專(zhuān)利名稱(chēng)：一組陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及ー組具有廣譜抗菌活性的陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從青霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，抗生素一直是人類(lèi)治療病原微生物感染的有力武器，但隨著傳統(tǒng)抗生素的濫用，越來(lái)越多的病原菌開(kāi)始對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性，所以急需尋找一類(lèi)全新的抗菌藥物來(lái)替代抗生素進(jìn)行使用。陽(yáng)離子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides)是植物和動(dòng)物產(chǎn)生的一般由12-50個(gè)氨基酸殘基組成的陽(yáng)離子型(富含精氨酸及賴(lài)氨酸)多肽，能夠保護(hù)宿主不受外界病原微生物感染。陽(yáng)離子抗菌肽的抗菌譜比傳統(tǒng)抗生素寬，來(lái)自昆蟲(chóng)、豬、蛙以及人的陽(yáng)離 子抗菌肽不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌有抗菌作用，而且還具有抗真菌及抗病毒活性。傳統(tǒng)抗生素通過(guò)消除微生物生長(zhǎng)或生存必不可少的條件，如使酶變性，來(lái)達(dá)到殺菌的目的，但細(xì)菌只要ー種基因突變后就可以抵抗此類(lèi)抗生素的攻擊。而陽(yáng)離子抗菌肽則通過(guò)中和電荷的方法與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，以此穿透殺死細(xì)菌，極大地減少了細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能。但天然的陽(yáng)離子抗菌肽并非完美無(wú)缺，部分抗菌肽對(duì)真核生物有一定的毒性，對(duì)病原物高殺滅活性的同時(shí)往往伴隨著對(duì)真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性并最大程度降低其毒性是目前抗菌肽藥物開(kāi)發(fā)的難點(diǎn)和希望所在。目前的研究主要將a-螺旋的兩性抗菌肽作為研究對(duì)象，圍繞陽(yáng)離子氨基酸以及疏水性氨基酸數(shù)量及位置，對(duì)抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，如殘基替換、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽鏈的正電荷含量等，取得了較大進(jìn)展。Yanga等研究了富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽Tritrpticin,他們將抗菌肽氨基酸序列中精氨酸替換為賴(lài)氨酸，發(fā)現(xiàn)雖然兩者的構(gòu)象沒(méi)有顯著的差別，但替換后的抗菌肽活性提高了 2倍而且溶血活性大大降低。Shin等將CecropinA的N端8個(gè)殘基作頭，Magainin2的N端12個(gè)殘基作尾，合成得到了雜合鏈CecropinA (I 8) _magainin2 (I 12)(縮寫(xiě)CE-MA)，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，且沒(méi)有溶血性。Fernandez等通過(guò)交替D和L型氨基酸,合成了一系列含有偶數(shù)殘基的短肽。通過(guò)抑菌(S. aureus和E. coli)試驗(yàn)，得到僅有8個(gè)殘基的a螺旋肽鏈(KQQRWLWLW)具有強(qiáng)抑菌作用。Subbalakshmi等人工合成了 Melittin的C端15個(gè)氨基酸殘基(MCF) ,MCF包含了 Melittin的大部分兩親片段，而且抗菌活性比Melittin高5 7倍，而溶血活性低300倍。Ahn等截取并不具抗菌活性的Tenecinl的螺旋區(qū)域，用Lys替代其中的Asp和His得衍生肽L4，正電荷數(shù)由2增至5，使L4展示出很強(qiáng)的抗菌活性，且無(wú)溶血性。美國(guó)專(zhuān)利US006040291A 設(shè)計(jì)了序列為(或包含)Lys-Xal-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Xa2-Phe-Ile-Xaa-Xa2-Phe-Leu-Arg-Xa2-Leu-Val 的一系列陽(yáng)離子抗菌妝，其中 Xal 代表疏水性氨基酸殘基，Xa2代表親水性氨基酸殘基，Xaa代表任意氨基酸殘基。體內(nèi)外試驗(yàn)表明，此系列抗菌肽具有較高的抗菌活性。
美國(guó)專(zhuān)利US20050277589A1公布了一組序列為(KLAKLAK)n ( P xx P )m的抗菌肽序列，其中0代表堿性氨基酸殘基，X代表任意氨基酸殘基，PxxP為4-15個(gè)氨基酸殘基組成的帶正電荷的序列。m和n代表1-5之間的任一數(shù)值。體外實(shí)驗(yàn)表明，該系列化合物具有廣譜抗菌活性。中國(guó)專(zhuān)利CN 101319007A設(shè)計(jì)的一條序列為將牛乳鐵蛋白LfcinB15中第4位的精氨酸和第10位的甲硫氨酸替換為色氨酸，新抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制活性。中國(guó)專(zhuān)利CN 1363558A公布了一組蛙皮抗菌肽素的衍生物及其適合于藥用的鹽，其序列 Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Phe-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-X-Asn-Y-OH,其中,X為選自Met、Ile或Leu的氨基酸殘基，Y為選自Ser、Lys> lie、Arg、Leu的兩個(gè)氨基酸殘基的組合。研究表明，此衍生物和天然蛙皮抗菌肽的活性相當(dāng)，但安全性更優(yōu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一組多肽，其氨基酸序列為X-(C)m- n-His-X，其中X為Cys或缺失，當(dāng)X為Cys時(shí)，該肽可以形成環(huán)肽；(為L(zhǎng)eu、lie、Nle、Val、Trp, Phe, D-Phe或Thi ；B為L(zhǎng)ys、D-Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ;m 與 n 為 6-8 中的任一值。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案X優(yōu)選以缺失的形式存在；C優(yōu)選Phe、Leu或Trp，m=6 ；B 優(yōu)選 Lys 或 Arg, n = 7。 作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案X優(yōu)選以缺失的形式存在；C選自Phe、Leu*Trp，m 為 6 ; (B)n 為 Lys-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys。本發(fā)明所涉及的氨基酸殘基既包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本發(fā)明所涉及的天然氨基酸所對(duì)應(yīng)的三字母代碼表如表I所示，本發(fā)明所涉及的非天然氨基酸所對(duì)應(yīng)的三字母代碼表及結(jié)構(gòu)如表2所示。本發(fā)明所涉及的所有氨基酸殘基若不特別限定其構(gòu)型，代表L型氨基酸。本發(fā)明所涉及的多肽為線(xiàn)性肽時(shí)，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，優(yōu)選以酰胺的形式存在。表I :天然氨基酸三字母代碼表
權(quán)利要求
1.多肽或其藥用鹽，所述多肽通式為x-(C)m- n-HiS-X其中X為Cys或缺失；C 為 Leu、Ile、Nle、Val、Trp、Phe、D-Phe 或 Thi ；B 為 Lys、D-Lys、Arg、D-Arg 或 HoR ；m與n為6-8中的任一值。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于多肽為線(xiàn)性肽或環(huán)肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的線(xiàn)性肽，其特征在于多肽C末端為羧酸的形式或酰胺的形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)肽，其特征在于X為Cys且形成分子間二硫鍵。
5.權(quán)利要求3所述線(xiàn)性肽的制備方法，步驟為 (1)在樹(shù)脂上固相合成多肽； (2)將步驟(I)的產(chǎn)物在三氟乙酸或氫氟酸中進(jìn)行裂解，加入側(cè)鏈保護(hù)基清除劑；并與5-20倍體積比的冰乙醚混合，沉淀多肽，離心，干燥得到粗肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(I)是在液相環(huán)境中進(jìn)行，具體包括浸泡樹(shù)脂-脫除氨基保護(hù)基-洗滌-偶聯(lián)氨基酸-監(jiān)測(cè)-洗滌-脫除氨基保護(hù)基(順序連接其余氨基酸)-干燥樹(shù)脂。
7.權(quán)利要求3所述線(xiàn)性肽的純化方法，其特征在于采用反相色譜法或離子交換色譜法。
8.權(quán)利要求4所述環(huán)肽的制備方法，步驟為 (1)制備線(xiàn)性肽； (2)雙氧水氧化法在線(xiàn)性肽的基礎(chǔ)上制備環(huán)肽。
9.權(quán)利要求4所述環(huán)肽的純化方法，其特征在于采用反相色譜法或離子交換色譜法。
10.權(quán)利要求1-4所述的多肽在制備抗細(xì)菌及抗真菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一組具有廣譜抗菌活性的陽(yáng)離子抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的陽(yáng)離子抗菌肽的氨基酸序列通式為X-(C)m-(B)n-His-X。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102766196SQ20111011664
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者馮軍, 吳勇, 張喜全, 徐宏江, 朱裕輝, 楊潔, 路建光 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司