專利名稱：提高生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白功效的方法和典型變異蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明研制出一種蛋白質(zhì)變體，其結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明研制出一種蛋白質(zhì)變體，其位于α螺旋區(qū)人細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代。
背景技術(shù)：
人類許多疾病由蛋白質(zhì)缺陷或不足引起的功能缺失造成。要治療這種疾病只須給病人直接服用相應(yīng)蛋白質(zhì)。然而，許多有生理活性的蛋白質(zhì)藥用后常常還沒到達(dá)發(fā)揮作用的靶點(diǎn)在血清里就會被降解。因此對于多數(shù)有生理活性和治療價(jià)值的蛋白質(zhì)，患者常常過量、過于頻繁服用以維持能夠發(fā)揮滿意治療效果的適當(dāng)?shù)臐舛人?。要解決上述問題可以結(jié)合聚乙烯乙二醇(聚乙二醇化)或者將有生理活性的蛋白質(zhì)裝入微膠囊。然而這些方法過于繁瑣，因?yàn)榘械鞍鬃畛跤晌⑸锂a(chǎn)生，已經(jīng)經(jīng)過提純。此外，計(jì)劃之外的位點(diǎn)可能會發(fā)生交聯(lián)進(jìn)而影響最終產(chǎn)品的同質(zhì)性。另一種解決途徑是糖基化，即對細(xì)胞表面蛋白和真核細(xì)胞分泌蛋白進(jìn)行糖基化修飾。它可以影響活體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、功能和生理屬性。但是因?yàn)樘腔鞍踪|(zhì)依賴于具有此功能的真核細(xì)胞而且生產(chǎn)過程復(fù)雜，難以制造出在所有目標(biāo)位點(diǎn)都完成糖基化的同質(zhì)終
女口
廣 PFt ο此外，傳統(tǒng)方法雖然可以降低服藥頻率，但是不能提高蛋白質(zhì)的生理功效，這樣會導(dǎo)致過量服藥。例如，安進(jìn)公司開發(fā)的NESP (參見U. S. Pat. No. 6，586，398)通過延長蛋白質(zhì)血內(nèi)半排出期來降低服藥頻率，但是無法增強(qiáng)生理功效而導(dǎo)致過量服用，還可能誘導(dǎo)阻斷抗體生成。通過誘導(dǎo)野生型蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生突變能夠改善其生物活性。以下特許刊物刊登了相關(guān)蛋白質(zhì)變體(1)美國，專利號5，457，089，人紅細(xì)胞生成素(EPO)變體通過改變羧基末端能夠增強(qiáng)與受體結(jié)合力。(2)國際專利，出版物號02/077034，人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)變體，改變T細(xì)胞抗原表位降低對人粒細(xì)胞集落刺激因子的免疫原性。(3) 國際專利，出版物99/57147，人血小板生成素(TPO)變體，在位點(diǎn)115用賴氨酸、精氨酸或酪氨酸取代谷氨酸，其余從7號到151號位點(diǎn)構(gòu)成同成熟人血小板生成素。(4)美國，專利號6，136，563和6，022，711，人生長激素變體在18、22、25、26、29、65、168和174位發(fā)生丙氨酸取代。然而上述蛋白質(zhì)變體側(cè)重改善治療效果而沒有關(guān)注體內(nèi)抗原性的改變。因此不同規(guī)模、程度、位點(diǎn)的改變可能引起不同程度的免疫反應(yīng)?？乖钥赡芤饑?yán)重的副反應(yīng)。 (Casadevall et al. N. Eng. J. Med. 2002, vol. 346, p. 469).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過增強(qiáng)生物反應(yīng)修飾蛋白功效、改良制備蛋白變體工藝，提供一種新型生物反應(yīng)修飾蛋白變體，它的藥理活性有所增強(qiáng)，能夠最大限度發(fā)揮原有功效并能有效防止阻斷抗體形成。一方面，本發(fā)明研制出一種蛋白質(zhì)變體，其結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。另一方面，本發(fā)明研制出一種編碼蛋白變體的DNA，該蛋白變體結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。進(jìn)一步說，本發(fā)明研制出一種與編碼蛋白變體DNA相結(jié)合的重組載體，其結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。再進(jìn)一步，本發(fā)明研制出一種被DNA編碼蛋白質(zhì)變體重組載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。更加深入，本發(fā)明研制出一種制備蛋白質(zhì)變體的方法，包括怎樣培養(yǎng)被DNA編碼蛋白質(zhì)變體重組載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能，也包括如何從培養(yǎng)基殘?jiān)蟹蛛x蛋白質(zhì)變體。更加準(zhǔn)確地說，本發(fā)明研制出一種藥理成分和一種藥理學(xué)可接受載體，其中包括蛋白質(zhì)變體，其結(jié)合區(qū)的苯基丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區(qū)域與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物反應(yīng)修飾功能。


通過以下詳細(xì)介紹和附帶圖紙你可以清楚了解上述和其他目標(biāo)、該發(fā)明特色和其他優(yōu)點(diǎn)。圖IA顯示了位于4-螺旋細(xì)胞活素受體結(jié)合區(qū)域的多氨基酸序列。圖IB顯示了位于干擾素受體結(jié)合區(qū)域的多氨基酸序列。圖2A顯示了利用本技術(shù)取得的血小板生成素(TPO)變體的免疫印記成像。(從最左邊依次為標(biāo)記、野生型 TP0、TP0-[F46V]、TP0-[F128V]、TP0-[F131V]和 TP0_[F141V])圖2B顯示了利用本技術(shù)取得的紅細(xì)胞生成素變體(EPO)的免疫印記成像。(從最左邊依次為標(biāo)記、野生型 EPO、EPO- [F48V]、EPO- [F138V]、EPO- [F142V]和 EPO- [F148V])圖2C顯示了利用本技術(shù)取得粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)變體的免疫印記成像。 (從最左邊依次為標(biāo)記、野生型 G-CSF、G-CSF-[F 13V]、G-CSF-[F83V]、G-CSF-[F113V]、 G-CSF- [F140V]、G-CSF- [F144V]和 G-CSF- [F160V])圖3A顯示了同野生型TPO相比，利用本技術(shù)取得的TPO變體的相對表達(dá)水平。圖3B顯示了同野生型EPO相比，利用本技術(shù)取得的EPO變體的相對表達(dá)水平。圖3C顯示了同野生型G-CSF相比，利用本技術(shù)取得的G-CSF變體的相對表達(dá)水平。圖4A通過ELISA化驗(yàn)顯示了利用本技術(shù)取得的TPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖4B通過ELISA化驗(yàn)顯示了利用本技術(shù)取得的EPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖4C通過ELISA化驗(yàn)顯示了利用本技術(shù)取得的G-CSF變體與受體結(jié)合的親和力。
圖4D通過ELISA化驗(yàn)顯示了利用本技術(shù)取得的GH變體與受體結(jié)合的親和力。圖5A顯示了通過SI3R化驗(yàn)利用本技術(shù)取得的TPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖5B顯示了通過SI3R化驗(yàn)利用本技術(shù)取得的EPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖6A顯示了通過FACS分析，利用本技術(shù)取得的TPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖6B顯示了通過FACS分析，利用本技術(shù)取得的EPO變體與受體結(jié)合的親和力。圖7A顯示了通過分析利用本技術(shù)取得的TPO變體濃度測得的TF-1/c-Mpl細(xì)胞增殖率。圖7B顯示了通過分析利用本技術(shù)取得的EPO變體濃度測得的TF-I細(xì)胞增值率。圖7C顯示了通過分析利用本技術(shù)取得的G-CSF變體濃度測得的HL60細(xì)胞增值率。圖7D顯示了通過分析利用本技術(shù)取得的GH變體濃度測得的Nb2細(xì)胞增值率。圖8A顯示了利用本技術(shù)取得的TPO變體的藥物動力學(xué)測試，在實(shí)驗(yàn)中，給兔子靜脈注射TPO變體，并測量其血清水平。圖8B顯示了利用本技術(shù)取得的EPO變體的藥物動力學(xué)測試，在實(shí)驗(yàn)中，給兔子靜脈注射EPO變體，并測量其血清水平。圖8C顯示了利用本技術(shù)取得的EPO變體的藥物動力學(xué)測試，在實(shí)驗(yàn)中，給小鼠腹膜注射EPO變體，并測量其血清水平。圖9A、9B、9C分別顯示了紅血球增值率、網(wǎng)狀細(xì)胞增殖率和血細(xì)胞比容變化，反應(yīng)體內(nèi)利用本技術(shù)取得的EPO變體活性。在實(shí)驗(yàn)中給小鼠腹膜注射EPO變體。圖10A、10BU0C分別顯示了血小板、白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞增殖率變化，反應(yīng)活體利用本技術(shù)取得的TPO變體活性。在實(shí)驗(yàn)中，給小鼠腹膜注射TPO變體。
具體實(shí)施例方式依照國際生化聯(lián)盟關(guān)于氨基酸縮寫的規(guī)定，現(xiàn)用單個(gè)大寫字母代表相應(yīng)氨基酸。A 丙氨酸；B 天冬酰胺酸或天冬氨酸C 胱氨酸；D 天冬氨酸；E 谷氨酸F 苯丙氨酸；G :甘氨酸；H :組胺酸I 異亮氨酸；K 賴氨酸L 亮氨酸M 蛋氨酸；N:天冬酰胺酸；P:脯氨酸Q 谷甘氨酸R 精氨酸S 絲氨酸T :蘇氨酸；V :纈氨酸；W :色氨酸Y 酪氨酸Z 谷氨酰胺或谷氨酸以下這種命名法“(代表某種氨基酸的大寫字母)(氨基酸位點(diǎn))(代表另一種氨基酸的大寫字母)”表示前一個(gè)氨基酸在指定位點(diǎn)被后一個(gè)所取代。例如，F(xiàn)48V表明位于某蛋白48位的苯丙氨酸被纈氨酸所取代。氨基酸位點(diǎn)從成熟野生型蛋白質(zhì)N端算起。本文中提及的“蛋白質(zhì)變體”是指氨基酸序列異于野生型的蛋白質(zhì)，比如某種同受體、配體或底物結(jié)合具有生理活性的蛋白質(zhì)的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代，尤其當(dāng)這種替代發(fā)生在結(jié)構(gòu)域時(shí)。方便起見本項(xiàng)發(fā)明提及的蛋白質(zhì)變體命名為“蛋白質(zhì)名稱_[(代表某種氨基酸的大寫字母)(氨基酸位點(diǎn))(代表另一種氨基酸的大寫字母)]”例如，TP0-[F131V]指代一種野生型131位點(diǎn)原苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代生成的TPO變體?！吧锓磻?yīng)修飾蛋白”指的是通過誘導(dǎo)、中止、調(diào)節(jié)發(fā)生于多細(xì)胞個(gè)體中多種多樣的生物反應(yīng)，來維持軀體穩(wěn)態(tài)的一類蛋白，它們通常通過與受體、配體或底物結(jié)合來發(fā)揮功效。本項(xiàng)發(fā)明能夠改變?nèi)客ㄟ^結(jié)合受體、配體或底物具有固有調(diào)節(jié)生物反應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。非限制性蛋白質(zhì)包括細(xì)胞活素及其受體、粘附分子、腫瘤壞死因子(TNF)受體、 酶、受體酪氨酸激酶、化學(xué)活素受體、其他細(xì)胞表面蛋白和可溶性配體。非限制性細(xì)胞活素包括CNTF(細(xì)胞神經(jīng)滋養(yǎng)因子)、GH(生長激素)、IL-1，IL-IRa(白介素-1受體拮抗劑)、 胎盤催乳激素(PL)、心磷脂、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、1L-17、TNF、 TGF (轉(zhuǎn)化生長因子)、IFN (干擾素)、GM-CSF (粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子)、G-CSF (粒細(xì)胞集落刺激因子)、EPO (促紅細(xì)胞生成素)、TPO (血小板生成素)、M-CSF (單核細(xì)胞集落刺激因子)、LIF(白血病抑制因子)、0SM(制瘤素-M)、SCF(干細(xì)胞因子)、HGF(肝細(xì)胞生長因子)、FGF (纖維原細(xì)胞生長因子)、IGF (胰島素樣生長因子)和LPT (瘦素)。非限制性細(xì)胞活素受體包括生長激素受體(GHR)、IL-13R、IL-1R、IL-2R、IL-3R、 IL-4R、L-5R、IL-6R、L-7R、IL-9R、IL-15R、TNFR、TGFR、IFNR(例如，IFN- y Ra 鏈、IFN- y R)、 interferon- a R、- β R 禾口 - γ R、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl、gpl30 禾口 Fas (Apo 1)。化學(xué)活素受體包括CCRl和CXCR1-4。受體酪氨酸激酶包括TrkA、TrkB, TrkC, Hrk、REK7、Rse/ Tyro-3、肝細(xì)胞生長因子受體、血小板衍生生長因子受體和Flt-I。其他細(xì)胞表面蛋白包括CD2、CD4、CD5、CD6、CD22、CD27、CD28、CD30、CD31、CD40、 CD44、CD100、CD137、CD150、LAG-3、B7、B61、β -neurexin、CTLA-4、I COS, ICAM-U 補(bǔ)體 R-2(⑶21)、IgER、溶酶體膜gp-1、α 2_微球蛋白受體相關(guān)蛋白、促尿鈉排泄肽受體。本發(fā)明研制出能結(jié)合相比野生型有較強(qiáng)疏水性的受體、配體或底物的蛋白質(zhì)變體，以提高上述多種蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明的特色是在每種蛋白的結(jié)構(gòu)域用纈氨酸取代苯丙氨酸殘基。苯丙氨酸基本上屬于非極性氨基酸，有一個(gè)芳香支鏈，疏水指數(shù)達(dá)到3. 0。纈氨酸屬于非極性氨基酸，有一個(gè)脂肪支鏈，疏水指數(shù)達(dá)到4. 0。此外，當(dāng)體積較小的纈氨酸取代苯丙氨酸后，蛋白質(zhì)可以在鑲嵌模式下更緊密地與相應(yīng)受體、配體或底物結(jié)合，增加疏水性、 親和力，進(jìn)而提高生物反應(yīng)調(diào)節(jié)功效。此外因?yàn)橛美i氨酸替代苯丙氨酸屬于保守替代，對蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)影響降到最低，這樣很少影響蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮(Argos,EMB0 J. 1989，vol. 8，pp779_85)。還因?yàn)楸奖彼嶂饕挥趶?qiáng)疏水區(qū)域，難以暴露出來，當(dāng)它被纈氨酸所取代時(shí)，纈氨酸的強(qiáng)疏水性會使蛋白質(zhì)遠(yuǎn)離表面。因此這種替代誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的惡可能性較小。某種蛋白應(yīng)當(dāng)首先同相應(yīng)受體、配體或底物結(jié)合再調(diào)節(jié)某種生物反應(yīng)。結(jié)合越緊密，調(diào)節(jié)生物反應(yīng)功效越強(qiáng)， 本項(xiàng)發(fā)明可以改造所有相關(guān)蛋白質(zhì)，生產(chǎn)所有蛋白變體。人自身免疫病NK細(xì)胞表達(dá)的Fc γ RIIIa(⑶16)發(fā)生突變可以證明苯丙氨酸為纈氨酸所取代后蛋白質(zhì)親和力增強(qiáng)。人受體蛋白具有基因多形性，即人群分為兩組位于識別抗體配體的Fc段的176位點(diǎn)，一組人是苯丙氨酸，另一組是纈氨酸。受體176位點(diǎn)是苯丙氨酸的個(gè)體與抗體配體Fc段結(jié)合時(shí)親和力較低，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性很高。(JianmingWu et al. J. Clin. Invest. 1997，vol. 100，pp. 1059—70)另一方面，如上所述，本發(fā)明特別之處在于位于有生物反應(yīng)修飾作用蛋白結(jié)構(gòu)域的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代。這里所說的“結(jié)構(gòu)域”是指通過與受體、配體或底物結(jié)合能夠發(fā)揮生物功能蛋白質(zhì)的一部分(或某區(qū)域)，相對該蛋白上其他區(qū)域，該區(qū)域有強(qiáng)疏水性和抵抗原性，該術(shù)語在技術(shù)領(lǐng)域家喻戶曉。例如，用來指代本發(fā)明的某些4-α螺旋束細(xì)胞活素和干擾素分別具有D-α螺旋結(jié)構(gòu)和Α-α螺旋結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)就是與相應(yīng)受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。然而根據(jù)本發(fā)明更改的結(jié)構(gòu)域不局限于技術(shù)領(lǐng)域?yàn)槿耸熘慕Y(jié)構(gòu)域。因?yàn)樯锓磻?yīng)調(diào)節(jié)蛋白與受體、配體或底物的結(jié)合同時(shí)受到與之直接結(jié)合和其它幾個(gè)氨基酸殘基的影響。根據(jù)本發(fā)明更改的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域還包括技術(shù)領(lǐng)域?yàn)槿耸熘慕Y(jié)構(gòu)域中從兩端算起的約50個(gè)氨基酸殘基，或者更適宜說約25個(gè)甚至約10個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明包括通常含有幾個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)胞活素，其中位于N段的第一和最后位螺旋被稱作與相應(yīng)受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(見圖1)。技術(shù)領(lǐng)域普遍接受細(xì)胞活素與相應(yīng)受體結(jié)合的α螺旋因細(xì)胞活素種類而異。例如，IL-2第二和第五個(gè)螺旋與IL-2受體中的 ρ55α受體結(jié)合，第一個(gè)螺旋與IL-2受體中的ρ75 γ受體結(jié)合，第六個(gè)螺旋與γ受體結(jié)合。 (Fernando Bazan, Science J. 1992，vol. 257，pp. 410-2).如上所述，細(xì)胞活素不同的螺旋結(jié)構(gòu)參與與不同受體的結(jié)合，但是螺旋結(jié)構(gòu)氨基酸序列很相近。本發(fā)明研制出一種細(xì)胞活素變體，它位于結(jié)構(gòu)域中的α螺旋的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。細(xì)胞活素包括4-螺旋束細(xì)胞活素家族，例如CNTF、ΕΡ0、Flt3L、GM-CSF, IL-2, IL-3、L-4、IL-5、L_6、IL_12p35、LPT、LIF、M-CSF, OSM、PL、SCF, TPO, G-CSF, GHR 和 IFN。它們都具有四個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，分別命名為A-α螺旋、B-α螺旋、C_a螺旋和D_ α螺旋。與受體結(jié)合的主要是 A-α 螺旋禾口 D-α 螺旋。(Fernando Bazan, Immunology today, 1990, vol.11 pp. 350-4，The Cytokine Facts Book, 1994，pp.104—247)上述4-螺旋束細(xì)胞活素家族中，CNTF、EPO, Flt3L、GM-CSF, IL-2, IL-3, I L-4, IL-5、IL-6、L-12p35、LPT、LIF、M-CSF, OSM、PL、SCF, TPO, G-CSF 和 GHR 都包括一個(gè) D- α 螺旋和C-α螺旋與D-α螺旋的聯(lián)合區(qū)。結(jié)合區(qū)包括4-螺旋束細(xì)胞活素家族中位于110和 180位點(diǎn)間的氨基酸殘基。綜上，本發(fā)明研制出一種4-螺旋束細(xì)胞活素變體，該家族中位于 110和180位點(diǎn)間苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。上述4-螺旋束細(xì)胞活素家族中，干擾素(例如IFN-a2A、IFN-a 2B, IFN- β , IFN-Y、IFN-ω、IFN-τ)結(jié)合區(qū)中包含一個(gè)Α_α螺旋。具體說來，干擾素的結(jié)合區(qū)包括處于位點(diǎn)1到50間的氨基酸殘基。因此，本發(fā)明研制出一種干擾素變體，它位于1和50位點(diǎn)間的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。另一方面，根據(jù)本技術(shù)修飾的結(jié)合區(qū)可能包括兩個(gè)或以上苯丙氨酸殘基，它們可能都會被纈氨酸所取代。然而因?yàn)檫@樣會導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平下降，最好只有一個(gè)苯丙氨酸被取代。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)位于高疏水區(qū)域的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代后，生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白功效會明顯改善。因此，本發(fā)明選擇用位于高疏水區(qū)域的苯丙氨酸殘基來被纈氨酸所取代。某一氨基酸序列某特殊區(qū)域的疏水性可以確定(Kyte，J.et al.J.Mol. Biol. 1982, vol. 157, pp. 105-132, Hopp, Τ. P. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981,vol. 78(6)，pp. 3824-3828)?？梢愿鶕?jù)技術(shù)領(lǐng)域廣為人知的化學(xué)合成方法利用本發(fā)明來制造生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白變體(Creighton，Proteins-Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co. , NY 1983)。這里舉出幾種常用方法，但不限于此，比如液相、固相合成法、片段濃縮法、F-M0C、T-B0C 化學(xué)合成法(Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams et al.，Eds.，CRC Press，BocaRaton Florida，1997 ；A Practical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，IRLPress, Oxford,England，1989)。本發(fā)明改造的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白變體也可采用DNA重組技術(shù)制備。該技術(shù)包括準(zhǔn)備編碼本發(fā)明改造的蛋白變體的DNA序列，可以通過改變編碼野生型蛋白的DNA序列來獲得。簡言之，合成編碼野生型蛋白的DNA序列之后，通過點(diǎn)突變使含有苯丙氨酸的密碼子變成含有纈氨酸的密碼子，以此合成目標(biāo)DNA序列。同時(shí)，制備編碼本發(fā)明改造蛋白變體的DNA序列也可通過化學(xué)方法，例如利用寡核苷酸合成器?；谀繕?biāo)蛋白變體的氨基酸序列，或者不如說選擇產(chǎn)生此種蛋白變體宿主細(xì)胞采用的適宜密碼子來合成寡核苷酸。技術(shù)領(lǐng)域普遍認(rèn)同遺傳密碼存在簡并性，即有些氨基酸有幾個(gè)密碼子為之編碼。本發(fā)明涵蓋眾多簡并性編碼蛋白變體的DNA序列。編碼本發(fā)明改造蛋白變體的DNA序列可能包括也可能不包括編碼信號序列的DNA 序列。如果存在的話，信號序列應(yīng)該能夠被表達(dá)蛋白變體的宿主細(xì)胞識別。信號序列可能來自原核或真核細(xì)胞，或者同時(shí)來自這兩種細(xì)胞，或者屬于固有蛋白的信號序列。通過檢測以重組細(xì)胞分泌物形式表達(dá)的蛋白變體水平可以評價(jià)信號序列水平。如果宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，DNA序列通常不編碼信號序列而是更傾向于N端含有蛋氨酸來直接表達(dá)目標(biāo)蛋白。一般采用從野生型蛋白衍生的信號序列。把用上述方法制備的DNA序列與其它編碼本發(fā)明改造蛋白的DNA序列結(jié)合在一起，插入包含調(diào)節(jié)結(jié)果DNA序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列的載體。這樣宿主細(xì)胞就轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染有結(jié)果重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化株和轉(zhuǎn)染株在適宜DNA序列表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。從培養(yǎng)基中取得編碼DNA序列的高純度生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白變體?！拜d體”是指能穩(wěn)定地將外源性基因攜帶入宿主細(xì)胞的DNA分子。為了方便應(yīng)用， 載體應(yīng)該能夠復(fù)制、能夠?qū)⒆陨硪胨拗骷?xì)胞并且具有可供選擇的標(biāo)記物。此外，“重組表達(dá)載體”是指能將外源性基因帶入宿主細(xì)胞的環(huán)狀DNA分子。重組表達(dá)質(zhì)體在被引入宿主細(xì)胞后，無論宿主染色體DNA是不是在大量復(fù)制都能夠自身復(fù)制產(chǎn)生異種DNA。技術(shù)領(lǐng)域普遍接受為了提高宿主內(nèi)傳染基因表達(dá)水平，該基因應(yīng)該同宿主表達(dá)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)序列合理連接起來。如果表達(dá)調(diào)控序列和外源性基因能被裝入帶有細(xì)菌選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的單表達(dá)載體，效果會更好。如果選用真核細(xì)胞作表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)載體應(yīng)該包含適用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記物。與重組表達(dá)載體連用的“表達(dá)調(diào)控序列”是指對于該發(fā)明改造的蛋白變體必要或有益的核苷序列。調(diào)控序列可能與編碼蛋白變體的核苷序列同源或異源。非限制性表達(dá)調(diào)控序列包括前導(dǎo)序列、多腺苷酸序列、末端肽、啟動子、增強(qiáng)子或上游活化序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。表達(dá)調(diào)控序列至少包含一個(gè)啟動子序列?！斑m宜結(jié)合”是指不同核苷序列的結(jié)合狀態(tài)能夠保障應(yīng)有功能的正常發(fā)揮。核苷序列可能是基因或調(diào)控序列，當(dāng)適宜分子(例如，轉(zhuǎn)錄活化蛋白)結(jié)合到調(diào)控序列時(shí)，就可以誘導(dǎo)基因表達(dá)。舉例來說，如果前序列或分泌前導(dǎo)能夠協(xié)助成熟蛋白分泌，就稱之為“與蛋白結(jié)合適宜”。當(dāng)啟動子調(diào)節(jié)編碼序列轉(zhuǎn)錄時(shí)，它與編碼序列結(jié)合適宜。如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)允許編碼序列翻譯正常進(jìn)行，就說它與編碼序列結(jié)合適宜。通常“適宜結(jié)合”指核苷序列彼此相連。就分泌型前導(dǎo)序列而言，它的適宜結(jié)合是指與編碼序列相連，且位于該序列的領(lǐng)頭區(qū)段。然而增強(qiáng)子不一定要和編碼序列相連。核苷序列連接可以在方便的限制酶識別位點(diǎn)完成。沒有限制酶識別位點(diǎn)時(shí)，可應(yīng)用傳統(tǒng)方法合成的寡核苷酸結(jié)合體。為了表達(dá)編碼本發(fā)明改造蛋白變體DNA序列，有多種宿主細(xì)胞和載體重組體可供選擇?？捎糜谵D(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞的載體包含諸如SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、 細(xì)胞巨化病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等表達(dá)調(diào)控序列。細(xì)菌宿主載體包含從大腸桿菌中提取的質(zhì)體 (例如 pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC、pBR322 和 pMB9)及其衍生物，來自多種宿主細(xì)胞的質(zhì)體，如RP4、抗菌素DNA，多種λ抗菌素衍生物如λ gtlO、λ gtll和NM989，其它抗菌素DNA如絲狀單鏈DNA抗菌素(例M13)。適用于酵母細(xì)胞的表達(dá)載體含2 μ質(zhì)體及其衍生物。適用于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體含PVL 941。為了表達(dá)編碼本發(fā)明改造蛋白變體DNA序列，這些載體有多種表達(dá)調(diào)控序列可供選擇。這些有用的表達(dá)調(diào)控序列包括那些與上述載體的結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的那些序列。有用的表達(dá)調(diào)控序列包括SV40或腺病毒、乳糖系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)的早期和晚期啟動子，T3和T7啟動子、噬菌體λ操縱子和啟動子的主要區(qū)域、fd蛋白衣調(diào)控區(qū)、3-磷酸甘油酯激酶和其它糖酵解酶的啟動子、磷脂酶啟動子，例如Pho5、酵母α雜交體統(tǒng)啟動子、調(diào)控原核或/和真核細(xì)胞及其病毒基因表達(dá)的其他序列。特別地，Τ7 RNA聚合酶啟動子Φ10有助于大腸桿菌多肽的表達(dá)。經(jīng)上述重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞還包含本發(fā)明的另外一方面成果。有多種單核宿主細(xì)胞可以用來表達(dá)編碼本發(fā)明改造蛋白變體的DNA序列。這樣的宿主細(xì)胞包括諸如大腸桿菌、假單細(xì)胞菌、桿菌、鏈霉菌、真菌、酵母等原核或真核細(xì)胞，諸如Sp0d0ptFrugiperda(Sf9)這樣的昆蟲細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)或小鼠細(xì)胞等動物細(xì)胞，非洲綠猴細(xì)胞例如C0S1、C0S7、BSC1、BSC40或BMT10，人組織培養(yǎng)細(xì)胞和植物細(xì)胞。常常選用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌和哺乳動物的組織培養(yǎng)細(xì)胞作宿主細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)入門里描述的方法對宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, 1986 ；Sambrook,J. ,et al. ,Basic Methodsin Molecular Biology, 1989)。一般采用鈣磷酸鹽轉(zhuǎn)染法、DEAE右旋糖苷介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、轉(zhuǎn)位法、 顯微注射、陽離子脂介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、轉(zhuǎn)導(dǎo)變異、刮載法、彈道介導(dǎo)和感染法將編碼本發(fā)明改造蛋白變體的DNA序列載入宿主細(xì)胞。在表達(dá)編碼本發(fā)明改造蛋白變體的DNA序列時(shí)，所有載體和表達(dá)調(diào)控序列發(fā)揮的功能不盡相同。同樣，在同樣的表達(dá)系統(tǒng)里所有宿主細(xì)胞發(fā)揮的功能也不盡相同。然而，技術(shù)熟練的人不需做很多實(shí)驗(yàn)就能選出本發(fā)明所要求的適宜的載體、表達(dá)調(diào)控序列和宿主。 例如，選擇載體時(shí)應(yīng)該也把宿主考慮在內(nèi)，因?yàn)檩d體需要能夠在宿主內(nèi)部復(fù)制。應(yīng)該仔細(xì)斟酌載體的復(fù)制量、控制復(fù)制量的能力、該載體編碼的其他蛋白的表達(dá) (比如抗體標(biāo)記物)。同時(shí)選擇表達(dá)調(diào)控序列時(shí)也應(yīng)該考慮多方面的因素，比如相對強(qiáng)度、 調(diào)控能力、與本發(fā)明中DNA序列的兼容性，尤其要注意與二級結(jié)構(gòu)相關(guān)的因素。選擇宿主時(shí)應(yīng)該考慮與載體的兼容性、核苷序列編碼產(chǎn)物的毒性、產(chǎn)物的分泌屬性、正確折疊多肽鏈的能力、發(fā)酵條件、組織培養(yǎng)條件、核苷序列編碼產(chǎn)物是否容易提純等等。制備本發(fā)明改造蛋白變體的過程中，把宿主細(xì)胞放在適宜多肽生存成的營養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，如搖暖培養(yǎng)，小或大規(guī)模實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵桶發(fā)酵(要求培養(yǎng)基條件適宜多肽表達(dá)和/或分離)。要求培養(yǎng)基按照規(guī)范程序配制，含有適量碳、氮和無機(jī)鹽。培養(yǎng)基可以從供貨商那里購得也可依據(jù)公布的配比自行配制(如American TypeCulture Collection目錄)。如果多肽分泌入培養(yǎng)基，它應(yīng)該能再直接復(fù)原；如果沒有分泌入培養(yǎng)基，它應(yīng)該能從細(xì)胞溶解產(chǎn)物中復(fù)原。本發(fā)明改造的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白變體能通過以下傳統(tǒng)方法復(fù)原，但不限于這幾種方法，如離心、過濾、提取、噴霧烘干、蒸發(fā)或沉淀法。蛋白變體能通過以下傳統(tǒng)方法提純， 但不限于這幾種方法，如色譜法(離子交換、親和力、疏水性、大小篩選)、電泳、差別溶解度(銨硫酸鹽沉淀)、SDS-PAGE或提取法。本發(fā)明研制出生產(chǎn)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白變體的藥物配比和藥劑學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明研制出的藥物配比是治療有效劑量。本發(fā)明藥物配比中的載體包括制藥領(lǐng)域常用的載體、佐劑、賦形劑，這些統(tǒng)稱為藥劑學(xué)可接受載體。本發(fā)明藥物配比中的非限制性藥劑學(xué)可接受載體包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩沖劑(如磷酸鈉、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、植物飽和脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、鹽、電解質(zhì)(如硫酸精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素底物、聚乙烯乙二醇、羥甲基纖維素鈉鹽、多芳基化合物、蠟、聚乙烯_聚氧丙烯_阻斷共聚物、聚乙烯乙二醇和羊毛脂。服用本發(fā)明的藥物配比可以隨意采用常用方式，只要采用該方式能夠達(dá)到目標(biāo)組織即可，如局部用藥、口服、非腸道使用、眼內(nèi)使用、經(jīng)皮、直腸內(nèi)使用，可制成溶液、懸浮液、 藥片、藥丸、膠囊或緩釋形式。非腸道使用包括皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、機(jī)內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、干內(nèi)、心內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或灌輸技術(shù)。本發(fā)明的藥物配比可以制備成水溶液采用非腸道服用。如果合理地選用Hank溶液、注射溶液或生理鹽等緩沖溶液，效果會更好。注射水懸濁液可以同時(shí)補(bǔ)充能夠提高粘性的物資，如羧甲基纖維素鈉鹽、山梨醇、右旋糖苷。此外，有效成分懸濁液如注射油性懸濁液，包括親脂性溶劑或載體，如芝麻油等脂肪酸和油酸乙酯、甘油三酯、脂質(zhì)體等合成脂肪酸酯。聚陽離子非脂氨基聚合物也可作為載體。懸浮液可以適當(dāng)添加穩(wěn)定劑或藥物來增加蛋白變體溶解度，同時(shí)獲得高濃度蛋白變體溶液。本發(fā)明的藥物配比若經(jīng)過消毒處理，采用注射方式會更好，如制成水性或油性懸濁液進(jìn)行注射。懸濁液可采用適宜分散或潤濕物質(zhì)(如Tween 80)和懸浮物質(zhì)。也可以制成消毒供注射溶液或無毒非腸道注射可接受稀釋液或溶劑，如1，3-丁二醇溶液。可接受載體和溶劑包括甘露醇、水、注射溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，習(xí)慣上采用消毒的非揮發(fā)性油作溶劑或懸濁液溶液。這樣可以采用刺激性小的非揮發(fā)性油，如合成的單或雙甘油酯。另外，油酸、甘油酯衍生物等脂肪酸可以同制藥可接受的天然油脂(如橄欖油和蓖麻油)一樣用來制備注射用藥，尤其是聚氧乙基衍生物。上述水性配比主要通過濾去細(xì)菌、摻入消毒劑或聯(lián)合應(yīng)用輻射進(jìn)行消毒。經(jīng)過消毒成分會變硬，如通過冰凍烘干來獲得變硬的產(chǎn)品，實(shí)際應(yīng)用中，再把它溶于消過毒的水或稀釋液中。與本發(fā)明藥物配比相關(guān)的“治療有效劑量”是指應(yīng)用本發(fā)明藥物成分時(shí)治療疾病時(shí)有效成分的劑量達(dá)到改善的或治療的效果。本發(fā)明藥物配比的治療有效劑量因病人的年齡、性別、應(yīng)用部位、服藥頻率、服藥持續(xù)時(shí)間，藥品形式是仿制還是佐劑而異。通常， 與野生型蛋白產(chǎn)品相比，服藥本發(fā)明藥物劑量應(yīng)酌減，如0.01-1000 μ g/kg/天，更適宜
0.1-500 μ g/kg/ 天，最好 1-100 μ g/kg/day。另一方面，技術(shù)領(lǐng)域資深人士接受本發(fā)明配比類型不同的蛋白適用于治療不同類型的疾病。作為本發(fā)明代表的EPO和TPO可以用來治療單獨(dú)的或作為其它疾病并發(fā)癥(如腸炎、更加嚴(yán)重的腎病、腎衰竭引發(fā)的貧血、用齊多夫定(AZT)治療HIV感染者并發(fā)的貧血、 腫瘤化療引發(fā)的貧血、亨廷頓疾病(HD)、鐮刀型紅細(xì)胞貧血、子宮交換輸血后新生兒次再生性貧血聯(lián)合Rh溶血性疾病)的貧血。此外，本發(fā)明改造的G-CSF可以用來治療原發(fā)性和骨髓移植、腫瘤化療誘導(dǎo)的嗜中性白血球減少癥。GH變體可以用來治療侏儒癥、兒科慢性腎功能衰竭。然而，本發(fā)明的應(yīng)用范疇遠(yuǎn)不止于此。以下，本發(fā)明研制出4-螺旋束細(xì)胞活素纈氨酸取代苯丙氨酸殘基生成的干擾素變體，詳細(xì)地說，包括 CNTF、EPO、Flt3L、G-CSF, GM-CSF, GH、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、L-6、 IL-12p35、LPT、LIF、M-CSF、0SM、PL、SCF、TP0、IFN-a 2A、IFN-a 2B、IFN-3 , IFN- γ , IFN-ω 禾口 IFN- τ 0另一方面，本發(fā)明提供以下蛋白變體⑴野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID NO. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體。(2) 野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)的48、138、142或148位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQID NO. 3)的6、15、81、87、96或 124位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144或160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113或119位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)的
1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 GH 變體。(7)野生型 IFN-a 2A 氨基酸序列(SEQ ID N0. 7)的 27、36、38、43、47、64、67、 84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- a 2A變體。(8)野生型IFN_a2B 氨基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-a2B變體。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、 38、50、67、70、111或154位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體。(10)野生型 IFN-Y 氨基酸序列(SEQ ID N0. 10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、95 或 139 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID N0. 11) 的27、36、38、65、68、124或153位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體。(12) 野生型 IFN-τ 氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 13)的42、44、78、103、117或124位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體。 (14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID N0. 14)的37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體。(1 野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO. 15)的33、 45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體。(16)野生型IL-5 氨基酸序列(SEQ ID NO. 16)的49、69、96或103位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-5 變體。(17)野生型 IL-6 氨基酸序列(SEQ ID NO. :17)的 73、77、93、104、124、169 或 172位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列 (SEQ ID NO. 18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-12p35變體。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體。O0)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成1^正變體。Ql)野生型 M-CSF 氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的 35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、 311、439、466或485位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體。Q2)野生型OSM 氨基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體。(23)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO. :23)的10、31、44、52、54、92、 97、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體。Q4)野生型SCF 氨基酸序列(SEQ ID N0. 24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207 或 245位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體。0 野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1觀、131、141、186、204、240或286位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體。 另一方面，本發(fā)明提供以下DNA分子(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID N0. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，編碼此變體的DNA。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或148位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，編碼此變體的DNA。( 野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L 變體，編碼此變體的DNA。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、 140、144或160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，編碼此變體的DNA。(5) 野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，編碼此變體的DNA。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)的 1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176 或 191 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，編碼此變體的DNA。(7)野生型IFN-α 2A氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 7) 的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成正^0 2八變體，編碼此變體的DNA。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、 43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B變體，編碼此變體的DNA。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，編碼此變體的DNA。(10)野生型 IFN-Y 氨基酸序列(SEQ ID NO. :10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、95 或 139 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-Y變體，編碼此變體的DNA。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，編碼此變體的DNA。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID NO. :12) 的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- τ變體，編碼此變體的DNA。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44，、78、 103、117或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，編碼此變體的DNA。(14) 野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO. :14)的37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，編碼此變體的DNA。(1 野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO. 15)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，編碼此變體的DNA。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQID NO. :16)的49、69、96或103位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，編碼此變體的DNA。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO. 17)的73、77、93、104、1M、169或172位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，編碼此變體的DNA。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO. :18) 的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35 變體，編碼此變體的DNA。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，編碼此變體的DNA。O0)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 LIF變體，編碼此變體的DNA。Ql)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、 54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466 或 485 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，編碼此變體的DNA。02)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO. :22) 的56、70、160、169、176或184位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，編碼此變體的 DNA。(23)野生型 PL 氨基酸序列(SEQ ID NO. :23)的 10、31、44、52、54、92、97、146、 166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，編碼此變體的DNA。Q4) 野生型 SCF 氨基酸序列(SEQ ID NO. :24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、 205,207或245位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，編碼此變體的DNA。Q5) 野生型 TPO 氨基酸序列(SEQ ID NO. :25)的 46、128、131、141、186、204、240 或 286 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，編碼此變體的DNA。 本發(fā)明提供以下重組表達(dá)載體(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID N0. 1)的 3、83、98、105、119、152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(2)野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或 148位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(3) 野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、140、144或160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 G-CSF變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)的1、10、25、31、44、54、 92、97、139、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(7)野生型IFN-α 2A氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 7)的27、36、38、43、 47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-α 2A變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、43、 47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(10)野生型 IFN-γ 氨基酸序列(SEQ ID NO. :10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、 95或139位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(11)野生型 IFN-ω 氨基酸序列(SEQ ID NO. :11)的 27、36、38、65、68、1 或 153 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(12)野生型 IFN-τ 氨基酸序列(SEQ ID NO. :12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(13) 野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44、78、103、117或1 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)的37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-3變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO. :16)的49、69、96或 103位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。 (17)野生型 IL-6 氨基酸序列(SEQ ID NO. :17)的 73、77、93、104、124、169 或 172 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(18)野生型 IL-12p;35 氨基酸序列(SEQ ID NO. :18)的 13、39、82、96、116、132、150、166 或 180 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(19) 野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。00)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。Ql)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。02)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體， 裝有編碼此變體DNA的適宜載體。03)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO. :23)的10、31、 44、52、討、92、97、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。04)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO. :24)的63、102、 110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。05)野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1觀、131、141、186、204、240或286位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。 進(jìn)一步說，本發(fā)明提供以下宿主細(xì)胞(1)被編碼CNTF變體DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，CNTF變體由野生型CNTF氨基酸序列(SEQ ID N0. 1)的3、83、98、105、119、 152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼EPO變體DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，EPO變體由野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或148 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼Flt3L變體DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，F(xiàn)lt3L變體由野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ IDN0. 3)的6、15、81、87、96或IM 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(4)被編碼G-CSF變體DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，G-CSF變體由野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144或 160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼GM-CSF變體DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，GM-CSF變體由野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113 或119位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(6)被編碼GH變體的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，GH變體由野生型GH氨基酸序列(SEQ ID NO. 6)的1、10、25、31、44、54、92、 97、139、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體。(7)被編碼 IFN- α 2Α變體的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN- α 2Α變體由野生型IFN- α 2Α氨基酸序列(SEQ ID NO. 7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(8)被編碼IFN-a2B變體的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN-a2B變體由野生型 IFN-a2B 氨基酸序列(SEQ ID NO. :8)的 27、36、38、43、47、64、67、84、123 或 151 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(9)被編碼IFN-β變體的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN-β變體由野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、 111或巧4位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(10)被編碼IFN-Y變體的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN-γ變體由野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ IDN0. 10)的18、32、 55、57、60、63、84、85、95或139位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(11)被編碼IFN-ω 變體氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN-ω變體由野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(12)被編碼IFN-τ變體氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IFN-τ變體由野生型 IFN-τ 氨基酸序列(SEQ ID NO. :12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(1 被編碼IL-2氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL-2變體由野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44、78、 103、117或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(14)被編碼IL-3氨基酸序列的 DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL-3變體由野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO. :14)的 37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(1 被編碼IL-4氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL-4變體由野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(16)被編碼IL-5 氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL-5變體由野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID N0. 16)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(17)被編碼IL-6氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL-6變體由野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID N0. 17)的73、77、93、104、1M、169或172位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(18)被編碼IL-12p35氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL_12p35變體由野生型 IL-12p35 氨基酸序列(SEQ ID NO. :18)的 13、39、82、96、116、132、150、166 或 180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(19)被編碼IL-12p35氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，IL_12p35變體由野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO. :19) 的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。00)被編碼LIF氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，LIF變體由野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、52、 67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。Ql)被編碼LIF氨基酸序列的 DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，LIF變體由野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的 35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466 或 485 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。02)被編碼OSM氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，OSM變體由野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO. :22)的56、70、160、169、176或184位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。被編碼PL氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，PL 變體由野生型 PL 氨基酸序列(SEQ IDN0. 23)的 10、31、44、52、54、92、97、146、166、 176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。04)被編碼SCF氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，SCF變體由野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO. :24)的10、31、 44、52、M、92、97、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。0 被編碼SCF氨基酸序列的DNA的適宜載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，SCF變體由野生型SCF氨基酸序列 (SEQ ID NO. :25)的46、1沘、131、141、186、204、240或286位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。 進(jìn)一步說，本發(fā)明提供以下制備蛋白變體的方法(1)野生型CNTF氨基酸序列 (SEQ ID NO. :1)的3、83、98、105、119、152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 CNTF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。⑵野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)的48、138、142或148位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(3)野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、 81、87、96或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、140、144或160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(6)野生型GH氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(7)野生型 IFN-α 2A 氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 7)的 27、36、38、43、47、64、67、 84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- α 2Α變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ IDN0. 8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-a2B變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID N0. 9)的8、38、50、67、 70,111或巧4位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID N0. 10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID NO. :11)的27、36、38、 65、68、IM或153位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(12)野生型IFN-τ氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- τ變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(13)野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、 44、78、103、117或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(14)野生型IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)的37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(15)野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID NO. :15)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(16)野生型IL-5氨基酸序列(SEQ ID NO. :16) 的49、69、96或103位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID NO. 17)的73、77、93、104、124、169或172位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID NO. :18)的13、39、82、96、116、 132、150、166或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(19)野生型LPT氨基酸序列(SEQ ID N0. 19)的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體， 培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。00) 野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、52、67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(22)野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID NO. :22)的56、70、160、169、176或184 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。03)野生型PL氨基酸序列(SEQ ID N0. 23)的10、31、44、52、討、92、97、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 PL變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。(24)野生型 SCF 氨基酸序列(SEQ ID NO. :24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、 158、199、205、207或M5位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。0 野生型TPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1沘、131、141、186、204、240或286位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，培養(yǎng)裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細(xì)胞的方法和把它從培養(yǎng)基分離出來的方法。 再進(jìn)一步說，本發(fā)明提供以下藥物配比(1)野生型CNTF氨基酸序列(SEQ IDN0. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。( 野生型EPO氨基酸序列(SEQ ID N0. 2)的 48、138、142或148位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。⑶野生型Flt3L氨基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(4)野生型G-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144 或160位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(5)野生型GM-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113或11 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(6)野生型 GH 氨基酸序列(SEQ ID NO. 6)的 1、10、25、31、44、54、92、97、139、 146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(7)野生型IFN-α 2A氨基酸序列(SEQ ID NO. 7)的27、36、38、 43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-α 2A變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(8)野生型IFN-a2B氨基酸序列(SEQ ID NO. 8) 的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B 變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(9)野生型IFN-β氨基酸序列(SEQ ID N0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β 變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(10)野生型IFN-γ氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-Y變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(11)野生型IFN-ω氨基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(1 野生型IFN- τ氨基酸序列(SEQ IDN0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(1 野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44，、78、103、117或124位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(14)野生型 IL-3氨基酸序列(SEQ ID NO. :14)的37、61、107、113或133位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(1 野生型IL-4氨基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(16)野生型IL-5氨基酸序列 (SEQ ID NO. :16)的49、69、96或103位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體， 包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(17)野生型IL-6氨基酸序列(SEQ ID N0. 17)的73、77、93、104、1對、169或172位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體， 包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(18)野生型IL-12p35氨基酸序列(SEQ ID N0. 18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-12p35變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(19)野生型LPT氨基酸序列 (SEQ ID NO. :19)的41或92位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。00)野生型LIF氨基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、 52、67、70、156或180位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(21)野生型M-CSF氨基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。0 野生型OSM氨基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。野生型PL氨基酸序列(SEQ ID NO. 23)的10、31、44、52、M、92、97、146、166、176或191位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。04)野生型SCF氨基酸序列(SEQ ID NO. 24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207 或 245 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。(2 野生型 TPO 氨基酸序歹Ij (SEQ ID NO. :25)的 46、128、131、141、186、204、240 或沘6 位點(diǎn)上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，包含此變體的藥物配比和制藥學(xué)可接受載體。 現(xiàn)以ΤΡΟ、EPO、G-CSF和GH為例來說明本發(fā)明改造蛋白變體如何提高化學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)功能。很顯然對于技術(shù)領(lǐng)域人士，本發(fā)明可以通過這些例子來闡釋，但不僅限于適用于這些例子。編碼 TP0/EP0/G-CSF/GH 野生型 DNA 結(jié)構(gòu)A.編碼TPO野生型DNA結(jié)構(gòu)骨髓組織中添加750 μ 1 TRIzol (MRC.，USA)放入微試管離心機(jī)室溫培養(yǎng)5分鐘。 往試管中添加200 μ 1氯仿，振蕩15秒鐘，室溫培養(yǎng)2至3分鐘，4°C下15，000r/m離心15 分鐘。取上清液，轉(zhuǎn)入1.5ml試管，添加500 μ 1異丙醇。取樣-70°C培養(yǎng)30分鐘，4°C下 15，000r/m離心15分鐘。棄去表面懸浮物，用75% DEPC-乙醇溶液渦流沖洗RNA球狀小體， 4°C下15，000r/m離心15分鐘。棄去表面懸浮物，RNA球狀小體室溫干燥5分鐘，之后溶于 50 μ 1 DEPC處理過的3°蒸餾水。2μ g mRNA 凈化提純方法如上，混合 1μ 1 寡dT30 引物(10 μ M，Promega，USA) 70°C 加熱2分鐘，立即冰凍降溫2分鐘。之后，反應(yīng)混合物中加入200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Promega, USA)，10 μ 1 5Χ 反應(yīng)緩沖劑 Q50mM Tris-HCl, pH 8. 3,375mM KCI，15mM MgCl2, 50nM DTT)，1 μ 1 dNTP(10mM dATP, IOmM dTTP, IOmM dGTP, IOmM dCTP)和DEPC處理過的 3° 水使總量達(dá)到50 μ 1。輕輕混合均勻，42 °C培養(yǎng)60分鐘。為了放大cDNA編碼野生型TPO活性，選用第一條cDNA作模板，往含有2UpfuDNA 聚合酶(Stratagene，USA)、10 μ 1 10Χ 反應(yīng)緩沖液、Triton X-100、lmg/mlBSA、3 μ 1 引 *1(10μΜ)、3μ13|*2(10μΜ)、2μ1 of dNTP(10mM dATP、IOmM dTTP、IOmM dGTP、IOmM dCTP)的PCR試管中添加引物1和引物2(表1)，再加入蒸餾水使總量達(dá)到10μ1。PCR反應(yīng)所需條件如下95°C每次3分鐘，1輪接著95°C每次30秒，52C每次1分鐘，72C每次1. 5 分鐘，30輪，最后72°C每次10分鐘，1輪直至反應(yīng)徹底結(jié)束。將得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)品分離，放入0.8%瓊脂培養(yǎng)基(BMA，USA)，用Qiaex 11凝膠提取法(Qiagen，USA)提純。分離出的DNA與15U EcoRI混合后，加入10U NotI、3y 1 10X 反應(yīng)緩沖液和3°蒸餾水使總量達(dá)到30μ1，37 培養(yǎng)DNA2小時(shí)。將PCR反應(yīng)產(chǎn)品分離，放入0. 8%瓊脂培養(yǎng)基，用Qiaex II凝膠提取法凈化。將5yg pBluescript KS II (+)載體與 15U EcoRIUOU NotI、3yl 10X 反應(yīng)緩沖液混合，加入3°蒸餾水使總量達(dá)到30μ 1，37°C培養(yǎng)DNA2小時(shí)。將限制性pBluescript KS II (+)載體分離，放入0. 8%瓊脂培養(yǎng)基，用Qiaex II凝膠提取法凈化。將IOOng消化的pBluescript KS II (+)載體與20ng經(jīng)同樣酶消化的PCR產(chǎn)品混合。將混合物置于16°C水浴16小時(shí)，這樣就制成了含有編碼野生型TPO cDNA的重組載體。接著，把它轉(zhuǎn)入經(jīng)過氯化銣處理的ToplO大腸桿菌anvitrogen，USA)。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌置于包含50μ 1/ml氨比西林(Sigma，USA)的LB瓊脂板培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)，將菌簇置于含有 50 μ 1/ml氨比西林的:3ml LB介質(zhì)，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。用堿溶解法從培養(yǎng)細(xì)菌中分離出質(zhì)粒，用EcoRI/NotI限制檢測質(zhì)?？寺』虻膬?nèi)容物。B.克隆編碼野生型EPO DNA的方法基本同克隆編碼野生型TPO DNA的方法。取第一條cDNA鏈作模板，取引物11和引物12來放大(見表幻做編碼野生型 EPO DNA在PCR反應(yīng)中的表現(xiàn)。用EcoRI和BamHI核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。將消化的PCR產(chǎn)物和克隆載體結(jié)合轉(zhuǎn)入活性大的大腸桿菌 ToplO(lnvitrogen, USA)。用堿溶解法從培養(yǎng)細(xì)菌中分離出質(zhì)粒，用EcoRI/BamHI限制檢測質(zhì)?？寺』虻膬?nèi)容物C.克隆DNA編碼野生型G-CSF的方法與克隆DNA編碼野生型TPO的方法類似。選用健康人的白細(xì)胞進(jìn)行mRNA提取，取引物21和引物22來放大(見表幻編碼野生型G-CSF cDNA在PCR反應(yīng)中的表現(xiàn)。用EcoRI和SmaI核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。將消化的PCR產(chǎn)物和克隆載體結(jié)合轉(zhuǎn)入活性大的大腸桿菌E. coli ToplO (lnvitrogen, USA)。用堿溶解法從培養(yǎng)細(xì)菌中分離出質(zhì)粒，用Smal/EcoRI 限制檢測質(zhì)?？寺』蚴欠翊嬖?。D.編碼野生型GH的DNA結(jié)構(gòu)。編碼野生型GH的DNA購自ATCC (ATCC No. 67097)。 在PCR法中采用引物35和引物36 (見表4)在cDNA的N末端添加先導(dǎo)序列。再次用PCR法中采用引物37和引物38(見表4)保證全部編碼野生型GH的cDNA都能與先導(dǎo)序列結(jié)合。 用EcoRI和HindiIII核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。用堿溶解法從培養(yǎng)細(xì)菌中分離出質(zhì)粒，用EcoRI/Hindilll限制檢測質(zhì)粒克隆基因是否存在。例2 編碼 TP0/EP0/G-CSF/GH 突變蛋白 cDNA 結(jié)構(gòu)A.編碼TPO突變蛋白cDNA結(jié)構(gòu)在ΤΡ0、TPO-[F46V]、TPO-[FU8V]、TPO-[F131V]和 TP0_[F141V]的各自位點(diǎn)用纈氨酸取代苯丙氨酸可以得到四種突變蛋白。表1構(gòu)建編碼野生型TPO以及突變蛋白的cDNA所用引物
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權(quán)利要求
1.一種TPO變體，其中，所述TPO是通過纈氨酸取代SEQ ID NO. :25所示的氨基酸序列的第131或141位的苯丙氨酸殘基而被改變。
2.—種DNA，其中，該DNA編碼權(quán)利要求1所述的TPO變體。
3.重組表達(dá)載體，根據(jù)2，DNA可實(shí)際與之連接的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)3，DNA可實(shí)際與之連接的重組表達(dá)載體，該載體存取號為KCCM-10500、 KCCM-10501 或 KCCM-10571。
5.根據(jù)3或4，宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體被轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)染。
6.根據(jù)5，該方法為制備蛋白變體的方法，含培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中分離蛋白變體的方法。
7.—種藥物組合物，其中，該藥物組合物含有權(quán)利要求1所述的TPO變體以及藥學(xué)上可接受載體。
全文摘要
揭示一種蛋白變體，該蛋白變體是位于通過與相應(yīng)受體、配體或底物結(jié)合有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)功能蛋白結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸被纈氨酸所取代生成的。同時(shí)，本發(fā)明揭示編碼該蛋白變體的DNA，結(jié)合DNA的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，制備蛋白變體的方法，含培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中分離蛋白變體的方法。進(jìn)一步說，本發(fā)明揭示一種含蛋白變體的藥物配比和藥物學(xué)可接受載體。
文檔編號C07K14/52GK102286090SQ20111017635
公開日2011年12月21日 申請日期2004年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月26日
發(fā)明者李基完, 李學(xué)燮, 許閏華, 鄭用勛, 金哉潤 申請人:魅德秀專有限公司