專利名稱：β-內(nèi)酰胺酶抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種活性多肽，特別涉及一種具有β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的多肽，還涉及該多肽在制藥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌對(duì)β -內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的機(jī)制有多種，其中β -內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是最重要和最常見(jiàn)的機(jī)制，其通過(guò)與內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基共價(jià)結(jié)合，水解酰胺鍵而使內(nèi)酰胺類抗生素失活。近年來(lái)，隨著超廣譜內(nèi)酰胺類抗生素的大量應(yīng)用，內(nèi)酰胺酶的種類、底物譜及耐藥程度以驚人的速度發(fā)展，已經(jīng)使細(xì)菌對(duì)氨曲南、絕大多數(shù)第三代頭孢菌素甚至第四代頭孢菌素耐藥。解決上述問(wèn)題的主要方法之一是開(kāi)發(fā)內(nèi)酰胺酶抑制劑。目前臨床廣泛應(yīng)用的內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦和三唑巴坦等，它們通過(guò)抑制 β-內(nèi)酰胺酶的活性而達(dá)到保護(hù)β-內(nèi)酰胺類抗生素的目的。但隨著這些β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的廣泛應(yīng)用，對(duì)這些內(nèi)酰胺酶抑制劑耐藥的產(chǎn)酶菌也逐漸增加。因此，開(kāi)發(fā)新型、 高效的其它β-內(nèi)酰胺酶抑制劑很有必要。β -內(nèi)酰胺酶抑制蛋白(β -lactamase inhibitory protein, BLIP)是 1990 年從土壤棒狀鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到的主要蛋白質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道，BLIP的2個(gè)折疊區(qū)域能夠插入β -內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)中，阻止β -內(nèi)酰胺酶與β -內(nèi)酰胺類抗生素的接合。雖然 BLIP由165個(gè)氨基酸組成，分子量較大，抗原性較強(qiáng)，不適合開(kāi)發(fā)成為臨床使用的藥物，但其為β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的研究和開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。申請(qǐng)?zhí)枮?00410084577. 1的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種能夠抑制內(nèi)酰胺酶的多肽。該多肽由M個(gè)氨基酸組成，推測(cè)分子量為沈00道爾頓，雖然與BLIP相比在分子量、抗原性方面具有一定優(yōu)勢(shì)，但仍然存在分子量較大及潛在的抗原性等問(wèn)題；同時(shí)該多肽采用大腸桿菌表達(dá)制備，工藝復(fù)雜，周期長(zhǎng)，耗資大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。李勇湧等(β_內(nèi)酰胺酶抑制肽的活性研究.中國(guó)抗生素雜志， 2010, 35(4) 300-304)通過(guò)計(jì)算機(jī)分子三維模擬設(shè)計(jì)并合成了 6個(gè)β -內(nèi)酰胺酶抑制肽 (各抑制肽的氨基酸序列未公開(kāi))，但在鑒定活性的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，抑制肽②和⑤無(wú)法溶解，抑制肽④在保存過(guò)程中大部分已降解，剩下的3個(gè)抑制肽雖然具有β-內(nèi)酰胺酶抑制活性，但活性均較弱。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種β-內(nèi)酰胺酶抑制肽，具有較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制活性，且分子量小，不易產(chǎn)生抗原性，適合大規(guī)模生產(chǎn)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案內(nèi)酰胺酶抑制肽，其氨基酸序列 Thr-Thr-Trp-Ser-Glu-Tyr-Tyr-Pro-Ala-Tyr (TTffSEYYPAY, SEQ ID No. 1)所示。本發(fā)明通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了 BLIP與β -內(nèi)酰胺酶接合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，綜合考慮肽鏈長(zhǎng)度、特定氨基酸殘基的位置、等電點(diǎn)及親水性等幾方面，采用計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)設(shè)計(jì)了一系列可能與內(nèi)酰胺酶具有較好構(gòu)效關(guān)系的短肽，通過(guò)固相多肽合成法制得了這些短肽并對(duì)其進(jìn)行了內(nèi)酰胺酶抑制活性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些短肽中，氨基酸序列為T(mén)TWSEYYPAY的短肽具有較強(qiáng)的β -內(nèi)酰胺酶抑制活性，能夠明顯抑制β -內(nèi)酰胺酶降解氨芐西林的速率，明顯提高頭孢噻肟對(duì)產(chǎn)內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的抗菌活性，且分子量小、不易產(chǎn)生抗原性，可通過(guò)固相多肽合成法制備，簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。鑒于上述短肽具有較強(qiáng)的β -內(nèi)酰胺酶抑制活性，本發(fā)明進(jìn)一步提供如下技術(shù)方案氨基酸序列為T(mén)TWSEYYPAY的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽在制備β -內(nèi)酰胺酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽可以單獨(dú)或與其它具有β -內(nèi)酰胺酶抑制活性的分子組成復(fù)方，再輔以藥學(xué)上可接受的載體，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制成內(nèi)酰胺酶抑制劑，與內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用，通過(guò)抑制內(nèi)酰胺酶的活性來(lái)提高內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)產(chǎn)酶耐藥致病菌株的療效，降低內(nèi)酰胺類抗生素的用量，減少毒副作用的發(fā)生。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種內(nèi)酰胺酶抑制肽，具有較強(qiáng)的 β -內(nèi)酰胺酶抑制活性，且僅由10個(gè)氨基酸組成，分子量小、不易產(chǎn)生抗原性；可通過(guò)固相多肽合成法制備，簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；可用于制備β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能提高β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌療效，在細(xì)菌感染治療領(lǐng)域具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為采用固相多肽合成法制備的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽的高效液相色譜圖。圖2為采用固相多肽合成法制備的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽的質(zhì)譜圖。圖3為β -內(nèi)酰胺酶抑制肽對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的抑制活性鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。除另有說(shuō)明外，優(yōu)選實(shí)施例中使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的通用含義；優(yōu)選實(shí)施例中使用的氨基酸、氨基酸保護(hù)基團(tuán)及其它化合物的英文縮寫(xiě)為本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的通用縮寫(xiě)。一、固相多肽合成法制備β -內(nèi)酰胺酶抑制肽
本實(shí)施例采用Fmoc (9-芴甲氧羰基)法固相合成氨基酸序列為T(mén)TWSEYYPAY的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽。①稱取氨基酸樹(shù)脂F(xiàn)moc-Tyr-Wang Resin 1. 5mmol，置多肽合成反應(yīng)器中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的DBLK溶液(六氫吡啶的N，N- 二甲基甲酰胺溶液)，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)5分鐘， 排空溶液，重復(fù)上述操作一次，脫除氨基酸的Fmoc保護(hù)基；再用DMF (二甲基甲酰胺)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌洗滌氨基酸樹(shù)脂5次，DCM (二氯甲烷)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌洗滌氨基酸樹(shù)脂2 次；
②稱取保護(hù)氨基酸Fmoc-Ala-OH 1. 5mmol、HBTU [2-(1H-苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽]1. 5mmol和HOBT (1-羥基苯并三唑)1. 5mmol，置活化器中，加入體積比為1 1的DMF/DCM混合液，攪拌反應(yīng)，活化保護(hù)氨基酸的羧基；在步驟①所得氨基酸樹(shù)脂中加入上述羧基活化的保護(hù)氨基酸，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，排空溶液，用DMF在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌洗滌肽樹(shù)脂3次，除去多余的保護(hù)氨基酸；再向肽樹(shù)脂中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的 DBLK溶液，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)5分鐘，排空溶液，重復(fù)上述操作一次，脫除氨基酸的Fmoc保護(hù)基； 再用DMF在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌洗滌肽樹(shù)脂5次，DCM在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌洗滌肽樹(shù)脂2次；
③參照步驟②，按照β-內(nèi)酰胺酶抑制肽的氨基酸序列，依次用HBTU和HOBT活化各保護(hù)氨基酸的羧基，再將其偶聯(lián)至肽樹(shù)脂上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的DBLK溶液脫除氨基酸的 Fmoc保護(hù)基，再用DMF和DCM洗滌肽樹(shù)脂，使肽樹(shù)脂上的肽鏈從β _內(nèi)酰胺酶抑制肽的C-端逐個(gè)向N-端延伸，直至β-內(nèi)酰胺酶抑制肽合成完畢；用甲醇攪拌洗滌肽樹(shù)脂3次，排空溶液，真空干燥，獲得β -內(nèi)酰胺酶抑制肽樹(shù)脂；
④稱取β-內(nèi)酰胺酶抑制肽樹(shù)脂，置燒瓶中，按照10ml/g的用量加入裂解液(由三氟乙酸、三異丙基硅烷、水和酒石酸乙二胺按照體積比為91:3:3:3混合而成)，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，將內(nèi)酰胺酶抑制肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)同時(shí)去除各氨基酸殘基上的側(cè)鏈保護(hù)基，將反應(yīng)液用砂芯漏斗過(guò)濾，濾液加入10倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心分離，收集多肽，用冰乙醚洗滌2次，真空干燥，獲得β -內(nèi)酰胺酶抑制肽粗品；
⑤稱取內(nèi)酰胺酶抑制肽粗品，加入少量無(wú)熱原純化水，攪拌使充分溶解，用孔徑為0. 45 μ m的有機(jī)濾膜過(guò)濾，收集濾液，采用高效液相色譜法進(jìn)行純化(Waters 600E高效液相色譜儀，Kromasil 20 X 250mm C18 120A色譜柱，流動(dòng)相由體積分?jǐn)?shù)為0. 1%的三氟乙酸和乙腈按照體積比為50:50混合而成)，即得β -內(nèi)酰胺酶抑制肽純品，經(jīng)高效液相色譜法 (圖1)鑒定，其純度大于98% ；經(jīng)質(zhì)譜法(圖2)鑒定，其分子量與理論分子量一致。二、β -內(nèi)酰胺酶粗提液的制備及活性鑒定
挑取臨床分離并經(jīng)Nitrocefin ( β -內(nèi)酰胺酶特異性鑒定試劑)鑒定的產(chǎn)β -內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌單菌落，接種于5ml新鮮肉湯中，37°C孵育M小時(shí)，再吸取該培養(yǎng)液2ml 加入200ml新鮮肉湯中，37°C振蕩孵育M小時(shí)，4°C、5000 X g離心30分鐘，收集菌體，用 0. 05M、pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2次，再用該緩沖液5ml重懸菌體，冰水浴條件下超聲破碎菌體，4°C、20000Xg離心1小時(shí)，收集上清液，即得β -內(nèi)酰胺酶粗提液，經(jīng)蛋白定量后置-70°C冰箱中保存。向終濃度為10_4M的頭孢噻啶溶液3ml中加入β -內(nèi)酰胺酶粗提液30 μ 1，37°C混勻，立即用紫外分光光度計(jì)觀察單位時(shí)間內(nèi)波長(zhǎng)260nm處的吸收度(OD值)變化，從OD值開(kāi)始下降起，每隔一段時(shí)間記錄一次OD值，直至OD值不再變化或變化幅度明顯減??；以O(shè)D 值為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，計(jì)算時(shí)間-OD值回歸方程，選取相關(guān)系數(shù)γ >0.90的點(diǎn)，計(jì)算 AOD即兩個(gè)相鄰時(shí)間的OD值之差的均值，再按照下式計(jì)算β -內(nèi)酰胺酶的活性β -內(nèi)酰胺酶活性(U) = AODXIOXI分鐘內(nèi)記錄OD值的次數(shù)χ iooo/水解前的OD值χ蛋白定量 (mg/ml)。結(jié)果顯示，本實(shí)施例制得的β -內(nèi)酰胺酶粗提液中含有465U的β -內(nèi)酰胺酶。三、β -內(nèi)酰胺酶抑制肽對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的抑制活性測(cè)定
試驗(yàn)分為3組①氨芐西林+酶組向濃度為0. 4mg/ml的氨芐西林溶液2ml中加入 β -內(nèi)酰胺酶粗提液40 μ 1和水8ml ；②氨芐西林+酶+抑制肽組向濃度為0. 4mg/ml的氨芐西林溶液2ml中加入β -內(nèi)酰胺酶粗提液40 μ 1和濃度為0. lmg/ml的β -內(nèi)酰胺酶抑制肽溶液8ml ；③氨芐西林組向濃度為0. 4mg/ml的氨芐西林溶液2ml中加入0. 05M、pH7. O 的磷酸鹽緩沖液40 μ 1和水8ml ；各組于37°C混勻，立即用紫外分光光度計(jì)觀察單位時(shí)間內(nèi)波長(zhǎng)235nm處的OD值變化，通過(guò)氨芐西林降解速率的快慢，考察β-內(nèi)酰胺酶以及β-內(nèi)酰胺酶抑制肽對(duì)氨芐西林降解的影響。結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)③組的吸收度在400秒內(nèi)幾乎沒(méi)有變化；①組的吸收度下降最快，表明內(nèi)酰胺酶能夠催化降解氨芐西林；②組的吸收度下降速率較①組明顯減慢，表明內(nèi)酰胺酶抑制肽能夠明顯抑制內(nèi)酰胺酶對(duì)氨芐西林的降解作用。四、β -內(nèi)酰胺酶抑制肽對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的抑制方式和抑制常數(shù)測(cè)定
將終濃度為ι μ M的克拉維酸或β -內(nèi)酰胺酶抑制肽分別與終濃度為50 μ Μ、100 μ M的頭孢噻啶在ΡΗ7. 0、37°C條件下平衡后，加入β -內(nèi)酰胺酶粗提液30 μ 1，在波長(zhǎng)260nm處測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，采用Lineweaver-Burk(L-B)作圖法求出抑制劑(克拉維酸或β -內(nèi)酰胺酶抑制肽)加入前后酶水解頭孢噻啶的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度，判斷抑制劑的抑酶方式。將終濃度為0、0. 1、1.0、10μΜ的克拉維酸或β -內(nèi)酰胺酶抑制肽分別與終濃度為5(^11、10(^11的頭孢噻啶在？!17.0、371條件下平衡后，加入一定量的β -內(nèi)酰胺酶粗提液，在波長(zhǎng)沈0 nm處測(cè)定酶反應(yīng)的初速度，采用Dixon作圖法求取抑制劑(克拉維酸或 β -內(nèi)酰胺酶抑制肽)對(duì)酶水解頭孢噻啶的抑制常數(shù)Mi值越大說(shuō)明抑制效率越低。結(jié)果如表1所示，可見(jiàn)克拉維酸或β -內(nèi)酰胺酶抑制肽加入前后，酶水解頭孢噻啶的最大反應(yīng)速度沒(méi)有明顯變化，符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，說(shuō)明克拉維酸和內(nèi)酰胺酶抑制肽均為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑；β -內(nèi)酰胺酶抑制肽的Λ 為0. 01，克拉維酸的Λ 為 0. 19，說(shuō)明內(nèi)酰胺酶抑制肽比克拉維酸具有更強(qiáng)的內(nèi)酰胺酶抑制活性。表1 β -內(nèi)酰胺酶抑制肽對(duì)β -內(nèi)酰胺酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)
權(quán)利要求
1.β -內(nèi)酰胺酶抑制肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的β-內(nèi)酰胺酶抑制肽在制備β -內(nèi)酰胺酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的β-內(nèi)酰胺酶抑制肽，該抑制肽具有較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶抑制活性，且僅由10個(gè)氨基酸組成，分子量小、不易產(chǎn)生抗原性；可通過(guò)固相多肽合成法制備，簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；可用于制備β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用可提高其抗菌療效，在細(xì)菌感染治療領(lǐng)域具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102212110SQ20111011403
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者朱衛(wèi)民, 歐陽(yáng)凈, 陳勇川 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院