專利名稱：人臍帶間充質(zhì)干細胞表達人2.5Sβ-神經(jīng)生長因子及分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種用人臍帶間充質(zhì)干細胞(HUMSC)表達人2. 5S β -神經(jīng)生長因子(2. 5S β -NGF)及分離純化的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。NGF包含α、 β、Y三個亞單位，活性區(qū)是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體。NGF在人體內(nèi)主要分布于腦、神經(jīng)節(jié)、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織及成纖維細胞、平滑肌、骨骼肌、膠質(zhì)細胞、雪旺氏細胞等。NGF與受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制產(chǎn)生內(nèi)在化，形成由軸膜包繞、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，經(jīng)軸突沿微管逆行轉(zhuǎn)運至胞體，經(jīng)酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇鈣、內(nèi)源性環(huán)腺苷酸等第二信使體系的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，對靶細胞的某些結(jié)構(gòu)或功能蛋白基因表達進行調(diào)控而發(fā)揮其生物效應(yīng)。大鼠體內(nèi)試驗結(jié)果表明神經(jīng)生長因子可改善由己二酮和丙烯酰胺造成的大鼠中毒性周圍神經(jīng)病所致的肢體運動功能障礙，縮短神經(jīng)_肌肉動作電位潛伏期，并提高神經(jīng)-肌肉動作電位幅度。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，神經(jīng)生長因子有減輕動物脛神經(jīng)的髓鞘腫脹發(fā)生率和降低變性脛神經(jīng)纖維數(shù)量等作用。以上結(jié)果提示神經(jīng)生長因子可能有促進神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。目前，生產(chǎn)2. 5Si3-NGF的方法主要從小鼠頌下腺提取，還沒見到利用HUMSC表達的報道。利用HUMSC細胞表達2. 5S β -NGF是新一代NGF表達系統(tǒng)，它克服了傳統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)不能進行翻譯后的修飾活性低等缺點。利用基因重組技術(shù)表達人神經(jīng)生長因子的優(yōu)點是NGF的結(jié)構(gòu)和功能與人體天然的NGF結(jié)構(gòu)和功能完全一致，沒有免疫原性，具有半衰期較長，沒有鼠源性病毒交叉感染的安全隱患等優(yōu)點。在臨床上治療神經(jīng)損傷，促進損傷神經(jīng)恢復(fù)方面占有重要地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用HUMSC干細胞表達重組人2. 5S β NGF，采用等電點沉淀、CM-SepharosFF和SP-S^haroeHP層析三步聯(lián)用法分離純化法。人體臍帶間充質(zhì)干細胞表達人體2. 5S β -神經(jīng)生長因子及分離純化的方法，包括如下步驟1、HUMSC原代細胞的分離與培養(yǎng)；2、傳代擴增；3、凍存4,2. 5S β -NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴增；
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5、HUMSC的微載體擴增；6、2. 5S β -NGF 的分離純化。該方法的有益效果是具有比傳統(tǒng)親和層析、離子交換層析和疏水層析法具有分離規(guī)模大、產(chǎn)品純度高、活性高和收率高等優(yōu)點。
具體實施例方式實施例1一、HUMSC原代細胞的分離與培養(yǎng)1、取破宮產(chǎn)無菌臍帶20cm，置無菌生理鹽水瓶中，4°C保存。2、生物安全柜中清洗臍帶血漬，將臍帶剪成5cm片段，剔除血管，PBS洗滌2次。3、將8cm長的臍帶轉(zhuǎn)移到IOcm的培養(yǎng)皿中，加入青霉素和鏈霉素，濃度分別為100 單位/ml和100微克/ml。4、將臍帶剪成IOmm3小塊，加入10% I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化，工作濃度為 0. 1% (含3mM的CaCl2,)，混勻，37°C消化4小時。5,STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)消化液用200目過濾，細胞懸液300G離心5分鐘，收集細胞，接種于25T細胞瓶培養(yǎng)，溫度37°C，飽和濕度，5% C02。6、3天后換液，除去未貼壁細胞，繼續(xù)用STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)。二、傳代擴增1、原代細胞培養(yǎng)12天后，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞達到80 %生長面積，集落生長達到95 %融合可進行傳代，Pl代后90%融合后可傳代。2、棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，0. 5%胰蛋白酶-EDTA消化40秒。3、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，離心收獲細胞，STEMPRO MSCSFM分瓶培養(yǎng)傳代。三、凍存1、取對數(shù)生長期的HUMSC加10% DMSO和FBS于凍存管按凍存曲線在程控降溫儀中降溫，降溫結(jié)束后置液氮中保存。四、2. 5S β -NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴增1、將帶有(1)2. 5S β-NGF 基因、(beta 亞基)；(2) EGFP (enhanced green fluorescent protein)基因和(3) Neo (R)基因(新霉素抗性基因)的慢病毒載體 LV(multigenic lentivira lvector,LV)導(dǎo)入HUMSC干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)篩選、鑒定后再誘導(dǎo)分化。在二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和細胞因子等誘導(dǎo)下，HUMSC可向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。將HUMSCs在STEMPROMSC SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入神經(jīng)條件培養(yǎng)基NCM中誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞，進一步誘導(dǎo)，最后可得到12. 7%的酪氨酸羥化酶TH陽性神經(jīng)細胞，該細胞能分泌出多巴胺。并表達成熟神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白、可穩(wěn)定的表達2. 5S β -NGF,生物活性可達到180萬AU/mgNGF，還可分泌如粒細胞集落刺激因子(G-SCF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。五、HUMSC的Cytoline 1微載體培養(yǎng)1、小規(guī)模一次性生物反應(yīng)器Cytoline 1微載體培養(yǎng)將誘導(dǎo)分化的細胞和微體進行小規(guī)模培養(yǎng)，Cytoline 1微載體濃度為5克/L，待細胞濃度達到2 X IO6后轉(zhuǎn)入大規(guī)模培養(yǎng)。2、大規(guī)模一次性生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)將小規(guī)模培養(yǎng)的細胞換液，調(diào)整細胞密度至5X 105cellS/ml，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基和微載體，加入組合細胞因子SCF 15ng/ ml, FL 5ng/ml, TPO 6ng/ml]，IL-3 15ng/l 1]，G-CSFlng/mg GM-CSF 5ng/ml，接種至生物反應(yīng)器中，37°C、5% CO2,20% O2、飽和濕度條件下共同養(yǎng)12天；規(guī)模為每批5L，收獲細胞總數(shù)約為5 X IO13個細胞。六、2. 5S β -NGF的分離純化1、等電點沉淀；采用離心法將培養(yǎng)基和細胞分離，將培養(yǎng)基Ph調(diào)至9. 1，攪勻，室溫靜置2小時，離心分離沉淀，備用。2、CM-SepharosFF 和 SP-S印haroeHP 層析分離CM-S印harosFF用2_3倍柱床體積的PH6. 8,0. 02MPB平衡，離心分離沉淀液經(jīng)透析平衡后加入層析柱，流速50ml/h. cm2, s收集流出液，4°C酸化處理。再經(jīng)SP-S印haroeHP層析，溫度4°C，離子交換層析分離純化2. 5Si3NGF，一次可分離IOL以上，可獲得1 OmgNGF，生物活性達到150萬AU/mg，分子量14，OOODa，等電點為9. 1。生物活性鑒定表明純化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表達的100多倍。該方法分離純化的2. 5S β-NGF能促進雞胚和新生小鼠背根節(jié)細胞在體外的存活、生長和分化。實施例2一、HUMSC原代細胞的分離與培養(yǎng)1、取破宮產(chǎn)無菌臍帶30cm，置無菌生理鹽水瓶中，5°C保存。生物安全柜中清洗臍帶血漬，將臍帶剪成6cm片段，剔除血管，PBS洗滌3次。2、將IOcm長的臍帶轉(zhuǎn)移到IOcm的培養(yǎng)皿中，加入青霉素和鏈霉素，濃度分別為 100單位/ml和100微克/ml。3、將臍帶剪成10mm3小塊，加入10% I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化，工作濃度為 0. 1% (含 3mM 的 CaCl2,)，混勻，37°C消化 4. 5 小時。4,STEMPR0 MSC SFM培養(yǎng)消化液用200目過濾，細胞懸液300G離心5分鐘，收集細胞，接種于25T細胞瓶培養(yǎng)，溫度37°C，飽和濕度，5% CO2.5、3天后換液，除去未貼壁細胞，繼續(xù)用STEMPR0 MSC SFM培養(yǎng)。二、傳代擴增1、原代細胞培養(yǎng)13天后，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞達到85 %生長面積，集落生長達到95 %融合可進行傳代，Pl代后90%融合后可傳代。2、棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，0. 5%胰蛋白酶-EDTA消化55秒。3、STEMPR0 MSC SFM中和胰蛋白酶，離心收獲細胞，STEMPR0 MSCSFM分瓶培養(yǎng)傳代。三、凍存1、取對數(shù)生長期的HUMSC加10% DMSO和FBS于凍存管按凍存曲線在程控降溫儀中降溫，降溫結(jié)束后置液氮中保存。四、2. 5S β -NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴增1、將帶有(1)2. 5S β-NGF 基因、(beta 亞基)；(2) EGFP (enhanced green
5fluorescent protein)基因和(3) Neo (R)基因(新霉素抗性基因).的慢病毒載體 LV(multigenic lentiviralvecto r，LV)導(dǎo)入HUMSC干細胞干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)篩選、鑒定后再誘導(dǎo)分化。在二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和細胞因子等誘導(dǎo)下，HUMSC可向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。將HUMSCs在DMEM培養(yǎng)，加入神經(jīng)條件培養(yǎng)基NCM中誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞，進一步誘導(dǎo)，最后可得到12. 7%的酪氨酸羥化酶TH陽性神經(jīng)細胞，該細胞能分泌出多巴胺。并表達成熟神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白、可穩(wěn)定的表達2. 5S β -NGF,生物活性可達到180萬 AU/mgNGF，還可分泌如粒細胞集落刺激因子(G-SCF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF) 和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。五、HUMSC的擴增1、一次性生物反應(yīng)器小規(guī)模Cytoline 1微載體培養(yǎng)將誘導(dǎo)分化的細胞和微體進行小規(guī)模培養(yǎng)，微載體濃度為5克/L，待細胞濃度達到2 X IO6后轉(zhuǎn)入大規(guī)模培養(yǎng)。2、一次性生物反應(yīng)器大規(guī)模微載體培養(yǎng)將小規(guī)模培養(yǎng)的細胞換液，調(diào)整細胞密度至5X 105cellS/ml，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基和微載體，加入組合細胞因子SCF 15ng/ ml, FL 5ng/ml，TP0 6ng/ml]，IL_315ng/l 1]，G-CSFlng/mg GM-CSF 5ng/ml，接種至生物反應(yīng)器中，37°C、5% CO2,20% O2、飽和濕度條件下共同養(yǎng)12天；規(guī)模為每批5L，收獲細胞總數(shù)約為5 X IO13個細胞。六、2. 5S β -NGF的分離純化1、等電點沉淀；采用離心法將培養(yǎng)基和細胞分離，將培養(yǎng)基PH調(diào)至9. 1，攪勻，室溫靜置2小時，離心分離沉淀，備用。2、CM-SepharosFF 和 SP-S印haroeHP 層析分離CM-SepharosFF用2. 5倍柱床體積的PH6. 8，0. 02MPB平衡，離心分離培養(yǎng)上清液經(jīng)透析平衡后加入層析柱，流速50ml/h.cm2，s收集流出液，4°C酸化處理。再經(jīng) SP-SepharoeHP層析，溫度4°C，離子交換層析分離純化2. 5S β NGF, 一次可分離IOL以上，可獲得15mgNGF，生物活性達到140萬AU/mg，分子量14，000，等電點為9. 1。生物活性鑒定表明純化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表達的100多倍。該方法分離純化的2. 5S β-NGF 能促進雞胚和新生小鼠背根節(jié)細胞在體外的存活、生長和分化。實施例3一、HUMSC原代細胞的分離與培養(yǎng)1、取破宮產(chǎn)無菌臍帶40cm，置無菌生理鹽水瓶中，6°C保存。2、生物安全柜中清洗臍帶血漬，將臍帶剪成7cm片段，剔除血管，PBS洗滌4次。3、將12cm長的臍帶轉(zhuǎn)移到IOcm的培養(yǎng)皿中，加入青霉素和鏈霉素，濃度分別為 100單位/ml和100微克/ml。4、將臍帶剪成IOmm3小塊，加入10% I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化，工作濃度為 0. 1% (含3mM的CaCl2,)，混勻，37°C消化5小時。5,STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)消化液用200目過濾，細胞懸液300G離心5分鐘，收集細胞，接種于25T細胞瓶培養(yǎng)，溫度37°C，飽和濕度，5% CO2.6、3天后換液，除去未貼壁細胞，繼續(xù)用STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)。二、傳代擴增
1、原代細胞培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞達到90 %生長面積，集落生長達到95 %融合可進行傳代，Pl代后90%融合后可傳代。2、棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，0. 5%胰蛋白酶-EDTA消化70秒。3、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，離心收獲細胞，STEMPRO MSCSFM分瓶培養(yǎng)傳代。三、凍存1、取對數(shù)生長期的HUMSC加10% DMSO和FBS于凍存管按凍存曲線在程控降溫儀中降溫，降溫結(jié)束后置液氮中保存。四、2. 5S β -NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴增1、將帶有(1)2. 5S β-NGF 基因、(beta 亞基)；(2) EGFP (enhanced green fluorescent protein)基因和(3) Neo (R)基因(新霉素抗性基因).的慢病毒載體 LV(multigenic lentiviralvecto r，LV)導(dǎo)入HUMSC干細胞干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)篩選、鑒定后再誘導(dǎo)分化。在二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和細胞因子等誘導(dǎo)下，HUMSC可向神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。將HUMSCs在STEMPRQMSC SFM培養(yǎng)，加入神經(jīng)條件培養(yǎng)基NCM 中誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞，進一步誘導(dǎo)，最后可得到12. 7%的酪氨酸羥化酶TH陽性神經(jīng)細胞，該細胞能分泌出多巴胺。并表達成熟神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白、可穩(wěn)定的表達2. 5Si3-NGF，生物活性可達到180萬AU/mgNGF，還可分泌如粒細胞集落刺激因子(G-SCF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等各種神經(jīng)營養(yǎng)因子。五、HUMSC的擴增1、一次性生物反應(yīng)器小規(guī)模Cytoline 1微載體培養(yǎng)將誘導(dǎo)分化的細胞和微體進行小規(guī)模培養(yǎng)，微載體濃度為5克/L，待細胞濃度達到2 X IO6后轉(zhuǎn)入大規(guī)模培養(yǎng)。2、一次性生物反應(yīng)器大規(guī)模Cytoline 1微載體培養(yǎng)將小規(guī)模培養(yǎng)的細胞換液， 調(diào)整細胞密度至5X105cellS/ml，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基和微載體，加入組合細胞因子 SCF 15ng/ml, FL 5ng/ml, TPO 6ng/ml]， IL_315ng/l 1]， G-CSFlng/mg GM-CSF 5ng/ml，接種至生物反應(yīng)器中，371、5%0)2、20%02、飽和濕度條件下共同養(yǎng)12天；規(guī)模為每批5L，收獲細胞總數(shù)約為5 X IO13個細胞。六、2. 5S β-NGF的分離純化1、等電點沉淀采用離心法將培養(yǎng)基和細胞分離，將培養(yǎng)基Ph調(diào)至9. 1，攪勻，室溫靜置2小時，離心分離沉淀，備用。2、CM-SepharosFF 和 SP-S印haroeHP 層析分離CM-S印harosFF用3倍柱床體積的PH6. 8,0. 02MPB平衡，離心分離培養(yǎng)上清液經(jīng)透析平衡后加入層析柱，流速50ml/h. cm2, s收集流出液，4°C酸化處理。再經(jīng)SP-S印haroeHP 層析，溫度4°C，離子交換層析分離純化2. 5Si3 NGF，一次可分離10L以上，可獲得20mgNGF， 生物活性達到160萬AU/mg，分子量14，000，等電點為9. 1。生物活性鑒定表明純化后每毫克蛋NGF的比活性是原核表達的100多倍。該方法分離純化的2. 5S β -NGF能促進雞胚和新生小鼠背根節(jié)細胞在體外的存活、生長和分化。本方法采用無血清培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)HUMSC干細胞并用該細胞表達人2. 5S β -NGF 并采用等電點沉淀、CM-SepharosFF和SP-S印haroeHP層析三步聯(lián)用技術(shù)分離純化
72. 5Si3 -NGF，產(chǎn)品純度達到98% (HPLC法)、相對分子質(zhì)量約為14000Da,收率達73.0%, 產(chǎn)品DNA殘留可降低到1. 5ng/mg以下，生物活性達到150萬AU單位/mg，(雞胚背根神經(jīng)節(jié)法)，比小鼠頌下腺高50%。與傳統(tǒng)大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)和親和層析分離技術(shù)比較，該表達分離純化系統(tǒng)可對蛋白質(zhì)進行翻譯后的折疊和糖基化，提高了 2. 5Si3-NGF的生物活性，利用等電點沉淀、CM-SepharosFF和SP-S印haroeHP層析三步聯(lián)用技術(shù)分離純化 2. 5Si3-NGF，具有收率高、規(guī)模大、純度高工藝穩(wěn)定等優(yōu)點，適合大規(guī)模生產(chǎn)。采用了無血清培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)攜帶有2. 5S β-NGF基因的HUMSC干細胞，蛋白表達量可達到l_20mg/L.蛋白質(zhì)可折疊和糖基化，使活性提高了 50%以上。 顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化和變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
權(quán)利要求
1.人臍帶間充質(zhì)干細胞表達人2.5S β -神經(jīng)生長因子及分離純化的方法，包括如下步驟1)、HUMSC原代細胞的分離與培養(yǎng)；2)、STEMPROMSC SFM無血清Cytoline 1微載體培養(yǎng)技術(shù)傳代培養(yǎng)；3)、細胞凍存；4)、2.5Si3 -NGF克隆、誘導(dǎo)分化與擴增；5)、HUMSC的Cytoline1微載體擴增； 7)、2. 5S β -NGF的分離純化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟一包括以下子步驟1)取破宮產(chǎn)無菌臍帶20-40cm，置于無菌生理鹽水瓶中，4-6°C保存；2)生物安全柜中清洗臍帶血漬，將臍帶剪成5-7cm片段，剔除血管，PBS洗滌2_4次；3)將8-12cm長的臍帶轉(zhuǎn)移到IOcm的培養(yǎng)皿中，加入青霉素和鏈霉素，濃度分別為100 單位/ml和100微克/ml ；4)將臍帶剪成IOmm3小塊，加入10%I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化，工作濃度為0. 1%, 混勻，37°C消化4-5h ；5)STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)消化液用200目過濾，細胞懸液300G離心5分鐘，收集細胞， 接種于25T細胞瓶培養(yǎng)，溫度37°C，飽和濕度，5% CO2 ；6)3天后換液，除去未貼壁細胞，繼續(xù)用STEMPRO MSC SFM培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟二包括以下子步驟1)、原代細胞培養(yǎng)12-14天后，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞達到80-90%生長面積，集落生長達到 95%融合可進行傳代，Pl代后90%融合后可傳代；2)、棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，0.5%胰蛋白酶-EDTA消化40-70秒；3)、STEMPROMSC SFM中和胰蛋白酶，離心收獲細胞，STEMPROMSC SFM分瓶培養(yǎng)傳代。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟三包括取對數(shù)生長期的HUMSC加10%DMSO和FBS 于凍存管按凍存曲線在程控降溫儀中降溫，降溫結(jié)束后置液氮中保存的步驟。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟五包括一次性生物反應(yīng)器小規(guī)模STEMPROMSC SFM培養(yǎng)基，Cytoline 1微載體培養(yǎng)和大規(guī)模微載體培養(yǎng)的步驟。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟六包括等電點沉淀以及CM-S印harosFF和 SP-SepharoeHP層析分離的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種STEMPRO MSC SFM無血清Cytoline1微載體培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(HUMSC)表達重組人2.5SβNGF和分離純化人2.5SβNGF的新方法。該方法采HUMSC表達系統(tǒng)表達2.5S-βNGF，采用等電點沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP層析三步聯(lián)用法分離純化。該方法與從小鼠頜下腺提取NGF或大腸桿菌表達系統(tǒng)表達NGF利用親和層析、離子交換層析和疏水層析技術(shù)分離相比，具有生產(chǎn)規(guī)模大、產(chǎn)品純度高、產(chǎn)品生物活性高和收率高、可避免異源性蛋白的污染等優(yōu)點。
文檔編號C07K1/36GK102220338SQ20111011640
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者周波, 夏臘菊, 楊國成, 楊媛 申請人:武漢北度生物科技有限公司