專利名稱：一種桶形α芋螺多肽Bt1.3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桶形α芋螺多肽Btl. 3及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)性疼痛是一種由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性病變或功能障礙而引起的疼痛綜合癥。神經(jīng)性疼痛的典型癥狀包括感覺異常、痛覺過(guò)敏和痛覺超敏等。目前許多重大疾病(如癌癥、艾滋病、創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、麻瘋病、硬化癥、帶狀皰疹)均可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能的損傷而引發(fā)神經(jīng)性疼痛，臨床上常用的藥物主要有抗驚厥藥(如萊提西酞、奧卡西平)、 阿片類藥(如嗎啡等)和各種抗抑郁藥的聯(lián)用，但是由于毒副作用以及長(zhǎng)期用藥帶來(lái)的耐受性、成癮性等問題，治療效果不佳。因此，開發(fā)新一代高活性、低耐受和非成癮的鎮(zhèn)痛藥物十分必要。最新研究表明神經(jīng)元型亞型nAChRs α 9 α 10，α 7及α 3 β 2與鎮(zhèn)痛相關(guān)，是發(fā)展無(wú)致癮慢性鎮(zhèn)痛藥物的理想靶點(diǎn)。α -芋螺毒素(a -CTX)是最早從芋螺毒腺管中純化出的一類多肽，屬于A超家族， 一般由9-18個(gè)氨基酸組成，含有2對(duì)二硫鍵，框架結(jié)構(gòu)為CCXmCXnC (C代表半胱氨酸，X代表非半胱氨酸，m和η表示非半胱氨酸的數(shù)量)，根據(jù)m和η的不同，α-CTX被劃分為α 3/5、 α 4/3、α 4/6、α 4/7等亞家族。其中α 3/5，如α -MI，主要作用于脊椎動(dòng)物的肌肉型乙酰膽堿受體，其他亞型則大多選擇性地作用于脊椎動(dòng)物的神經(jīng)型乙酰膽堿受體的不同亞型(如 α 3 β 2、α 9 β 10等)。在鎮(zhèn)痛活性研究方面，目前發(fā)現(xiàn)RglA、Vcl. 1、MII三種α -芋螺多肽具有較好的鎮(zhèn)痛活性(Callaghan B et al. J Neurosci, 2008 ；28 :10943-10951 ；Young T et al. Brain Res. 2008 ；1229 :118-124.)，可以減輕由于創(chuàng)傷、炎癥、或神經(jīng)性損傷引起的疼痛。α芋螺多肽RglA、Vcl. 1的鎮(zhèn)痛作用靶點(diǎn)可能是乙酰膽堿受體α 9 α 10亞型(Vincler et al.PNAS. 2006，103 06) ,17880-17884)，而MII的作用靶點(diǎn)是乙酰膽堿受體α3β2亞型(Young Y，et al. Brain Res.，2008，1229 :118-124)。作用于外周神經(jīng)系統(tǒng)，可以采用多肽皮下、肌肉或腹腔等給藥方式，方便應(yīng)用。Vcl. 1鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的最新研究表明，Vcl. 1是通過(guò)GABAB介導(dǎo)的N型鈣通道的抑制而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用(Klimis H et al. PAIN 2011,152 259466)，但也有可能與目前未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種桶形α芋螺多肽Btl. 3。本發(fā)明提供的多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列2。所述多肽的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述多肽的編碼基因?yàn)槿缦垄呕?2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能多肽的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能多肽的DNA分子。 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。所述的多肽在制備鎮(zhèn)痛的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述產(chǎn)品為藥品。利用α芋螺毒素信號(hào)肽的保守區(qū)及3’ RACE克隆方法，從中國(guó)南海西沙群島海域的桶形芋螺(Conus betulinus)毒腺管中克隆獲得一條新的α 4/7型芋螺多肽Btl. 3基因 (圖1)，NCBI序列比對(duì)分析表明該芋螺多肽具有全新的氨基酸組成，與目前報(bào)道的α型芋螺多肽在氨基酸組成上具有顯著差異。利用Fmoc-固相肽合成法合成了 Btl. 3線性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然后在 NH4HCO3緩沖液中一步折疊，產(chǎn)物形成2個(gè)峰(第I峰和第II峰，圖2Α)。一般天然α芋螺毒素的二硫鍵連接方式主要為“C1-C3，C2-C4”，呈球狀結(jié)構(gòu)，在反相HPLC分析中出峰較早。 為進(jìn)一步證實(shí)Btl. 3折疊I峰的二硫鍵排列方式，合成了 Cl及C3位半胱氨酸帶有側(cè)鏈保護(hù)基 Acm (乙酰胺)的線性肽(RKC (Acm) CSNPAC (Acm)NRYNPAIC)。第一步在 pH 7. 7 的 0. IM Tris-HCl緩沖液氧化約2 后形成含一對(duì)二硫鍵(C2-C4)的產(chǎn)物(圖2B_b)，純化該產(chǎn)物并在碘溶液中脫去Acm得到二硫鍵排布為(C1-C3，C2-C4)的產(chǎn)物III峰(圖2B_c)。然后將一步折疊獲得的產(chǎn)物I峰(圖2A)與二硫鍵已知的兩步法產(chǎn)物III峰共同進(jìn)樣，結(jié)果表明二者保留時(shí)間一致(圖2B-d)。證實(shí)Btl. 3 一步折疊I峰的二硫鍵排列方式為“C1-C3， C2-C4”。質(zhì)譜測(cè)定其荷質(zhì)比“M+1”為1907. 87，與理論計(jì)算值相符(理論值為1907.81)。然后，用大鼠坐骨神經(jīng)半切模型(PSL)測(cè)定Btl. 3-1的鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明 Btl. 3-1具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，肌肉注射很低劑量的Btl. 3(0. 3nmol/只)即可使大鼠痛閾提高約沈.7%，與同劑量Vcl. 1的鎮(zhèn)痛活性相當(dāng)。在一定劑量范圍內(nèi)，該肽的鎮(zhèn)痛效果呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3)。此外，對(duì)Btl. 3的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了研究。將大鼠乙酰膽堿受體α3β2和α3β4 亞型表達(dá)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞上，用雙電極電壓鉗測(cè)定Btl. 3-1對(duì)亞型乙酰膽堿激發(fā)電流的抑制作用，結(jié)果表明Btl. 3可特異性地作用于α 3 β 2亞型，IOOOnM的Btl. 3-1即可抑制大鼠神經(jīng)元α 3 β 2亞型乙酰膽堿激發(fā)電流約65. 3%，而對(duì)α 3 β 4亞型作用弱(圖4)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明合成的Btl. 3多肽，具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，此且其可特異性地作用于α3β2亞基。


圖1為Btl. 3前體肽cDNA序列和預(yù)測(cè)的翻譯產(chǎn)物，下劃線所示為信號(hào)肽序列，陰影部分為成熟肽序列。圖2為合成Btl. 3的檢測(cè)圖，圖2A為Btl. 3 —步氧化折疊產(chǎn)物HPLC分析；a)線性肽；b) —步折疊產(chǎn)物I和II ； c)純化后的產(chǎn)物I。
圖2B為Btl. 3兩步折疊產(chǎn)物III及與一步折疊產(chǎn)物I共進(jìn)樣HPLC分析；a)線性肽；b)第一步折疊產(chǎn)物；C)第二步折疊產(chǎn)物III ；d)折疊產(chǎn)物I與III的混合樣品。圖3為Bt 1. 3-1給藥后1. 5h痛閾值變化，柱狀圖表示PNL大鼠肌肉注射生理鹽水、Vcl. 1及不同劑量Btl. 3，1. 5h后的平均痛閾值提高率(％)。圖4為Btl. 3對(duì)不同神經(jīng)型nAChR的作用效果，a) -c)分別為10nM、50nM及IOOOnM Btl. 3對(duì)大鼠α 3 β 2亞型ACh激發(fā)電流的抑制效果。d) IOOOnM Btl. 3對(duì)大鼠α 3 β 4亞型ACh激發(fā)電流的抑制效果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、α -芋螺多肽Btl. 3的合成一、α -芋螺多肽Btl. 3的基因克隆l、cDNA 的合成從中國(guó)南海西沙群島海域采集的活體桶形芋螺(Conus betulinus)作為樣本材料。采用iTrizol法提取芋螺毒腺管總RNA。使用大連TaKaRa公司3，F(xiàn)u 11-RACE試劑盒 (3’ -Full RACE Core Set Ver 2. 0)進(jìn)行cDNA的合成，具體方法如下先按比例添加下列組分
權(quán)利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.權(quán)利要求1所述多肽的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述多肽的編碼基因?yàn)槿缦?1)或 (2)或(3)的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能多肽的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能多肽的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cysl-Cys3和Cys2-Cys4 ；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cysl、Cys2、Cys3、Cys4。
5.權(quán)利要求1所述的多肽在制備具有鎮(zhèn)痛功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種桶形α芋螺多肽Bt1.3及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種桶形α芋螺多肽Bt1.3，其氨基酸序列為序列表中的序列2；所述多肽的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。所述多肽的二硫鍵的連接方式為Cys1-Cys3和Cys2-Cys4；從所述多肽的氨基端開始的Cys按順序分別記作Cys1、Cys2、Cys3、Cys4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用Fmoc-固相肽合成法合成了Bt1.3線性肽(RKCCSNPACNRYNPAIC)，然后在NH4HCO3緩沖液中一步折疊，得到Bt1.3多肽，鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的α型芋螺多肽在大鼠坐骨神經(jīng)半切模型中表現(xiàn)出很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102190708SQ201110086538
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者付超, 劉娜, 劉珠果, 孫婷, 戴秋云, 胡潔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所