專利名稱：一種基于特異抗體的硝基化修飾位點(diǎn)的檢測(cè)方法及特異識(shí)別scot硝基化位點(diǎn)的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)蛋白質(zhì)特異位點(diǎn)硝基化的方法，制備了特異識(shí)別SCOT硝基化位點(diǎn)的抗體及將其應(yīng)用在生物疾病模型樣本的檢測(cè)中，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酪氨酸硝基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種形式，該修飾可能引起蛋白質(zhì)功能的改變。現(xiàn)有對(duì)于蛋白質(zhì)硝基化的分析主要采用3NT抗體法普適性識(shí)別硝基化蛋白質(zhì)和質(zhì)譜法特異性鑒定硝基化氨基酸殘基。3NT是廣泛識(shí)別硝基化酪氨酸的抗體，具有操作簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，但對(duì)于某種特定的蛋白質(zhì)或某個(gè)特定的硝基化位點(diǎn)，無法給出準(zhǔn)確的定量測(cè)定結(jié)果。質(zhì)譜固然能鑒定特異硝基化的蛋白質(zhì)基團(tuán)，然而其實(shí)驗(yàn)操作流程復(fù)雜，而且高度依賴昂貴的精密分析儀器，所以很難滿足一般實(shí)驗(yàn)室和常規(guī)操作對(duì)硝基化蛋白質(zhì)分析的需求。我們提出，在質(zhì)譜精密分析硝基化位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過嚴(yán)格篩選識(shí)別特異硝基化位點(diǎn)的單克隆 抗體，然后建立對(duì)特定硝基化蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)鑒定方法，就能夠解決硝基化蛋白質(zhì)的常規(guī)鑒定問題，實(shí)現(xiàn)對(duì)大規(guī)模樣本的硝基化半定量分析。線粒體蛋白琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT)是酮體代謝的重要限速酶，催化CoA從琥珀酰CoA轉(zhuǎn)移至乙酰乙酸。SCOT在肝臟以外的大多數(shù)組織中有表達(dá)。一般認(rèn)為，SCOT功能異常可直接造成體液酮體增加(J. T. Tildon, M. Cornblath. Succinyl-CoA :3_KetoacidCoA-Transferase Deficiency. J Clin Invest. 51 (1972) :493-498.),從而引發(fā)多種疾病。所以對(duì)于控制和調(diào)節(jié)SCOT功能的分子機(jī)制的探討，將為尋找組織特異性的藥物治療靶標(biāo)，特別是為糖尿病、心肌病的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。在糖尿病和衰老小鼠模型中，研究者報(bào)道SCOT的硝基化修飾增加并伴隨酶活性的改變(C. Bregere, I. Rebrin, T. K. Gallaher,R. S Sohal. Effects of age and calorie restriction on tryptophan nitration,protein content, and activity of succinyl-CoA 3-ketoacid CoA transferase inrat kidney mitochondria, Free Radical Biology&Medicine. 48(2010) :609-618;S. M. Illarion V. Turko,and F Murad,Diabetes-associated nitration of tyrosine andinactivation of succinyl-CoA 3-oxoacid CoA-transferase, Am. J. Physiol. Heart.Circ. Physiol. 281 (2001) :2289-2295)。我們采用細(xì)胞線粒體內(nèi)高表達(dá)iNOS的細(xì)胞模型，引發(fā)SCOT的硝基化修飾，結(jié)果顯示線粒體內(nèi)高表達(dá)iNOS的細(xì)胞中，SCOT硝基化水平顯著增加，并伴隨它的催化活性的下降。我們還利用0N00-作為NO的供體，以大腸桿菌中表達(dá)的重組SCOT為修飾靶標(biāo)，綜合酶活性實(shí)驗(yàn)及質(zhì)譜的方法進(jìn)行鑒定，確定了 SCOT發(fā)生硝基化修飾的位點(diǎn)，并進(jìn)一步利用定點(diǎn)突變的技術(shù)，確定了硝基化修飾時(shí)對(duì)活性有關(guān)鍵影響的兩個(gè)位點(diǎn)分別是SCOT第4位和第76 位的酪氨酸(Y. Wang, F. Peng, W. Tong, H. Sun, N. Xu, and S. Liu, The Nitrated Proteomein Heart Mitochondria of the db/db Mouse Model Characterization of NitratedTyrosine Residues in SCOT, J. Proteome. Res. 9 (2009) :4254-4263)。雖然基于體外重組蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果以及廣泛識(shí)別硝基化酪氨酸的3NT抗體的研究方法可以使我們找到并確定了對(duì)活性有關(guān)鍵影響的硝基化位點(diǎn)，但依賴這些方法在動(dòng)物模型或臨床樣本中進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，即探測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否發(fā)生相應(yīng)的硝基化修飾，我們卻遭遇到較大的困難。一方面是由于SCOT的表達(dá)豐度較低而且修飾蛋白質(zhì)的量更低，另一方面則是由于線粒體制備可引發(fā)SCOT的丟失，造成硝基化信號(hào)降低。因此，發(fā)展一種高靈敏度和特異性，并且在實(shí)驗(yàn)操作上簡(jiǎn)易可行的方法是硝基化蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域一個(gè)迫切需要解決的問題。本發(fā)明以質(zhì)譜對(duì)硝基化SCOT的分析為出發(fā)點(diǎn)，選擇其中的一個(gè)硝基化位點(diǎn)，制備了特異識(shí)別SCOT第4位酪氨酸硝基化狀態(tài)的單克隆抗體，并建立了對(duì)SCOT特定位點(diǎn)硝基化的免疫化學(xué)檢測(cè)方法。采用該方法對(duì)小鼠糖尿病模型的組織線粒體SCOT進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)表明，這個(gè)方法不僅驗(yàn)證了其他實(shí)驗(yàn)室的觀察，而且進(jìn)一步提供了相應(yīng)硝基化位點(diǎn)的信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種簡(jiǎn)便地檢測(cè)蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)硝基化修飾狀態(tài)的方 法。本發(fā)明的目的之二是提供一種特異識(shí)別蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)硝基化抗體的制備方法。本發(fā)明的目的之三是提供一種識(shí)別SCOT蛋白的第4位酪氨酸硝的抗體。本發(fā)明的目的之四是提供利用該抗體在研究或臨床應(yīng)用中大規(guī)模檢測(cè)SCOT蛋白第4位酪氨酸硝基化的方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案利用特定酪氨酸位點(diǎn)硝基化修飾的肽段作為半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)后免疫小鼠。經(jīng)細(xì)胞融合，并利用該位點(diǎn)修飾與未修飾的肽段以及其他位點(diǎn)修飾的肽段進(jìn)行鑒別篩選，獲得高效分泌特異識(shí)別第4位酪氨酸硝基化的SCOT抗體的雜交瘤細(xì)胞系。利用該雜交瘤細(xì)胞系用小鼠進(jìn)行腹水制備,Protein A/G柱親和層析純化腹水,獲得鼠單克隆抗體。用ELISA技術(shù)測(cè)定該單克隆抗體的亞類和親和常數(shù)。利用ELISA和免疫印記(Western Blot)實(shí)驗(yàn)顯示抗體特異識(shí)別第4位酪氨酸硝基化的SCOT蛋白的能力。利用該抗體對(duì)糖尿病動(dòng)物模型心臟及腎臟蛋白質(zhì)中SCOT進(jìn)行檢測(cè)分析，從而為糖尿病心臟、腎臟中SCOT活性的變化給出理論解釋，并提供該病臨床診斷及藥物研發(fā)的靶標(biāo)。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面I、一種檢測(cè)蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)修飾狀態(tài)的方法，其特征在于利用特異識(shí)別特定位點(diǎn)修飾的抗體檢測(cè)該位點(diǎn)的修飾狀態(tài)。2、上述技術(shù)方案描述的抗體制備方法，其特征在于利用載體偶聯(lián)的硝基化的多肽作為免疫原，并利用該位點(diǎn)修飾與未修飾的肽段以及其他位點(diǎn)修飾的肽段進(jìn)行鑒別篩選，獲得針對(duì)特異位點(diǎn)硝基化的抗體。3、上述技術(shù)方案制備的一個(gè)單克隆抗體，其特征為由保藏號(hào)為CGMCC 4876的小鼠雜交瘤細(xì)胞系(雜交瘤細(xì)胞株為70524 (CN : 10)，保藏號(hào)為CGMCCN0. 4876，保藏日期為2011年05月19號(hào)。保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)產(chǎn)生。4、上述的單克隆抗體，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中SEQ IDNo :1的氨基酸殘基序列的多肽與載體蛋白偶聯(lián)得到。5、上述的單克隆抗體，其特征在于特異識(shí)別第4位酪氨酸硝基化的SCOT蛋白。6、上述的單克隆抗體，其用于檢測(cè)SCOT第4位酪氨酸的硝基化修飾水平的變化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(I)本發(fā)明提供了利用特異識(shí)別特定位點(diǎn)硝基化的抗體對(duì)蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)硝基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的方法。該方法相比現(xiàn)有的對(duì)硝基化酪氨酸進(jìn)行檢測(cè)的3NT抗體具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠直接指示SCOT的特定位點(diǎn)的硝基化修飾；與對(duì)具體位點(diǎn)進(jìn)行硝基化鑒定的質(zhì)譜相比，具有簡(jiǎn)便易行的可操作性。(2)本發(fā)明首次采用硝基化修飾的肽段作為抗原并利用免疫原、非硝基化修飾的同一肽段和硝基化修飾的其他肽段進(jìn)行差異篩選，成功制備了特異識(shí)別特定位點(diǎn)硝基化的抗體。利用該方法可以制備特異識(shí)別其他位點(diǎn)硝基化的抗體。 (3)本發(fā)明產(chǎn)生了特異識(shí)別第4位酪氨酸硝基化的SCOT的抗體一種。該抗體可以用來檢測(cè)SCOT蛋白在第4位酪氨酸硝基化修飾的狀態(tài)。


圖I是ELISA檢測(cè)抗體的滴度及特異性?？贵w為CN-10 ;包被抗原分別為BSA-CN-NO2 ( · )，BSA-CE-NO2 (〇)，BSA-CG-NO2 (T), BSA-CL-NO2 ( Λ )，BSA ( ■)。圖2是Western blot檢測(cè)抗體對(duì)硝基化SCOT的特異性。CCB staining(考馬斯亮藍(lán)染色)檢測(cè)兩個(gè)泳道上樣量的一致性；抗體為CN-10 ;抗原分別是硝基化和非硝基化的SCOT。圖3是Western blot檢測(cè)抗體對(duì)4種硝基化蛋白識(shí)別的特異性。CCB staining(考馬斯亮藍(lán)染色)檢測(cè)每個(gè)泳道上樣量的一致性；抗體分別為3NT，CN-10 ;抗原分別是SC0T，CGl 1963, HADHB, BSA。圖4是Western blot檢測(cè)糖尿病小鼠模型中SCOT硝基化酪氨酸的變化情況。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)分別為對(duì)照組及db/db糖尿病小鼠心臟、腎臟及肝臟的線粒體蛋白質(zhì)?？贵w分別為 ATP synthase β，SCOT, CN-IO0
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合圖表和具體實(shí)施的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I.免疫抗原及篩選抗原的制備一、合成含有硝基化修飾的SCOT關(guān)鍵位點(diǎn)的肽段及用于篩選的肽段通過對(duì)SCOT蛋白第4位所在蛋白質(zhì)序列的抗原性分析，確定了作為抗原的肽段。利用硝基化酪氨酸代替酪氨酸作為合成底物，使合成的肽段為硝基化修飾的狀態(tài)，同時(shí)在其N末端加上半胱氨酸作為與載體蛋白連接的手臂，將肽段命名為CN-N02。為了后期篩選特異抗體，除了免疫用的多肽外，還合成了另外四種肽段，作為篩選時(shí)的參考肽段分別是含SCOT的另外三個(gè)酪氨酸位點(diǎn)(第76位、第117位和第368位酪氨酸)的肽段(CE-NO2, CG-NO2和CL-NO2)，將其中的酪氨酸也替換為硝基化酪氨酸，同時(shí)也將半胱氨酸連接至其N末端；以及含SCOT位點(diǎn)為第4位酪氨酸的肽段(KN)，該肽段中的酪氨酸為未硝基化的狀態(tài)。這五種肽段的序列見序列表。
上述肽段均送交上海吉爾生化有限公司合成。合成的多肽配成10mg/ml的溶液。二、肽段與載體蛋白KLH的耦聯(lián)將10mg/ml 的 sulfo-GMBS (PIERCE 公司)和 10mg/ml 的 mcKLH(Thermo-Fisher 公司)以I : 5的比例混合,室溫下置于搖床上緩慢搖勻30min后，12，OOOrpm離心5min。取上清，經(jīng)s印hadex G-25 Fine (GE公司)分離收集活化好的載體蛋白質(zhì)KLH-sulfo_GMBS，以等質(zhì)量比滴加到步驟一得到的多肽溶液(CN-NO2)中，在室溫下旋轉(zhuǎn)混勻3h(或4°C旋轉(zhuǎn)過夜)即可。實(shí)施例2.雜交瘤細(xì)胞系的建立一、免疫將肽段CN-NO2與KLH耦聯(lián)產(chǎn)物用弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化，免疫4_6周齡雌性Balb/c小鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6點(diǎn)，劑量為60 μ g/ 只。每14天加強(qiáng)免疫一次，免疫原使用弗氏非完全佐劑(Sigma公司)乳化，劑量為30 μ g/只。第3次加強(qiáng)免疫后10天以間接ELISA(波長450nm)檢測(cè)小鼠血清中抗免疫原的多抗效價(jià)，效價(jià)最高的小鼠以腹腔注射沖擊免疫，免疫原用生理鹽水混勻，劑量為50 μ g/只。二、細(xì)胞融合無菌制備免疫達(dá)標(biāo)的小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0 (ATCC)以5 I比例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37°C水浴中，在I分鐘內(nèi)緩慢加入Iml的PEG1500(ROche公司)，并攪動(dòng)細(xì)胞。在溫水中靜置Imin后，加入IOml無血清的IMDM (Sigma公司)，混勻，離心1，OOOrpm, 5min。棄上清后,加入IOml血清(PAA公司)小心的將細(xì)胞吹打起來，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司)的胸腺細(xì)胞，混勻。再加入25ml含有2. 1%硝基纖維素(Sigma公司)的半固體培養(yǎng)基充分混勻，然后均勻的倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、挑克隆融合后11天克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中，在解剖鏡下，吸取圓、實(shí)、大的克隆團(tuán)打入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中，放入37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。四、ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞挑克隆3天后，細(xì)胞量大約占底面積2/3，取100 μ I上清用KLH-CN-NO2作為包被抗原對(duì)融合克隆進(jìn)行ELISA篩選。陽性克隆完全換液，加入200 μ I含飼養(yǎng)細(xì)胞和I %HT (Sigma公司)的完全培養(yǎng)基。兩天后進(jìn)行第二次ELISA篩選，用KLH-CN-NO2與KLH的免疫反應(yīng)進(jìn)行ELISA的比較，以及利用修飾肽段與未修飾肽段進(jìn)行ELISA的比較，從而選取其中特異性較好的陽性克隆，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和HT)的24孔板培養(yǎng)。四天后取100 μ I上清進(jìn)行第三次ELISA篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。實(shí)施例3.腹水誘生法制備單克隆抗體一、腹水制備對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計(jì)數(shù) 5X105，lml。懸浮的細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4°C離心4000rpm，IOmin。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，4°C或-20°C保存。二、單克隆抗體的純化
用HiTrap rProtein AFF(GE公司)親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。SDS-PAGE膠鑒定純度，Bradford法測(cè)定濃度。純化的抗體保存于_20°C。實(shí)施例4.單克隆抗體特性鑒定一、亞類鑒定用IOOmM PBS(pH7. 4)稀釋包被羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)至O. 5μ g/ml，每孔加100μ 1，4°C，過夜。傾空液體，用含O. 05% Tween的PBS (PBS-T)洗3次，每孔加入200 μ I封閉液(含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加入O. Iml雜交瘤上清，37°C孵育Ih。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封閉液I : 1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(K，λ )抗體或I : 2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA)抗體(Southern Biotech 公司)0. Iml 每孔分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7°C孵育lh。傾空液體，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ I含0.15%ABTS(Southern Biotech公司)和0. 03% H2O2的檸檬酸緩沖液(PH4. 0)進(jìn)行顯色反應(yīng)，10-20min內(nèi)測(cè)定405nm波長下的OD值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體CN-10為G2a型鼠源 單克隆抗體。二、親和常數(shù)測(cè)定(ELISA方法)包被合成多肽，包被濃度為2 μ g/ml，100 μ I/孔，4°C包被過夜，PBS-T洗3次。每孔加200 μ I封閉液37°C封閉lh，PBS-T洗3次。用封閉液倍比(2倍)稀釋純化抗體(I 1000起始)，加入相應(yīng)孔中l(wèi)OOul，37度溫育I小時(shí)，PBS-T洗3次。HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗I : 3000稀釋，每孔100μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100 μ I含O. I %TMB (Sigma公司)和O. 03% H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色I(xiàn)Omin,加50 μ I 0· 5Μ硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450nm的吸光值。利用抗體稀釋倍數(shù)對(duì)OD值，畫出OD值對(duì)應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲線，找出> 1/2“平臺(tái)OD值”對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。利用下列公式計(jì)算出單克隆抗體CN-10的親和常數(shù)為6. 2*108。
150000 X A
未和常數(shù)=pad,
抗體原始濃度實(shí)施例5.抗體特異性的鑒定一、ELISA鑒定抗體特異性將4 個(gè)含硝基化酪氨酸(Tyr4、Tyr 76,Tyr 117、Tyr368)的肽段(CN-NO2、CE-NO2、CG-NO2, CL-NO2)與BSA相耦聯(lián)，然后采用實(shí)施例4中測(cè)親和力的方法對(duì)本發(fā)明的單抗與這4個(gè)位點(diǎn)的識(shí)別能力進(jìn)行比較。結(jié)果如圖I所示，CN-10只識(shí)別含在第4位酪氨酸有硝基化修飾的肽段CN-NO2，對(duì)其他3個(gè)SCOT的硝基化修飾酪氨酸肽段無免疫反應(yīng)。二、Western blot鑒定抗體特異性用Western blot對(duì)SCOT硝基化修飾與非修飾形式識(shí)別能力進(jìn)行比較,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組SCOT為檢測(cè)底物，在體外采用過氧亞硝酸為NO供體，使其發(fā)生硝基化修飾。免疫印跡實(shí)驗(yàn)過程如下每種蛋白上樣約lOOng，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore公司)。將膜置于含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉液中4°C過夜。加入單克隆抗體(I 2500稀釋)震蕩孵育I小時(shí)。用TBS-T洗膜后，加入I 3000稀釋的羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫震蕩孵育I小時(shí)。再次TBST洗膜，加入ECL超敏顯色液(普利萊公司)，用ImageQuant ECL儀器(GE公司)捕獲顯色圖像。如圖2所示，這兩種形式的SCOT在相同的上樣量條件下，只有硝基化修飾的SCOT有明顯的免疫雜交。用Western blot方法對(duì)硝基化修飾的SCOT與硝基化修飾的其他3種蛋白的識(shí)別能力進(jìn)行比較。首先利用過氧亞硝酸分別將SC0T、skpA associated protein (大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì))、Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase beta subunit (HADHB)(大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì))和BSA(Calbiochem公司)進(jìn)行硝基化修飾，圖3表明，通過考馬斯亮藍(lán)染色和3NT (Santa Cruz公司)的雜交信號(hào)顯示，相等量的這4種蛋白都發(fā)生了硝基化修飾，而且其水平相當(dāng)，但CN-10只識(shí)別含硝基化修飾的SCOT。綜合上述結(jié)果，CN-10對(duì)第4位酪氨酸硝基化修飾的SCOT能夠特異識(shí)別。實(shí)施例6.對(duì)糖尿病小鼠組織SCOT特定位點(diǎn)硝基化修飾進(jìn)行檢測(cè)采用實(shí)施例5所述的Western blot方法,利用本發(fā)明所產(chǎn)生的特異抗體CN-10對(duì)糖尿病小鼠(北京美森生物醫(yī)藥科技有限公司)組織線粒體中SCOT第4位酪氨酸的硝基化修飾水平變化與否進(jìn)行檢測(cè)。如圖4所示,通過ATP synthase β抗體(BD Bioscience公司)的免疫信號(hào)顯示心臟、腎臟、肝臟線粒體的上樣量基本一致，通過SCOT抗體(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)的免疫信號(hào)顯示SCOT的表達(dá)水平在糖尿病心臟和腎臟組織線粒體中基本沒有變化，而CN-10抗體的雜交信號(hào)顯示在糖尿病小鼠的心臟和腎臟中硝基化修飾明顯比對(duì)照組增加。在肝臟中則沒有SCOT的表達(dá)及其修飾的信號(hào)。利用5對(duì)小鼠組織分別進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果見表I。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，在糖尿病小鼠心臟和腎臟組織線粒體中SCOT第4位酪氨酸硝基化修飾增加了 2-3倍。SCOT第4位和第76位酪氨酸硝基化水平的增加與糖尿病具有相關(guān)性。用SCOT蛋白特定位點(diǎn)的硝基化修飾的特異抗體可以簡(jiǎn)便地檢測(cè)SCOT蛋白的硝基化狀態(tài)，并可能用于糖尿病的研究和檢測(cè)。表1SC0T第4位酪氨酸硝基化修飾變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)修飾狀態(tài)的方法，其特征在于利用特異識(shí)別特定位點(diǎn)修飾的抗體檢測(cè)該位點(diǎn)的修飾狀態(tài)。
2.權(quán)利要求I所述方法中抗體的制備方法，其特征在于利用載體偶聯(lián)的硝基化的多肽作為免疫原，并利用該位點(diǎn)修飾與未修飾的肽段以及其他位點(diǎn)修飾的肽段進(jìn)行鑒別篩選，獲得針對(duì)特異位點(diǎn)硝基化的抗體。
3.權(quán)利要求2所述的方法制備的一個(gè)單克隆抗體，其特征為由保藏號(hào)為CGMCC4876的小鼠雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中SEQ ID No 1的氣基酸殘基序列的多妝與載體蛋白偶聯(lián)得到。
5.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于特異識(shí)別第4位酪氨酸硝基化的SCOT蛋白。
6.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其用于檢測(cè)SCOT第4位酪氨酸的硝基化修飾水平的變化。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種檢測(cè)蛋白質(zhì)特異位點(diǎn)硝基化的方法，以及特異識(shí)別線粒體蛋白琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(SCOT)特異位點(diǎn)硝基化修飾的抗體的制備方法。提供了一種識(shí)別SCOT第4位酪氨酸硝基化的抗體和分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系70524(CN10)，保藏號(hào)為CGMCC No.4876。該位點(diǎn)的硝基化修飾對(duì)氧化脅迫時(shí)SCOT的酶活性改變有較大影響，利用該抗體可對(duì)不同生理、病理小鼠模型(如db/db糖尿病小鼠模型)的SCOT第4位酪氨酸硝基化狀態(tài)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硝基化修飾的SCOT關(guān)鍵位點(diǎn)的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K16/40GK102818896SQ201110154178
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
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