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      使用il-21和單克隆抗體療法治療癌癥的方法

      文檔序號:3571779閱讀:367來源:國知局
      專利名稱:使用il-21和單克隆抗體療法治療癌癥的方法
      使用IL-21和單克隆抗體療法治療癌癥的方法本申請是申請日為2005年5月20日、申請?zhí)枮?00580021262. 5、發(fā)明名稱為“使用IL-21和單克隆抗體療法治療癌癥的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
      背景技術(shù)
      細(xì)胞因子一般刺激造血譜系的細(xì)胞的增殖或分化,或參與身體的免疫和炎性反應(yīng)機(jī)制。白細(xì)胞介素是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子的家族。免疫反應(yīng)的核心是T細(xì)胞,該細(xì)胞產(chǎn)生許多細(xì)胞因子和影響對抗原的適應(yīng)性免疫。已將τ細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子分類為THl和 TH2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol.巡300_317,1998)。1 型細(xì)胞因子包括 IL-2、IFN-γ、 LT-α,其參與炎癥反應(yīng)、病毒性免疫、細(xì)胞內(nèi)寄生蟲免疫和同種異體移植物排斥。2型細(xì)胞因子包括IL-4,IL-5,IL-6,IL-10和IL-13,其參與體液反應(yīng)、蠕蟲免疫和過敏性反應(yīng)。1型和2型之間共享的細(xì)胞因子包括I L-3,GM-CSF和TNF- α。一些證據(jù)顯示1型和2型生產(chǎn)性T細(xì)胞群體優(yōu)先地遷移入不同類型的炎癥組織。天然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞以及B細(xì)胞具有共同的祖細(xì)胞,在免疫監(jiān)督中發(fā)揮作用。NK細(xì)胞,其占血液淋巴細(xì)胞的高達(dá)15%,不表達(dá)抗原受體,是先天免疫的組成部分。NK 參與識別和殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞。在體內(nèi),據(jù)認(rèn)為NK細(xì)胞需要激活,然而,在體外,已顯NK細(xì)胞殺傷一些類型的腫瘤細(xì)胞而無需激活。已顯示IL-21是細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的有效調(diào)節(jié)劑。(Parrish-Novak,等人 Nature 408 :57-63,2000 ;Parrish-Novak,等人,T. Leuk. Bio. 72 :856-863,2002 ;Collins 等人,Immunol. Res. 28 131-140, 2003 :Brady,等人Τ. Immunol. :2048-58,2004.)。已顯示 IL-21共刺激NK細(xì)胞的擴(kuò)增,已證明其增強(qiáng)這些細(xì)胞的效應(yīng)器功能。T細(xì)胞應(yīng)答包括調(diào)節(jié)記憶T細(xì)胞功能以及增強(qiáng)初級抗原反應(yīng)(Kasaian等人,Immunity 16 =559-569, 2002)??贵w療法使用選擇性地在某些細(xì)胞類型中表達(dá)的抗原??贵w療法在癌癥的治療中已取得了顯著的成功,因為某些腫瘤細(xì)胞展現(xiàn)獨(dú)特的抗原、譜系特異性抗原,或相對于正常細(xì)胞存在過量的抗原。單克隆抗體(MAb)療法的發(fā)展已從小鼠雜交瘤技術(shù)(Kohler等人, Nature256 =495-497,1975)發(fā)展而來,由于不能刺激人免疫效應(yīng)器細(xì)胞的活性和產(chǎn)生人抗小鼠的抗體(HAMA ;Khazaeli等人,T. Immunother. 15 =42-52,1994),因此該單克隆抗體具有有限的治療功效。使用人恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)獲得抗原性較低的基因工程改造的嵌合型抗體。這些抗體具有增加的效應(yīng)器功能和減少的HAMA反應(yīng)(Boulianne等人,Nature Ml 643-646,1984)。已使用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty 等人,Nature 348 :552-554,1990) 來發(fā)展人單克隆抗體,最近以來,已使用攜帶人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)完全人單克隆抗體(Green,Τ. Immunol. Methods 231 :11-23,1999)。關(guān)于單克隆抗體療法,參見,Brekke 等人,Na t. Rev. Drug Discov. 2 :52_62,2002。本發(fā)明提供了用IL-21增強(qiáng)單克隆抗體療法的抗腫瘤活性的方法。IL-21和治療性單克隆抗體的組合提供了超過單獨(dú)使用單克隆抗體的改善,尤其適用于對于對單獨(dú)的單克隆抗體治療或和其他治療方案組合的單克隆抗體治療不產(chǎn)生反應(yīng)的患者。根據(jù)此處的教導(dǎo),這些和其他用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)是很明顯的。發(fā)明概述
      本發(fā)明提供了在受治療者中,特別是人受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用治療上有效量的單克隆抗體和治療上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO :2中顯示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。在一個實施方案中,所述單克隆抗體是抗CD20單克隆抗體。在另一實施方案中,單克隆抗體是利妥昔單抗。在另一個實施方案中,本發(fā)明的方法治療非何杰金氏淋巴瘤。本發(fā)明的其他實施方案提供了這樣的方法,在該方法中,長達(dá)連續(xù)8周每周一次地施用單克隆抗體利妥昔單抗和IL-21多肽。在另一個實施方案中,長達(dá)連續(xù)8周,每周一次地施用利妥昔單抗,每周高達(dá)5次地施用IL-21多肽。 本發(fā)明的另一個實施方案提供了從10至500 μ g/kg/劑的IL-21多肽劑量。在本發(fā)明的某些實施方案中,以前曾用利妥昔單抗治療患者,但未顯示明顯的腫瘤減緩或消退。在其他實施方案中,在接受利妥昔單抗治療后,患者復(fù)發(fā)疾病。在另一個方面,本發(fā)明提供了在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用治療上有效量的抗⑶20單克隆抗體和治療上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO :2中顯示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。其中,施用IL-21導(dǎo)致最佳免疫學(xué)應(yīng)答。在另一個方面,本發(fā)明提供了在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用結(jié)合 Her-2/neu受體的單克隆抗體和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如SEQ ID NO 2中顯示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。在一個實施方案中,受治療者是人患者。在另一個實施方案中,單克隆抗體是曲妥單抗。本發(fā)明的一個方面提供了在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用結(jié)合細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)的單克隆抗體和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,如 SEQ ID NO :2中顯示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。在某些實施方案中,受治療者是人患者。在本發(fā)明的另一實施方案中,以每三周:3mg/kg的劑量施用抗CTLA-4單克隆抗體,進(jìn)行4個循環(huán),和以每周5次,長達(dá)8周地施用IL-21多肽或片段。本發(fā)明也提供了這樣的實施方案,在該實施方案中,IL-21多肽的劑量是從10至500 μ g/kg/劑。附圖概述

      圖1-舉例說明去除了巨噬細(xì)胞的小鼠顯示不同于非去除小鼠的存活曲線。圖2-舉例說明通過抗Gr-IMAb的注射去除了粒細(xì)胞的小鼠,當(dāng)和非去除小鼠比較時,顯示減少的存活率。圖3-舉例說明抗CTLA4+IL21的組合在RENCa模型中具有抗腫瘤效果。發(fā)明描述在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前,定義下列術(shù)語可有助于理解其此處所用的術(shù)語“親和標(biāo)簽”是指可附著至第二多肽以提供第二多肽的純化或檢測或提供用于第二多肽與底物的附著的位點(diǎn)的多肽片段。原則上,任何可獲得其相應(yīng)的抗體或其他特異性結(jié)合試劑的肽或蛋白可用作親和標(biāo)簽。親和標(biāo)簽包括多組氨酸片段、A 蛋白(Nilsson 等人,EMBO .1.4:1075,1985 ;Nilsson 等人,Methods Enzymol, 198 3,1991)、谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶(Smith 和 Johnson,Gene 位31,1988)、Glu-Glu 親和標(biāo)簽 (Grussenmeyer 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :7952-4,1985)、P 物質(zhì)、Flag 肽(Hopp 等人,BiotechnoloRy6 1204-10,1988)、鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合性肽或其他抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一般參見 Ford 等人,Protein Expression andPurification 2 :95-107,1991。可從商業(yè)提供商(例如,PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ)商購獲得編碼親和標(biāo)簽的 DNA。此處使用的術(shù)語“等位基因變體”是指占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的任何兩個或多個可選擇的基因的形式。等位基因變異天然地通過突變發(fā)生,其可導(dǎo)致群體內(nèi)的表型多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(被編碼的多肽上未發(fā)生改變)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語等位基因變體此處也可用于表示由基因的等位變體編碼的蛋白。此處所用的術(shù)語“氨基末端”和“羧基末端”是指多肽內(nèi)的位置。在上下文允許的情況下,針對多肽的特定序列或部分,這些術(shù)語用于表示臨近或相對位置。例如,位于多肽內(nèi)參照序列的羧基末端的某一序列位于靠近該參照序列的羧基端,但不一定位于完整多肽的羧基端。此處所用的術(shù)語“癌癥”或“癌細(xì)胞”是指在贅生物中發(fā)現(xiàn)的、具有使其和正常組織或組織細(xì)胞區(qū)分開的特征的組織或細(xì)胞。在這些特征中包括但不限于退行性變化的程度、形狀上的不規(guī)則、細(xì)胞輪廓的不可分辨性、細(xì)胞核大小、細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)上的改變、其他表型改變、預(yù)示癌癥或前癌狀態(tài)的細(xì)胞蛋白的存在、增加的有絲分裂次數(shù)和轉(zhuǎn)移的能力。和“癌癥”有關(guān)的術(shù)語包括癌、肉瘤、腫瘤、上皮癌、白血病、淋巴癌、息肉,以及硬癌、 轉(zhuǎn)化、贅生物等。此處所用的術(shù)語“共施用”表示IL-21多肽或蛋白和治療性單克隆抗體可以同時給藥或在不同時間給藥。共施用也可以是I L-21和單克隆抗體的單次共施用或共施用的多個循環(huán)。共施用不必只限于給患者施用IL-21或單克隆抗體時候,可單獨(dú)地或和除了 IL-21 以外的治療劑一起施用藥劑。此處所用的術(shù)語“組合治療”是指給受治療者施用至少一種治療有效劑量的IL-21 組分(“IL-21”)和治療性單克隆抗體。所述IL-21組分可以是展示IL-21的生物學(xué)活性的成熟的多肽、其片段、融合物或綴合物。術(shù)語“分離的”,當(dāng)用于多核苷酸時,是指已將該多核苷酸從其天然遺傳背景中取出,從而不含有其他外來或不想要的編碼序列,其以適合在經(jīng)遺傳工程改造的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式存在。這樣的分離的分子是從其天然環(huán)境中分離的分子,包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含通常和其相關(guān)的其他基因,但可包含天然發(fā)生的5' 和3'非翻譯區(qū)例如啟動子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明了 (參見例如,Dynan 和 Ti jan,Nature316 :774-78,1985)?!胺蛛x的”多肽或蛋白是在除了其天然環(huán)境外,例如除了血液和動物組織外的條件下發(fā)現(xiàn)的多肽或蛋白。在優(yōu)選的形式中,分離的多肽基本上不含有其他多肽,特別是動物來源的其他多肽。優(yōu)選地以高度純化的形式,即大于95%的純度、更優(yōu)選地大于99%的純度提供多肽。當(dāng)用于本說明書中時,術(shù)語“分離的”不排除相同的多肽以可選擇的物理形式存在,例如以二聚體或可選擇地糖基化或衍生的形式存在。術(shù)語“水平”,當(dāng)指免疫細(xì)胞,例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞、B細(xì)胞等時,增加的水平是指增加的細(xì)胞數(shù)目或增強(qiáng)的細(xì)胞功能的活性。術(shù)語“水平”,當(dāng)用于指病毒感染時,是指病毒感染水平上的改變,其包括,但不限于,CTLs或NK細(xì)胞(如上面所描述的)的水平上的變化、病毒載量上的減少、增加的抗病毒的抗體的滴度、如通過靶組織或器官的組織學(xué)檢查所確定的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的血清學(xué)水平上的降低或提高。確定這些水平上的改變是否具有顯著的差異或改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。術(shù)語“贅生性”,當(dāng)指細(xì)胞時,表示在組織中特別是這樣的組織中正進(jìn)行新的和不正常增殖的細(xì)胞,在所述組織中,擴(kuò)增是不受控制的和累進(jìn)的,從而導(dǎo)致贅生物。所述贅生性細(xì)胞可以是惡性的,即侵襲性的和轉(zhuǎn)移性的,或可以是良性的。術(shù)語“最佳免疫劑量”定義為獲得最佳免疫反應(yīng)的IL-21或IL-21和單克隆抗體的劑量。術(shù)語“最佳免疫反應(yīng)”是指在施用IL-21或IL-21+MAb的組合后,在免疫反應(yīng)上的改變超過當(dāng)單獨(dú)地施用MAb時觀察到的改變,其可以是(1)被激活的或腫瘤特異性CD8T細(xì)胞的數(shù)量上的增加,(2)表達(dá)更高水平的粒酶B或穿孔素或IFN γ受體的活化的或腫瘤特異性CD8T細(xì)胞的數(shù)量上的增加,(3) NK細(xì)胞、單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞上的Fc γ受體(CD16、 ⑶32或⑶64)的上調(diào),(4)血清中可溶性⑶25的增加,(5)通過腫瘤細(xì)胞釋放的蛋白例如癌胚抗原(CEA)、IgG、CA-19-9或卵巢癌抗原(CA125)的血清水平上的減少(參見,例如, Taro 等人,T. CellPhysiol 203(1) 1-5, 2005), (7)激活性細(xì)胞因子例如 IL-18、I L-15、 IFN γ和能夠使效應(yīng)器細(xì)胞尋找到腫瘤的趨化因子例如IP-10、RANTES, IL_8、MIPla或 MIPlb的水平上的增加,(8)在腫瘤位點(diǎn)外周或其上的被活化的巨噬細(xì)胞的數(shù)量上的增加, 其中可通過增加的MHC I型或II型的表達(dá),IL-15、IL-18、IFN γ或IL-21的產(chǎn)生來檢測激活,或(9)通過紅細(xì)胞計數(shù)的下降(貧血的嚴(yán)重度)表示的巨噬細(xì)胞活性。“多核苷酸”是從5'至3'末端閱讀的脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA,其可從天然來源分離,體外合成,或從天然和合成的分子的組合制備。多核苷酸的大小表示為堿基對(編寫為“bp”)、核苷酸(“nt”)或千堿基(“1Λ”)。在上下文允許的情況下,后兩個術(shù)語可描述單鏈的或雙鏈的多核苷酸。當(dāng)所述術(shù)語用于雙鏈分子時,其用于表示總的長度,理解為和術(shù)語“堿基對”的意思相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到雙鏈多核苷酸的兩條鏈可在長度上稍微不同,其末端可以因為酶的切割而產(chǎn)生交錯,因此雙鏈多核苷酸分子內(nèi)的核苷酸可以不配對?!岸嚯摹笔怯呻逆I連接的氨基酸殘基的多聚體,無論是天然產(chǎn)生的還是合成的。少于大約10個氨基酸的多肽通常稱為“肽”。“蛋白”是包含一個或多個肽鏈的大分子。蛋白也可包含非肽成分,例如糖基??赏ㄟ^產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞向蛋白加入糖和其他非肽取代物,糖和非肽取代物隨細(xì)胞的類型不同而不同。此處根據(jù)蛋白的氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)來定義蛋白;取代物例如糖基一般不具體指明, 但是可以存在。術(shù)語“受體”是指這樣的細(xì)胞結(jié)合的蛋白,該蛋白結(jié)合生物活性分子(即,配體)和介導(dǎo)該配體對細(xì)胞的作用。膜結(jié)合受體的特征在于包含細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一般參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的多個肽結(jié)構(gòu)。配體和受體的結(jié)合導(dǎo)致受體的構(gòu)象變化, 該變化導(dǎo)致效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的其他分子之間產(chǎn)生相互作用。該相互作用依次導(dǎo)致細(xì)胞的代謝上的改變。和受體-配體相互作用關(guān)聯(lián)的代謝事件包括基因的轉(zhuǎn)錄、磷酸化、去磷酸化、環(huán)AMP產(chǎn)量的增加、細(xì)胞鈣的動員、膜脂的動員、細(xì)胞粘附、肌醇脂類的水解和磷脂的水解。一般地,受體可以是膜結(jié)合的、存在于細(xì)胞溶質(zhì)或細(xì)胞核中的、單體的(例如,促甲狀腺激素受體、β -腎上腺素能受體)或多聚體的(例如,PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體)。術(shù)語“治療上有效的量”被定義為這樣的IL-21組分或IL-21組分和單克隆抗體的量,該量導(dǎo)致完全的反應(yīng)、部分反應(yīng)、或穩(wěn)定的疾病,這些反應(yīng)或穩(wěn)定的疾病具有增加的超過在無IL-21的情況下單克隆抗體療法的中等反應(yīng)持續(xù)時間的進(jìn)程時間。術(shù)語“腫瘤相關(guān)抗原”是指具有不同于非腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的抗原的表達(dá)特征譜的肽或多肽或肽復(fù)合物。例如,和非腫瘤細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞可以更高的頻率或密度表達(dá)非腫瘤抗原。腫瘤抗原可在結(jié)構(gòu)上與非腫瘤抗原不同,例如,腫瘤抗原可作為截短的多肽表達(dá), 在編碼該抗原的氨基酸序列或多核苷酸序列上具有一些突變,翻譯后錯誤折疊或不正確修飾。和存在于宿主生物中的正常的、非腫瘤細(xì)胞上的抗原相似,其可使腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視機(jī)制。通過不精確分析方法(例如,凝膠電泳)確定的多聚體的分子量和長度應(yīng)理解為近似值。當(dāng)這樣的值表示為“大約”X或“近似”X時,所述的X值要理解為精確值士 10%。此處引用的所有文獻(xiàn)以其全文在此引用作為參考。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn),即I L-21和治療性單克隆抗體的一起施用導(dǎo)致比單獨(dú)施用單克隆抗體更有效的抗腫瘤活性。A. IL-21 的描沭。人I L-21(SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2)最初被稱為 zalphall 配體,在共同擁有的美國專利號6,307,024和6,686,178中對其進(jìn)行了描述,該專利在此引用作為參考。 在共同擁有的WIPO公開號WO 0/17235和W001/77171中描述了 IL-21受體,(以前稱為 zalphall)現(xiàn)稱為 IL-21R(SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6)、異二聚體受體IL-21R/IL-2R γ , 該文獻(xiàn)在此引用作為參考。如在這些出版物中所描述的,IL-21分離自從激活的用CD3篩選的人外周血細(xì)胞(hPBCs)產(chǎn)生的cDNA文庫。⑶3是對于淋巴來源的細(xì)胞特別是T細(xì)胞是獨(dú)特的細(xì)胞表面標(biāo)志物。IL-21R的氨基酸序列顯示被編碼的受體屬于I類細(xì)胞因子受體亞家族,該家族包括,但不限于,IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF 和 G-CSF 的受體(綜述參見, Cosman,"The HematopoietinReceptor Superfamily"in Cytokine 5(2) :95-106,1993)。 已在NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞上鑒定了 IL-21受體,這表明IL-21對造血譜系細(xì)胞特別是淋巴祖細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞起作用。其他已知的對淋巴樣細(xì)胞起作用的四-螺旋-束 (four-helical-bundle)的細(xì)胞因子包括 IL-2、IL-4、IL-7 和 IL-15。關(guān)于四-螺旋-束細(xì)胞因子,參見,Nicola 等人,Advances in Protein Chemistry 52 :1-65,1999 和 Kelso, Α.,Immunol. Cell Biol. 76 :300-317,1998。對于IL-21,分泌信號序列由氨基酸殘基I(Met)至四(5吐)組成,成熟的多肽由氨基酸殘基30 (Gln)至162 (kr)(如SEQ ID NO 2中所示)組成。對應(yīng)的多核苷酸序列示于 SEQ ID NO :1中。本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)SEQ ID NO=I中公開的序列代表人IL-21的單個等位基因,預(yù)期可發(fā)生等位基因變異和可變剪接。本發(fā)明也提供了具有和SEQ ID NO 2的多肽或其直向同源物基本上相似的序列同一性的分離的IL-21多肽。術(shù)語“基本上相似的序列同一性”此處是指多肽包含和SEQ ID NO 2中顯示的序列或其直向同源物至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列同一性。本發(fā)明也包括包含這樣的氨基酸序列的多肽,該氨基酸序列和SEQ ID N0:2的氨基酸殘基1至162或30至162的序列具有至少80%、至少90%、至少95%或超過95%的序列同一性。本發(fā)明還包括編碼這些多肽的核酸分子。用于確定同一性百分比的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的?!愕?,當(dāng)設(shè)計針對分子的修飾或鑒定特異性片段時,通過對經(jīng)修飾的分子的活性的評估來進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定。關(guān)于IL-21多核苷酸和多肽的修飾的詳細(xì)描述,參見,美國專利號6,307,024和6,686,178,在此引用其作為參考。本發(fā)明也包括施用具有IL-21的功能活性的分子。因此,本發(fā)明包括施用IL-21 多肽的功能性片段和經(jīng)功能性修飾的多肽以及編碼這些功能性片段和經(jīng)修飾的多肽的核酸分子。此處定義的“功能性” IL-21或其片段的特征在于其增殖或分化活性,在于其誘導(dǎo)或抑制特化的細(xì)胞功能的能力,特別是對于免疫效應(yīng)器細(xì)胞例如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞。功能性IL-21也包括展現(xiàn)體內(nèi)或體外抗癌和抗病毒作用的能力,或特異性結(jié)合抗IL-21的抗體或IL-21受體(可溶性的或被固定的)的能力。也可使用各種多肽融合物(和相關(guān)的包含一種或多種多肽融合物的多聚體蛋白)。例如,可將IL-21多肽與二聚化蛋白制備為融合物,如美國專利號5,155,027和 5,567,584中所公開的。在該方面,優(yōu)選的二聚化蛋白包含免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域??稍诮?jīng)遺傳工程改造的細(xì)胞中表達(dá)免疫球蛋白-IL-21多肽融合物(以產(chǎn)生各種多聚體IL-21 類似物)??蓪⑤o助結(jié)構(gòu)域融合至IL-21多肽以將其靶向特定的細(xì)胞、組織或大分子。例如, 可將IL-21多肽或蛋白靶向預(yù)先確定的細(xì)胞類型,通過將IL-21多肽融合至這樣的配體或單克隆抗體來將IL-21多肽靶向預(yù)先確定的細(xì)胞類型,所述配體或單克隆抗體特異性地結(jié)合該靶細(xì)胞的表面上的受體。這樣,為了治療或診斷目的,可靶向多肽或蛋白??蓪 L-21 多肽融合至兩個或更多個部分,例如用于純化的親和標(biāo)簽和靶向性結(jié)構(gòu)域。多肽融合物也可包含一個或多個切割位點(diǎn),特別是在結(jié)構(gòu)域之間。參見,Tuan等人,Connective Tissue Research 34 :1-9,1996。不論變體I L-21多核苷酸的特定的核苷酸序列如何,該多核苷酸編碼這樣的多肽,該多肽的特征在于其增殖或分化活性,在于其誘導(dǎo)或抑制特化的細(xì)胞功能的能力,或在于特異性結(jié)合抗IL-21的抗體或IL-21受體的能力。更明確地,變體IL-21多核苷酸編碼這樣的多肽,該多肽表現(xiàn)至少50%,在某些實施方案中,大于70^^80%或90%的SEQ I DNO 2中顯示的多肽的活性。對于任何IL-21多肽,包括變體和融合蛋白,本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地使用遺傳密碼子和本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法產(chǎn)生完全簡并的編碼該變體的多核苷酸序列。根據(jù)常規(guī)技術(shù)可在經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)用于本發(fā)明的I L-21多肽。 合適的宿主細(xì)胞是可用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染和在培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞類型,包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。真核細(xì)胞,特別是多細(xì)胞生物的培養(yǎng)細(xì)胞是優(yōu)選的。用于操作克隆的DNA分子和將外源DNA導(dǎo)入各種宿主細(xì)胞的技術(shù)公開于Sambrook等人,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 片反,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989,禾口 Ausubel 等人,eds. , Current Protocols in Molecular BioloRY, Johnffiley and Sons,Inc.,NY,1987。用于產(chǎn)生IL-21的表達(dá)構(gòu)建體和方法描述于美國專利號6,686,178和PCT US 03/39764,在此引用作為參考。用于治療的I L-21綴合物包含藥物可接受的水溶性聚合物部分。合適的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-PEG、單-(Cl-ClO)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、 聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、三氟乙磺酰單甲氧PEG、PEG丙醛、二琥珀酰亞胺碳酸PEG、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇、 葡聚糖、纖維素或其他基于糖類的聚合物。合適的PEG可具有從大約600至大約60,000的分子量,包括,例如,5,000、12,000,20, 000和25,000o IL-21綴合物也可包含這些水溶性聚合物的混合物。B.在組合療法中使用IL-21和單克降抗體。和單克隆抗體療法的抗腫瘤活性相關(guān)的一個機(jī)制是抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。 在ADCC中,單克隆抗體結(jié)合靶細(xì)胞(例如,癌細(xì)胞)和表達(dá)該單克隆抗體受體的特異性效應(yīng)器細(xì)胞(例如,NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)結(jié)合單克隆抗體/靶細(xì)胞復(fù)合物導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。IL-21增強(qiáng)效應(yīng)器細(xì)胞功能,從而增加單克隆抗體治療的功效。和MAbs組合的 IL-21的施用劑量和方案基于IL-21提高這樣的參數(shù)的能力,所述參數(shù)和介導(dǎo)ADCC的細(xì)胞群體的分化和功能活性關(guān)聯(lián),所述細(xì)胞包括但不限于NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞??墒褂肗K、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性、ADCC(NK細(xì)胞級分或總的單核細(xì)胞、或細(xì)胞進(jìn)行ADCC的能力所需的效應(yīng)器分子(例如,F(xiàn)asL、粒酶和穿孔素))的測定法估計這些參數(shù)。 當(dāng)和MAb+腫瘤細(xì)胞組合時,IL-21也通過NK細(xì)胞增加細(xì)胞因子(例如IFN y )和趨化因子的產(chǎn)量。也已證明Kupffer細(xì)胞“清除”利妥昔單抗包被的B細(xì)胞的重要性(Gong等人, T. Immunol. 174 =817-826, 2005)。和抗腫瘤活性相關(guān)的另一個機(jī)制是MAb包被的腫瘤細(xì)胞的吞噬作用。這也是Fc受體依賴性的,已顯示影響通過抗CD20的抗體進(jìn)行的B細(xì)胞去除 (Uchida等人.T.Exp. Med. 199(12) 1659-69,2004)。MAbs的劑量和給藥方案基于歸于共施用的特定抗體的藥物動力學(xué)和毒性動力學(xué)特征,應(yīng)當(dāng)最優(yōu)化這些效果,同時使任何可能和 IL-21施用相關(guān)的毒性降至最低。基于此處詳細(xì)描述的關(guān)于利妥昔單抗和曲妥單抗的結(jié)果,當(dāng)IL-21和利用免疫效應(yīng)器細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性的機(jī)制的其他單克隆抗體一起使用時,所述單克隆抗體的抗腫瘤活性也得到了增強(qiáng)。此外,因為IL-21增強(qiáng)免疫效應(yīng)器細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性,某些單獨(dú)使用時具有有限的抗腫瘤功效的單克隆抗體將成為用于和IL-21 —起使用的組合療法的優(yōu)良候選者。當(dāng)?shù)谝痪€治療失敗時,可使用IL-21和單克隆抗體的組合療法,可將其當(dāng)作第二線療法。然而,基于和單克隆抗體組合的IL-21的增強(qiáng)的抗腫瘤活性,本發(fā)明也提供了使用該組合作為患者群體中的第一線療法,所述患者群體是最新被診斷的并且是以前未接受過抗癌藥治療的“新患者(de novo patients)”和以前未接受過任何單克隆抗體治療的“未曾服藥的患者(naiive patients)”。在任何直接的抗體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的ADCC不存在的情況下,也可將IL-21和單克隆抗體一起用于組合療法。在免疫系統(tǒng)中阻斷抑制信號的抗體可導(dǎo)致提高的免疫應(yīng)答。 示例包括(1)抗B7R家族的分子例如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)、編程性死亡-1 (PD-I)、B和T淋巴細(xì)胞衰減子(BTLA)的抗體,該家族分子具有抑制性功能;(2)抗抑制性細(xì)胞因子如IL_10、TGFi3的抗體;和(3)去除或抑制抑制性細(xì)胞的功能的抗體如抗 ⑶25或CTLA-4。例如,據(jù)認(rèn)為小鼠和人中的抗CTLA4mAbs都抑制免疫抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞 (Tregs)的功能或抑制抑制性信號,該信號通過T細(xì)胞上的CTLA-4和APCs或腫瘤細(xì)胞上的B7-1或B7-2分子結(jié)合來傳遞。CTLA-4在被激活的T細(xì)胞表面短暫表達(dá)而在Treg細(xì)胞上組成型地表達(dá)。交聯(lián)CTLA-4導(dǎo)致對激活的T細(xì)胞的抑制性信號,抗CTLA-4的抗體阻斷對T 細(xì)胞的抑制性信號,從而導(dǎo)致持續(xù)的T細(xì)胞活化(Wian等人,PNAS,100 :8372-8377,2003.)。 在小鼠模型中,抗CTLA4治療導(dǎo)致被激活的腫瘤特異性CD8T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)目增加,從而導(dǎo)致有效的抗腫瘤反應(yīng)。IL-21的受體(IL-21R)在這些效應(yīng)器細(xì)胞上表達(dá),IL-21可通過IL-21R激活這些效應(yīng)器細(xì)胞來進(jìn)一步增強(qiáng)其效應(yīng)器功能。這可以導(dǎo)致更有效的抗腫瘤活性。正在黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌中進(jìn)行這樣的臨床試驗,在該試驗中,給患者施用抗CTLA-4的阻斷性抗體。然而,功效和一系列副作用相關(guān)聯(lián)(參見,US2004/0M1169),產(chǎn)生更低毒性治療的組合療法是有利的。表1是經(jīng)批準(zhǔn)或經(jīng)檢驗可能和I L-21 —起用于組合療法的單克隆抗體的非排它性目錄。Table 權(quán)利要求
      1.在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用治療上有效量的單克隆抗體和治療上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,該片段為SEQ ID NO 2中所示的從氨基酸殘基 30至殘基162的片段。
      2.在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用治療上有效量的抗CD20單克隆抗體和治療上有效量的I L-21多肽或IL-21多肽的片段,該片段為SEQ ID NO :2中所示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。
      3.權(quán)利要求2的方法,其中所述單克隆抗體是利妥昔單抗。
      4.權(quán)利要求2的方法,其中所述癌癥是非何杰金氏淋巴瘤。
      5.權(quán)利要求2的方法,其中所述受治療者是人患者。
      6.權(quán)利要求3的方法,其中每周一次施用利妥昔單抗和IL-21多肽,進(jìn)行長達(dá)連續(xù)8周。
      7.權(quán)利要求3的方法,其中每周一次地施用利妥昔單抗和每周高達(dá)5次地施用IL-21 多肽,進(jìn)行長達(dá)連續(xù)8周。
      8.權(quán)利要求3的方法,其中所述IL-21多肽的劑量是從10至500μ g/kg/齊U。
      9.權(quán)利要求5的方法,其中所述患者以前曾用利妥昔單抗治療過但沒有顯示明顯的腫瘤緩減或消退。
      10.權(quán)利要求5的方法,其中所述患者在接受利妥昔單抗治療后復(fù)發(fā)。
      11.在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用治療上有效量的抗CD20單克隆抗體和治療上有效量的IL-21多肽或IL-21多肽的片段,該片段為SEQ ID NO 2中所示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段,其中施用IL-21導(dǎo)致最佳的免疫反應(yīng)。
      12.在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用結(jié)合Her-2/neu受體的單克隆抗體和I L-21多肽或I L-21多肽的片段,該片段為SEQ IDNO :2中所示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。
      13.權(quán)利要求12的方法,其中所述受治療者是人患者。
      14.權(quán)利要求13的方法,其中所述單克隆抗體是曲妥單抗。
      15.在受治療者中治療癌癥的方法,其包括共施用結(jié)合細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4(CTLA-4)的單克隆抗體和IL-21多肽或IL-21多肽的片段,該片段為SEQ ID NO 2中所示的從氨基酸殘基30至殘基162的片段。
      16.權(quán)利要求15的方法,其中所述受治療者是人患者。
      17.權(quán)利要求16的方法,其中每三周一次地以:3mg/kg的劑量施用抗CTLA-4單克隆抗體,進(jìn)行4個循環(huán),和每周1-5次地施用IL-21多肽或片段,施用長達(dá)8周。
      18.權(quán)利要求17的方法,其中所述IL-21多肽的劑量是從10至500μ g/kg/齊U。
      全文摘要
      描述了通過共施用治療性單克隆抗體和IL-21治療癌癥的方法。可使用的示例性單克隆抗體是利妥昔單抗、曲妥單抗和抗CTLA-4抗體。對于對單克隆抗體療法具有抗性的、在用單克隆抗體治療后復(fù)發(fā)的或其中增強(qiáng)的IL-21抗腫瘤效果減少毒性(該毒性和使用單克隆抗體的治療法相關(guān))的患者群體,所述組合療法的增強(qiáng)的抗腫瘤性特別有用。
      文檔編號C07K16/28GK102188704SQ20111010797
      公開日2011年9月21日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月20日
      發(fā)明者C·H·克雷格, D·C·弗斯特, M·D·黑佩爾, P·V·斯瓦庫瑪, R·A·約翰遜, R·D·豪雷, S·D·胡格赫斯, W·R·金德斯沃格爾 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司
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