專利名稱：檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種檢測環(huán)丙沙星的SCFv抗體、其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，化學(xué)名稱為1_環(huán)丙基_6_氟-1，4_ 二氫_4_氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，是合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具廣譜抗菌活性，殺菌效果好，幾乎對(duì)所有細(xì)菌均具有抗菌活性，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用。但因其具有一定的毒性，在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生威脅。檢測環(huán)丙沙星殘留量的化學(xué)分析方法需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體及編碼該抗體的基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述scFv抗體及其編碼基因在檢測環(huán)丙沙星中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，其中，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明還提供上述scFv抗體的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗體。例如，在重鏈上，將第M位的Ala替換為Wie,或是將第89位的Glu替換為Asp ；在輕鏈第96位的Thr添加kr，或是將輕鏈第34位的Trp缺失；均不會(huì)影響該抗體的功能。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因，其中，編碼scFv抗體重鏈的基因具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有編碼上述scFv抗體的基因的載體。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有所述基因的載體或含有該載體的宿主細(xì)胞在檢測環(huán)丙沙星中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述scFv抗體的制備方法，即將編碼上述scFv抗體的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。其中，所述表達(dá)載體為 PCANTAB5E。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體，主要采用競爭性ELISA方法定性或定量檢測樣品中環(huán)丙沙星的殘留；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣品；采用高特異性的環(huán)丙沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測。


圖1 隨機(jī)挑選20個(gè)scFv-pCANTAB5e重組質(zhì)粒sfil和NotI雙酶切電泳圖，M DL2000 核酸分子量 Marker，1 20 :scFv-pCANTAB5e 酶切產(chǎn)物。圖2 為30個(gè)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生可溶性抗體scFv-ELISA結(jié)果。圖3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖，1 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)上清液，2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)胞間質(zhì)，3 陰性對(duì)照。圖4 環(huán)丙沙星誘導(dǎo)表達(dá)上清中可溶性重組抗體間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的試劑盒材料均為市售商品。實(shí)施例1免疫原及檢測原的偶聯(lián)制備1、材料牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、環(huán)丙沙星(CIP)標(biāo)準(zhǔn)品、透析膜、透析膜處理液、磁力攪拌儀、紫外分光光度儀。2、方法采用混合酸酐法，將環(huán)丙沙星與蛋白大分子(BSA、OVA)進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫原和包被原。2. 1免疫原及包被原合成及純化A.中間產(chǎn)物制備a.取20mg藥物置于燒杯中，加入^iil DMF，若溶解不充分，可在超聲波中助溶；b.充分溶解后，加入25mg EDC和20mg NHS,磁力攪拌反應(yīng)；c.將以上燒杯用錫箔紙包裹好，室溫磁力攪拌反應(yīng)M小時(shí)，此液為A液。B.合成及初步純化a.取 50mg BSA (或 OVA)溶于 6ml PBS (0. 01M, ρΗ7· 4)中，充分溶解，此液為 B 液；b.在磁力攪拌下，將A液逐滴滴入B液中；c.用錫箔紙將燒杯包裹，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜；d.待以上反應(yīng)完成，將過夜反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中，于4°C冰箱中，用 PBS透析3天。透析中，前3次，每隔2小時(shí)換液，之后每8-12小時(shí)換液；e.透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液以4000rpm離心30min，取上清，_20°C凍存；f.取透析液在紫外分光光度儀下，檢測偶聯(lián)效果及偶聯(lián)物濃度。實(shí)施例2小鼠免疫1、材料Balb/c小鼠(雄性、6周齡)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、96孔酶標(biāo)板、免疫原CIP-BSA、包被原CIP-0VA、包被緩沖液(Na2CO3緩沖液0. 05N，pH9. 6)、封閉液脫脂乳PBS)、洗滌緩沖液(PBS、0. 1% Tween20PBST)、終止液、鼠抗環(huán)丙沙星單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體、TMB顯色液。2、方法2.1小鼠免疫a.取100 μ g免疫原CIP-BSA加入等量弗氏完全佐劑，制成乳化劑；b.首免取8只6周齡Balb/c小鼠，采用背部多點(diǎn)注射免疫，0. 2ml/只，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組；C. 二免與三免免疫方法取100 μ g免疫原與等量弗氏不完全佐劑制成乳化劑， 背部多點(diǎn)免疫小鼠；每次免疫間隔15天。d.三免后15天，處死小鼠，摘取脾臟，_70°C凍存。眶下竇取血，離心取血清。2. 2ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價(jià)a.將包被原 CIP-OVA 用包被緩沖液，按照 0. 5mg/l、0. 4mg/l、0. 3mg/l、0. 2mg/l、 0. lmg/1濃度梯度，200 μ 1/孔，包被酶標(biāo)板，4°C包被過夜；b.洗滌棄包被液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；c.封閉向每孔加滿封閉液，于37 °C封閉1. 5小時(shí)；d.洗滌棄封閉液，用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；e.加血清將小鼠血清用 PBS 按照 1 IOOU 200,1 400,1 800,1 1600、 1 3200、1 6400、1 12800,1 25600、1 51200進(jìn)行梯度稀釋后，加入封閉好的酶標(biāo)孔中，200 μ 1/孔，37°C孵育反應(yīng)2小時(shí)；f.洗滌棄血清稀釋液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；g.加酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體用PBS做1 10000稀釋，200 μ 1/孔， 37 °C孵育反應(yīng)1小時(shí)；h.洗滌棄酶標(biāo)抗體液，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干酶標(biāo)板；i.顯色加入200 μ 1/孔TMB顯色液，37°C孵育顯色45min左右；j.終止用200 μ 1/孔終止液，終止顯色，在450nm處讀值。3、結(jié)果通過間接ELISA檢測，包被原最佳濃度0. 2mg/mL·環(huán)丙沙星免疫組的3只小鼠(3、 4、8號(hào))血清抗體效價(jià)達(dá)到1 1觀00以上，可滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。實(shí)施例3免疫小鼠脾細(xì)胞RNA的提取及通過RT-PCR獲得cDNA1、材料免疫小鼠脾臟、細(xì)胞篩、DEPC處理的滅菌PBS、DEPC處理去離子水、總RNA提取試劑盒RNA iso Plus (Takara公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)。2、方法2. 1脾細(xì)胞總RNA的提取采用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus，參照說明書進(jìn)行a.剔除脾臟外周脂肪及外膜細(xì)胞，用DEPC處理的滅菌PBS清洗后，將脾臟置于細(xì)胞篩上，用眼科剪剪碎脾臟，用5ml DEPC處理去離子水沖洗細(xì)胞篩，收集篩下的細(xì)胞；b. 8000g 4°C離心 2min,棄上清；c.調(diào)整細(xì)胞濃度至IO7個(gè)/ml，向每IO7個(gè)細(xì)胞中加入1 ^il的RNAiso Plus ；
d.用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀；室溫靜置5min ；e.向上述的勻漿裂解液中加入氯仿(RNA iso Plus的1/5體積量)，劇烈振蕩15 秒，待溶液充分乳化(無分相現(xiàn)象)后，于室溫靜置5min;12，(KK)g 4°C離心15min;f.從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，S卩無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)；g.向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15 30°C下靜置 IOmin ；h. 12000g 4°C離心 IOmin ；i.棄上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12，OOOg 4°C離心5min后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇)；j.室溫干燥沉淀2 5分鐘，加入適量的不含Rnase的水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-70°C保存；k.在微量紫外分光光度計(jì)上測定得到的RNA的量。2. 2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA從-70°C低溫冰箱中取出獲得的小鼠脾臟RNA，在低溫環(huán)境下進(jìn)行操作。采用商品化總RNA提取試劑盒(Takara)，參照說明書進(jìn)行a.在Microtube管中配制下列混合液，10 μ 1反應(yīng)體系
dNTPs混合物1μl
OligodT 引物1μl
模板RNA2μ1
無RNA酶水6μ1b.將以上反應(yīng)體系，迅速置于PCR儀上，設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，反應(yīng)條件為:65°C,5min ；4°C ；c.反應(yīng)結(jié)束，離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部；d.采用Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，20 μ 1反應(yīng)體系
上述變性、退火后反應(yīng)液ΙΟμΙ5xPrimeScript RT 緩沖液4μ1RNase抑制劑0.5μ1Prime Script RTase (第二步)0.5μ1RNase Free dH205μ1 e.將以上反應(yīng)體系，迅速置于PCR儀上，設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，反應(yīng)條件為 A2°C 30min ；95°C 5min ；
f.擴(kuò)增獲得cDNA第一鏈，-70°C保存。3、結(jié)果根據(jù)免疫小鼠血清抗體效價(jià)，選取了效價(jià)高的小鼠脾臟，通過提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共制得環(huán)丙沙星免疫組小鼠(共3只3、4、8號(hào))脾細(xì)胞cDNA文庫，cDNA濃度均達(dá)到 420ng/μ 1。實(shí)施例4scFv單鏈抗體庫的構(gòu)建1、材料免疫小鼠 cDNA、重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Recombinant PhageAntibody System) (27-9400-01)包括重鏈引物混合物、輕鏈引物混合物和linker引物混合物、(Pharmacia公司)、long amp Taq DNA 聚合酶(NEB 公司)、瓊脂糖凝膠、DNAladder (DL2000、lkb)、凝膠回收試劑盒(TaKara公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(TaKara公司)、T4DNA連接試劑盒(NEB公司)、 限制性內(nèi)切酶(sfiI、NotI) (NEB公司)、pMD18-Tsimple載體系統(tǒng)(TaKara公司)、DH5a工程菌、TGl宿主菌、pCANTABk噬菌體載體、0. IN CaCl2、酵母提取物、Tryptone、氨芐青霉素、 卡那霉素。2、方法2. IVH 禾口 VL 基因 PCR 擴(kuò)增A.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VH基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
5xPCR緩沖液20 μLIOmM dNTP (each)6 pLcDNA (約 200ng )5 μ ν重鏈引物對(duì)4 μ Long amp Taq4 μL雙蒸水補(bǔ)足100 μL將以上反應(yīng)體系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增950C 5min 熱啟動(dòng)，加入 Long amp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；35 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(340bp)的目的條帶。B.從超低溫冰箱取出cDNA，在低溫環(huán)境下構(gòu)建VL基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系5 xPCR緩沖液20成
IOmMdNTP (每種)6 pL
cDNA (約 200ng)5 pL
輕鏈引物混合物
Longamp Taq4 pL
雙蒸水補(bǔ)足IOOpL反應(yīng)體系將以上反應(yīng)體系除long amp Taq外，加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增950C 5min 熱啟動(dòng)，加入 Long amp Taq 后94°C lmin，55°C 2min，65°C 2min ；35 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(325bp)的目的條帶。C. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化回收使用膠純化試劑盒(Takara公司)回收，參照說明書進(jìn)行a.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體；b.切碎膠塊，稱量膠塊重量，以Img = 1 μ 1進(jìn)行計(jì)算；c.向膠塊中加入膠塊3倍體積的膠塊融化液DR-I緩沖液；d.均勻混合后75°C加熱融化膠塊，此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化(約 6 10分鐘)；e.向上述膠塊融化液中加入DR-I緩沖液量的1/2體積量的DR-II緩沖液，均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇；f.將試劑盒中的Spin柱安置于收集管上；g.將上述操作e的溶液轉(zhuǎn)移至Spin柱中，12，OOOrpm離心1分鐘，棄濾液；h.將 500μ IWRinse A 加入 Spin 柱中，12，OOOrpm 離心 30 秒鐘，棄濾液;i.將 700μ IWRinse B 加入 Spin 柱中，12，OOOrpm 離心 30 秒鐘，棄濾液;j.重復(fù)操作步驟i ；k.將Spin柱安置于收集管上，12，OOOrpm離心1分鐘；1.將Spin柱安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin柱膜的中央處加入25 μ 1的滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液，室溫靜置1分鐘；m. 12，OOOrpm 離心 1 分鐘洗脫 DNA。將純化回收獲得的VH和VL基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測定片段的量。2. 2S OE-PCR 拼接 VH-Linker-VL 基因采取“VH-Linker-VL”形式將VH基因、Linker及VL基因進(jìn)行拼接。采用二步法 SOR-PCR法進(jìn)行。取以上純化獲得的VH和VL基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建scFv基因拼接PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系5xPCR緩沖液 IOmM dNTP (每種)
10 μL 5 μ ν
VH基因片段 VL基因片段
約 50 ng 約 50 ng
Linker引物混合物
4 μL 2 pL 補(bǔ)足50 μL
Long amp Taq
雙蒸水將以上反應(yīng)體系加入到PCR管中，迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增 940C Imin，63 °C 4min，7 個(gè)循環(huán)。2. 3引入sfil、NotI酶切位點(diǎn)A.以上反應(yīng)結(jié)束，立即取出反應(yīng)體系，迅速加入預(yù)先配制好的以下反應(yīng)體系將以上反應(yīng)體系迅速置入PCR儀中，并設(shè)置以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增940C lmin，55°C 2min，65°C 2min，30 個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，4°C保溫。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取全部擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)上樣緩沖液混勻，加入到瓊脂糖凝膠中，90V電泳40min，紫外下觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果，并切取符合大小(750bp)的目的條帶。B. scFv拼接產(chǎn)物切膠純化回收使用凝膠純化試劑盒Oiiagen)回收，參照說明書進(jìn)行a.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體；b.切碎膠塊，稱量膠塊重量，以Img = 1 μ 1進(jìn)行計(jì)算；c.加入3倍膠塊體積量的QG緩沖液，50°C水浴，融解膠塊；d.加入等體積的異丙醇，充分混勻；e.將試劑盒中的Spin柱安置于收集管上；f. 13000rpm 離心 lmin，棄濾液；g.向Spin柱中央膜加入500 μ 1 QG緩沖液洗柱，13000rpm離心lmin,棄濾液；h.向柱中加入750 μ 1 PE緩沖液，室溫作用5min, 13000rpm離心lmin,棄濾液；i.重復(fù)操作h—次；j.將Spin柱安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin柱膜的中央處加入30 μ 1 EB 緩沖液，室溫靜置1分鐘；k. 13000rpm 離心 lmin，收集濾液。將純化回收獲得的scFv基因片段，在微量紫外分光光度計(jì)上測定片段的量。C. scFv 基因連接 pCANTAB5e
5xPCR緩沖液 IOmM dNTP (每種)
10 μL 2 pL 4 μ 2 pL 32 pL
RS引物Mix Long amp Taq
雙蒸水
使用商品化T4DNA連接酶(Promega)，將經(jīng)sfil和NotI酶切處理的scFv片段與 pCANTAB5e載體連接。操作方法參照說明書進(jìn)行。取適量pCANTAB5e。載體和scFv基因片段，在低溫環(huán)境下構(gòu)建連接反應(yīng)體系
IOx連接酶緩沖液
T4 DNA連接酶IpL
scFv 片段MpL
pCANTAB5eN μ
雙蒸水補(bǔ)足20 pL酶切體系將連接體系置4°C連接過夜。scFv片段與pCANTAB5e使用量，按照如下公式進(jìn)行
載體質(zhì)量(ng) χ插入片段大小(kb) -χ插入載體摩爾比=插入片段量ngD.電轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細(xì)胞制備a.從_70°C低溫冰箱中取出TG1菌種，劃線于2XYT平板上，37°C培養(yǎng)16-20小時(shí)；b.挑取單個(gè)菌落接種于5ml 2 X YT培養(yǎng)基中，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)過夜；c.取過夜培養(yǎng)菌液250 μ L接種于50ml 2 X YT培養(yǎng)液中，37°C，300rpm震蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm = 0. 72-0. 76，將細(xì)菌培養(yǎng)物置于冰水混合物中驟冷；d.將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4°C，2000 Xg離心lOmin，收集菌體；e.用預(yù)冷的雙蒸水輕輕重懸菌體沉淀，先加入少量雙蒸水重懸菌體，再加滿雙蒸水，4°C，2000Xg，離心 lOmin，棄上清；f.用10%甘油重復(fù)以上e步驟兩次，2400 X g，離心lOmin，最后一次倒盡上清后， 用殘存管底的甘油懸浮細(xì)胞，分裝離心管，100 μ L/管；g.將離心管放入液氮中速凍，-70°C低溫冰箱保存。E.電轉(zhuǎn)化a.將電擊杯(0. 2cm間隙)置于冰上預(yù)冷，取出-70°C凍存的感受態(tài)細(xì)胞，于冰水混合物上融解；b.取30 μ L感受態(tài)細(xì)胞，向其中加入2 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻后，置于冰上90秒；c.將混合液加入預(yù)冷電擊杯的間隙中，擦干杯體，將電擊杯置于電轉(zhuǎn)化儀中；d.設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)15kv/cm，5ms，電轉(zhuǎn)；e.取出電擊杯，立即輕柔加入Iml預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，輕輕混勻后，吸出轉(zhuǎn)化液， 37°C，150rpm，培養(yǎng) 1. 5 小時(shí)。2. 6 建庫A.取上步轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液100 μ L，用2XYT培養(yǎng)液做梯度倍比稀釋，涂布 SOB-AG平板，30°C培養(yǎng)過夜。計(jì)數(shù)平板上的單菌落，推算庫容。剩余的轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液，加入80%終濃度滅菌甘油，-70°C凍存，此即為初級(jí)抗體庫。
B.隨機(jī)挑取SOB-AG平板上，長出的單克隆10個(gè)，提取質(zhì)粒DNA，用sfil和NotI 雙酶切，初步鑒定陽性克隆。質(zhì)粒提取及酶切反應(yīng)操作和以上步驟相同。對(duì)酶切陽性的重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測定和分析。3、結(jié)果以環(huán)丙沙星免疫組小鼠脾細(xì)胞cDNA文庫為模板，通過初步擴(kuò)增，獲得了各免疫小鼠抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因VH、VL片段，電泳顯示條帶大小為340和325bp，符合預(yù)期大將VH、VL片段切膠純化回收，與linker進(jìn)行拼接，獲得全長750bp的scFv電泳片段。切膠純化回收scFv片段，與pMD18-T simple載體做T-A克隆，插入載體構(gòu)建 scFv-pMD18-T重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，過夜培養(yǎng)后，提取重組菌質(zhì)粒，用sfil和NotI雙酶切初步鑒定陽性克隆，電泳顯示正確連接率達(dá)到100%。將亞克隆板上所有菌落洗下，培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，sfil和NotI雙酶切獲得scFv 片段，與用同樣雙酶切處理的pCANTAB5e噬菌粒載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后，涂布SOBAG平板。隨機(jī)挑取20個(gè)單菌落，過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，sfiI和NotI雙酶切鑒定scFv與pCANTAB5e 連接情況，結(jié)果有18個(gè)酶切陽性，分別切出約4. 5kb大小的噬粒和約750bp的scFv插入片段，說明scFv片段成功插入pCANTAB5e噬粒載體。計(jì)算庫容均達(dá)到1. 3X 107。20個(gè)單菌落中有18個(gè)均能切出目的條帶和載體片段(圖1)，重組率達(dá)到90%。通過以上操作，共制備了環(huán)丙沙星免疫組小鼠各3個(gè)初級(jí)抗體庫，各抗體庫庫容如表1所示表1構(gòu)建鼠源抗環(huán)丙沙星單鏈抗體初級(jí)抗體庫情況
權(quán)利要求
1.一種檢測環(huán)丙沙星的SCFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，其特征在于，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
2.權(quán)利要求1所述scFv抗體的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗體。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體重鏈的基因具有SEQID No. 3 所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼scFv抗體輕鏈的基因具有SEQID No. 4 所示的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述基因的載體。
7.含有6所述載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1或2所述的scFv抗體、權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因、權(quán)利要求6所述的載體或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞在檢測環(huán)丙沙星中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述scFv抗體的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因構(gòu)建至表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后進(jìn)行蛋白的表達(dá)及分離純化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pCANTABk。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體，其包括重鏈和輕鏈，重鏈和輕鏈的氨基酸序列分別如序列表SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供編碼上述scFv抗體的基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述scFv抗體及其編碼基因在檢測環(huán)丙沙星中的應(yīng)用。本發(fā)明檢測環(huán)丙沙星的scFv抗體，主要采用競爭性ELISA方法定性和定量檢測樣品中環(huán)丙沙星的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣品；采用高特異性的環(huán)丙沙星scFv抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/44GK102199213SQ20111008688
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月7日
發(fā)明者侯曉林, 孫英健, 鄭志明 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院