專利名稱：T細(xì)胞表位肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花粉過敏原的T細(xì)胞表位肽及以該肽為有效成分的基于肽的免疫治療方法中的組合物。該組合物用于治療和/或預(yù)防春天的花粉病。
背景技術(shù)：
日本人口中大約10%患有發(fā)生于春天的花粉病，例如雪松花粉病。這種情形正在增加并引起了大家的注意?；ǚ鄄“l(fā)生和持續(xù)的時期一般相應(yīng)于花粉散發(fā)的時期。在許多情況下，在雪松花粉散發(fā)的季節(jié)過后花粉病的癥狀仍會保持，這是由于大部分雪松花粉病患者同時也對日本扁柏花粉(Hiroki cypress pollens)過敏，其花粉在雪松花粉散發(fā)期后即開始。因此，同時對日本扁柏花粉敏感的患者在一年的一長段時間中都患有花粉病的癥狀。雪松花粉和日本扁柏花粉具有同樣的抗原性(Takeshi Ide等，Allergy Clinic 11，174-178，1991)。已經(jīng)確定了雪松花粉和日本扁柏花粉之間IgE抗體的交叉反應(yīng)性 (Taniai M.等，Mol. Immunol. 30，183-189，1993)?；即禾旎ǚ鄄〉幕颊咂溥^敏原特異性 IgE抗體的陽性指數(shù)對雪松花粉而言是83.5%，對日本扁柏花粉是80.0%，二者同時則是 76. 4% (Mitsuhiro Okano 等，Allergy 43，1179-1184，1994)。此外，60%患雪松花粉病的患者具有日本扁柏花粉特異性的IgE抗體(Yozo Saito, Chiryo (Therapy) 78，1571-1576， 1996)。根據(jù)這些報道，一般認(rèn)為患雪松花粉病的患者會患上日本扁柏花粉的花粉病，反之亦然?；ǚ鄄∈且环N典型的由花粉過敏原(它是引起過敏的抗原因此基本上就是抗原) 和特異于該過敏原的IgE抗體之間的抗原-抗體反應(yīng)誘導(dǎo)的I型立即過敏。因此，目前所用的花粉病的預(yù)防和治療方法其理論根據(jù)是I型過敏的形成機制。下面將簡要描述該機制。侵入機體的抗原由抗原呈遞細(xì)胞呈遞給輔助T細(xì)胞。結(jié)果，B細(xì)胞成熟為抗體產(chǎn)生細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性的IgE抗體，該抗體結(jié)合到肥大細(xì)胞表面。其后，如果再有抗原入侵，該抗原就會結(jié)合到肥大細(xì)胞表面的IgE抗體上。這種刺激使肥大細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)例如組胺，于是引起過敏癥狀。根據(jù)上述機制，下面是三種用于預(yù)防和治療過敏的主要方法1)避免引起過敏的抗原，2)典型地使用抗組胺劑的化學(xué)治療，以及3)使用過敏原的脫敏作用。但是，方法1) 在實踐中難于操作，而且方法2)僅僅是一種癥狀性的治療。方法3)看起來是解決根本問題的唯一途徑，但它并非總是有效而且可能會引起嚴(yán)重的副作用例如過敏性休克。由于這些原因，最近已嘗試將使用過敏原的T細(xì)胞表位肽的基于肽的免疫治療來預(yù)防和治療過敏。T細(xì)胞表位參加引起過敏的臨床癥狀的蛋白質(zhì)過敏原的免疫反應(yīng)的起始和保持。這些T細(xì)胞表位結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞表面的II類HLA分子上刺激相關(guān)的T細(xì)胞亞群。據(jù)信這種刺激能引發(fā)輔助T細(xì)胞水平的起始反應(yīng)。這種起始反應(yīng)能引起T細(xì)胞的增殖，淋巴因子的分泌，局部發(fā)炎反應(yīng)，增殖的免疫反應(yīng)細(xì)胞向發(fā)炎部位的遷移，以及在抗體產(chǎn)生前B細(xì)胞級聯(lián)的活化。作為這些抗體的同型的IgE抗體對過敏的發(fā)展和保持是至關(guān)重要的。另外，其產(chǎn)生會受到上述級聯(lián)開始時輔助T細(xì)胞分泌的淋巴因子的性質(zhì)影響。T細(xì)胞表位是被T細(xì)胞受體識別的基本元素和最小單位，該表位含有識別受體所必需的氨基酸。T 細(xì)胞應(yīng)答是免疫抑制的要點，而使用T細(xì)胞表位肽來抑制T細(xì)胞應(yīng)答則與過敏發(fā)炎的治療緊密相關(guān)。已知使用T細(xì)胞表位肽的抗過敏治療劑包括含貓源過敏原的T細(xì)胞表位肽的治療組合物(日本(JP-WA)No. Hei 7-505365公開的PCT申請)，由雪松花粉T細(xì)胞表位肽Cryjl組成的治療組合物(JP-WA-Hei 8-502163)，將雪松花粉T細(xì)胞表位肽Cryjl和 Cryj2結(jié)合而成的多表位肽(日本專利申請?zhí)朒ei 8-80702)。據(jù)報道日本扁柏花粉主過敏原Chaol分子量為45KD或50KD。每種分子的等電點都為6. 8，并且由含有5%糖類的蛋白質(zhì)組成(Takeshi Ide 等，Nippon Kafun Gakkaishi (Journal of the Japanese Pollen Association) 34，39，1988)。但并不知道其一級結(jié)構(gòu)，因而還未鑒定過敏原分子表面上的T 細(xì)胞表位位點。最近，本發(fā)明人成功地克隆了日本扁柏過敏原基因，并表明了在Chaol之外還存在另一類型的過敏原，即Chao2。而且還確定了 Chaol和Chao2的基本結(jié)構(gòu)(日本專利申請?zhí)?Hei 6-335089) 本發(fā)明的公開雪松花粉散發(fā)期與日本扁柏花粉散發(fā)期重疊是指花粉散發(fā)期的交叉。這兩種花粉具有一個相同的抗原性，這使得難以把由雪松花粉引起的癥狀與由日本扁柏引起的癥狀區(qū)分開來。甚至在雪松花粉散發(fā)期過后該癥狀還會繼續(xù)并發(fā)展。由于該時期空氣中的花粉絕大部分是日本扁柏花粉，這些癥狀看起來似乎是由日本扁柏花粉引起的。由于所種植的日本扁柏要多于雪松，因此日本扁柏的散發(fā)量逐年增加并且將來不久將會超過雪松花粉的散發(fā)量。因此建立一種方法用于預(yù)防和治療對春天由樹木花粉引起的基本的(root) —系列 (overall)花粉病的過敏病是有用的，花粉病包括日本扁柏花粉病和雪松花粉病。有希望將使用T細(xì)胞表位肽的免疫治療與過敏的根本治療相聯(lián)系。如上所述，對雪松花粉病而言已有幾種這類免疫治療的方法。然而，對日本扁柏花粉病或由春天樹木的花粉，包括雪松和日本扁柏花粉引起的花粉病還沒有任何報道。本發(fā)明的一個目的是提供用于日本扁柏花粉病的基于肽的免疫治療的T細(xì)胞表位肽。本發(fā)明的另外一個目的是提供T細(xì)胞表位肽用于治療春天由樹木花粉引起花粉病的患者包括與日本扁柏花粉具交叉反應(yīng)性的雪松花粉病患者的基于肽的免疫治療。本發(fā)明人通過以覆蓋了日本扁柏花粉過敏原全部一級結(jié)構(gòu)的人工重疊肽刺激由日本扁柏花粉病患者建立的T細(xì)胞系鑒定了日本扁柏花粉過敏原分子上的T細(xì)胞表位位點，從而解決了上述問題。本發(fā)明由每一個權(quán)利要求中描述的發(fā)明組成，并且將在下面進行詳細(xì)描述。具體地，本發(fā)明涉及1.包含日本扁柏花粉過敏原Chaol的至少一種T細(xì)胞表位肽并具有選自如圖4 所示的下列某一肽的氨基酸序列或所說氨基酸序列的一部分的肽，這些肽包括肽#1-2 (SEQ ID NO 4)，肽 #1-4 (SEQ ID NO 6)，肽 #1-5 (SEQ ID NO -J),肽 #1-6 (SEQ ID NO 8)，肽#1-7 (SEQ ID NO 9) Ji #1-8 (SEQ ID NO 10)，月太 #1-10 (SEQ ID NO 12) Ji #1-11 (SEQ ID NO 13)，肽 #1-12 (SEQ ID NO 14)，肽 #1-14 (SEQ ID NO 16)，肽 #1-15 (SEQ ID NO: 17)，肽 #1-16 (SEQ ID NO 18)，月太 #1-19 (SEQ ID NO :21)，月太 #1-20 (SEQ ID NO 22) Ji #1-21 (SEQ ID NO 23) Ji #1-22(SEQ ID NO :24)，肽#1-23(SEQ ID NO :25)，肽#1-24(SEQ ID NO 26), Ι #1-25 (SEQ ID NO :27)，肽#1-26 (SEQ ID NO :28)，肽#1-27 (SEQ ID NO 29)，肽#1-30 (SEQ ID NO :32) J太#1-31 (SEQ ID NO :33) J太#1-32 (SEQ ID NO :34) J太#1-33 (SEQ ID NO 35), 以及肽 #1-34 (SEQ ID N0:36)。2.包含日本扁柏花粉過敏原Chao2的至少一種T細(xì)胞表位肽并具有選自如圖4 所示的下列某一肽的氨基酸序列或所說氨基酸序列的一部分的肽，這些肽包括#2-5(SEQ ID NO :42) J太 #2-7 (SEQ ID NO :44) J太 #2-8 (SEQ ID NO :45) J太 #2-9 (SEQ ID NO :46)，月太 #2-10 (SEQ ID NO :47)，肽 #2-11 (SEQ ID NO :48)，肽 #2-12 (SEQ ID NO :49)，肽 #2-13 (SEQ ID NO 50) Ji #2-14 (SEQ ID NO 51) Ji #2-15 (SEQ ID NO 52) Ji #2-16 (SEQ ID NO 53), Ι #2-17 (SEQ ID NO 54) Ji #2-18 (SEQ ID NO 55) Ji #2-19 (SEQ ID NO 56) Ji #2-20 (SEQ ID NO 57) J太 #2-21 (SEQ ID NO 58) J太 #2-22 (SEQ ID NO 59) J太 #2-23 (SEQ ID NO 60), Ι #2-24 (SEQ ID NO :61) J太#2-25 (SEQ ID NO 62) Jjv#2-26 (SEQ ID NO 63) Ji #2-27 (SEQ ID NO :64)，肽#1-2 (SEQ ID NO :65)，肽#2-30 (SEQ ID NO 67)，肽#2-31 (SEQ ID N0:68)，肽 #2-32 (SEQ ID NO 69) Ji #2-33 (SEQ ID NO 70) Ji #2-34 (SEQ ID NO 71) Ji #2-35 (SEQ ID NO 72)，肽 #2-36 (SEQ ID NO 73)，肽 #2-37 (SEQ ID NO 74)，肽 #2-38 (SEQ ID NO 75)，肽 #2-40 (SEQ ID NO 77)，肽 #2-41 (SEQ ID NO 78)，肽 #2-42 (SEQ ID NO: 79)，和肽 #2-43(SEQ ID NO 80)。3.項1或2中所說的肽，其中所說的肽包含至少兩個T細(xì)胞表位。4.對春天由樹木花粉引起的花粉病患者的T細(xì)胞具有刺激和/或抑制效應(yīng)并具有經(jīng)取代、缺失或插入修飾的項1或2中所述的氨基酸序列的肽。5.用于由春天因樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療的組合物，包括作為有效成分的項1到4中的任一項的肽。6.將項1到4中任一項的肽用于制備春天由樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療組合物的用途。7.用于治療和預(yù)防春天由樹木花粉引起的花粉病的方法，包括用項1到4中任一項的肽進行給藥。8.用于診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的試劑，包括作為有效成分的項1到4 中的任一項的肽。9.將項1到4中任一項的肽用于制備診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的試劑的用途。10.用于診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的方法，包括用項1到4中任一項的肽進行給藥。本發(fā)明人確定了以SEQ ID NO 1表示的日本扁柏花粉過敏原主要抗原Chaol (成熟蛋白質(zhì))的氨基酸序列(在日本專利申請No. Hei 6-335089中有描述)以及以SEQ ID NO :2表示的Chao2的氨基酸序列。Chaol的氨基酸序列與雪松花粉過敏原Cryjl的氨基酸序列具有80%的同源性，Chao2的氨基酸序列與雪松花粉過敏原Cryj2的氨基酸序列具有75%的同源性。在來自于花粉、螨類和蜂毒的過敏原中有一些氨基酸取代。將這些種類的過敏原稱之為同系過敏原。例如從樺樹花粉BetvI中分離到了 11個同系過敏原，并且其氨基酸序列之間所差異在 2% 到 15% 的范圍內(nèi)(Swoboda, I. J. Biol. Chem. 270 :2607-2613, 1995)。目前在Cryj2方面，發(fā)現(xiàn)了其成熟蛋白質(zhì)中有六個氨基酸殘基取代的兩個同系過敏原(未審
公開日本專利申請(JP-A)No.Hei8-47392及No. 7-170986)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以合乎情理地認(rèn)為Chaol和Chao2中也存在著同系過敏原。本發(fā)明中這類同系過敏原也包含于Chaol和Chao2之中。將雪松樹這一科分成9個屬，日本扁柏科分成七個屬。據(jù)報道來自于屬于雪松(杉科)科的日本柳杉、北美紅杉以及水杉、曾被認(rèn)為屬于一個獨立的科、雪松科或松科的金松 (或意大利傘松，Umbrella Pine)的過敏原與來自于柏科的日本扁柏、日本花柏、側(cè)柏、杜松及圓柏的過敏原有交叉反應(yīng)性(Takeshi Ide等，Allery Clinic, 11，174-178，1991)。從該報道看來，雪松過敏原與日本扁柏有相當(dāng)廣泛的交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明的肽對日本扁柏花粉病與雪松花粉病都是普遍有效的。為了得到本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽合成了覆蓋Chaol和Chao2整個一級結(jié)構(gòu)的重疊肽；每一個肽含有適當(dāng)長度的氨基酸殘基(12到20個殘基)。本發(fā)明的肽刺激和/或抑制來源于患由春天時樹木花粉引起的花粉病的患者的T細(xì)胞活性。也就是說，本發(fā)明的肽可以引起T細(xì)胞的反應(yīng)(例如T細(xì)胞的增殖、淋巴因子分泌等)和/或可誘導(dǎo)T細(xì)胞的無反應(yīng)性(無反應(yīng))。用與JP-A-Hei 8-47392的描述相同的方法以T細(xì)胞生長作指標(biāo)可以鑒定過敏原分子上的T細(xì)胞表位位點。尤其是從日本扁柏花粉患者的外周淋巴細(xì)胞對每個患者建立了與Chaol和Chao2產(chǎn)生特異反應(yīng)的T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆。在重疊肽的每一種肽都存在的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆。在肽存在的條件下通過測定T細(xì)胞的增殖來鑒定表位位點(例如，細(xì)胞對[咕]胸腺嘧啶的吸收)并計算其刺激指數(shù)。此處所用的刺激指數(shù)(Si)是指在用沒有肽時細(xì)胞對[咕]胸腺嘧啶的放射性(cpm)吸收水平(對照)的值去除在有肽存在條件下細(xì)胞對[3H]胸腺嘧啶放射性(cpm)吸收水平的值而得到的。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，對每個患者組都計算了每種肽的平均刺激指數(shù)。將引起T細(xì)胞反應(yīng)和/或T細(xì)胞無反應(yīng)的肽定義為有T細(xì)胞刺激活性的肽。本發(fā)明優(yōu)選的T細(xì)胞表位肽具有T細(xì)胞刺激活性，因此其含有至少一個T細(xì)胞表位。Chaol的T細(xì)胞表位肽的實例見

圖1 (具體見圖2、圖 3 以及 SEQ ID NO :3 至 Ij SEQ ID NO :37)，包括肽 #1-2 (SEQ ID NO :4)，肽 #1-4 (SEQ ID NO: 6) J太 #1-5 (SEQ ID NO 7) J太 #1-6 (SEQ ID NO 8) Ji #1-7 (SEQ ID NO 9) J太 #1-8 (SEQ ID NO 10)，肽 #1-10 (SEQ ID NO 12)，肽 #1-11 (SEQ ID NO 13)，肽 #1-12 (SEQ ID NO: 14)，肽 #1-14 (SEQ ID NO 16) Ji #1-15 (SEQ ID NO 17)，Jft #1-16 (SEQ ID NO 18)，Jft #1-19 (SEQ ID NO 21) Ji #1-20 (SEQ ID NO 22) Ji #1-21 (SEQ ID NO 23) Ji #1-22 (SEQ ID NO 24), Ι #1-23 (SEQ ID NO :25)，肽#1-24 (SEQ ID NO :26)，肽#1-25 (SEQ ID NO :27)，肽#1-26 (SEQ ID NO 28) Ji #1-27 (SEQ ID NO 29) Ji #1-30 (SEQ ID NO 32) Ji #1-31 (SEQ ID NO 33), 肽 #1-32 (SEQ ID N0:34)Ji#l-33(SEQ ID NO :3 ，以及肽 #1-34 (SEQ ID NO :36)(圖 4)。 Chao2的T細(xì)胞表位肽的實例見圖5(具體見圖6、圖7以及SEQ ID N0:38到SEQ ID NO 88), 包括 Jft#2-5(SEQ ID NO :42) J太 #2-7 (SEQ ID NO :44) J太 #2-8 (SEQ ID NO :45) J太 #2-9 (SEQ ID NO 46) Ji #2-10(SEQ ID NO :47)，Jft #2-11(SEQ ID NO :48)，Jft #2-12(SEQ ID NO :49)，Ii #2-13 (SEQ IDNO :50)，肽#2-14 (SEQ ID NO :51)，肽#2-15 (SEQ ID NO :52)，肽#2-16 (SEQ ID NO 5 ，肽#2-17(SEQ ID NO :54)，肽#2-18(SEQ ID NO :55)，肽#2-19(SEQ ID NO 56), Ι #2-20 (SEQ ID NO 57) Ji #2-21 (SEQ ID NO 58) Ji #2-22 (SEQ ID NO 59) Ji #2-23 (SEQ ID NO 60) J太#2-24 (SEQ ID NO :61) J太#2-25 (SEQ ID NO 62) J太#2-26 (SEQ ID NO 63), 肽#2-27(SEQ ID NO :64)，肽#1-2(SEQ ID NO :65)，肽#2-30(SEQ ID NO :67)，肽#2-31(SEQ ID NO :68) J太#2-32 (SEQ ID NO 69) Ji #2-33 (SEQ ID NO 70) Ji #2-34 (SEQ ID NO 71), Ι #2-35 (SEQ ID NO 72) Ji #2-36 (SEQ ID NO 73) Ji #2-37 (SEQ ID NO 74) Ji #2-38 (SEQ ID NO 75)，肽#2-40 (SEQ ID NO77)，肽#2-41(SEQ ID NO 78)，肽#2-42 (SEQ ID NO 79), 和肽#2-43 (SEQ ID NO :80)(圖8)。更優(yōu)選地，該T細(xì)胞表位的平均刺激指數(shù)為2. 0或更多。實例包括肽 #1-2 (SEQ ID NO :4)，肽 #1-7 (SEQ ID NO :9)，肽 #1-8 (SEQ ID NO: 10)，肽 #1-20 (SEQ ID NO :22)，肽 #1-22 (SEQ ID NO :24)，肽 #1-24 (SEQ ID NO :26)，肽 #1-26 (SEQ ID N0:28)Ji#l-32(SEQ ID NO :34)，肽 #1-33 (SEQ ID NO :35)，以及肽 #1-34 (SEQ ID NO: 36)，如圖 1 所示。以及肽#2-10 (SEQ ID NO :47)，肽#2-20 (SEQ ID NO :57)，肽#2-21 (SEQ ID NO :58)，肽 #2-40 (SEQ ID NO :77)，肽 #2-41 (SEQ ID NO :78)，肽 #2-42 (SEQ ID NO: 79)，禾口肽#2-43 (SEQ ID NO 80)，如圖5所示。最優(yōu)選地，該T細(xì)胞表位肽的最小陽性指數(shù)為100。 其實例包括肽#1-7 (SEQ ID NO :9)，肽#1-22 (SEQ ID NO :24)，肽#1-32 (SEQ ID N0:34)，肽 #1-33 (SEQ ID NO :35)，如圖 1 所示。以及肽 #2-20 (SEQ ID NO 57)，肽 #2-40 (SEQ ID NO: 77) J太#2-41 (SEQ ID NO :78) J太#2-42 (SEQ ID NO :79)，和月太#2-43 (SEQ ID NO :80)，如圖 5所示。此處所用的“陽性指數(shù)”通過將某肽的平均刺激指數(shù)乘以對該肽具有T細(xì)胞反應(yīng)的患者的出現(xiàn)頻率(％ )而得到的。為了精確地識別該表位，具有T細(xì)胞刺激活性因而含有至少一個T細(xì)胞表位的肽可通過在該肽的氨基端或羧基端缺失任何氨基酸殘基來進行修飾。當(dāng)兩個或多個具重疊區(qū)域的肽產(chǎn)生T細(xì)胞刺激活性時，可以制備一個含重疊肽的全部或部分的新的T細(xì)胞表位肽， 并以相同方法測定其T細(xì)胞刺激活性。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽有可能與T細(xì)胞交叉反應(yīng)中的Cryjl或Cryj2是免疫相關(guān)的。尤其是，DChaol的氨基酸序列與Cryjl的氨基酸序列有80%的同源性，Chao2的氨基酸序列與Cryj2的氨基酸序列有75%的同源性；幻除兩個氨基酸外(Chaol第12位上的丙氨酸相當(dāng)于CJI-I上的絲氨酸，Chaol第15位上的天冬氨酸相當(dāng)于CJI-I上的丙氨酸)，本發(fā)明實施例5中Chaol的T細(xì)胞表位肽#1-2的氨基酸序列(相當(dāng)于成熟型Chaol的SEQ ID NOS :11-30的氨基酸序列)與Cryjl的T細(xì)胞表位肽的CJI-I氨基酸序列(相當(dāng)于成熟型 Cryjl的SEQ ID NOS :11_30的氨基酸序列)是相同的；以及3)雪松花粉與日本扁柏花粉具有相同的抗原性。由于這些原因，本發(fā)明T細(xì)胞表位肽的來源不限于日本扁柏。本發(fā)明的T 細(xì)胞表位肽不僅對日本扁柏花粉病有效，而且對雪松花粉病也有效。在本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽中，參與識別T細(xì)胞受體的氨基酸殘基可用已知方法確定(例如測定因氨基酸殘基取代而引起的可能的T細(xì)胞刺激活性的變化)。用其它氨基酸殘基來取代在與T細(xì)胞受體相互作用中具重要作用的氨基酸殘基，這樣就可以抗原特異性地控制T細(xì)胞刺激活性向抑制過敏性發(fā)炎(增加T細(xì)胞反應(yīng)性，改變淋巴因子產(chǎn)生形式，無反應(yīng)性等)的方向發(fā)展。據(jù)報道在人過敏模型中，當(dāng)雪松花粉Cryjl上T細(xì)胞表位肽的T細(xì)胞識別位點的一個氨基酸殘基被另一個氨基酸取代(第339位的蘇氨酸被取代為纈氨酸)時，所得類似肽與野生型肽在T細(xì)胞生長及IL-4的產(chǎn)生方面是基本相同，但卻提高了抑制IgE抗體產(chǎn)生的IFN-Y的產(chǎn)生量(Ikagawa, S.等，J. Aller. Clin. Immunol. 97，54-64，1996)。還進一步表明，HLA II 類分子的結(jié)合基元包含間隔1至2個氨基酸排列的3至5個氨基酸殘基，當(dāng)這些殘基含有幾種特定的氨基酸殘基時，肽會結(jié)合到HLA II類分子上(Matushita，S.等J. Exp. Med. 180 877-883,1994)。因此，用已知的方法通過確定對與HLA II類分子反應(yīng)中有重要作用的本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的氨基酸殘基，然后用其它氨基酸殘基來取代所確定的氨基酸殘基就可以防止過敏性發(fā)炎。而且，為增加其可溶性可以對本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽進行修飾，于是也就增加了其治療或預(yù)防效應(yīng)或穩(wěn)定性。這類修飾包括氨基酸殘基的取代、缺失和增加。本發(fā)明中，T細(xì)胞表位肽優(yōu)選不與IgE抗體結(jié)合。即使與IgE抗體結(jié)合，其結(jié)合程度也明顯低于與作為所述肽來源的天然日本扁柏花粉過敏原與該抗體的結(jié)合。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽優(yōu)選含有至少7個氨基酸殘基。這些區(qū)域可以與對酶(例如組織蛋白酶或胰蛋白酶)的切割敏感的接頭(例如精氨酸-精氨酸或賴氨酸-賴氨酸) 連接，以增加對抗原呈遞細(xì)胞的加工的敏感性。由此可得到含有一個或多個T細(xì)胞表位的肽區(qū)域。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可以與其它肽例如Cryjl的T細(xì)胞表位肽(JP-A-Hei 8-502163)和/或Cryj2的T細(xì)胞表位肽(JP-WA-Hei 8-47392)結(jié)合使用。當(dāng)將含有至少一個本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的肽向?qū)θ毡颈獍鼗ǚ酆?或?qū)θ毡颈獍丶把┧苫ǚ圻^敏的個體給藥時，該肽可控制該個體對過敏原的過敏反應(yīng)。因此該肽對基于肽的免疫治療是有效的。尤其是，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的與雪松花粉的T細(xì)胞表位肽的結(jié)合可更加有效地用于由春天以雪松和日本扁柏花粉為代表的樹木花粉引起花粉病的患者的基于肽的免疫治療。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可用作由日本扁柏花粉過敏原或其它與日本扁柏花粉過敏原有免疫交叉反應(yīng)性的樹木花粉引起的花粉病的診斷工具。在這種應(yīng)用上，將本發(fā)明的T 細(xì)胞表位肽加入到收集自患者的外周淋巴細(xì)胞中，其加入量約為0.1微克/毫升到約1毫克/毫升優(yōu)選約1到300微克/毫升。將混合物溫育一周后，測定并評價淋巴細(xì)胞中[咕] 胸腺嘧啶的吸收，可以進行花粉病的診斷。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽也可用于T細(xì)胞功能或T 細(xì)胞增殖或二者的評價。當(dāng)用重組DNA技術(shù)合成本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽時，在適于宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基上培養(yǎng)用含有編碼該肽的序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該肽可用已知技術(shù)從培養(yǎng)上清或宿主細(xì)胞中收獲。大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞都可以用作這類宿主細(xì)胞。當(dāng)將本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽用于花粉病患者的基于肽的免疫治療時，該肽可與可藥用的稀釋物或載體一同給藥。此處所指的“花粉病患者”包括與日本扁柏花粉過敏原有免疫交叉反應(yīng)性的雪松花粉病患者。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可用簡單方法，例如通過注射 (皮下或靜脈內(nèi))、滴注、鼻內(nèi)注射、口服給藥、吸入或經(jīng)皮給藥。在注射時，單劑量的肽優(yōu)選從1微克到約30毫克，更優(yōu)選從約20微克到10毫克。附圖簡要說明圖1說明了日本扁柏花粉過敏原Chaol及每一肽的陽性指數(shù)。圖2 說明了 Chaol 的重疊肽(#1-1 到 #1-28)。圖3 說明了 Chaol 的重疊肽(#119 到 #1-35)。
圖4說明了含Chao 1的T細(xì)胞表位的肽。 圖5說明了日本扁柏花粉過敏原Chao2的T細(xì)胞表位肽及每一肽的陽性指數(shù)。
圖6 說明了 Chao2 的重疊肽(#2-1 到 #2-27)。圖7說明了 Chao2的重疊肽(#2-沘#2_51)。圖8說明了含Chao2的T細(xì)胞表位的肽。本發(fā)明的最佳實施方式下面將對本發(fā)明的實施例進行描述，但不應(yīng)將其理解為是對本發(fā)明范圍的限制。實施例1重疊肽的合成根據(jù)日本扁柏花粉過敏原Chaol (SEQ ID NO 1)及Chao2 (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列，用肽合成儀(PSSMUhimadzu Saisakusho Ltd.)通過Fmoc方法合成了各含10個殘基的重疊部分的20個氨基酸殘基的重疊肽(其中，肽#1-35(SEQ ID NO :37)及肽#2-51 (SEQ ID NO 88)為14個殘基)。對Chaol制備了 35種重疊肽(圖1，SEQ ID NO 3 37)，對 Chao2制備了 51種(圖5，SEQ ID NO 38到SEQ ID NO 88)。如此所得的肽用ODS柱高壓液相色譜(HPLC)純化。在上述肽中，其純度為90%或更高。用LASERMAT2000 (Firmigan MAT Ltd.)鑒定純化肽的分子量。實施例2大腸桿菌中重組蛋白質(zhì)的表達用PCR技術(shù)從質(zhì)粒DNA中擴增了 cDNA，該質(zhì)粒中已克隆了編碼日本扁柏花粉過敏原的Chaol或Chao2cDNA(日本專利申請?zhí)朒ei 6-335089)。將限制酶識別位點附到了 cDNA 的末端。將該DNA片段插入到組氨酸標(biāo)簽結(jié)合蛋白表達載體pQE9中，并將所得的載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15 (pREP4)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確證了氨芐西林抗性克隆的轉(zhuǎn)化基因的表達。用Ni-NTA瓊脂糖親和柱純化表達蛋白質(zhì)。實施例3如下建立Chaol的T細(xì)胞系。用Ficoll-Paque通過比重離心分離了 19名Ala STAT (Nippon DPC公司)或CAP-RAST (Pharmacia)日本扁柏陽性患者外周血來源的淋巴細(xì)胞。在補充了 2毫升來自于同一患者的血漿(10%)或人AB型血清(20%，BanpOh Tsusho Co. ,Ltd.)的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO，Inc.)中懸浮該淋巴細(xì)胞QX IO6個細(xì)胞)。將該懸浮液與實施例2中所得的10到30微克/毫升的重組Chaol或與實施例1中所得的重疊肽混合物(0. 01到1微摩爾/升)一起在M孔板上溫育3到10天(37°C，CO2恒溫箱，TABAI， Inc.)。當(dāng)用顯微鏡確證Chaol刺激所活化的T細(xì)胞后，將5單位/毫升的IL-2 (Boehringer Mannheim)加到系統(tǒng)中，隨后溫育過夜。第二天，用補充了 20單位/毫升IL-2，10%或20% 人AB型血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。用同樣方法每天替換培養(yǎng)基將溫育持續(xù)10天。測定了該增殖T細(xì)胞系的特異性，并將部分的T細(xì)胞系冰凍冷藏。用同樣方法從20個日本扁柏花粉病患者中也建立了有Chao2刺激的T細(xì)胞系。實施例4抗原呈遞細(xì)胞建立建立了用EB病毒(非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒，EBV)感染B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化來的淋巴樣干細(xì)胞系(B細(xì)胞系)并用作抗原呈遞細(xì)胞。首先，在補充有20%失活的肽牛血清(FCS，GIBC0 Inc.)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn) EBV 的 B-95-8 細(xì)胞(marmoset，ATCC CRL 1612)。以 0.22微米無菌濾器過濾培養(yǎng)物上清。將過濾物冰凍保存于-80°C。隨后，將1毫升的EBV 溶液加到日本扁柏花粉病患者的淋巴細(xì)胞OXlO6個細(xì)胞)中，將混合物在37°C保持30分鐘進行感染。將EBV感染的細(xì)胞洗滌兩次，然后在補充有終濃度為200納克/毫升的環(huán)孢菌素(Sandoz Pharmaceutical Co. ,Ltd.)的 20% FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)基中溫育約 20 天。在以裸眼能觀察到細(xì)胞團后于20% FCS-RPMI培養(yǎng)基上在繼續(xù)培養(yǎng)20天。所得細(xì)胞冰凍保存待用。實施例5 T細(xì)胞表位肽的建立用50微克/毫升絲裂霉素C (Sandoz Pharmaceutical Co.，Ltd.)將實施例4中所建立的B細(xì)胞培養(yǎng)系處理30分鐘或以X光曝光(50g ray)，然后以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌4次。將B細(xì)胞接種到96孔板(10000個細(xì)胞/孔)后，在其中加入終濃度為10微克/ 毫升的Chaol或Chao2。對照組中加入終濃度為10微克/毫升的溶血鏈球菌細(xì)胞壁抗原 (SCff)，終濃度為10微克/毫升的白色假絲酵母抗原(CA)或終濃度為1微克/毫升的結(jié)核菌素抗原(PPD)。接著，將來自于已建立了 B細(xì)胞系的相同患者的T細(xì)胞系O0000個細(xì)胞 /孔)接種到每個孔中。溫育48小時后，在每孔中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶并繼續(xù)培養(yǎng)16小時。用細(xì)胞收集器(Berthold)在玻璃濾紙上收集細(xì)胞后，通過液閃計數(shù)器測定細(xì)胞[3H]胸腺嘧啶的吸收來確證細(xì)胞的生長反應(yīng)。當(dāng)確證T細(xì)胞具有對Chaol或Chao2的特異性生長反應(yīng)后，用實施例3中建立的 T細(xì)胞系通過與上述相同的方法測定了 T細(xì)胞系對每種重疊肽(終濃度為1微摩爾/升) 的生長反應(yīng)。圖1和圖5中表明了 T細(xì)胞系對重疊肽的生長反應(yīng)的平均刺激指數(shù)、出現(xiàn)頻率及如此計算所得的陽性指數(shù)。而且，測定了 T細(xì)胞系(N = 17)對氨基酸序列#2-11和#2-12的有一個氨基酸發(fā)生取代的修飾序列(SEQ ID N0:89和SEQ ID NO 90)的生長反應(yīng)。這兩個修飾序列的刺激活性用刺激指數(shù)表示時是1. 6和1. 2，用出現(xiàn)頻率表示時是16%和11 %，用陽性指數(shù)表示時是25. 6和13. 2。如上所述，即使有一個或多個氨基酸殘基的突變，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽仍然保持了其T細(xì)胞刺激活性，在某些情況下其活性還有增加。工業(yè)實用性本發(fā)明的肽含有Chaol或Chao2的至少一個T細(xì)胞表位肽，Chaol和Chao2是日本扁柏花粉的主要過敏原。本發(fā)明還進一步包括一種與該肽有免疫T細(xì)胞交叉反應(yīng)性的其它樹木花粉的肽片段。這些肽在用于春天由以雪松和日本扁柏花粉為代表的樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療是有效的。
權(quán)利要求
1.分離的日本扁柏花粉過敏原Chao2的肽或其一部分，所述肽或其一部分具有T細(xì)胞刺激活性并且由選自下列肽的氨基酸序列組成圖8所示的肽#2-5(SEQ ID N0:42)，肽 #2-7 (SEQ ID NO :44) J太 #2-8 (SEQ ID NO 45) Ji #2-9 (SEQ ID NO 46) Ji #2-10 (SEQ ID NO :47)，肽 #2-11 (SEQ ID NO :48)，肽 #2-12 (SEQ ID NO :49)，肽 #2-13 (SEQ ID N0:50)，肽 #2-14 (SEQ ID NO :51)，肽 #2-15(SEQ ID NO :52)，肽 #2-16 (SEQ ID NO :53)，肽 #2-17 (SEQ ID NO :54)，肽#2-18(SEQ ID NO :55)，肽#2-19 (SEQ ID NO :56)，肽#2-20(SEQ ID NO :57)， Ι #2-21(SEQ ID NO 58) J太 #2-22 (SEQ ID NO 59) Ji #2-23 (SEQ ID NO 60) Ji #2-24 (SEQ ID NO 61) Ji #2-25 (SEQ ID NO :62)，月太#2-26 (SEQ ID NO 63) Ji #2-27 (SEQ ID NO 64), Ι #2-30 (SEQ ID NO 67) Ji #2-31 (SEQ ID NO 68) Ji #2-32 (SEQ ID NO 69) Ji #2-33 (SEQ ID NO 70) J太 #2-34 (SEQ ID NO :71) J太#2-35 (SEQ ID NO 72) J太 #2-36 (SEQ ID NO 73), 月太#2-37 (SEQ ID NO 74) Ji #2-38 (SEQ ID NO 75) Ji #2-40 (SEQ ID NO 77) Ji #2-41 (SEQ ID NO 78) J太 #2-42 (SEQ ID NO 79) Ji #2-43 (SEQ ID NO :80)。
2.一種肽，其對日本扁柏花粉病患者的T細(xì)胞具有等同于權(quán)利要求1所述肽的刺激和 /或抑制效應(yīng)，并且其是權(quán)利要求1所述肽或其一部分的氨基酸序列，但其中有一或多個氨基酸被取代。
3.權(quán)利要求2的肽，其具有SEQID NO 89或90所示的氨基酸序列。
4.一種包含至少兩個區(qū)的分離的肽，每一區(qū)具有T細(xì)胞刺激活性且由選自下組的氨基酸序列的全部或一部分組成圖 8 中的肽#2-5 (SEQ ID NO :42)，肽#2-7 (SEQ ID NO 44)，肽#2-8 (SEQ ID N0:45)，肽 #2-9 (SEQ ID NO :46)，肽#2-10 (SEQ ID NO :47)，肽#2-11 (SEQ ID NO :48)，肽#2-12 (SEQ ID NO :49)，肽 #2-13 (SEQ ID NO :50)，肽 #2-14 (SEQ ID NO :51)，肽 #2-15 (SEQ ID N0:52)，肽 #2-16 (SEQ ID NO :5；3)，肽 #2-17(SEQ ID NO :54)，肽 #2-18 (SEQ ID NO :5 ，肽 #2-19 (SEQ ID NO :56) J太 #2-20 (SEQ ID NO :57) J太 #2-21 (SEQ ID NO :58) J太 #2-22 (SEQ ID NO :59)， Ι #2-23 (SEQ ID NO 60) Ji #2-24 (SEQ ID NO :61) J太#2-25 (SEQ ID NO 62) Ji #2-26 (SEQ ID NO :63) J太 #2-27 (SEQ ID NO 64) J太 #2-30 (SEQ ID NO :67) J太 #2-31 (SEQ ID NO 68), Ι #2-32 (SEQ ID NO 69) Ji #2-33 (SEQ ID NO 70) Ji #2-34 (SEQ ID NO :71) J太#2-35 (SEQ ID NO 72)，肽 #2-36 (SEQ ID NO 73)，肽 #2-37 (SEQ ID NO 74)，肽 #2-38 (SEQ ID NO 75)，肽 #2-40 (SEQ ID NO 77)，肽 #2-41 (SEQ ID NO 78)，肽 #2-42 (SEQ ID NO: 79)，和肽 #2-43(SEQ ID NO 80)。
5.權(quán)利要求4的肽，其中所述每一區(qū)由選自下組的氨基酸序列的全部或一部分組成肽 #2-10(SEQ ID NO 47)，肽 #2-20(SEQ ID NO 57)，肽 #2-21(SEQ ID NO 58)，肽#2-40 (SEQ ID NO 77)，肽 #2-41 (SEQ ID NO 78)，肽 #2-42 (SEQ ID NO 79)，和肽 #2-43 (SEQ ID NO 80)。
6.權(quán)利要求4的肽，其中所述每一區(qū)由選自下組的氨基酸序列的全部或一部分組成肽 #2-10(SEQ ID NO 47)，肽 #2-20(SEQ ID NO 57)，肽 #2-40(SEQ ID NO 77)，肽#2-41 (SEQ ID NO 78) J太 #2-42 (SEQ ID NO 79)，和Jft #2-43 (SEQ ID NO :80)。
7.權(quán)利要求4的肽，其中至少兩個肽經(jīng)由Arg-Arg或Lys-Lys接頭連接。
8.權(quán)利要求5的肽，其中至少兩個肽經(jīng)由Arg-Arg或Lys-Lys接頭連接。
9.權(quán)利要求6的肽，其中至少兩個肽經(jīng)由Arg-Arg或Lys-Lys接頭連接。
10.一種用于治療或預(yù)防日本扁柏花粉病的組合物，所述組合物包含至少一種按照權(quán)利要求1-9任一項所述的肽或其一部分作為有效成分，還包含可藥用的載體或稀釋劑。
11.一種用于治療或預(yù)防日本扁柏花粉病的組合物，所述組合物包含至少兩種肽作為有效成分并包含可藥用載體或稀釋劑，其中每種肽包含選自下組的氨基酸序列的全部或一部分圖 8 中的肽#2-5 (SEQ ID NO :42)，肽#2-7 (SEQ ID NO 44)，肽#2-8 (SEQ ID N0:45)，肽 #2-9(SEQ ID NO :46)，肽#2-10(SEQ ID NO :47)，肽#2-11(SEQ ID NO :48)，肽#2-12(SEQ ID NO :49)，肽 #2-13 (SEQ ID NO :50)，肽 #2-14 (SEQ ID NO :51)，肽 #2-15 (SEQ ID N0:52)，肽 #2-16 (SEQ ID NO :5；3)，肽 #2-17(SEQ ID NO :54)，肽 #2-18 (SEQ ID NO :5 ，肽 #2-19 (SEQ ID NO :56) J太 #2-20 (SEQ ID NO :57) J太 #2-21 (SEQ ID NO :58) J太 #2-22 (SEQ ID NO :59)， Ι #2-23 (SEQ ID NO 60) Ji #2-24 (SEQ ID NO :61) J太#2-25 (SEQ ID NO 62) Ji #2-26 (SEQ ID NO :63) J太 #2-27 (SEQ ID NO 64) J太 #2-30 (SEQ ID NO :67) J太 #2-31 (SEQ ID NO 68), Ι #2-32 (SEQ ID NO 69) Ji #2-33 (SEQ ID NO 70) Ji #2-34 (SEQ ID NO :71) J太#2-35 (SEQ ID NO 72)，肽 #2-36 (SEQ ID NO 73)，肽 #2-37 (SEQ ID NO 74)，肽 #2-38 (SEQ ID NO 75)，肽 #2-40 (SEQ ID NO 77)，肽 #2-41 (SEQ ID NO 78)，肽 #2-42 (SEQ ID NO: 79)，和肽 #2-43(SEQ ID NO 80)。
12.用于診斷日本扁柏花粉病的試劑，該試劑包含權(quán)利要求1到9任一項所述的肽或其一部分作為有效成分。
13.權(quán)利要求1到9任一項所述的肽或其一部分在制備日本扁柏花粉病的基于肽的免疫治療組合物中的用途。
14.權(quán)利要求1到9任一項的肽或其一部分在制備診斷日本扁柏花粉病的試劑中的用途。
全文摘要
用覆蓋日本扁柏花粉過敏原一級結(jié)構(gòu)的重疊肽對來自患日本扁柏(hinoki)花粉過敏原過敏的患者的T細(xì)胞系進行刺激從而鑒定了日本扁柏花粉過敏原的T細(xì)胞表位位點。該肽可用于春天的樹木花粉病包括與日本扁柏花粉有交叉反應(yīng)活性的日本扁柏花粉病的免疫治療和診斷。
文檔編號C07K14/415GK102286077SQ201110190310
公開日2011年12月21日 申請日期1997年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月14日
發(fā)明者大力一雄, 紀(jì)光助 申請人:明治乳業(yè)株式會社