000 10000的管式復(fù)合膜，納濾膜的截留分子量是100 200。所述步驟2)、3)中的酸可選用鹽酸、硫酸、甲酸、醋酸等有機酸或無機酸中的一種，堿可以選用氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種。所述步驟4)中的活性炭加入量為沉淀物的2 8%,水浴保溫20 50min。所述步驟4)中的ODS中壓柱為娃膠為200 400目，徑高比為I : (8 15)。所述步驟4)中的洗脫液是甲醇-水或乙腈-水(2 7 3 6)混合溶劑系統(tǒng)， 用量是6 15BV。綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點I.膜濃縮采用膜濃縮，有效降低能耗；2.酸堿除雜通過三葉豆苷在酸堿溶液中溶解度的差異得到羅布麻葉總黃酮，操作簡單，產(chǎn)品損失少；3.柱層析采用ODS加壓柱層析，ODS硅膠具有疏水性，對極性產(chǎn)品的分離效果較好采用加壓的方式保證了洗脫劑的流速，加強了分離效果。下面將結(jié)合具體實施方式
進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
具體實施例方式下述實施實例中三葉豆苷有效成分的監(jiān)測采用薄層監(jiān)測法(參照魏錦萍等“大葉白麻葉化學成分的研究”文獻)，具體方法如下展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6 3 3 I)薄層板硅膠或者硅膠HF254顯色劑=AlCl3乙醇溶液將樣品以及對照品的供試液進行層析展開，通過AlCl3乙醇溶液顯色或者直接置 254nm熒光燈下觀察與對照品色譜相應(yīng)的位置上有相同顏色的單一斑點。實施例I :將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入12L40%乙醇冷浸16h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合并濾液，加入截留分子量6000的管式復(fù)合超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至PH9，加入截留分子量100的納濾膜中濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入鹽酸調(diào)節(jié)至PH4，過濾，沉淀再用pHIO的氫氧化鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)至PH4，過濾，濾餅加450ml水洗漆，得羅布麻葉總黃酮21g。將總黃酮用乙醇溶解，加入Ig活性炭水浴60°C保溫脫色20min，過濾得脫色液，取500g300目的ODS硅膠，裝柱(徑高比I : 8)，脫色液過色譜柱加壓層析，用8BV的甲醇-水(2 : 3)溶劑系統(tǒng)洗脫， 采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收試劑至小體積，放置結(jié)晶得三葉豆苷O. 96g，含量 98. 7%o實施例2 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入3L30%甲醇超聲提取lh，過濾，濾渣按上述條件再提取兩次，過濾，合并濾液，加入截留分子量4000的管式復(fù)合超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至PH8，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入硫酸調(diào)節(jié)至PH6，過濾，沉淀再用pH8的氫氧化鉀溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加硫酸調(diào)節(jié)至PH4，過濾，濾餅加500ml水洗滌，得羅布麻葉總黃酮19g。將總黃酮用乙醇溶解， 加入O. 5g活性炭水浴50°C保溫脫色30min，過濾得脫色液，取400g400目的ODS硅膠，裝柱 (徑高比I : 10)，脫色液過色譜柱加壓層析，用IOBV乙腈-水(5 6)溶劑系統(tǒng)洗脫，采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收試劑至小體積，放置結(jié)晶得三葉豆苷I. 19g，含量 98. 1%。實施例3 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取lKg，加入8L50%乙醇回流提取2h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合并濾液，加入截留分子量10000的管式復(fù)合超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)至PH9. 5，加入截留分子量100的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入醋酸調(diào)節(jié)至PH5，過濾，沉淀再用pHIO的碳酸鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物，濾液加醋酸調(diào)節(jié)至PH5，過濾，濾餅加550ml水洗滌，得羅布麻葉總黃酮22. 3g。將總黃酮用乙醇溶解，加入I. 5g活性炭水浴70°C保溫脫色40min，過濾得脫色液，取550g200目的ODS硅膠， 裝柱(徑高比I : 12)，脫色液過色譜柱加壓層析，用12BV甲醇水(3 5)溶劑系統(tǒng)洗脫， 采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收試劑至小體積，放置結(jié)晶得三葉豆苷I. Hg，含量 98. 3%o實施例4 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取5Kg，加入18L30%乙醇回流提取I. 5h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合并濾液，加入截留分子量8000的管式復(fù)合超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至PH8. 5，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入鹽酸調(diào)節(jié)至PH5. 5，過濾，沉淀再用pH9的氫氧化鈉溶液溶解，過濾，棄去不溶物， 濾液加鹽酸調(diào)節(jié)至PH5，過濾，濾餅加3L水洗滌，得羅布麻葉總黃酮118g。將總黃酮用乙醇溶解，加入2. 5g活性炭水浴65°C保溫脫色50min，過濾得脫色液，取2. 8Kg400目的ODS硅膠，裝柱(徑高比I : 8)，脫色液過色譜柱加壓層析，用IOBV乙腈-水(5 4)溶劑系統(tǒng)洗脫，采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收試劑至小體積，放置結(jié)晶得三葉豆苷5. 68g， 含量97. 9%o實施例5 將羅布麻葉藥材粉碎，稱取10Kg，加入50L60%乙醇冷浸20h，過濾，濾渣按上述條件再提取一次，過濾，合并濾液，加入截留分子量10000的管式復(fù)合超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至PH9. 5，加入截留分子量200的納濾膜濃縮，得濃縮液，向濃縮液中加入硫酸調(diào)節(jié)至PH4，過濾，沉淀再用pH9. 5的氫氧化鉀溶液溶解，過濾，棄去不溶物,濾液加硫酸調(diào)節(jié)至PH4. 5，過濾，濾餅加3L水洗滌，得羅布麻葉總黃酮190g。將總黃酮用乙醇溶解，加入Ilg活性炭水浴55°C保溫脫色40min，過濾得脫色液，取4Kg300目的ODS硅膠， 裝柱(徑高比I : 10)，脫色液過色譜柱加壓層析，用6BV甲醇-水(7 5)溶劑系統(tǒng)洗脫， 采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收試劑至小體積，放置結(jié)晶得三葉豆苷10. lg，含量 98. 2%。
權(quán)利要求
1.一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于包含以下步驟1)提取將羅布麻葉藥材粉碎，加入3 12倍量30 60%低碳醇提取2 4次，過濾，得提取液；2)膜濃縮將上述提取液加入超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液加堿調(diào)至pH8 9.5，再經(jīng)納濾膜濃縮，得濃縮液；酸堿除雜將上述濃縮液用酸調(diào)節(jié)至PH4 6沉淀，用pH8 10的堿液溶解，再加酸調(diào)節(jié)至pH4 6,濾出沉淀加水洗漆,得沉淀物3)柱層析將上述沉淀物用乙醇溶解，加入活性碳水浴保溫50 80°C脫色，過濾，濾液采用ODS中壓柱層析，以甲醇-水或乙腈-水混合溶劑系統(tǒng)洗脫，采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收溶劑至小體積，放置結(jié)晶即得產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于所述步驟I)中低碳醇洗用甲醇或乙醇，提取方法可采用回流提取、冷浸提取、超聲提取中的一種。
3.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的超濾膜是截留分子量400 10000的管式復(fù)合膜，納濾膜的截留分子量是100 200。
4.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于所述步驟2)和3)中的酸可選用鹽酸、硫酸、甲酸、醋酸等有機酸或無機酸中的一種，堿可以選用氫氧化鈉、 氫氧化鉀、碳酸鈉中的一種。
5.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于所述步驟4)中的活性炭加入量為沉淀物的2 8%，水浴保溫20 50min。
6.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于所述步驟4)中的 ODS中壓柱為硅膠為200 400目，徑高比為I : (8 15)。
7.如權(quán)利要求I所述的一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在干所述步驟4)中的洗脫液是甲醇-水或乙腈-水(2 7 3 6)混合溶劑系統(tǒng)，用量是6 15BV。
全文摘要
一種高含量三葉豆苷的制備方法，其特征在于將羅布麻葉用30～60％低碳醇提取，提取液經(jīng)超濾膜系統(tǒng)超濾，透過液調(diào)堿，再用納濾膜濃縮，濃縮液調(diào)酸沉淀，濾出沉淀物用堿性乙醇溶液溶解，再次調(diào)酸沉淀，濾出沉淀物水洗，用乙醇溶解，加入活性炭脫色，脫色液注入ODS色譜柱層析，用混合溶劑系統(tǒng)洗脫，采用薄層監(jiān)測，收集高濃度流分，合并，回收溶劑至小體積，靜置結(jié)晶即得產(chǎn)品。該制備方法操作簡單，制得產(chǎn)品含量高，硅膠柱可再生利用，適合小規(guī)模制備。
文檔編號C07H17/07GK102603831SQ201110026199
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者劉東鋒, 李法慶 申請人:蘇州寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司