專利名稱：豬瘟病毒csfv e2蛋白配體表位多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子病理學與免疫學技術領域，具體涉及豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽及其應用。
背景技術：
CSF是由CSFV引起的豬的一種高度接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員之一。在病毒感染過程中，細胞膜上的受體與病毒配體結合是介導病毒侵入宿主細胞的關鍵因素，也是病毒能否感染細胞的關鍵。因此，研究病毒受體和病毒配體之間的相互作用成為目前病毒致病機制研究的熱點問題之一，因為以其中的任何一個為藥物靶點都可以阻斷病毒與靶細胞的結合，從而抑制病毒的感染。關于 CSFV配體的研究，已證實Erns蛋白參與了病毒的早期吸附，El和E2蛋白形成的異源二聚體可以介導CSFV侵入宿主細胞，并且此異源二聚體還起到使哺乳動物細胞融合的作用。但是，究竟這三種蛋白的哪些氨基酸序列作為病毒配體與病毒受體結合，目前還沒有詳細的報道。近年來，一大批病毒的受體被相繼分離和鑒定，研究病毒受體的方法有病毒鋪敷蛋白印跡技術、單克隆抗體法、免疫共沉淀、篩選易感細胞cDNA文庫鑒別病毒受體克隆表達技術、噬菌體表面展示技術、酵母雙雜交技術和親和層析法等。病毒與宿主細胞的結合實質上是病毒受體與病毒配體的結合，所以對病毒配體與病毒受體結合方式及位點的研究可以從分子水平上揭示病毒的感染機制，并對病毒性疾病的診斷、預防和治療都有著重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題本發(fā)明提供了 CSFV結合靶細胞的一條線性配體表位多肽的氨基酸序列，該配體表位多肽能夠抑制CSFV感染PK-15細胞，隨多肽濃度的增加感染率降低，并且得到能夠完全抑制病毒感染靶細胞的多肽濃度；
還提供了細胞免疫化學染色鑒定多肽SEM與PK-15細胞的結合效率及多肽SEM抑制 CSFV感染PK-15靶細胞的方法。本發(fā)明的技術方案
本發(fā)明利用生物信息學技術，分析了 CSFV E2蛋白氨基酸序列的一級結構，設計并合成了 CSFV E2蛋白上的1條多肽。以冊-15細胞為靶細胞，通過CSFV的感染、收獲，測定了 CSFV的TCID50和感染比(MOI)，進行合成多肽與靶細胞的結合試驗、病毒阻斷試驗和多肽阻斷CSFV感染靶細胞的試驗，篩選的特異性結合靶細胞能夠抑制病毒感染配體表位多肽， 對CSFV的配體表位進行了精確定位。豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽，其氨基酸序列為VHASDERLGPMPCRPKEIGSS AGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF。所述的CSFV E2蛋白配體表位多肽為線性配體結合表位。
所述的CSFV E2蛋白配體表位多肽，用Sulfo-NHS-Biotin標記的多肽SEM與 PK-15細胞結合時，二者摩爾比為1 1 1 4,多肽SE24的濃度為0. 025 0. 2mmol/L。所述多肽完全抑制CSFV感染PK-15靶細胞時的多肽濃度為0. 2mmol/L。所述的CSFV E2蛋白配體表位多肽鑒定該多肽與冊-15細胞結合效率的方法，包括以下步驟
(1)培養(yǎng)冊-15細胞，于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，直至細胞鋪滿96孔的細胞培養(yǎng)板；
(2)傾去培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)好的單層細胞用預冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上分別依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L 和 0. 025mmol/L 的 Biotin 標記的多月太 Biotin-SE24，100 μ L/孔，每個濃度重復做3次，4°C孵育Ih,同時設6孔不加Biotin標記的多肽Biotin-SE24的正常細胞做對照實驗，用Biotin標記的BSA做無關多肽對照實驗；
(3)洗滌，用預冷的PBS洗滌細胞3次，洗去未結合的多肽，中止多肽結合試驗；
(4)固定，加入0.3%的H2A甲醇溶液5(^17孔，41固定101^11，傾去上清液，用？85丁洗滌3次；
(5)封閉，加入含10%脫脂奶粉的PBST緩沖液，200μ L/孔，在37°C封閉lh，傾去上清液，用PBST洗滌3次；
(6)加入Avidin-HRP和HRP的標記抗生物素蛋白，50μ L/孔，用含10%脫脂奶粉的PBST 緩沖液進行1:500的稀釋，在37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；
(7)用AEC顯色試劑盒顯色，根據試劑盒的說明操作，在顯微鏡下觀察試驗結果，并記錄染色細胞數目。利用CSFV E2蛋白配體表位多肽鑒定該多肽抑制CSFV感染PK-15靶細胞的方法， 包括以下步驟
(1)培養(yǎng)ra-15細胞，于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，直至ra-15細胞鋪滿96孔細胞培養(yǎng)板；
(2)加多肽SE24，傾去培養(yǎng)上清液，用預冷的PBS洗滌細胞一次，在96孔細胞培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L、0. 0125mmol/L、 0. 00625mmol/L的多肽SE24，100 μ L/孔，每個濃度重復做3次，稀釋液為10%的DMEM，設3 孔BSA作為無關多肽對照和3孔空白對照，37°C作用Ih ；
(3)傾去含有多肽的上清液，加病毒CSFV，每孔加入10倍的TCID50CSFV感染細胞， 100 μ L/孔，其中空白對照只加細胞維持液，37°C作用Ih ；
(4)用10%的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，加入5%的DMEM維持培養(yǎng)基，100μ L/孔，37°C 繼續(xù)培養(yǎng)M 48 h ；
(5)細胞免疫化學染色，統(tǒng)計感染細胞數量，并分析試驗結果。所述細胞免疫化學染色的步驟為
a.洗滌，傾去細胞培養(yǎng)上清液，用PBST洗滌3次，每次孵育3min ；
b.固定，用含0.3%H2O2的甲醛溶液固定，50yL/孔，4°C固定lOmin，用PBST洗滌3次， 每次孵育3min ；
c.封閉，用10%的脫脂奶粉封閉，200μ L/孔，37°C封閉lh，用PBST洗滌3次，每次孵育 3min ；d.加一抗，加入1 200倍稀釋的兔抗CSFV高免血清，稀釋液為PBS溶液，50 μ L/孔， 37°C作用30min，用PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；
e.加二抗，加入1:40倍稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，稀釋液為10%的脫脂奶粉，50μ L/ 孔，37 °C作用Ih，用PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；
f.AEC顯色試劑盒顯色，根據試劑盒說明操作，在顯微鏡下觀察實驗結果，并記錄染色細胞數目。所述的CSFV E2蛋白配體表位多肽在抑制CSFV感染PK-15細胞中的應用。本發(fā)明的積極有益效果
1、本發(fā)明提供了 CSFV結合靶細胞的一條線性配體表位多肽SEM，該表位多肽位于E2 蛋白上，其分子量為5. 73kDa。2、本發(fā)明的配體表位多肽SEM能夠抑制CSFV感染PK-15細胞，并且隨著多肽濃度的增加，PK-15細胞的感染率降低，具有劑量依賴性，并得出多肽濃度為0. 2mmol/L時能夠完全抑制CSFV感染PK-15靶細胞的結論。3、本發(fā)明采用的細胞免疫化學染色鑒定多肽SEM與H(-15細胞的結合效率及多肽SEM抑制CSFV感染PK-15靶細胞的方法，該方法特異、敏感、經濟易操作。4、本發(fā)明為進一步從病毒配體和病毒受體相互作用方面進行病毒配體表位的研究，為進一步揭示CSFV的感染機制，以及抗病毒藥物篩選和新型疫苗的研制提供了理論依據。


圖1 實施移圖2 實施移圖3 實施移圖4 實施侈圖5 實施移圖6 實施移圖7 實施移圖8 實施移圖9 實施移圖10實施釤圖11實施移圖12實施釤圖13實施移圖14實施釤圖15實施
(200X)ο圖I6實施
(200X)ο圖17實施
2 中 0. 2mmol/L 的 Biotin-SEM 結合 PK-15 細胞的結果(100 X)。 2 中 0. lmmol/L 的 Biotin_SE24 結合 PK-15 細胞的結果(100 X)。 2 中 0. 05mmol/L 的 Biotin-SE24 結合 PK-15 細胞的結果(100 X)。 2 中 0. 025mmol/L 的 Biotin-SE24 結合 PK-15 細胞的結果(100 X)。 2中Biotin-BSA結合PK-15細胞的結果(100X)。 2中正常的PK-15細胞(100X)。
3中Biotin-SEM多肽結合冊-15細胞的流式細胞分析的散點圖。 3中Biotin-SEM多肽結合冊-15細胞的流式細胞分析的集合圖。 3中Biotin-BSA結合冊-15細胞流式細胞分析的散點圖。 3中Biotin-BSA結合冊-15細胞流式細胞分析的集合圖。 3中CSFV阻斷SEM多肽結合H(-15細胞流式細胞分析的散點圖。 3中CSFV阻斷SEM多肽結合H(-15細胞流式細胞分析的集合圖。 3中Biotin-SEM結合試驗和阻斷試驗的流式細胞術的疊加圖。 3中Biotin-SEM結合試驗和阻斷試驗的流式細胞術的三維圖。
列4中0. 2mmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染H(-15細胞的結果
列4中0. lmmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染PK-15細胞的結果
列4中0. 05mmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染H(-15細胞的結果(200X)ο圖18實施例4中0. 025mmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染H(-15細胞的結果
(200X)ο圖19實施例4中0. 0125mmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染H(-15細胞的結果
(200X)ο圖20實施例4中0. 00625mmol/L的SEM多肽抑制CSFV感染PK-15細胞的結果
(200X)ο圖21實施例4中BSA抑制CSFV感染PK-15細胞的結果Q00X)。圖22實施例4中正常的PK-15細胞Q00X)。圖23實施例4中不同濃度的SEM多肽抑制CSFV感染冊_15細胞的感染抑制曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明中若沒有特別說明外， 其中的百分比均指重量百分比。實施例1、CSFV E2蛋白多肽的設計、合成及Sulfo-NHS-Biotin標記多肽 1. 1多肽的設計
利用DNASIS (Ver. 2. 5)軟件將CSFV E2蛋白的氨基酸序列進行分析，設計1條多肽，其中包含E2蛋白的部分氨基酸序列，且多肽N端均添加Cys，以便用SMCC雙功能試劑與載體偶聯。用peptide程序分析合成難度；設計合成(裂解)程序；編輯肽鏈；計算并配制溶液、試劑；啟動合成程序。1. 2多肽的合成
利用Symphony 12通道多肽合成儀在Fmoc-氨基酸-王樹脂(Fmoc-Amino Acids attached to Wang Resin, i^^/K ) ±^lllffi^ ^) ' (solid-phase peptide synthesis)合成多肽，多肽合成按標準操作規(guī)程進行?；竞铣蛇^程為執(zhí)行程序進行C末端氨基酸王樹脂溶漲一執(zhí)行Std程序(或Md_db程序)*加20% piperidine 脫Fmoc保護一用DMF洗樹脂一*加下一位Fmoc保護氨基酸和活化劑HBTU進行?；磻?用Kaiser法或TNBS法檢測酰化反應的完成情況一*DMF洗樹脂一重復執(zhí)行 Std程序(或Md_db程序)，在樹脂上連接下一位氨基酸(重復帶*步驟)，直到該多肽序列合成完成。根據組成肽鏈氨基酸不同選取適當的裂解試劑，執(zhí)行程序，用TFA法裂解肽鏈與樹脂的連接一冷乙醚離心沉淀法回收TFA裂解多肽一Sephadex G_25脫鹽純化 —MS和HPLC分析鑒定和純化多肽。其中，多肽裂解反應完成后，應用冷乙醚離心沉淀法從 TFA裂解多肽收集液中回收合成肽產物。將收集管中的收集液蒸發(fā)30 60min，過濾除掉雜質。向收集液中加入3倍收集液體積的冷乙醚(4°C)，蓋好收集管蓋，顛倒混勻，冰浴10 分鐘，3000r/m，離心lOmin，棄上清，留沉淀。重新用新鮮的冷乙醚重懸沉淀(旋渦震蕩)，重復以上操作3次。收集沉淀物，即為粗品合成肽。粗品合成肽經過G25脫鹽純化，再經制備型HPLC純化后，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆?。合成多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。1. 3 Sulfo-NHS-Biotin 標記多月太
(1)將Sulfo-NHS-Biotin和多肽從_20°C取出，放置使之恢復室溫；
7CN 102268079 A
說明書
5/7頁(2)稱量4.4mg的Sulfo-NHS-Biotin，溶于ImL的雙蒸水中，充分混勻，配制成IOmmol/ L 的 Sulfo-NHS-Biotin 溶液；
(3)稱量多肽ang，分別溶于50μ L DMSO中配制成40mg/mL的儲存液；
(4)取出80μ L Sulfo-NHS-Biotin分別與50 μ L的多肽溶液充分混合(連接時多肽與 Sulfo-NHS-Biotin的摩爾比是1: 2)，室溫作用30min，4°C過夜孵育Biotin_SE24多肽；
(5)以10%的DMEM調整Biotin-SEM多肽濃度至lmg/mL，混勻后，小劑量分裝用于 PK-15細胞結合試驗。實施例2、細胞免疫化學染色鑒定Biotin-SE24多肽與冊_15細胞的結合試驗
(1)培養(yǎng)H(-15細胞，于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，待細胞鋪滿96孔細胞培養(yǎng)板；
(2)傾去培養(yǎng)上清，培養(yǎng)好的單層細胞用預冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上分別依次加入濃度 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L 和 0. 025mmol/L 的 Biotin 標記的多月太 Biotin-SE24,100 μ L/孔，每一個稀釋度做3個重復，4°C孵育lh，使Biotin標記的多肽與 PK-15細胞充分結合，設6孔不加Biotin標記多肽的正常細胞做對照，Biotin標記BSA為無關多肽對照；
(3)用預冷的PBS輕柔的洗滌細胞3次，洗去未結合的多肽，中止多肽結合試驗；
(4)固定，加入0.3%的H2A甲醇溶液50 μ L/孔，4°C固定lOmin，傾去上清，PBST輕柔洗滌3次；
(5)封閉，加入10%脫脂奶粉PBST20(^17孔，37°〇封閉lh，傾去上清，PBST輕柔洗滌 3次；
(6)力口Avidin-HRP，加入HRP標記抗生物素蛋白50 μ L/孔，1:500稀釋，稀釋液為10% 脫脂奶粉PBST，37°C作用Ih ；傾去上清，PBST輕柔洗滌3次；
(7)AEC試劑盒顯色，依次取試劑盒中的A、B和C液各一滴于ImL DDW中，充分混勻， 50 μ L/孔，室溫作用lOmin，顯微鏡下觀察試驗結果，并計數染色細胞，記錄結果。參見圖 1 圖6。圖1 圖6表明=Biotin標記SEM多肽能與H(-15細胞結合，并且SEM多肽主要結合到PK-15細胞的細胞膜上，結合效率隨SEM濃度的增加而提高，而BSA不能結合PK-15 細胞。實施例3、用流式細胞術分析Biotin-SEM多肽結合試驗和病毒阻斷試驗
用冊-15細胞同時進行以下試驗。試驗分為3組，試驗A組=Biotin標記多肽結合 PK-15細胞試驗；試驗B組=Biotin-BSA結合冊-15細胞試驗，作為陰性對照；試驗C組 CSFV封閉H(-15細胞結合位點后，再進行Biotin標記多肽結合冊_15細胞試驗，作為病毒阻斷試驗。具體試驗步驟如下
(1)培養(yǎng)H(-15細胞，待培養(yǎng)24h后，細胞長成單層；
(2)預冷PBS洗滌細胞3次，用胰酶消化細胞，約20min，用IOml移液器將細胞從細胞瓶中吹下，混勻，減少細胞大團塊，1500r/m離心5min，棄去細胞上清；
(3)加入新的預冷PBS，將細胞重懸，使細胞的濃度在IO6個/mL;
(4)加病毒，僅試驗C組需此步驟，試驗A和B組加病毒，加入200μ L CSFV，(TCID50為 10-3. 5)，混勻，0°C結合 Ih ；(5)1500r/m，4°C離心5min，離心去除未結合的CSFV，傾去上清，加入ImL的洗液(IOmL 預冷PBS加0. 5mL胎牛血清與200 μ L 10% NaN3)，用預冷洗液洗滌細胞，1500r/m, 4°C離心 5min，沉淀細胞，棄去上清；
(6)在試驗A組中加入Biotin標記的多肽50μ L，試驗B組中加入Biotin-BSA 200 μ L, 與ΡΚ-15細胞0°C結合30min ；
(7)1500r/m，4°C離心5min，離心去除未結合的Biotin標記多肽和Biotin-BSA，傾去上清，加入ImL洗液，洗滌吹勻細胞，1500r/m，4°C離心5min，沉淀細胞，棄去上清；
(8)加入FITC標記的Avidin,1:50倍稀釋，試驗A、B和C組中各加入100μ L，0°C結合 30min ；
(9)1500r/m，4°C離心5min，傾去上清，加入ImL的洗液，吹勻細胞，1500r/m，4°C離心 5min，沉淀細胞，傾去上清；
(10)用0.5mL預冷的PBS將PK-15細胞重新懸浮，混勻，400目尼龍網過濾，通過流式細胞術檢測多肽結合H(-15細胞與病毒阻斷情況，每組試驗樣品計數10000個細胞。參見表1、圖7 圖14。 表1流式細胞術結合和阻斷試驗數據分析(mean 士 SD)
結合試驗阻斷試驗Mean+ SD陽性細胞數(％)5139. 445. 2±0. 082**平均熒光強度23. 7720. 0721. 92±2. 616**
注“#”表示比較差異極顯著(P彡0.01)。表1中數值經T檢驗分析，P (0.0074)彡0.01，表明比較差異極顯著，說明CSFV 能夠阻斷SEM多肽結合冊-15細胞。圖7 圖10表明SE24結合冊-15細胞的陽性細胞數為51.0%，平均熒光強度為23. 77 ；無關多肽Biotin-BSA結合冊_15細胞的陽性細胞數為14. 7%，平均熒光強度為 17. 58。說明SEM多肽能夠結合H(-15細胞，而陰性對照無關多肽BSA不能與H(-15細胞
社a
？口口。圖11和圖12中CSFV阻斷SEM結合冊_15試驗結果顯示經CSFV阻斷后SEM 結合H(-15細胞的陽性細胞數為39. 4%，平均熒光強度為20. 70，與SEM結合H(-15細胞試驗結果相比，陽性細胞數降低了 11. 6%，平均熒光強度降低了 3. 07。圖13和圖14表明SEM多肽能與H(-15細胞結合，CSFV可以阻斷SEM結合H(-15 細胞，且CSFV和多肽在與H(-15細胞的結合位點上具有競爭性，并說明SEM多肽是CSFV 上的關鍵位點。圖13 圖14中，1 =Biotin-BSA無關多肽對照曲線；2 :Boitin_SEM多肽結合 H(-15細胞曲線；3 :CSFV阻斷SEM多肽結合H(-15細胞曲線。實施例4、細胞免疫化學染色鑒定SEM多肽抑制CSFV感染PK-15細胞的試驗
(1)培養(yǎng)冊-15細胞，37°CCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞鋪滿96孔細胞培養(yǎng)板；
(2)加多肽，傾去培養(yǎng)上清，用預冷的PBS洗滌細胞一次，在96孔細胞培養(yǎng)板上依次加入濃度從 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 00625mmol/L 的多肽SE24，100 μ L/孔，每個濃度做3個重復，稀釋液為10% DMEM，設3孔BSA作為無關多肽對照和3孔空白對照，37 °C作用Ih ；
(3)傾去含有多肽的上清，加病毒，每孔加入10XTCID50CSFV感染細胞，100 μ L/孔，其中其中空白對照只加細胞維持液，37°C作用Ih;
(4)用新鮮10%DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，加入5% DMEM維持培養(yǎng)基，100 μ L/孔，37°C 繼續(xù)培養(yǎng)M 48 h ；
(5)細胞免疫化學染色，統(tǒng)計感染的細胞數量，分析試驗結果，方法如下
a.傾去細胞培養(yǎng)上清，PBST洗滌3次，每次孵育3min ；
b.固定，用0.3%H2O2甲醛溶液固定，5(^17孔，41固定101^11，PBST洗滌3次，每次孵育:3min ；
c.封閉，用10%脫脂奶粉封閉，200μ L/孔，37°C封閉lh，PBST洗滌3次，每次孵育 3min ；
d.加一抗，加入兔抗CSFV高免血清(1:200倍稀釋)，稀釋液為PBS溶液，50 μ L/孔， 37°C作用30min，PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；
e.加二抗，加入HRP-山羊抗兔IgGC1 40倍稀釋)，稀釋液為10%脫脂奶粉，50 μ L/孔， 37°C作用Ih，PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；
f.AEC試劑盒顯色，根據試劑盒的說明書，取A、B和C液各一滴于ImL雙蒸水中，充分混合，以防結晶出現，50 μ L/孔，10 min作用在顯微鏡下觀察結果。參見表2、圖15 圖 23。 表2不同濃度的SEM多肽抑制CSFV感染PK-15細胞的感染率
權利要求
1.豬瘟病毒CSFVE2蛋白配體表位多肽，其特征是所述表位多肽的氨基酸序列為VH ASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYFo
2.權利要求1所述的CSFVE2蛋白配體表位多肽為線性配體結合表位。
3.權利要求1所述的CSFVE2蛋白配體表位多肽，其特征是用Sulfo-NHS-Biotin標記的多肽SEM與豬腎細胞PK-15細胞結合時，二者摩爾比為1 1 1 :4，多肽SEM的濃度為 0.025 0. 2mmol/L0
4.權利要求3所述的CSFVE2蛋白配體表位多肽，其特征是所述多肽完全抑制CSFV 感染H(-15靶細胞時的多肽濃度為0. 2mmol/L。
5.利用權利要求1所述的CSFVE2蛋白配體表位多肽鑒定該多肽與H(-15細胞結合效率的方法，其特征是該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)冊-15細胞，于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，直至細胞鋪滿96孔的細胞培養(yǎng)板；(2)傾去培養(yǎng)上清液，將培養(yǎng)好的單層細胞用預冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上分別依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L 和 0. 025mmol/L 的 Biotin 標記的多月太 Biotin-SE24，100 μ L/孔，每個濃度重復做3次，4°C孵育Ih,同時設6孔不加Biotin標記的多肽Biotin-SE24的正常細胞做對照實驗，用Biotin標記的BSA做無關多肽對照實驗；(3)洗滌，用預冷的PBS洗滌細胞3次，洗去未結合的多肽，中止多肽結合試驗；(4)固定，加入0.3%的H2A甲醇溶液5(^17孔，41固定101^11，傾去上清液，用？85丁洗滌3次；(5)封閉，加入含10%脫脂奶粉的PBST緩沖液，200μ L/孔，在37°C封閉lh，傾去上清液，用PBST洗滌3次；(6)加入Avidin-HRP和HRP的標記抗生物素蛋白，50μ L/孔，用含10%脫脂奶粉的PBST 緩沖液進行1:500的稀釋，在37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；(7)用AEC顯色試劑盒顯色，根據試劑盒的說明操作，在顯微鏡下觀察試驗結果，并記錄染色細胞數目。
6.利用權利要求1所述的CSFVE2蛋白配體表位多肽鑒定該多肽抑制CSFV感染H(-15 靶細胞的方法，其特征是該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)冊-15細胞，于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，直至冊-15細胞鋪滿96孔細胞培養(yǎng)板；(2)加多肽SE24，傾去培養(yǎng)上清液，用預冷的PBS洗滌細胞一次，在96孔細胞培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L、0. 0125mmol/L、 0. 00625mmol/L的多肽SE24，100 μ L/孔，每個濃度重復做3次，稀釋液為10%的DMEM，設3 孔BSA作為無關多肽對照和3孔空白對照，37°C作用Ih ；(3)傾去含有多肽的上清液，加病毒CSFV，每孔加入10倍的TCID50CSFV感染細胞， IOOyL/孔，其中空白對照只加細胞維持液，37°C作用Ih ；(4)用10%的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，加入5%的DMEM維持培養(yǎng)基，100μ L/孔，37°C 繼續(xù)培養(yǎng)M 48 h ；(5)細胞免疫化學染色，統(tǒng)計感染細胞數量，并分析試驗結果。
7.權利要求6所述的方法，其特征是所述細胞免疫化學染色的步驟為a.洗滌，傾去細胞培養(yǎng)上清液，用PBST洗滌3次，每次孵育3min ；b.固定，用含0.3%H2O2的甲醛溶液固定，50yL/孔，4°C固定lOmin，用PBST洗滌3次， 每次孵育3min ；c.封閉，用10%的脫脂奶粉封閉，200μ L/孔，37°C封閉lh，用PBST洗滌3次，每次孵育 3min ；d.加一抗，加入1:200倍稀釋的兔抗CSFV高免血清，稀釋液為PBS溶液，50 μ L/孔， 37°C作用30min，用PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；e.加二抗，加入1:40倍稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，稀釋液為10%的脫脂奶粉，50μ L/ 孔，37 °C作用Ih，用PBST洗滌3次，每次孵育3 min ；f.AEC顯色試劑盒顯色，根據試劑盒說明操作，在顯微鏡下觀察實驗結果，并記錄染色細胞數目。
8.權利要求1所述的CSFV E2蛋白配體表位多肽在抑制CSFV感染PK-15細胞中的應
全文摘要
本發(fā)明涉及豬瘟病毒CSFVE2蛋白配體表位多肽及其應用，多肽氨基酸序列為VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF，其分子量為5.73kDa；并以PK-15細胞為靶細胞，通過CSFV的感染、收獲，測定了CSFV的TCID50和感染比，進行合成多肽與靶細胞的結合試驗、病毒阻斷試驗和多肽阻斷CSFV感染靶細胞的試驗，篩選的特異性結合靶細胞能夠抑制病毒感染配體表位多肽，對CSFV的配體表位進行了精確定位。本發(fā)明的多肽SE24能夠抑制CSFV感染PK-15細胞，隨著多肽濃度的增加PK-15細胞的感染率降低，當多肽濃度為0.2mmol/L時能夠完全抑制CSFV感染PK-15靶細胞。本發(fā)明為進一步從病毒配體和病毒受體相互作用方面進行病毒配體表位的研究提供了理論依據。
文檔編號C07K14/18GK102268079SQ20111011265
公開日2011年12月7日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權日2011年5月3日
發(fā)明者孫國鵬, 寧紅梅, 岳鋒, 張艷芳, 朱艷平, 李鵬, 王選年, 賈文科, 銀梅 申請人:新鄉(xiāng)學院