專利名稱：一種β-環(huán)糊精配基瓊脂糖氫鍵吸附純化縮宮素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)合成多肽藥物一縮宮素的氫鍵吸附色譜分離純化方法，具體的是采用表面鍵合了 β-環(huán)糊精配基的瓊脂糖凝膠介質(zhì)，利用氫鍵吸附色譜原理分離純化化學(xué)合成縮宮素。
背景技術(shù)：
自然界存在著數(shù)量龐大、種類繁多的生物活性肽，涉及各種毒素、激素、抗菌肽、信息素、細(xì)胞因子等，在各種生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，廣泛參與分子識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、 酶活調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化及個(gè)體發(fā)育調(diào)控等過程。自從上世紀(jì)初多肽人工合成技術(shù)發(fā)明以來，已經(jīng)有幾十種人工合成多肽藥物上市，并被廣大患者采用。隨著近年來頻頻爆發(fā)食品、藥品安全問題，以及人們對藥品質(zhì)量和使用安全性意識的提高，多肽藥物生產(chǎn)的純度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制又重新受到各有關(guān)方面的重視?？s宮素(oxytocin，0T)于1895年被發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)如圖1所示，是具有一個(gè)二硫鍵的九肽酰胺，又名催產(chǎn)素，是一種哺乳動(dòng)物激素，主要由下丘腦視上核和室旁核的神經(jīng)分泌大細(xì)胞系統(tǒng)分泌產(chǎn)生，從垂體后葉釋放入血液，沿血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)端的器官發(fā)揮作用，在臨床上被廣泛用于引產(chǎn)、催產(chǎn)及預(yù)防因分娩后子宮乏力引起的大出血，是目前美國FDA唯一認(rèn)可用于臨床引產(chǎn)的藥物。其分子量1007. 2Da，分子式C43H66N12O12S2,等電點(diǎn)7. 7，易溶于水， 溶于丙酮、丁醇和稀醋酸，不溶于乙醚和石油醚，干品穩(wěn)定，PH3. 8 4. 4的酸性溶液中較穩(wěn)定，堿性溶液中不穩(wěn)定。早年藥用縮宮素的生產(chǎn)采用從動(dòng)物垂體后葉組織中提取的方式，存在病毒滅活、除過敏原、除熱原等安全性問題，且提取物中存在難分離結(jié)構(gòu)近似物，即后葉加壓素。我國自1969年第一次合成縮宮素以來，國內(nèi)30余家縮宮素制劑生產(chǎn)廠家均采用九肽酰胺經(jīng)鈉-液氨法消除、縮合的辦法合成縮宮素，最終產(chǎn)品的純化過程較復(fù)雜，產(chǎn)品純度低、收率低，這也是導(dǎo)致臨床出現(xiàn)部分不良反應(yīng)的因素之一。化學(xué)合成縮宮素粗品中的主要雜質(zhì)，是一些與目標(biāo)多肽結(jié)構(gòu)類似的雜肽，例如氨基酸消旋化產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體、部分氨基酸未連接上產(chǎn)生的缺失肽、肽鍵斷裂產(chǎn)生的斷裂肽，以及氧化不徹底產(chǎn)生的還原態(tài)開環(huán)肽等。人工合成多肽藥物的傳統(tǒng)純化方法是多步反相色譜純化，反相色譜法是目前分辨率最高的多肽純化方法，可以精確分辨一個(gè)氨基酸殘基的差異，因此除了作為純化方法外， 還經(jīng)常被用作最終的純度驗(yàn)證步驟。盡管已有商品化的制備級反相色譜柱，但將反相色譜技術(shù)應(yīng)用于多肽藥物的規(guī)?；a(chǎn)還有不足第一，反相高效液相色譜的樣品載量較低，尤其是對雜質(zhì)較多的粗品，過量粗制樣品會造成色譜柱的不可逆塌陷；第二，介質(zhì)品種有限， 不易放大；第三，介質(zhì)的重復(fù)使用次數(shù)有限，對樣品的預(yù)處理要求較高；第四，常規(guī)硅膠基質(zhì)鍵合烷基配基，這樣的色譜分離介質(zhì)，用作臨床用藥的生產(chǎn)，其生物相容性與生物安全性沒有葡聚糖、瓊脂糖類的介質(zhì)高。瓊脂糖凝膠介質(zhì)是天然多糖類色譜介質(zhì)，發(fā)明于20世紀(jì)60年代，具有理想介質(zhì)的許多特性高孔度(90-96% )，即使在高濃度下也能保持高的孔度；具有連接纖維的開放的結(jié)構(gòu)；高的連通性有效保證了分子內(nèi)物質(zhì)傳遞；大比表面積提供了很高的吸附能力；易制備成不同瓊脂糖濃度、不同尺寸的球形顆粒以滿足不同領(lǐng)域的需求；在氫氧化鈉中穩(wěn)定可滿足苛刻的在位清洗步驟；低的非特異性吸附使應(yīng)用面較廣；具有彈性及非脆性(較易實(shí)現(xiàn)色譜柱的再裝填)，又可通過適度的交聯(lián)步驟使介質(zhì)具有剛性(有較高的耐壓性能)；表面具有大量親水羥基，可被不同功能配基取代而應(yīng)用于多種吸附色譜技術(shù)。β -環(huán)糊精是一種具有桶狀結(jié)構(gòu)的多糖分子，結(jié)構(gòu)如圖2所示，內(nèi)部具有疏水空腔，外表面具有豐富的親水羥基和醚鍵，能夠提供氫鍵形成位點(diǎn)，主要作為藥物載體，與藥物分子形成包合物，目的是增加藥物分子的親水性，改善藥物分子在循環(huán)系統(tǒng)中的溶解度與釋放速率。β-環(huán)糊精分子本身還具有一定的手性選擇性。氫鍵吸附色譜是利用色譜介質(zhì)與目標(biāo)分子之間形成氫鍵作用的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)分離的一類新型色譜分離方法，利用不帶有任何配基的高濃度、高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠本身作為氫鍵吸附色譜介質(zhì)，分離純化中藥多酚類化合物或多肽的機(jī)理及應(yīng)用研究已有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于采用自制的可規(guī)模放大的以β -環(huán)糊精為配基的瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)，分離純化化學(xué)合成縮宮素粗品，簡化純化工藝，提高目標(biāo)物選擇性、產(chǎn)品回收率、產(chǎn)品純度和生物安全性，提高樣品載量和介質(zhì)重復(fù)利用度。本方法適用于液相合成或固相合成的化學(xué)合成縮宮素粗品。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種以交聯(lián)瓊脂糖凝膠為基質(zhì)、以β-環(huán)糊精為配基的氫鍵吸附色譜介質(zhì)的合成方法，包括如下步驟1)12%濃度、30 μ m平均粒徑的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠微球1升，用水洗后轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器；2)加入 100-200ml 水，加 5_15g 硫酸鈉，攪拌 2_3h ；3)加入 100-200ml 水和 50_60ml 的 20-50 % 的氫氧化鈉，60rpm 攪拌；4)加入30_60ml環(huán)氧化試劑，包括環(huán)氧氯丙烷和1，4_ 丁二醇-二縮水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 攪拌，反應(yīng) 6_8h ；5)用鹽酸調(diào) pH 4-6;6)加入20-50mg β -環(huán)糊精，20-50 %的氫氧化鈉，20-30 °C，60rpm攪拌，反應(yīng) 12-20h ；7)用鹽酸調(diào)pH 4-6，水洗10個(gè)柱床體積；8)保存于20%乙醇中備用。本發(fā)明提供一種β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜分離純化化學(xué)合成縮宮素的方法，具體步驟如下1)流動(dòng)相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動(dòng)相為20-30%乙腈，配制好的流動(dòng)相用0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置0. 5_lh備用；2)化學(xué)合成縮宮素粗品溶解于初始流動(dòng)相，配制成10 50mg/mL溶液，超聲助溶 1 5min, 0. 45 μ m濾膜過濾；3) β-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)裝柱，用初始流動(dòng)相平衡2個(gè)柱床體積后進(jìn)樣，樣品體積為柱床體積的5 50% ；
4)洗脫方式初始流動(dòng)相等度洗脫2個(gè)柱床體積后，純水等度洗脫2個(gè)柱床體積，然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為5 10個(gè)柱床體積，線性流速20 100cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動(dòng)收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進(jìn)行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動(dòng)相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點(diǎn)，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點(diǎn)，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測，計(jì)算縮宮素純度和收率。本發(fā)明提供了一種使用自制β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化化學(xué)合成縮宮素的方法，是對現(xiàn)有多肽分離純化方法的有益補(bǔ)充，與傳統(tǒng)多步反相色譜技術(shù)相比的優(yōu)勢在于一步分離可獲得較高純度的多肽，回收率高；介質(zhì)對粗品耐受強(qiáng)， 樣品載量高，介質(zhì)可重復(fù)利用數(shù)十次，易于規(guī)模放大；介質(zhì)的生物相容性與生物安全性高。


圖1縮宮素分子結(jié)構(gòu)圖2β_環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)圖3實(shí)施例1中采用β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化液相合成縮宮素粗品色譜4實(shí)施例2中采用β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化固相合成縮宮素粗品色譜圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化液相合成縮宮素粗品(初始純度約17%)1)流動(dòng)相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動(dòng)相為30%乙腈，配制好的流動(dòng)相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣20min，室溫靜置0. 5h備用；2)化學(xué)合成縮宮素粗品溶解于初始流動(dòng)相，配制成50mg/mL溶液，超聲助溶5min， 0. 45 μ m濾膜過濾；3) β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)裝柱，柱床直徑10mm，柱床高度 30cm，用初始流動(dòng)相平衡2個(gè)柱床體積后進(jìn)樣，樣品體積為柱床體積的10% ；4)洗脫方式初始流動(dòng)相等度洗脫2個(gè)柱床體積后，純水等度洗脫2個(gè)柱床體積， 然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為10個(gè)柱床體積，線性流速40cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動(dòng)收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進(jìn)行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動(dòng)相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點(diǎn)，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點(diǎn)，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測；7)純化后，縮宮素純度由17%提高至96%，回收率78%。
實(shí)施例2、β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化固相合成縮宮素粗品(初始純度約58%)3)流動(dòng)相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動(dòng)相為20%乙腈，配制好的流動(dòng)相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣20min，室溫靜置0. 5h備用；4)化學(xué)合成縮宮素粗品溶解于初始流動(dòng)相，配制成50mg/mL溶液，超聲助溶3min， 0. 45 μ m濾膜過濾；幻β-環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)裝柱，柱床直徑16mm，柱床高度 30cm，用初始流動(dòng)相平衡2個(gè)柱床體積后進(jìn)樣，樣品體積為柱床體積的20% ；4)洗脫方式初始流動(dòng)相等度洗脫2個(gè)柱床體積后，純水等度洗脫2個(gè)柱床體積， 然后采用O 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為10個(gè)柱床體積，線性流速30cm/h ；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動(dòng)收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0. 三氟乙酸)溶解配制成0. 2mg/mL溶液，進(jìn)行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動(dòng)相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為梯度起點(diǎn)，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點(diǎn)，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測；7)純化后，縮宮素純度由58%提高至98%，回收率85%。
權(quán)利要求
1.一種采用以β-環(huán)糊精為配基的瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)分離純化化學(xué)合成縮宮素的方法。分離純化方法具體如下1)流動(dòng)相組成乙腈-乙酸-水體系，初始流動(dòng)相為20-30%乙腈，配制好的流動(dòng)相用 0. 45 μ m濾膜過濾，超聲脫氣或真空脫氣10-30min，室溫靜置0. 5_lh備用；2)化學(xué)合成縮宮素粗品溶解于初始流動(dòng)相，配制成10 50mg/mL溶液，超聲助溶1 5min, 0. 45 μ m濾膜過濾；3)β -環(huán)糊精配基瓊脂糖凝膠氫鍵吸附色譜介質(zhì)裝柱，用初始流動(dòng)相平衡2個(gè)柱床體積后進(jìn)樣，樣品體積為柱床體積的5 50% ；4)洗脫方式初始流動(dòng)相等度洗脫2個(gè)柱床體積后，純水等度洗脫2個(gè)柱床體積，然后采用0 10%乙酸線性梯度洗脫，梯度長度為5 10個(gè)柱床體積，線性流速20 IOOcm/ h；5)紫外檢測器^Onm在線監(jiān)測，自動(dòng)收集餾分；6)將步驟幻收集的餾分冷凍干燥，用15%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解配制成 0. 2mg/mL溶液，進(jìn)行純度檢測采用反相高效液相色譜C18柱，采用乙腈-三氟乙酸-水為流動(dòng)相體系，線性梯度洗脫，15%乙腈(含0. 三氟乙酸)為梯度起點(diǎn)，90%乙腈(含 0. 三氟乙酸)為梯度終點(diǎn)，梯度長度30min，紫外檢測器210nm在線監(jiān)測，計(jì)算縮宮素純度和收率。
2.權(quán)利要求1中瓊脂糖凝膠介質(zhì)偶聯(lián)β-環(huán)糊精配基的步驟包括1)12%濃度、30μ m平均粒徑的高交聯(lián)度瓊脂糖凝膠微球1升，用水洗后轉(zhuǎn)入反應(yīng)瓶或反應(yīng)器；2)加入100-200ml水，加5_15g硫酸鈉，攪拌2- ；3)加入100-200ml水和50_60ml的20-50%的氫氧化鈉，60rpm攪拌；4)加入30-60ml環(huán)氧化試劑，包括環(huán)氧氯丙烷和1，4-丁二醇-二縮水甘油醚， 20-30 0C，60rpm 攪拌，反應(yīng) 6_8h ；5)用鹽酸調(diào)pH4-6 ；6)加入20-50mgβ-環(huán)糊精，20-50%的氫氧化鈉，20-30°C，60rpm攪拌，反應(yīng)12_20h ；7)用鹽酸調(diào)pH4-6，水洗10個(gè)柱床體積；8)保存于20%乙醇中備用。
3.權(quán)利要求1中要求的應(yīng)用對象，化學(xué)合成縮宮素，包括液相合成與固相合成的縮宮素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用氫鍵吸附色譜分離純化化學(xué)合成縮宮素的方法。此方法采用表面鍵合了β-環(huán)糊精配基的高濃度、高交聯(lián)度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)，根據(jù)氫鍵吸附原理，從化學(xué)合成(包括液相合成和固相合成)的縮宮素粗品中，分離純化縮宮素，用于縮宮素原料藥的生產(chǎn)，具有選擇性高、樣品載量高、介質(zhì)重復(fù)利用度高等優(yōu)點(diǎn)，克服傳統(tǒng)反相色譜法的介質(zhì)重復(fù)利用度低、樣品載量低的缺點(diǎn)。
文檔編號C07K1/34GK102250218SQ20111017751
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者俞保彬, 周天瓊, 周正兵, 谷海濤, 顧銘, 高留根 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所, 杭州華津藥業(yè)股份有限公司