專利名稱：基于癌抑制基因wt1的產(chǎn)物的癌抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Wilms腫瘤的癌抑制基因WTl的產(chǎn)物為基礎(chǔ)的癌抗原。該癌抗原作為針對白血病、骨髓異形成綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血癌或?qū)嶓w瘤，例如胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細(xì)胞瘤、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等以及WTl表達(dá)的所有癌的抗癌疫苗上有用的。
背景技術(shù)：
用于排除異物的免疫機構(gòu)一般包括與識別抗原作為抗原提示細(xì)胞作用的巨噬細(xì)胞、識別該巨噬細(xì)胞的抗原提示產(chǎn)生各種淋巴因子使其他T-細(xì)胞等活化的輔助T細(xì)胞、通過該淋巴因子的作用分化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞等有關(guān)的體液免疫以及接受抗原提示分化成的殺傷T細(xì)胞攻擊破壞靶細(xì)胞的細(xì)胞免疫?，F(xiàn)在，認(rèn)為癌的免疫主要是與殺傷T細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞性免疫引起的。在殺傷T細(xì)胞引起的癌免疫中，識別以主要組織適合抗原(Major Histocompatibility Complex，MHC)第 I類與癌抗原形成的復(fù)合體形式提示的癌抗原的前體T細(xì)胞分化增殖生成的殺傷T細(xì)胞攻擊破壞癌細(xì)胞。這時，癌細(xì)胞在其細(xì)胞表面提示MHC第I類抗原與癌抗原形成的復(fù)合體，它成為殺傷 T 細(xì)胞的靶細(xì)胞(Cur. Opin, Immunol. ,5,709,1993 ；Cur. Opin, Immunol. ,5,719, 1993 ；Cell,82,13，1995 ；Immunol. Rev,146，167，1995)。作為靶細(xì)胞的癌細(xì)胞上通過MHC第I類抗原提示的上述癌抗原可以認(rèn)為是癌細(xì)胞內(nèi)合成的抗原蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶處理生成的約8 12個氨基酸構(gòu)成的肽(Cur. Opin, Immunol. ,5,709,1993 ；Cur.Opin. Immunol. , 5, 719,1993 ；Cell,82,13, 1995 ；Immunol. Rev. ，146，167，1995)?，F(xiàn)在，對于各種癌進行了抗原蛋白質(zhì)的檢索，證明是癌特異抗原的物質(zhì)較少。Wilms腫瘤的癌抑制基因WTl (WTl基因)是根據(jù)對Wilms腫瘤、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神發(fā)達(dá)遲滯等并發(fā)的WAGR綜合癥的解析，作為Wilms腫瘤的一種原因基因從染色體 11ρ13 分離出的物質(zhì)(Gessler, M.等，Nature, Vol.343，p. 774-778 (1990))，基因組 DNA通過約501Λ由10個外顯子構(gòu)成，其cDNA為約31Λ。由cDNA推測出的氨基酸序列如序列號 1 所示(Mol. Cell. Biol.，11，1707，1991)。WTl基因在人白血病中高度表達(dá)，用WTl反義低聚物(antisense oligomer)處理白血病細(xì)胞能夠抑制其細(xì)胞增殖(特開平9-104627號公報)等提示W(wǎng)Tl基因可以促進白血病細(xì)胞的增殖。而且，WTl基因在胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體瘤中高度表達(dá)(特愿平9-191635)，判斷出WTl基因是白血病和實體瘤中新的腫瘤標(biāo)識物。但是，尚未證明WTl基因表達(dá)產(chǎn)物是作為癌疫苗有用的癌特異抗原。
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發(fā)明公開因此，本發(fā)明確認(rèn)了 WTl基因表達(dá)產(chǎn)物作為癌抗原的可能性，提供了一種新型癌抗原。本發(fā)明人為了解決上述問題進行了各種研究，結(jié)果合成了 WTl基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列中含有被預(yù)測在小鼠和人的I類MHC和II類MHC的結(jié)合中作為錨定氨基酸 (anchor amino acid)起作用的至少1個氨基酸的連續(xù)7 30個氨基酸構(gòu)成的多肽，確認(rèn)這些肽與MHC蛋白質(zhì)結(jié)合，同時確認(rèn)與I類MHC抗原結(jié)合時誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞，而且對靶細(xì)胞具有殺細(xì)胞效果，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供小鼠WTl表達(dá)產(chǎn)物或含有其一部分的癌抗原。在優(yōu)選的方式中， 本發(fā)明提供以與WTl的CDNA對應(yīng)的序列號1所示的氨基酸序列中包括用于與MHC抗原結(jié)合的錨定氨基酸在內(nèi)的6 30個氨基酸構(gòu)成的肽作為活性成分的癌抗原。而且本發(fā)明提供以與人WTl的cDNA對應(yīng)的序列號2所示的氨基酸序列中包括用于與MHC抗原結(jié)合的錨定氨基酸在內(nèi)的7 30個氨基酸構(gòu)成的肽作為活性成分的癌抗原。本發(fā)明還提供含有上述癌抗原的癌疫苗。附圖的簡單說明

圖1表示實施例1中用DbU6肽免疫的細(xì)胞與非免疫細(xì)胞在流式細(xì)胞測量法中 ⑶4+細(xì)胞與⑶8+細(xì)胞的比例。圖2是比較實施例2中用Db126肽免疫的細(xì)胞對于用Db126肽脈沖的靶細(xì)胞和未脈沖的靶細(xì)胞的殺細(xì)胞作用。圖3是與圖2含義相同的圖。圖4中A表示實施例3中使用Db126肽誘導(dǎo)的CTL對于用Db126肽脈沖的T2細(xì)胞的殺細(xì)胞效果，B表示實施例3中使用WH187肽誘導(dǎo)的CTL對于用WH187肽脈沖的T2細(xì)胞的殺細(xì)胞效果。圖5表示由Db126肽誘導(dǎo)的CTL的表面標(biāo)識物通過FACS解析的結(jié)果(⑶19細(xì)胞以及CD3細(xì)胞)。圖6表示⑶4細(xì)胞以及⑶8細(xì)胞與圖5同樣的圖。圖7表示⑶56細(xì)胞與圖5同樣的圖。圖8表示W(wǎng)H187肽誘導(dǎo)的CTL的表面標(biāo)識物通過FACS解析的結(jié)果(⑶19細(xì)胞和 CD3細(xì)胞)。圖9表示CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞與圖8同樣的圖。圖10表示⑶56細(xì)胞與圖8同樣的圖。圖11表示抗HLA-A2. 1抗體對Db126肽特異性CTL引起的對于用Db126肽脈沖的 T2細(xì)胞的特異性細(xì)胞溶解的影響。圖12是比較Db126肽特異性CTL對于表達(dá)WTl的靶細(xì)胞或不表達(dá)WTl的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。a表示E T比為7. 5 1的情況下的結(jié)果，b表示E T比為15 1的情況下的結(jié)果。圖13是比較Db126肽特異性CTL對于先天表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞(FBL3)或不表達(dá) WTl的腫瘤細(xì)胞(RMA)的細(xì)胞溶解效果。圖14是比較Db126肽特異性CTL對于用WTl基因胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞以及未進行胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的同一細(xì)胞的細(xì)胞溶解效果。圖15表示I類抗H-2抗體對Db126肽特異性CTL的細(xì)胞毒性的影響。圖16表示使用DbU6肽作為疫苗使用，免疫小鼠時的體內(nèi)免疫效果。圖17表示將表達(dá)WTl的質(zhì)粒作為DNA疫苗投給小鼠時的免疫效果。圖18是圖17的對照，是表示投給不表達(dá)WTl的質(zhì)粒時不產(chǎn)生免疫效果的圖。發(fā)明的實施方式本發(fā)明中，作為設(shè)計癌抗原肽時的基礎(chǔ)，選擇小鼠I類MHC的Kb和Db，以及人HLA 的A*0201，選擇預(yù)測與它們具有高親和性的肽。根據(jù)Immunogenetics Vol. 41, p. 178-228(1995)的記載，預(yù)測與 Kb 結(jié)合的錨定氨基酸是5號的Phe和Tyr以及8號的Leu和Met等，另外預(yù)測與Db結(jié)合的錨定氨基酸是5 號的Asn以及9號的Met和Ile等。另夕卜，已知癌細(xì)胞表面上I類MHC提示的癌抗原肽的大小為約8 12個。因此， 本發(fā)明的癌抗原肽是序列號1所示W(wǎng)Tl基因產(chǎn)物的氨基酸序列中包括錨定氨基酸在內(nèi)的連續(xù)7 30個氨基酸構(gòu)成的肽。氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為8 12個，例如8或9個。在本發(fā)明中，作為其具體例子，I類MHC與Kb結(jié)合的肽使用由8個氨基酸構(gòu)成的下述肽Kb 45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu (序列號 3)Kb 330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu (序列號 4)I類MHC與Db結(jié)合的肽使用由9個氨基酸構(gòu)成的下述肽Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列號 5)Db 221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met (序列號 6)Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (序列號 7)上述序列中帶下劃線的氨基酸是被預(yù)測作為錨發(fā)揮作用的氨基酸。其次，使用未提示抗原肽(empty)但表達(dá)Kb以及Db的細(xì)胞線測定這些肽中Kb45以及Kb330與I類MHC的Kb的結(jié)合性，Db 126、Db221和Db235與I類MHC的Db的結(jié)合性。也就是說，在下培養(yǎng)RMA-S，使I類MHC高度表達(dá)，在37°C下培養(yǎng)該培養(yǎng)細(xì)胞與被測肽溶液1小時。這樣，不與肽結(jié)合的MHC分子變得不穩(wěn)定，從細(xì)胞表面消失，僅殘留與肽結(jié)合的I類MHC分子。其次，用識別I類MHC(Kb，Db)的熒光標(biāo)識單克隆抗體給RMA-S 細(xì)胞染色。最后，通過FACS解析，由每個細(xì)胞的平均熒光量計算結(jié)合解離常數(shù)(Immimol. Lett. ，47，1，1995)。結(jié)果，得到了下述結(jié)果。
Kb45-4.5784838(log)
Kb330-5.7617732
Db126-6.2834968
Db221-5.7545398
Db235-6.1457624
如上所述，與Kb或Db具有強-
-中度的結(jié)合親和性(kd值)但顯示最高結(jié)合親和性的Db126肽在以后的實驗中被使用。另外，對于人，根據(jù) Immunogenetics Vol. 41，ρ, 178-228 (1995)的記載，預(yù)測與人
5HLA-A*0201結(jié)合的錨定氨基酸是N-末端至2號Leu和Met以及N-末端至9號Val和Leu。 因此合成了人WTl蛋白質(zhì)的氨基酸序列(Mol. Coll. Biol. Vol. 11，p. 1707-1712，1991)(序列號2)中符合上述條件的9個氨基酸構(gòu)成的2種肽。Db 126 ；ArgJfet Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5)(與小鼠中Db126的序列相同)WH 187 ；Ser Leu Gly Glu Gln Gin Tyr Ser Val (序列號 8)(下劃線表示錨定氨基酸)如下所述測定上述肽與HLA_A*0201的結(jié)合能。在37°C下培養(yǎng)上述肽與具有 empty 的 HLA_A*0201 的 T2 細(xì)胞(J. Immunol.，150， 1763，1993 ；Blood，88，2450，1996) 1小時后，用識別HLA-A2. 1的熒光標(biāo)識單克隆抗體給T2 細(xì)胞染色，通過FACS解析，由每個細(xì)胞的平均熒光量計算結(jié)合解離常數(shù)。結(jié)合能
權(quán)利要求
1.編碼示于SEQID NO :1或2的蛋白質(zhì)或其部分肽的核酸在制備癌癥疫苗中的用途， 所述肽由序列號2所示氨基酸序列的9個連續(xù)氨基酸所組成，其中2位上氨基酸殘基是亮氨酸或甲硫氨酸，9位上氨基酸殘基是纈氨酸或亮氨酸，該肽可結(jié)合I類MHC抗原。
2.權(quán)利要求1的用途，其中的核酸編碼示于SEQID NO :1或2的蛋白質(zhì)用于所述制備。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中的核酸編碼的部分肽選自下組 位置 126-134 :Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (Db 126)， 位置 235-243 :Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Db 235)， 位置 187-195 ；Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (WH 187)， 位置 7-15 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val,位置 10-18 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu, 位置 225-233 :Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu, 位置 242-250 :Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val, 位置 441-449 :Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，所說的部分肽為以下任意一種 Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5) Db 235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (序列號 7) WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (序列號 8)。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，所說的部分肽為Db 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (序列號 5)或 WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (序列號 8)。
全文摘要
本發(fā)明涉及Wilms腫瘤癌抑制基因WT1的產(chǎn)物，以該氨基酸序列中包括與I類主要組織適合性抗原(MHC)結(jié)合的錨定氨基酸在內(nèi)的連續(xù)7～30個氨基酸構(gòu)成的肽作為有效成分的癌抗原，以及含有它們的癌疫苗。
文檔編號C07K14/82GK102198266SQ20111010288
公開日2011年9月28日 申請日期1999年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月31日
發(fā)明者岡芳弘, 杉山治夫 申請人:株式會社國際癌癥免疫研究所